Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA Genom Nyamuk

PengukuranKonsentrasi.....................(HasridaMustafa,et.al)
PengukuranKonsentrasidanKemurnianDNAGenomNyamuk
Anophelesbarbirostris
GenomicDNAConcentrationandPurityMeasurementof
Anophelesbarbirostris
a,
b
HasridaMustafa *,IndraRachmawati ,YusranUdin
a
a
BalaiLitbangP2B2Donggala,BadanLitbangKesehatan,KementerianKesehatanRI,Jl.MasitudjuNo.58
LabuanPanimba,Labuan,Donggala,SulawesiTengah,Indonesia
b
BadanPengkajiandanPenerapanTeknologi(BPPT),JalanMH.Thamrin8,Jakarta10340
INFOARTIKEL
ArticleHistory:
Received:2Dec.2015
Revised:24May2016
Accepted:8June2016
Keywords:
Measurement
DNAConcentration
DNApurity
Anophelesbarbirostris
Katakunci:
Pengukuran
KonsentrasiDNA
KemurnianDNA
Anophelesbarbirostris
ABSTRACT/ABSTRAK
ThepurityandconcentrationofDNAinformationfromsomesampleareimportantto
measurethedegreeofcontamination.Anophelesbarbirostrismosquitoessamplesfrom
KalukutingguVillagewasextractedtoobtainthegenomeDNAusingPureLinkGenomic
DNA mini Kits. The purity and concentration of DNA Anopheles barbirostris was
measured by using nano spectrophotometer. The results showed that DNA
concentrationwas17,33–34,79ug/ml,andtheirpuritywere1,90average.Thepurity
and concentration of the DNA from the samples showed were not contaminated and
eligibleforthenextstep,thatisDNAamplification.
Informasi mengenai konsentrasi dan kemurnian DNA sangat diperlukan untuk
mengetahuiderajatkontaminasisuatusampel.TelahdilakukanekstraksigenomDNA
Anopheles barbirostris dengan metode PureLinkTM Genomic DNA mini Kits untuk
mendapatkan DNA genom yang kemudian diukur konsentrasi dan kemurniannya.
SampelnyamukAnophelesbarbirostrisyangdigunakanberasaldaridesaKalukutinggu
dan Palolo. Pengukuran konsentrasi DNA dilakukan dengan menggunakan nano
spectrofotometerdandiperolehkonsentrasiDNAsekitar17.33-34.79µg/mldengan
tingkat kemurnian rata-rata 1,90. Hasil Konsentrasi dan kemurnian DNA An.
barbirostrismenunjukkanrata-ratasampeltidakterkontaminasidanmemenuhisyarat
untukdilakukanprosesselanjutnyayaituamplifikasiDNA.
©2016JurnalVektorPenyakit.Allrightsreserved
*AlamatKorespondensi:email:[email protected]
PENDAHULUAN
Anopheles barbirostris Van der Wulp
merupakan nyamuk yang berperan sebagai
vektor penyakit, diantaranya penyakit
1
malaria, filariasis dan arbovirusis. An.
barbirostris tersebar di wilayah Sumatera,
2
Jawa, Kalimantan dan Sulawesi. An.
barbirostrisjarangdijumpaimenghisapdarah
orangdiSumateradanJawatetapidiSulawesi
danNusaTenggaraTimur(NTT)banyakyang
tertarik menghisap darah orang sehingga
berperanbesarsebagaivektor.3
Pemeriksaan nyamuk secara molekuler
dapat digunakan sebagai alternatif untuk
mengidentifikasi nyamuk yang berperan
sebagai vektor. Mengingat ukuran nyamuk
yang kecil, sehingga tidak mudah untuk
4
memperolehDNAtotalyangberkualitasbaik.
Ekstraksi dan pemurnian DNA pada
dasarnya merupakan serangkaian proses
pemisahan DNA dari komponen-komponen
sellainnya.EkstraksiuntukmemperolehDNA
yang berkualitas tinggi merupakan kaidah
dasar yang harus dipenuhi dalam analisis
molekuler dan merupakan salah satu faktor
keberhasilan dalam amplifikasi DNA yang
akan digunakan dalam analisis karakter
5-7
genetika. Ekstraksi yang baik didukung oleh hasil
kuantitas DNA ekstrak yang diperoleh.
