pelatihan teknis dasar karantina tumbuhan
advertisement
MENGENAL TARGET PEST KARANTINA TUMBUHAN GOLONGAN BAKTERI Oleh LENNY HARTATI HARAHAP, SP. MSi (POPT Ahli Muda pada Balai Besar Karantina Pertanian Belawan) PENDAHULUAN Bakteri (dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel.Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi.Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks. Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia.Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi ada bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita.Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan).Beberapa jenis bakteri bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel. Jenis-jenis Bakteri Berdasarkan cara memperoleh makanannya, bakteri dapat digolongkan menjadi dua golongan yaitu bakteri heterotrof dan bakteri autotrof. a. Bakteri Heterotrof Bakteri ini hidup dengan memperoleh makanan berupa zat organik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa-sisa organisme lain. Bakteri yang mendapatkan zat organik dari sampah, kotoran, bangkai dan juga sisa makanan, kita sebut sebagai bakteri saprofit. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi dan mineral. Di dalam lingkungan bekteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan penyedia nutrisi 1 bagi tumbuhan. Jika Anda memperhatikan lingkungan tempat pembuangan sampah, sering terlihat adanya makanan yang membusuk. Itu disebabkan oleh bakteri pembusuk. Sedangkan dalam usus manusia terdapat juga bakteri yang hidup secara saprofit (menguraikan serat-serat pada makanan) dan menguntungkan adalah bakteri Escherichia coli. Selain bakteri heterotrof yang saprofit, ada juga yang bersifat parasit (merugikan) baik pada manusia, hewan maupun tumbuhan. Bakteri ini menyebabkan sakit (patogen). Beberapa contoh bakteri yang patogen di antaranya: b. Bakteri Autotrof Bakteri Autotrof adalah bakteri yang dapat menyusun zat makanan sendiri dari zat anorganik yang ada. Dari sumber energi yang digunakannya, bakteri autotrof (auto = sendiri, trophein = makanan) dibedakan menjadi dua golongan, yaitu: bakteri fotoautotrof dan bakteri kemoautotrof. 1. Bakteri fotoautrotof Bakteri fotoautrotof yaitu bakteri yang memanfaatkan cahaya sebagai energi untuk mengubah zat anorganik menjadi zat organik melalui proses fotosintesis. Contoh bakteri ini adalah: bakteri hijau, bakteri ungu. 2. Bakteri kemoautrotof Bakteri kemoautrotof adalah bakteri yang menggunakan energi kimia yang diperolehnya pada saat terjadi perombakan zat kimia dari molekul yang kompleks menjadi molekul yang sederhana dengan melepaskan hidrogen. Contoh bakteri ini adalah: Nitrosomonas. Nitrosomonas dapat memecah NH3 menjadi NH2, air dan energi. Energi yang diperoleh digunakan untuk menyusun zat organik. Contoh lain adalah Nitrosococcus dan Nitrobacter. Di samping itu pada tumbuhan kacangkacangan antara lain kacang tanah, pada akar tanaman tersebut kita temukan bintilbintil. Pada bintil-bintil akar tanaman tersebut merupakan tempat bakteri Rhizobium berada. Bakteri yang hidup pada bintil-bintil akar tanaman kacang-kacangan ini hidup bersimbiosis, dan bintil akar tumbuh karena rangsangan dari zat tumbuh yang dihasilkan oleh bakteri tersebut dan juga dapat menyuburkan tanah. Selain itu ada pula beberapa jenis bakteri yang mampu memfiksasi N2 (nitrogen bebas dari udara) di atmosfer ke dalam tanah, yang kemudian N2 ini akan dimanfaatkan oleh tumbuhan dalam pembentukan protein. Bakteri tersebut antara lain, Azotobacter vinelandi, Clostriddium pasteurianum dan Rhodospirillium rubrum Di samping terdapat bakteri yang dikelompokkan berdasarkan cara mendapatkan makanan, ada juga penggolongan bakteri berdasarkan sumber oksigen yang diperlukan dalam proses respirasi. Bakteri itu dikelompokan sebagai berikut: 1. Bakteri aerob, yaitu bakteri yang menggunakan oksigen bebas dalam proses respirasinya. Misal: Nitrosococcus, Nitrosomonas dan Nitrobacter. 2. Bakteri anaerob, yaitu bakteri yang tidak menggunakan oksigen bebas dalam proses respirasinya. Misal: Streptococcus lactis 2 Sedangkan berdasarkan kebutuhan terhadap oksigen, bakteri dikelompokkan lagi menjadi: 1. Bakteri aerob obligat: yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana mengandung oksigen. Misal: Nitrobacter dan Hydrogenomonas. 2. Bakteri anaerob obligat: yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana tanpa oksigen. Misal: Clostridium tetani. 3. Bakteri anaerob fakulatif: yaitu bakteri yang dapat hidup dengan atau tanpa oksigen. Misal: Escherichia coli, Salmonella thypose dan Shigella. Berdasarkan struktur sel, makhluk hidup secara garis besar dibagi atas 2 golongan yaitu Prokariot dan Eukariot. Berbeda dengan eukariot yang merupakan makhluk hidup multiselular, prokariot adalah makhluk hidup paling sederhana yang terdiri dari satu sel. Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dibidang genetika, makhluk hidup kemudian dibedakan atas 3 golongan besar (domain) berdasarkan sekuen nukleotida ribosomal RNA (Woese et al), yaitu Bacteria (eubacteria), Eucarya (eukaryotes) dan Archaea (archaebacteria). Dahulunya archaea dan bacteria berada dalam kelompok besar prokariota. Perbedaan Prokariot VS Eukariot : Penciri Prokariot Eukariot Nukleus Tiada(nukleoid) Ada(bermembran) Membran Sederhana Kompleks, invaginasi Kromosom Kromosomal DNA : Multiple, linier tunggal, sirkuler Ekstrakromosom (plasmid) : 1 atau lebih, sirkuler Diameter sel 1 -5 μm 10-100 μm Organel bermembran Tiada Ada(mitokondria, badan golgi, peroksisom) Ribosom 70S 70S dan80S Flagella Ada Microtubular Replikasisel Pembelahan biner Mitosis Peptidoglikan Ada Tiada Contoh Bakteri, Archaea Fungi,algae, nematoda, serangga, hewan, tumbuhan kloroplast, lisosom, Archaea adalah kelompok bakteri yang hidup dilingkungan ekstrim (lingkungan anaerobic, hipersalin, hidrothermal, geothermal ). Beberapa hidup pada temperatur melebihi 100 C, pada lingkungan yang sangat basa atau sangat asam, 3 atau pada air dengan konsentrasi garam yang ekstrim. menyerang tumbuhan. Archaea tidak ditemukan Klasifikasi Klasifikasi adalah meletakkan organisme kedalam kelompok taksonomik berdasarkan persamaan karakter yang dimiliki. Klasifikasi Bakteri Patogen Tanaman mengikuti Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition (1994) : KINGDOM PROKARIOT BAKTERI – Memiliki membran dan dinding sel Devisi I : GRACCILICUTES – Bakteri Gram negatif Klas : PROTEOBACTERIA – Umumnya bersel tunggal Famili : Enterobacteriaceae Genus : Erwinia Famili : Pseudomonadaceae Genus : Acidovorax, Pseudomonas, Rhizobacter, Xanthomonas, Xylophilus Famili : Rhizobiaceae Genus : Agrobacterium, Rhizobium Famili : Genus : Xylella Devisi II : FIRMICUTES – Bakteri Gram Positif Klas : FIRMIBACTERIA – Umumnya bersel tunggal Genus : Bacillus, Clostridium Klas : THALLOBACTERIA – bakteri bercabang Genus : Arthrobacter, Clavibacter, Curtobacterium, Rhodococcus, Streptomyces MOLLICUTES (Mycoplasma like organism (MLO) – hanya memiliki membran sel, dinding sel absen Devisi III: TENERICUTES Klas : Mollicutes Famili : Spiroplasmataceae Genus : Spiroplasma Famili : Genus : belum ditetapkan, dikenal sebagai phytoplasma (dulu disebut micoplasmalike organisms (MLO) Devisi IV: MENDISICUTE Klas : Archaeobacteria 4 Morfologi Morfologi bakteri sangat sederhana, sehingga sangat tidak mungkin hanya menggunakan morfologi sel untuk informasi taksonomi. Namun demikian morfologi tetap bernilai dalam taksonomi. Morfologi bakteri yang dipertimbangkan adalah : A. Bentuk sel - Umumnya berbentuk batang (rod shape) - Benang bercabang (filamentous) : Streptomyces - Seperti spiral (spirillum) : Spiroplasma - Tidak beraturan (pleomorphic) : Phytoplasma B. Ukuran Sel - Sangat kecil dan bervariasi : 1,0 - 5,0 x 0,5 - 1,0 µm, diameter 0,6 - 3,5 µm - Diamati dengan mikroskop pada pembesaran maksimum (100 X) - Detil struktur sel dapat diamati dengan menggunakan mikroskop elektron Tipikal sel bakteri dan bagian-bagiannya adalah seperti gambar di bawah ini. Struktur Sel bakteri dapat dibagi atas 3 bagian utama yaitu : 1. Dinding sel 2. Bagian internal berupa protoplasma yang mengandung : • Membran sel • Inclusion body • Mesosom • Ribosom • Nukleoid (DNA) 3. Bagian eksternal • • • Kapsul Flagela Pili 5 Dinding sel Dinding sel bakteri sangat tipis dan elastis ,terbentuk dari peptidoglikan yang merupakan polimer unik yang hanya dimiliki oleh golongan bakteri. Fungsinya dinding sel adalah- memberi bentuk sel, member perlindungan dari lingkungan luar dan mengatur pertukaran zat-zat dari dan ke dalam sel Teknik pewarnaan Gram adalah untuk menunjukan perbedaan yang mendasar dalam organisasi struktur dinding sel bakteri atau cell anvelope. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton. Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic space (hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi cairan atau gel yang mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan pewarna tandingan Safranin O, pewarna tersebut dapat diserap oleh dinding sel bakteri Gram negatif . Protoplasma Yaitu semua material yang terdapat didalam dinding sel a. Membran sel : Terdapat dibagian dalam dinding sel, terdiri dari phospholipid yang tersusun bilayer , dan mengandung berbagai protein yaitu: – Enzym untuk reaksi – Pori untuk proses difusi – Reseptor untuk transpor – Reseptors untuk mengenal, komunikasi, dan penempelan b. Sitoplasma : Merupakan cairan sel yang terdapat didalam plasma membran. Terdiri dari 80% air, ribosom, berbagai