abstrak aktivitas inhibitor topoisomerase beberapa tumbuhan

ABSTRAK
AKTIVITAS INHIBITOR TOPOISOMERASE
BEBERAPA TUMBUHAN INDONESIA ANGGOTA SUKU
APOCYNACEAE, SIMAROUBACEAE, DAN MAGNOLIACEAE
DENGAN METODE MECHANISM-BASED YEAST BIOASSAY
SERTA ISOLASI SENYAWA AKTIF TUMBUHAN TERPILIH
Oleh:
Ade Zuhrotun
NIM 30712005
(Program Studi Doktor Farmasi)
Penyakit kanker ditandai dengan pertumbuhan sel tidak terkendali dan
penyebarannya melalui sistem limfatik dan pembuluh darah menuju jaringan atau
bagian tubuh lainnya. Pertumbuhan sel ini akan terus berlangsung dan
menyebabkan kerusakan organ-organ vital manusia bahkan kematian. Jumlah
kasus kanker di dunia mengalami peningkatan dari 12,7 juta pada tahun 2008
menjadi 14,1 juta pada tahun 2012. Angka ini diperkirakan akan meningkat
menjadi 25 juta pada kurun waktu dua dekade. Sementara di Indonesia, prevalensi
kanker pada tahun 2013 yaitu 1,4 ‰ atau sekitar 347.792 orang.
Kombinasi operasi, radiasi dan kemoterapi merupakan pilihan yang sering
dilakukan untuk mengobati kanker. Beragamnya tipe sel kanker pada tiap pasien,
stadium panyakit, adanya resiko toksisitas obat, efek samping dan resistensi dalam
kemoterapi membuat kanker sulit diobati. Hal ini menjadi tantangan dan motivasi
untuk mencari sumber baru obat antikanker. Saat ini, sebanyak 74 dari 488 obat
antikanker yang diluncurkan National Cancer Institute (NCI) Amerika Serikat
merupakan obat asal tumbuhan. Sementara di Indonesia, sebanyak 16 dari 74
obat antikanker yang beredar merupakan obat asal tumbuhan.
Menurut NCI, ada Families of Special Interest (FOSI) atau beberapa suku
tumbuhan yang diperkirakan memiliki aktivitas antikanker, diantaranya yaitu
Apocynaceae, Simaroubaceae dan Magnoliaceae. Di Indonesia, tercatat sekitar 63
jenis tumbuhan Apocynaceae, 11 jenis tumbuhan Simaroubaceae dan 18 jenis
tumbuhan Magnoliaceae yang tersebar di berbagai wilayah.
Salah satu metode uji in vitro yang bisa digunakan dalam rangka mencari
antikanker dari bahan alam yaitu mechanism-based yeast bioassay. Hasil
pengujian ini berkorelasi terhadap salah satu mekanisme kerja senyawa antikanker
yaitu inhibitor enzim topoisomerase. Sampai saat ini belum pernah dilaporkan
adanya aktivitas inhibitor enzim topoisomerase terhadap tumbuhan Indonesia dari
suku Apocynaceae, Simaroubaceae dan Magnoliaceae. Oleh karena itu, penelitian
ini dilakukan untuk penapisan aktivitas inhibitor enzim topoisomerase beberapa
i
tumbuhan Indonesia anggota suku tersebut dan isolasi senyawa aktif tumbuhan
terpilih.
Penapisan aktivitas inhibitor topoisomerase dilakukan terhadap ekstrak metanol
kulit batang 15 jenis tumbuhan suku Apocynaceae, 3 jenis tumbuhan suku
Simaroubaceae dan 2 jenis tumbuhan suku Magnoliaceae dengan metode
mechanism-based yeast bioassay terhadap S. cerevisiae galur mutan (DNA repairatau recombination deficient). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak Kibatalia
arborea (Blume) G. Don. dan Michelia champaca L. memiliki aktivitas inhibitor
topoisomerase I dan II. Ekstrak Plumeria alba L., Tabernaemontana macrocarpa
Jack., Wrightia pubescens Blume, Picrasma javanica Blume, Picrodendron
baccatum Krug. & Urb. Ex. Urb., dan Quassia indica L. Nooteboom memiliki
aktivitas inhibitor topoisomerase I. Sedangkan ekstrak Ochrosia citrodora
Lauterb & K. Schum dan Michelia alba DC. memiliki aktivitas inhibitor
topoisomerase II.