7
JurnalVektorPenyakit,Vol.10No.1,2016:7-10
PengukurankuantitasDNAdilakukandengan
metode spektrofotometri menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang
(λ) 260 dan 280 nm.8 Kemurnian DNA
ditentukan dengan menghitung rasio
absorbansi pada A260 dengan A280 (Ratio
A260:A280). Molekul DNA dikatakan murni
jikarasioabsorbansinyaberkisarantara1,8–
9
2,0. Informasi mengenai konsentrasi dan
kemurnian DNA sangat diperlukan untuk
mengetahui derajat kontaminasi suatu
sampel dan apakah sampel tersebut baik
untukdigunakanpadatahapselanjutnya.Oleh
karena itu, dilakukan pengukuran terhadap
ku a n t i t a s b a i k ko n s e n t ra s i m a u p u n kemurnianDNAgenom.10
sebanyak200µlkemudianvortexselamalima
detik. Sebanyak 200 µl ethanol 96-100%
ditambahkankedalamsetiaptubekemudian
vo r t e x s e l a m a l i m a d e t i k , L a r u t a n dipindahkankedalamtubekePureLinkTMspin
column. Kolom disentrifus pada kecepatan
1000 g, selama 1-3 menit. Tube koleksi
dibuang dan pindahkan spin column ke tube
koleksiyangbaru.LimaratusmikroliterWash
Buffer ditambahkan ke spin column dan
disentrifuspadakecepatan12.000rpm,suhu
ruang selama lima menit. Tube koleksi
selanjutnya dibuang dan spin column
ditempatkan ke eppendorf tube dan
ditambahkan Elution Buffer sebanyak 25µl. Inkubasi di suhu ruang selama satu menit. Sentrifus kolom pada kecepatan maksimal
(12.000 rpm) pada suhu ruang selama 1-3
menit.
Eppendorf tube yang mengandung
BAHANDANMETODE
DNA, dipindahkan ke kolom eppendorf tube
Proses ektraksi DNA dilakukan
TM yang baru dan penambahan Elution Buffer
menggunakan prosedur kerja PureLink
diulangi. Tube disentrifus pada kecepatan
Genomic DNA mini Kits dari invitrogen.1
maksimal (12.000 rpm) pada suhu ruang
PureLinkTM Genomic DNA mini Kits adalah
selama 1-2 menit. Tabung spin column
paket ekstraksi DNA yang terdiri atas Lysis
dibuang dan larutan berisi DNA pada
Buffer,DigestionBuffer,WashBuffer1,Wash
Eppendorf tube dicek konsentrasi DNA
Buffer2,ElutionBuffer,Rnase,ProteinaseK.
menggunakan nano spectrofotometer (NDKit PureLink® Genomic DNA menggunakan
1000v3.5.2)padapanjanggelombangA260
kolomyangprinsipkerjanyadidasarkanpada
danA280.
ikatanselektifDNApadamembranberbahan
silika dan garam chaotropic sehingga dapat
mengikatdanmelepaskanDNAlebihefisien. HASIL
HasilkonsentrasiDNAgenomnyamukAn.
Lysisbufferpadakitinitelahdioptimasiuntuk meningkatkanaktivitasproteinaseKsebagai barbirostrisdariDesaKalukutinggurata-rata
enzim yang membantu dalam denaturasi sebesar 17.33 - 26.78 µg/ml, paling rendah
pada sampel satu dan paling tinggi pada
protein.
Sampel nyamuk dimasukkan ke dalam sampel tiga. Hasil konsentrasi DNA genom
eppendorf tube (satu ekor nyamuk per nyamuk An. barbirostris di desa Palolo rataeppendorf tube) ditambahkan PBS 20 µl dan rata sebesar 19.91 - 34.79 µg/ml. Paling
digerus dengan pellet pestle sampai hancur. rendahpadasampelAdanpalingtinggipada
Tambahkan 180 µl Genomic Digestion Buffer sampelB.