enzim, koenzim, senyawa organik (protein, lemak, karbohidrat, dll), senyawa anorganik. c. Ribosom : organel sel yang berfungsi sebagai pabrik protein d. Mesosome : Invaginasi dari plasma membran, dalam bentuk vesikel, tubule, atau lamela e. Nukleoid : Material genetik bakteri/kromosom bakteri/DNA , berbentuk circular (melingkar), membawa sifat yg mengatur viabilitas bakteri f. Plasmid : Material genetik non esensial, ekstra kromosom, berbentuk melingkar tetapi ukuran lebih kecil dari DNA, membawa sifat-sifat tambahan ketahanan terhadap antibiotik, ultra violet, patogenisitas, produksi bakteriosin, dll, tetapi tidak membawa sifat untuk viabilitas sel. Plasmid dapat berpindah antar bakteri, atau dari bakteri ke sel tanaman inang (contoh pada Agrobakterium tumefaciens) 6 Bagian eksternal a. Flagela Alat untuk bergerak, struktur utamanya adalah protein yang disebut flagellin, fleksibel, ukuran diameter10-15µm, panjang 10-20µm b. Pili/Fimbriae Merupakan alat untuk menempel pada permukaan (adhesin) substrat. Pili ada yang khusus digunakan untuk konjugasi, disebut pili sex. DNA bakteri dapat ditransfer dari satu sel bakteri ke sel bakteri lain selama proses konjugasi. c. Kapsul/envelope Merupakan selubung sel bakteri berupa extracellularpolysacharide (EPS). Berupa kapsul bila melekat erat pada dinding sel atau berupa lendir dengan struktur longgar Berfungsi sebagai pelindung sel dari kekeringan dan serangan mikroorganisme lain; alat untuk melekat pada permukaan; berperan dalam penyerapan ion selektif; dan dalam interaksi inang-patogen Reproduksi Reproduksi dengan pembelahan biner (1 sel membelah menjadi 2). Selama proses pembelahan, material genetik juga menduplikasi diri dan membelah menjadi dua, dan mendistribusikan dirinya sendiri pada dua sel baru. Bakteri membelah diri dalam waktu yang sangat singkat.Pada kondisi yang menguntungkan berduplikasi setiap 20 menit. Cara Reproduksi selain pembelahan biner antara lain : Konjugasi : reproduksi seksual dimana bakteri bertukar bahan genetik sebelum membelah diri, sehingga turunannya memiliki gen baru. Material genetik ditransfer melalui pili sex. Transformasi – bakteri mengambil gen dari bakteri lain yang telah mati dari lingkungannya Transduksi – virus menyisipkan gen baru ke dalam sel bakteri. Metoda ini digunakan dalam bioteknologi untuk menghasilkan bakteri yang dapat menghasilkan insulin. METODE DETEKSI DAN IDENTIFIKASI Pengamatan Visual dan Pengumpulan Informasi 1. Kenali identitas tanaman yang akan dianalisa Selain identitas tanaman, sebanyak mungkin informasi tentang pertanaman harus dikumpulkan, contohnya lokasi pertanaman, cara budidaya, cara irigasi, aplikasi pestisida, dan informasi iklim terbaru. 2. Kenali gejala dan tanda penyakit Kumpulkan informasi tentang penyebaran penyakit di pertanaman. Apabila mungkin, amati perkembangan gejala dari gejala awal sampai gejala lanjut. 3. Kumpulkan informasi secara nasional maupun regional tentang semua jenis penyakit yang dilaporkan menyerang tanaman dimaksud. 7 1. Gejala / Symptom Symptom adalah eksternal dan internal manifestasi dari penyakit pada tanaman. Bentuk atau pertumbuhan yang abnormal Kehilangan hasil menurunnya kualitas hasil atau nilai estetik dari produk tanaman. Dapat diamati pada bagian tanaman seperti bercak daun, hawar daun, bercak buah, busuk umbi,kanker batang, layu, kerdil,dll) Gejala berbeda untuk species pathogen dan tanaman inang yang berbeda. 2. Tanda / Signs Manifestasi keberadaan patogen pada jaringan tanaman sakit. Bisa berupa struktur tertentu yang dihasilkan oleh patogen atau hasil interaksi antara patogen dan tanaman inang. Sign penting untuk membuktikan gejala yang timbul disebabkan oleh patogen tanaman dan tidak karena faktor abiotik. Tanda serangan bakteri patogen tanaman bisa berupa ooze, pustul Karakter Morphologi dan Kultur • Kemurnian biakan bakteri sangat penting dalam determinasi • Morphologi Sel : - bentuk sel - motility - susunan flagella - struktur dinding sel - struktur lain : kapsul,endospore, intracellullar lipid • Morphology Kultur : - morphologi koloni - pigmen (diffussible/ nondifussible, fluorescent / non-fluorescen Morphologi Koloni 8 Sifat Physiologi dan Biokimia • Karakter morphology bakteri sangat sederhana sehingga sulit dipakai sebagai alat identifikasi • Perlu dilakukan serangkaian uji terpilih untuk mengetahui ada atau tidak ada enzym tertentu (uji biokimia dan physiologi) • Prosedur uji biasanya sudah standar dan dipakai secara luas. • Serangkaian uji yang spesifik diperlukan untuk identifikasi spesies atau subspesies. • Uji yang sangat umum lebih spesifik • Biakan harus murni sebelum melakukan berbagai uji. Isolasi Untuk melakukan identifikasi, suatu bakteri harus diisolasi. Media untuk isolasi