Berdasarkan hasil penapisan, ekstrak Michelia champaca L. dipilih sebagai
ekstrak terbaik yang menunjukkan aktivitas inhibitor topoisomerase I dan II.
Ekstrak tersebut memiliki efek toksik berdasarkan metode brine shrimp lethality
bioassay (LC50<1000 g/mL) dan memiliki aktivitas antijamur. Data ini
menunjukkan bahwa tumbuhan ini memiliki potensi sebagai antikanker. Oleh
karena itu, M.hampaca dijadikan tumbuhan terpilih untuk dilakukan isolasi
senyawa aktif.
Ekstrak metanol M. champaca difraksinasi dengan metode ekstraksi cair-cair
(ECC). Berdasarkan hasil uji aktivitas inhibitor topoisomerase dengan
mechanism-based yeast bioassay dan KLT bioautografi, diketahui bahwa senyawa
target yaitu bercak ke-5 (Rf 0,68) dalam fraksi etil asetat dengan pengembang
campuran kloroform-metanol (9:1). Fraksi etil asetat dipisahkan lebih lanjut
dengan gabungan metode kromatografi cair vakum dan kromatografi kolom
klasik. Pada tahap akhir dilakukan pemurnian senyawa dengan cara rekristalisasi
menggunakan pelarut kloroform. Hasil isolasi berupa kristal jarum berwarna
kuning dengan jarak lebur 271,5-272,6 C, yang dinamakan isolat MCET51.
Uji aktivitas inhibitor topoisomerase isolat MCET51 dilakukan dengan metode
mechanism-based yeast bioassay dan reaksi enzimatik terhadap human
topoisomerase I. Hasilnya menunjukkan bahwa isolat aktif sebagai inhibitor
topoisomerase I dan II.
Karakterisasi isolat MCET51 telah dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis,
spektrofotometri Inframerah, spektrometri massa dan spektrometri resonansi
magnet inti proton (1H), karbon (13C), Heteronuclear Single Quantum Coherence
(HSQC) serta Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy (HMBC).
Berdasarkan data karakterisasi dan setelah dibandingkan dengan pustaka,
disimpulkan bahwa isolat MCET51 adalah liriodenin.
Aktivitas ekstrak M. champaca dan liriodenin sebagai inhibitor topoisomerase I
dan II dengan metode mechanism-based yeast bioassay untuk pertama kali
ii
dilaporkan pada penelitian ini. Selain itu, aktivitas liriodenin sebagai inhibitor
topoisomerase I dengan metode enzimatik terhadap human topoisomerase I untuk
pertama kali dilaporkan pada penelitian ini. Penelitian lainnya hanya melaporkan
liriodenin sebagai inhibitor topoisomerase II.
Hasil penelitian ini sejalan dengan laporan NCI yang menyebutkan bahwa suku
Apocynaceae, Simaroubaceae dan Magnoliaceae termasuk ke dalam FOSI atau
suku tumbuhan yang diperkirakan mengandung zat aktif antikanker. Senyawa
yang diisolasi dari tumbuhan terpilih Michelia champaca L., yaitu liriodenin
memiliki aktivitas inhibitor topoisomerase I dan II yang merupakan salah satu
mekanisme obat-obat antikanker.
Kata kunci: Inhibitor topoisomerase, mechanism-based yeast bioassay, Apocynaceae, Simaroubaceae, Magnoliaceae, Michelia champaca L.
iii
ABSTRACT
TOPOISOMERASE INHIBITIONS ACTIVITY OF SEVERAL
INDONESIAN PLANTS OF APOCYNACEAE, SIMAROUBACEAE,
MAGNOLIACEAE USING MECHANISM-BASED YEAST BIOASSAY
AND ACTIVE COMPOUND ISOLATION OF SELECTED PLANT
By:
Ade Zuhrotun
NIM 30712005
(Doctoral Study Program of Pharmacy)
Cancers is characterized by unregulated growth and spread of cells through
lymphatic system and bloodstream to other parts of the body. These cells growth
will continue and damage vital organs or eventually death. In the world wide,
cancer incidences increases from 12.7 million in 2008 to 14.1 million in 2012 and
it was predicted to be 25 million over the next two decades. In Indonesia, cancer
prevalence in 2013 was 1.4 ‰ or 347,792 people.