Nilai tersebut diperoleh dari hasil
dan 20 µl proteinase-K, divortex dan
absorbansi
panjang gelombang A260 yang
diinkubasipadadrybath(Thermolyne)selama
0
ditunjukkan
pada alat spektrofotometer,
duamalamdengansuhu55 C.Setelahjaringan
sehinggadiketahuikonsentrasiDNAsampel1
lisis, campuran disentrifus pada kecepatan
maksimal (12.000 rpm) pada suhu ruang adalah = 17.33 µg/ml yaitu dengan
selama sekitar lima menit. Supernatan menggunakanrumus:
diambildandipindahkeeppendorftubeyang
Konsentrasisampel=A260xfaktorpengenceranx50
baru,ditambahkanRNAseAsebanyak20µlke
dalamsetiaptube,kemudiandivortexselama
Untuk perhitungan sampel lainnya
limadetik,inkubasidisuhuruangselamadua
menggunakan rumus yang sama. Sedangkan
menit.Selanjutnyadilakukanpenambahanke
untukKemurnianDNAdilihatdarinilairasio
tiap tube Genomic Lysis/Binding Buffer
8
PengukuranKonsentrasi.....................(HasridaMustafa,et.al)
Tabel1.HasilPengukuranKonsentrasiDNAgenomAn.barbirotris
Panjanggelombang
Sampel
Konsentrasi
Rasio
(µg/ml)
Absorbansi
A 260 A 2 80
5
4.78¹ 4.596
5¹ .77
6.6³ 6
4.7³ ¹ 4.667
5³ .² 8
5.¹ ² 7
4.97⁰ 4.6⁰ ⁰ 6⁰ .¹ ² 6.45
8
4.86¹ 4.68¹ 65.7¹ 5.¹ 7
9
4.8⁰ ² 4.67⁰ 67.86
5.³ ² ⁰
4.86⁰ 4.678
65.76
5.² 6
A
4.7³ ² 4.655
5³ .³ 5
5.² ³ B
4.⁰ ³ ⁰ 4.7¹ ¹ 78.¹ ³ 5.² 8
C
4.959
4.6¹ ¹ 69.¹ ⁰ 5.² ⁰ D
4.95² 4.6² 6
69.² ² 5.² 7
E
4.8¹ ² 4.68⁰ 67.² ³ 5.³ 8
F
4.968
4.6¹ 6
6⁰ .65
5.³ 6
(R)
ÇĮ Ô:1-6:SampelnyamukAn.barbirostrisdariDesaKalukutinggu; A-F:sampelnyamukAn.barbirostrisdariDesaPalolo.
absorbansi(R)A260
/A280.
Dari hasil pengukuran kemurnian DNA
genom nyamuk An. barbirostris diperoleh
berkisar1,78–2,29dengankemurnianratarata1,9.
PEMBAHASAN
Banyaknya radiasi ultraviolet yang
diserap oleh larutan DNA berbanding lurus
dengan banyaknya DNA dalam sampel
nyamuk yang diektraksi. Penyerapan sinar
ultraviolet oleh nukleotida secara maksimal
dapatdicapaipadapanjanggelombangA260
nm, sedangkan penyerapan sinar ultraviolet
maksimal oleh protein dicapai pada panjang
gelombangA280nm.6
HasilpengukurankemurnianDNAgenom
nyamukAn.barbirostrishanyaadaduasampel
yang kemurniannya diatas dua. Rasio
kemurnian DNA d atas dua menunjukkan
masihadanyasisabufferyangterbawaselama
i
10,12
proses isolasi.
Hasil yang sama juga
diperoleh pada penelitian Hasmiwati pada
nya m u k An . b a l a b a ce n s i s d i p e ro l e h konsentrasi DNA 8,25-71,25 µg/ml dan
13
KemurnianDNAyangberkisar1,59-2,1. Perbedaan tempat pengambilan sampel
tidak terlalu berpengaruh pada kemurnian
DNAyangdihasilkan.KonsentrasiDNAantara
nya m u k A n . b a r b i r o s t r i s d a r i D e s a Kalukutinggu dan Desa Palolo tidak
menunjukkanperbedaanyangsignifikan.Hal
ini dapat dilihat dari hasil rata-rata yang
diperoleh.Beberapahalyangsangatberperan
dalam mempengaruhi konsentrasi dan
kemurnian DNA yang dihasilkan adalah
metode ektraksi yang digunakan, rusaknya
DNA dan adanya zat pengotor/kontaminan
sepertifenolatauproteinlainnya.7
KESIMPULAN
Konsentrasi dan kemurnian DNA An.
barbirostris rata-rata 1,9 menunjukkan
sampel tidak terkontaminasi dan memenuhi
syarat untuk dilakukan proses selanjutnya
yaituamplifikasiDNA.
SARAN
Waktu yang diperlukan dalam tahap
pencucian pada proses ektraksi DNA tidak
bolehlebihdarilimamenit,karenapencucian
yangterlalulamadapatmempengaruhihasil
ekstrakyangdihasilkan.