atau media yang dipilih dan metode isolasi atau tahapan isolasi ditentukan berdasarkan bakteri yang dicurigai. Apabila gejala penyakit yang sama disebabkan oleh bakteri yang berbeda, maka media isolasi untuk kedua bakteri tersebut harus digunakan. Media umum untuk isolasi dapat digunakan untuk sebagian besar phytopatogenik bakteri dan biasanya digunakan bila penyakit belum diketahui penyebabnya. Media spesifik, media semi-selektif dan media diagnortik tersedia untuk hampir sebagian besar bakteri. Kandungan media bervariasi dan biasanya mengandung antibiotik untuk menekan bakteri non-target dan bakteri target menunjukan karakter diagnostik tertentu pada media tersebut. Media seperti ini digunakan untuk isolasi bakteri dari bahan perbanyakan tanaman dan dari tanaman sakit. Penyiapan media tersebut kadang-kadang sangat kompleks dan biasanya tidak rutin digunakan. Tetapi untuk isolasi beberapa patogen, seperti Erwinia spp dan Ralstonia solanacearum, disarankan menggunakan media khusus. Isolasi harus dilakukan dari bagian tanaman yang menunjukan gejala awal penyakit. Untuk kanker dan hawar, isolasi dari batas antara jaringan yang sakit dan sehat. Isolasi dari bercak harus dilakukan dari area kecil transparan ( water soaked), bukan dari dari bercak coklat atau nekrotik yang lebih luas. Bakteri sekunder dan cendawan biasanya terdapat dalam jumlah besar pada gejala lanjut. Mikroorganisme saprofit tersebut biasanya tumbuh lebih cepat pada media agar dari pada bakteri patogen, menghambat dan menyulitkan isolasi bakteri patogen yang menjadi target isolasi. Lakukan sterilisasi permukaan (bila perlu) dengan menggunakan 0,5% larutan sodium hypoclorit (NaOCl) atau alkohol 70% dengan merendam 30 – 20 menit (tergantung ketebalan dan tipe jaringan tanaman dan tingkat kontaminasi. Tanaman dengan gejala layu, daun yang sangat tipis atau daun yang telah kering sebaiknya tidak disterilisasi permukaan, tetapi dicuci dengan air mengalir. Setelah sterilisasi permukaan, bilas bahan tanaman sakit dengan air steril beberapa kali untuk menghilangkan sisa-sisa desinfektan. Bila tanaman mengandung tanah cuci terlebih dahulu. Bahan tanaman dibiarkan kering sebelum isolasi dilakukan. 9 Isolasi dapat juga dilakukan dengan melakukan maserasi jaringan tanaman sakit. Hasil maserasi digoreskan (streak plate) pada media yang sesuai dengan loop inokulasi untuk mendapatkan koloni tunggal. Cara lain adalah dengan meletakkan jaringan sakit pada tabung reaksi mengandung 2 -3 ml air steril, biarkan bakteri berdifusi pada suhu ruang selama 30 – 60 menit. Jika bakteri diduga adalah bakteri layu atau busuk lunak, atau bila terdapat saprofit dalam jumlah besar, sebaiknya dilakukan plating dengan pengenceran berseri. Pengenceran berseri 1 : 10 terhadap sap hasil maserasi dibuat dengan menggunakan air steril/buffer saline. Plating 0.1 ml dengan menyebarkan (spread plate) suspensi bakteri merata pada permukaan agar yang kering menggunakan L-glass rod. Koloni tunggal yang terpisah lebih mudah diperoleh dengan cara ini. Media yang sudah diinokulasi diinkubasi terbalik pada 25°C paling kurang 72 jam. Tahap pertama identifikasi patogen adalah membedakan antara bakteri phytopatogenik dan saprofitik dengan penampakan koloni pada media isolasi. Morfologi koloni, kecepatan tumbuh, warna dan penampilan bagi bakteri phytopatogenik pada media isolasi yang berbeda dapat menjadi penciri. Bakteri phytopatogenik biasanya tumbuh lebih lambat dari pada bakteri saprofitik dan koloni hanya muncul antar 36 – 72 jam. Beberapa bakteri yang lambat tumbuh memerlukan 7 hari atau lebih untuk bisa terlihat pada media agar. Jika media selektif digunakan, pertumbuhan patogen juga lebih lambat dibandingkan jika tumbuh pada media umum dan plate harus diinkubasi dan diamati setiap hari paling kurang 7 – 14 hari. Antibiotik pada media selektif memperlambat pertumbuhan patogen. Kultur yang murni sangat jarang didapatkan pada media untuk isolasi. Koloni dari patogen biasanya dominan jika isolasi dilakukan dari infeksi awal dan dari bahan tanaman yang masih segar. Bahan tanaman dengan gejala yang lanjut dan sampel yang terlalu lama disimpan sering diinvasi oleh cendawan dan bakteri saprofitik yang tumbuh cepat. Keberadaan saprofit sering meragukan karena penampilan yang menyerupai patogen. Contohnya Pantoea aglomerans dengan pigment kuning dan fluorescent saprofitik pseudomonads menyerupai patogenik xanthomonads dan pseudomonads. Media selektif atau semi selektif digunakan untuk memudahkan identifikasi awal dari koloni bakteri target. Media King’s B adalah media diagnostik, namun sangat memudahkan identifikasi awal terhadap Pseudomonads (pathogenik dan non-pathogenik) karena menghasilkan pigmen fluoresen biru sampai hijau bila