Combination of surgery, radiation therapy, and chemotherapy are the most chosen
therapy for cancer. Variation of cancer type for each patient, diseases stadium,
toxicity risks, side effects and drug resistances made cancer treatments often
difficult. So these conditions become opportunities and motivated the research for
new anticancer agents. Recently, 74 of 488 anticancer drugs that are released by
National Cancer Institute (NCI) of USA derived from plants. Whereas in
Indonesia 16 of 74 anticancer drugs that are currently used derived from plants.
The NCI has reported Families of Special Interest (FOSI) or plant families that are
active as anticancer or contain anticancer agents, such as Apocynaceae,
Simaroubaceae and Magnoliaceae. In Indonesia, about 63 species of
Apocynaceae, 11 species of Simaroubaceae and 18 species of Magnoliaceae are
grown and distributed in many areas.
Mechanism-based yeast bioassay is one of the in vitro assay that is used to search
anticancer agents from natural products. This assay’s result had correlation to a
mechanism of anticancer agents i.e topoisomerase enzyme inhibitor. Activity of
this inhibitor of Apocynaceae, Simaroubaceae and Magnoliaceae has not been
reported yet, so this research was aimed to screen some Indonesian plants of those
families and further to isolate active compound of selected plant.
Screening activity was tested on methanol bark extract of 15 species of
Apocynaceae, 3 species of Simaroubaceae and 2 species of Magnoliaceae against
S. cerevisiae mutant (DNA repair- or recombination deficient). The results
showed that extract of Kibatalia arborea (Blume) G. Don. and Michelia
champaca L. were active as topoisomerase I and II inhibitors. Extract of Plumeria
alba L., Tabernaemontana macrocarpa Jack., Wrightia pubescens Blume.,
i
Picrasma javanica Blume., Picrodendron baccatum Krug. & Urb. Ex. Urb., and
Quassia indica (L) Nooteboom were active as topoisomerase I inhibitors, while
extract of Ochrosia citrodora Lauterb & K. Schum and Michelia alba DC. were
active as topoisomerase II inhibitors.
Based on the screening, M. champaca extract was selected as the best choice that
showed as topoisomerase I and II inhibitors. It had toxic effect based on brine
shrimp lethality bioassay (LC50<1000 g/mL) and was activity as antifungi. Those
data showed that the plant had potential active as anticancer agent. So, the plant
was selected for its active compound isolation.
The extract of M. champaca was fractionated by liquid-liquid extraction (LLE).
Based on activity test results of topoisomerase inhibitor, using mechanism-based
yeast bioassay and bioautography TLC, showed that the target compound from the
fraction was spot number 5 (Rf 0.68) with chloroform-methanol (9:1) as
development system. The ethyl acetate fraction was further separated by
combination of fast column chromatography, followed by classical column
chromatography. At the end, purification process was done by recrystallization
using chloroform. The yellow needles crystal with melting point of 271.5-272.6
C, was named as MCET51 isolate.
Topoisomerase inhibitor activity of MCET51 then was also tested by mechanismbased yeast bioassay methods and enzymatic reaction to human topoisomerase I.
The result showed that the isolate was active as topoisomerase I and II inhibitors.
Characterization of MCET51 was done by UV-Vis, infrared spectrophotometric,
mass spectrometric and nuclear magnetic resonance spectroscopy of proton (1H),
carbon (13C), Heteronuclear Single Quantum Coherence (HSQC) and Heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy (HMBC) methods. Based on
characterization data compared to literatures, it can be concluded that MCET51
was liriodenine (C17H9NO3).
The activity of M. champaca extract and liriodenine as topoisomerase I and II
inhibitors using mechanism-based yeast bioassay were the first time reported by
this research. And the activity of liriodenine as topoisomerase I inhibitor using
enzymatic reaction to human topoisomerase I was the first time reported by this
research, whereas other research only reported liriodenin as topoisomerase II
inhibitor by different methods.
The results of this research was in line with NCI, that reported Apocynaceae,
Simaroubaceae and Magnoliaceae as FOSI or plant families that contained
anticancer agents. Isolated compound from selected plant Michelia champaca L.,
i.e liriodenine was proven as topoisomerase I and II inhibitors. These results can
be used as scientific evidence for further research to develop Indonesian plant as
herbal anticancer.
Keywords: Topoisomerase inhibitor, mechanism-based yeast bioassay, Apocynaceae, Simaroubaceae, Magnoliaceae, Michelia champaca L.
ii