9
JurnalVektorPenyakit,Vol.10No.1,2016:7–10
6. Tenriulo A, Suryati E, Parenrengi A. Ekstraksi
UCAPANTERIMAKASIH
DNA Rumput Laut Kappaphycus alvarezii
Terimakasihpenulisucapkankepadatim
Dengan Metode Fenol Kloroform. Mar. Chim.
PembinaRisbinkesdrg.FaridaSoetirta,Prof.
Acta.2001;2(2):6–10.
Amrul Munif, Prof. Emiliana Tjitra,
7. Sari septi kurniama, Mazieda muthia naila,
DR.Susilowati Herman yang telah
ListyoriniD,sulasmiekosri.OptimizationOf
memberikanbimbingansertamasukandalam
Dna Isolation And Purification Technique
penelitian ini. Terima kasih pula kepada
From Chili Pepper ( Capsicum frutescens )
teman-temandiBalaiLitbangP2B2Donggala
UsingGenomicDNAMiniKit(Plant)Geneaid.
atassarandanmasukandalampenelitianini.
Semin. Nas. XI Pendidik. Biol. FKIP UNS.
2014:65–70.
Terima kasih kepada Sekretariat Risbinkes
Badan Litbangkes atas izin dan dukungan 8. Darmono TW. Analisis keragaman genetik
Ganoderma spp . yang berasosiasi dengan
pembiayaan oleh DIPA Sekretariat badan
tanaman
kakao dan tanaman pelindungnya
Litbangkes.
menggunakan Random Amplified
PolymorphicDNA(RAPD).2011;79(1):6–14.
DAFTARPUSTAKA
9. Novita L. Analisis genetik karakter morfo1. BoesriH.PerananAnophelesbarbirostrisVan
agronomi jarak pagar hasil pemuliaan
Der Wulp Sebagai Penular Penyakit. BALABA.
berbasis pendekatan kuantitatif dan
2011;vOL7NO1:7–15.
molekuler.Tesis.2013:1–50.
2. Elyazar IRF, Sinka ME, Gething PW, et al. The 10. Amanda U darmania, Cartealy imam civi.
distributionandbionomicsofanophelesmalaria
IsolasiRNAtotaldarimesokarpbuahkelapa
vectormosquitoesinIndonesia.1sted.Elsevier
sawit (Elaeis guineenssis Jacq. var. Tenera).
L t d . ; 2 0 1 3 : 1 7 3 – 2 6 6 . Av a i l a b l e a t : Proceeding Semin. Nas. Masy. Biodivers.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2387
Indones. 2015;1 Nomor 2(April):171–176.
6873.AccessedMay17,2016.
A
v
a
i
l
a
b
l
e
3.NoshirmaM,WillaRW,WayanN,etal.Nyamuk
at:http://biodiversitas.mipa.uns.ac.id/M/M
Anophelesbarbirostris.MediaLitbangKesehat.
0101/M010101.pdf. Accessed October 25,
2012;22Nomor4:161–166.
2015.
4. Santoso,yahya, Nungki hapsari suryaningtyas 11. Invitrogen.UserManual :PureLinkGenomic
katarinasrirahayu.DeteksimikrofilariaBrugia
DNA Mini Kits for purification of Genomic
malayi pada nyamuk Mansonia spp dengan
DNA,invitrogen.In:;2007:8–9.
pembedahan dan metode PCR di Kabupaten 12.Kate-ngamS,LakoteP.Acomparativestudyof
Tanjung Jabung Timur. Aspirator. 2015;7 No
different RAPD-PCR protocols for genetic
1(April):29–35.
diversity analysis of Doritis germplasm.
5 . M u h a m m a d R , M u k r i m i n , G u s m i a t y. 2008;39(3):203–206.
OptimalisasiTeknikEkstraksidanIsolasiDNA 13. Hasmiwati, Sujadi, F.A S. Analisis Genetik
Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk
Anopheles balabacensis Baisas (Diptera :
Analisis Keragaman Genetik berdasarkan
Culicidae) dari Daerah Bangko (Jambi) dan
RandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD).
Purworejo (Jawa Tengah) Dengan Random
J.NaturIndones.14(2),Februari2012138-142
Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR.
ISSN1410-9379.2012;2:138–142.
Maj.Kedokt.Andalas.2006;30No2:70–80.
10