diamati dibawah lampu near UV. Erwinia busuk lunak yang ditumbuhkan pada media dasar polypectat menghasilkan lubang pada permukaan media karena degradasi pectat oleh bakteri. Hydrolisis pati (zona terang disekeliling koloni) dan lypolisis Tween 80 (presipitasi kristal disekeliling koloni) digunakan untuk membedakan Xanthomonads. Beberapa koloni tunggal yang diduga patogen target dimurnikan dengan menggoreskan koloni bakteri pada media non-selektif menggunakan loop inokulasi. Inkubasi dan amati kemurniannya. Biakan murni ditunjukan dengan penampilan koloni yang seragam, baik bentuk, ukuran, dan warna koloni. Untuk mendapatkan isolat yang benar-benar murni perlu dilakukan beberapa kali penggoresan ulang dengan mengambil satu koloni tunggal. Bila isolat telah murni, dapat dilakukan 10 pengujian karakter bakteri seperti uji patogenisitas, morfologi, fisiologi dan biokimia. Bakteri yang telah teridentidikasi selanjutnya dapat dikoleksi dan disimpan. Flagella dan Motilitas Jumlah dan orientasi flagella adalah penting secara taxonomi. Pewarnaan flagella untuk mikroskop cahaya tersedia tetapi hasilnya kurang bagus. Mikroskop elektron sering digunakan untuk mempelajari flagelasi. Metode ”hanging drop” dapat digunakan untuk mengetahui flagelasi dan motilitas menggunakan mikroskop kompon. Gerakan berenang yang cepat dan tiba-tiba adalah karakter dari bakteri dengan polar flagela. Bakteri dengan peritrichous flagela memperlihatkan gerakan berenang yang lambat diikuti dengan gerakan berguling yang tidak beraturan. Berdasarkan flagela bakteri dapat dibedakan atas : - monotrich : satu flagela pada salah satu kutub - lopotrich : flagela banyak, pada salah satu kutub - amphitrich : flagela terdapat pada kedua kutub - peritrich : flagela terdapat diseluruh permukaan sel Pewarnaan Gram Pengujian Gram bakteri biasanya adalah pengujian yang paling awal dilakukan, karena pengelompokan berdasarkan uji Gram menentukan penggolongan besar bakteri. Pewarnaan Gram menunjukan perbedaan yang mendasar dalam organisasi struktur dinding sel bakteri atau amplop sel. Bakteri Gram positif mempunyai dinding sel relatif tebal, terdiri dari beberapa lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton. Bakteri Gram negatif mempunyai dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic space (diwarnai dengan abu-abu); adalah zone cairan atau gel yang mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. 11 Mayoritas bakteri patogen tanaman adalah Gram-negatif, aerobik, berbentuk batang atau Gram negatif, anaerobik fakultatif, berbentuk batang. Sebagian besar bakteri Gram positif tergolong Actinomycetes yang digolongkan kepada kelompok Coryneform dan Actinomycetales. Hanya sedikit bakteri tanpa dinding sel yang bersifat patogenik pada tanaman. Reaksi Gram, bentuk sel dan ukuran sel menentukan kriteria identifikasi selanjutnya untuk menentukan apakah bakteri kemungkinan patogen tanaman atau tidak. Gunakan biakan yang masih muda (24 jam) untuk pewarnaan Gram. Bakteri Gram Positif akan berwarna ungu gelap sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah. Diagram Prosedur Pewarnaan Gram : Aplikasi crystalviolet 1 menit Aplikasi Iodine 1menit Pencucian alkohol, 5-10 detik Aplikasi safranin, 30 detik 12 CATATAN: - Bakteri gram positif corynoform dan bakteri gram negatif patogen tanaman berbentuk batang - Sterptomyces mempunyai pertumbuhan seperti miselium - Bakteri Gram negatif dan Gram positif berbentuk kokus (cocci) dan bakteri berbentuk batang menghasilkan spora bukan bakteri pathogen tanaman. - Sel bakteri corynoform umumnya lebih kecil dari bakteri Gram positif lainnya (< 0.8 µl dengan konfigurasi yang unik (berbentuk L dan Y). Uji KOH Solubility Cara cepat untuk membedakan bakteri Gram-negatif dan Gram-positif adalah dengan menguji solubilitas bakteri pada KOH 3%. Jika suspensi bakteri berupa benang berlendir bisa terangkat oleh loop, bakteri adalah Gram negatif. Jika terbentuk suspensi encer, berarti bakteri Gram positif. Dengan metode ini kita tidak dapat mengetahui bentuk dan ukuran sel bakteri. Pengujian Karakter Fisiologi dan Biokimia Bakteri Karena morfologi tidak cukup untuk memberi informasi taxonomi, maka membedakan bakteri umumnya menggunakan karakter physiologi dan biokimia. Berbagai uji telah tersedia untuk karakterisasi bakteri sampai ketingkat spesies. Resep media dan standar prosedur pengujian banyak tersedia pada berbagai buku referensi al : 13 Introduction to Practical Phytobacteriology (Goszczynska et al, 2000); Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bakteria (Schaad et all. 2001), dll. Bakteri patogen tanaman penting antara lain dari genus Erwinia, Pantoea, Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Xanthomonas, Xylella, Agrobacterium, Clavibacter, Clostridium, Bacillus, dan Streptomyces. Beberapa uji sederhana untuk membedakan genus bakteri patogen tumbuhan seperti pada Tabel di bawah ini. Untuk pengujian sampai tingkat spesies diperlukan pengujian yang lebih mendalam terhadap sifat biokimia dari bakteri uji. Tabel 1. Kunci identifikasi genus bakteri patogen tanaman ( Shaad, 2001) Character Erw Pa Aci n Ps e Ra l Bu Xa Xyl Agr Cla Clo Ba r n c St r Gram positive - - - - - - - - - + + + + Grows anaerobically + + - - - - - - - - + + - Grows aerobically + + + + + + + + + + - + + Colonies yellow or orange on YDC, or NBY - +a - - - - +b +c - +d - - - Colonies mucoid on YDC at 30°C - - + - + - + - + + ND ND - Fluorescent pigment on KB - - - + - - - - - - - - - Diffusible nonfluorescent pigment on KB - - - - - + - - - - - - - Urease -e - + - + V - + N D - Oxidase - - + - + +f - - + - - + V Grows at 40°C - V + - - +g - - - - + + - More than four peritrichous flagella + + - - - - - - - - V V - Growth agar - - - - - - - - + - - - - Spore formed - - - - - - - - - - + + - Aerial mycellium - - - - - - - - - - - - + on D1M ND ND N D 14 Postulat Koch Karena bakteri tersebar luas di lingkungan sebagai epiphyt, keberadaan bakteri pada tanaman/bagian tanaman yang bergejala belum membuktikan bahwa bakteri adalah penyebab penyakit pada tanaman tersebut. Perlu dilakukan percobaan untuk membuktikan suatu bakteri sebagai penyebab penyakit. Kriteria untuk menentukan agen penyebab penyakit pertama kali didefinisikan oleh Robert Koch (1880) dan sekarang dikenal sebagai Postulat Koch, yaitu sebagai berikut : 1. Konstan asosiasi : Patogen harus selalu ditemukan bersosiasi dengan penyakit pada semua tanaman sakit yang diamati. 2. Isolasi : Patogen harus dapat diisolasi dan ditumbuhkan sebagai biakan murni pada media sintetis. 3. Inokulasi : Patogen dari biakan murni harus menghasilkan penyakit yang sama ketika diinokulasikan pada tanaman sehat. 4. Reisolasi : Patogen harus dapat diisolasi kembali dalam bentuk biakan murni dan karakternya harus persis sama dengan pengamatan pada tahap 2. Inokulasi bakteri pada tanaman inang untuk melihat apakah bakteri menimbulkan penyakit disebut juga dengan uji patogenisitas. Kemampuan suatu bakteri untuk menimbulkan penyakit pada suatu spesies atau kultivar tanaman tertentu merupakan kriteria penting dalam menentukan status spesies dan patovar bakteri. Uji patogenisitas dilakukan terhadap isolat bakteri dengan menginfiltrasi suspensi bakteri kedalam jaringan tanaman dan selanjutnya respon tanaman diamati. Reaksi Hipersensitif Kemampuan bakteri menyebabkan penyakit (pathogenicity) bisa diketahui dengan menginduksi penyakit pada tanaman inang (dengan menginfiltrasi bakteri kedalam tanaman inang) atau dengan reaksi hypersensitif (dengan infiltrasi bakteri pada tanaman bukan inang). Bila suatu bakteri patogen diinfiltrasi pada area terbatas pada daun tanaman maka akan terjadi 3 tipe raksi tergantung kepada jenis spesies atau patovar bakteri, yaitu : 1. Reaksi hypersensitif : terjadi kematian sel tanaman yang cepat, tanpa terjadi penyebaran bakteri ke jaringan sekitarnya. 2. Reaksi penyakit : respon inang lambat terhadap infiltrasi bakteri, sehingga bakteri menyebar pada bagian lain dari tanaman. Tanaman menjadi layu bahkan mati. 3. Tidak ada reaksi Reaksi hipersensitif tidak terjadi dengan bakteri non-phytopatogenik. Kemampuan bakteri tanaman menghasilkan HR pada tanaman non-inang,dapat digunakan sebagai uji patogenisitas dari isolat bakteri patogen. HR dapat digunakan untuk hampir semua bakteri patogen tanaman termasuk yang menyebabkan penyakit nekrotik, layu, dan beberapa bakteri penyebab busuk lunak. HR biasanya tidak terjadi dengan bakteri erwinia busuk lunak, kelompok agrobacteria dan Pseudomonas savastanoi subsp. savastanoi dan patogen oportunistik seperti Pseudomonas marginalis. 15 Reaksi hypersensitif adalah respon resistensi tanaman untuk melokalisasi bakteri sehingga tanaman dapat mengatasi serangan berbagai jenis bakteri yang berpotensi menyebabkan penyakit. Tanaman tembakau biasanya digunakan untuk uji HR, karena daunnya mudah untuk diinfiltrasi, dan tanaman mudah dipelihara pada kondisi laboratorium. Inokulum bakteri pada fase pertumbuhan aktif (log phase) dengan konsentrasi 10 8 – 109 sel/ml diinfiltrasi ke dalam ruang interselular daun menggunakan syring. Reaksi nekrotik yang terlokalisir berwarna pucat atau dan merah perunggu muncul dalam jangka waktu 24 jam setelah infiltrasi bakteri. Untuk bakteri kelompok xanthomonads reaksi tembakau kurang bagus, dan dapat digantikan dengan tanaman tomat dan cabe. Gbr. 1. Respon daun terhadap infiltrasi bakteri menyebabkan reaksi kompatibel, inkompatibel dan saptofitik, tergantung kepada spesies atau patovar bakteri (Siegee, 1984) 16 Deteksi dan Identifikasi Bakteri Patogen Tanaman dengan Cara Cepat Deteksi dan identifikasi dengan cara konvensional memerlukan waktu yang lama karena memerlukan proses isolasi, uji morfologi, physiologi dan biokimia, bahkan uji patogenisitas. Untuk laboratorium karantina tumbuhan yang memerlukan pengujian yang cepat dan akurat identifikasi bakteri dengan metode konvensional terlalu lambat sehingga alternatif pengujian dengan metode yang modern, cepat dan akurat sangat diperlukan. Namun demikian, pengujian konvensional tidak boleh ditinggalkan, terutama sebagai pembuktian ilmiah yang diterima secara luas oleh dunia internasional terhadap keberadaan dan status bakteri patogen tanaman. Teknik pengujian yang dapat menjadi alternatif antara lain pengujian dengan teknik serologi dan PCR dimana bakteri tidak perlu diisolasi dari sampel tanaman, sehingga sangat menghemat waktu pengujian. Uji serologi dengan teknik ELISA sangat populer untuk deteksi bakteri yang menyerang tanaman/bagian tanaman, dimana pengujian dalam dilakukan untuk jumlah sampel yang besar. Pengujian ELISA dan uji serologi lainnya adalah berdasarkan reaksi antara antibody dan antigen. Sedangkan pengujian dengan teknik PCR adalah berdasarkan amplifikasi DNA patogen secara invitro dengan menggunakan primer yang spesifik. Pengujian dengan sistem Biolog sangat membantu identifikasi isolat murni bakteri secara cepat karena hanya memerlukan satu hari inkubasi terhadap suspensi bakteri di dalam mikroplate yang telah dicoating dengan 96 jenis substrat biokimia yang terseleksi. Bakteri yang berbeda memiliki kemampuan yang berbeda dalam memanfaatkan berbagai jenis sumber karbon sebagai sumber karbon tunggal. Reaksi dibaca dengan reader. Pola pertumbuhan bakteri menghasilkan profil metabolik/fingerprint dari mikroorganisme dibandingkan dengan database pada software Biolog untuk menetapkan spesies bakteri yang diuji. Sistem ini mampu mendeteksi sampel mikroorganisme dari jenis bakteri, yeast, dan cendawan, dimana lebih dari 2000 database tersedia. Analisa asam lemak dinding sel bakteri/fame (fatty accid methyl ester) dengan menggunakan peralatan GC (gas chromatography), merupakan salah satu cara cepat untuk identifikasi bakteri yang telah berupa isolat murni. Pola fatty acid yang dihasilkan dengan software yang tersedia secara otomatis dibandingkan dengan database. Sherlock MIDI System, salah satu produk alat identifikasi cepat asam lemak bakteri, mampu mendeteksi sampel mikroorganisme dari jenis bakteri, yeast, dan cendawan, memiliki 2000 database berdasarkan pola chromatography mikroorganisme. 17 PENGENALAN GEJALA PENYAKIT TANAMAN YANG DISEBABKAN OLEH BAKTERI Gejala penyakit tanaman yang disebabkan oleh bakteri dapat diklasifikasikan menjadi 4 kelompok utama : 1. Kematian cepat sel-sel jaringan tanaman yang diinvasi oleh bakteri patogen yang menimbulkan terakumulasinya pigmen gelap, seperti hasil oxidasi polyphenols dan melanin seringkali berasosiasi dengan khlorosis disekitar jaringan. Contoh : bercak nekrotik (spot), hawar (blight), dan canker Bakteri penyebab : kelompok xanthomonads dan pseudomonads Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, penyebab leaf spot pada tomat dan cabe Pseudomonas syringae pv. tabaci, penyebab angular leaf spot dan wildfire pada tembakau Xanthomonas axonopodis penyebab pustul pada kedelai Xanthomonas oryzae pv oryzae penyebab Bacterial Leaf Blight pada padi Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, hawar pada anthurium Xanthomons campestris, hawar pada ketela pohon Xanthomonas axonopodis pv citri pada jeruk (citrus canker) Gejala Xanthomonas campestris pv. vesicatoria pada tomat (Plant Protection Service, Wageningen, Cabi 2005) 2. Invasi yang progresif jaringan vaskular yang diikuti oleh nekrosis jaringan yang berdekatan yang bisa menyebabkan layunya tanaman inang. Contoh : layu pembuluh, menguning Bakteri penyebab : Clavibacter michiganensis (subsp. michiganensis, subsp. insidiosum, subsp. sepedonicus ), Pantoea stewartii, Erwinia tracheiphila, Ralstonia solanacearum, dan Xylela fastidiosa 3. Hancurnya jaringan tanaman karena hancurnya sel, yang dikenal sebagai gejala busuk lunak (soft-rot). Contoh : busuk lunak Bakteri penyebab : Xanthomonas campestris pv. campestris, Erwinia carotovora (subsp. atroseptica, subsp. caratovora), Erwinia chrysanthemi, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicum. 18 Busuk Lunak pada kentang disebabkan oleh Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Cabi, 2005) 4. Abnormalitas pembelahan, pemanjangan, dan perkembangan sel, menghasilkan pertumbuhan berlebihan (overgrowths) Contoh : tumor, nodule (bintil), and fasiasi. Bakteri penyebab : Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Rhodococcus fascians, Pseudomonas savastanoi subsp. Savastanoi Gejala puru pada pangkal batang mawar dan mossy gall pada bunga oleh Rhizobium radiobacter (Nigel Cattlin/Holt Studios International dan Larry W. Moore, Cabi 2005) Iustrasi gambar berikut adalah jenis gejala yang ditimbulkan oleh kelompok genus bakteri penting patogen tanaman. 19 Tabel berikut dapat menjadi kunci diagnosis bakteri penyebab penyakit tanaman berdasarkan gejala khas pada tanaman inang. Inang Kacang tanah Kubis Cabe Kedelai Tomat Ubi kayu Gejala Kemungkinan Penyebab Layu Ralstonia solanacearum Necrosis tepi daun, menguning Busuk batang X. campestris pv. campestris Spot daun Layu Spot buah X.campestris pv. vesicatoria Psudomonas solanacearum X.campestris pv. vesicatoria Spot daun (hawar) Pustul P. syringae pv. syringae X. campestris pv. glycines Layu pembuluh Spot buah Canker dan layu Ralstonia solanacearum X.campestris pv. vesicatori Clavibacter michiganensis michiganensis Spot daun Layu Erwinia carotovora subsp. X. campestris pv. manihotis X. campestris pv. manihotis Layu, necrosis Ralstonia solanacearum Pisang Padi Spot daun, batang Daun bergaris Daun menguning Psudomonas avenae X. oryzae pv. oryzicola X. oryzae pv. oryzae Spot daun Pseudomonas andropogonis Sorgum Layu Erwinia stewartii Clavibacter michiganensis subsp. nebrakensis Jagung Busuk batang Busuk akar Erwinia chrysanthemi Clavibacter michiganensis subsp. nebrakensis Layu Jahe Ralstonia solanacearum 20 Bakteri yang menguntungkan adalah sebagai berikut : 1. Pembusukan/penguraian sisa-sisa mahluk hidup contohnya Escherichia colie 2. Pembuatan makanan dan minuman hasil fermentasi contohnya : Acetobacter pada pembuatan asam cuka Lactobacillus bulgaricus pada pembuatan yoghurt Acetobacter xylinum pada pembuatan nata de coco Lactobacillus casei pada pembuatan keju yoghurt. 3. Berperan dalam siklus nitrogen sebagai bakteri pengikat nitrogen yaitu Rhizobium leguminosarum yang hidup bersimbiosis dengan akar tanaman kacang-kacangan dan Azotobacter chlorococcum. 4. Penyubur tanah contohnya Nitrosococcus, Nitrosomonas dan Nitrobacter yang berperan dalam proses nitrifikasi mengikat Nitrogen bebas di udara dalam bentuk akhir ion nitrat yang dibutuhkan tanaman. Proses nitrifikasi sebenarnya terdiri dari dua tahap yaitu : Nitritasi : oksidasi amonia (NH3) menjadi nitrit (NO2-) oleh bakteri nitrit. Proses ini dilakukan oleh kelompok bakteri Nitrosomonas dan Nitrosococcus. Nitratasi : oksidasi senyawa nitrit menjadi nitrat (NO3-) oleh bakteri nitrat. Proses ini dilakukan oleh kelompok bakteri Nitrobacter 5. Penghasil antibiotik contohnya adalah : Bacillus polymyxa penghasil antibiotik untuk pengobatan infeksi bakteri gram negatif Bacillus subtilis penghasil antibiotik untuk pengobatan infeksi bakteri gram positif Streptomyces griseus penghasil antibiotik streptomisin untuk pengobatan TBC 6. Pembuatan zat kimia misalnya aseton dan butanol oleh Clostridium acetobutylicum 7. Berperan dalam proses pembusukan sampah dan kotoran hewan sehinggga menghasilkan energi alternatif metana berupa biogas. Contohnya methanobacterium 8. Penelitian rekayasa genetika dalam berbagai bidang.sebagai contoh dalam bidang kedokteran dihasilkan obat-obatan dan produk kimia bermanfaat yang disintesis oleh bakteri, misalnya enzim, vitamin dan hormon. Bakteri yang merugikan sebagai berikut : 1. Pembusukan makanan contohnya Clostridium botulinum 2. Penyebab penyakit pada manusia contohnya : 21 Mycobacterium tuberculosis penyebab penyakit TBC Vibrio cholerae penyebab kolera atau muntaber Clostridium tetani penyebab penyakit tetanus Mycobacterium leprae penyebab penyakit lepra 3. Penyebab penyakit pada hewan contohnya Bacilluc antrachis penyebab penyakit antraks pada sapi 4. Penyebab penyakit pada tanaman budidaya contohnya : Pseudomonas solanacearum penyebab penyakit pada tanaman tomat, lombok, terungdl 22 DAFTAR PUSTAKA Agrios, G. N. 1997. Plant Pathology, 4th Ed. Academic Press. Crowtherm JR. 1996. ELISA-Theory and Practice. IST Publishers, Singapure. Goszczynska, T, Serfontein JJ, Serfontein S. 2000. Introduction to Practical Phytobacteriology. Safrinet, Pretoria.Kiado, Budapest. Lelliott RA and Stead DE, 1987. Methods for Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Riza, D. 2011, Identifikasi Bakteri Penyakit Tumbuhan, Modul Pelatihan Teknis Dasar Karantina Tumbuhan, Jakarta Schaad NW, Jones JB and Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. APS Press, St. Paul, Minessota. Shivas R, et al. 2005. Management of Plant Pathogen Collection. Australian Government - Departement of Agriculture, Fisheries and Forestry. Sigee, DC. 1993. Bacterial Plant Pathology : Cell and Molecular Aspects. Cambridge University Press, Cambridge. 23 24
