Ketrampilan Dasar Laboratorium

Ketrampilan Dasar Laboratorium
Program Studi Ilmu Biomedik 2011
2011
Kuliah 5: Oktober 10
Masalah regresi linear dari praktikum minggu
yang lalu
Sentrifugasi
Pemurnian makromolekul
DNA
protein
Teknik PCR
Praktikum 5: Isolasi DNA dan PCR
Grafik dan Regresi Linear
Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada
Panjang Gelombang sama dengan 600nm
4.0
Group meja 1
3.5
Group meja 3
Serapan
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
500
600
Grafik dan Regresi Linear
Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada
Panjang Gelombang sama dengan 600nm
y = 0.0025x + 1.9355
R² = 0.0843
4.0
3.5
Serapan
3.0
2.5
2.0
Group meja 1
1.5
1.0
Group meja 3
0.5
Linear (Group meja 1)
0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
Bagian data yang berbanding lurus
500
600
Grafik dan Regresi Linear
Hasil Serapan Beberapa Sempel Urea yang diukur pada
Panjang Gelombang sama dengan 600nm
4.0
3.5
y = 0.0825x - 0.0593
R² = 0.9902
Serapan
3.0
2.5
2.0
Group meja 1
1.5
Group meja 3
1.0
meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl
0.5
Linear (meja 1 dibawa konsentrasi 60mg/dl)
0.0
0
100
200
300
400
Konsentrasi Urea (mg/dl)
500
600
Grafik dan Regresi Linear
Caranya dalam Excel…..
1. Tabel data sudah terisa (X,Y1,Y2 dll)
2. Pilih data yang mau digambarkan
3. Gambarkan sebagai grafik “scatter”
4. Dari grafik yg muncul lihat bagian data yg
berbanding lurus
5. Klik “select data”
6. Isilah tabel yang muncul dgn subset data
7. Klik “layout” dan pilih “trendline/ more trendline
options”
8. Pilih rumus dan nilai r2 muncul pada grafiknya dan
“close”
Sentrifugasi
partikel preparat yang berat dan
besar turun lebih cepat
 = 2rm(1-)
f
Faktor2 yang mempengaruhi kecepatan partikel turun:
ukuran dan beratnya (m,)
densitas larutan ()
radias/jarak dari pusat rotasi (r)
angular velocity (kecepatan alat sentrifus) ()
frictional coefficient larutan (f)
 = 2rm(1-)
f
LEBIH CEPAT KALAU...
yang diatas semakin besar atau yang dibawah
semakin kecil
ukuran dan beratnya (m,) lebih besar
densitas larutan () lebih kecil
radias (r) lebih besar
kecepatan alat sentrifus () lebih besar
frictional coefficient larutan (f) lebih kecil
Pemurnian DNA
1.
pengumpulan/panen sel-sel
2.
pemecahan sel-sel
3.
pencernaan protein agar asam
nucleat dilepaskan
4.
pengendapan DNA
Pengumpulan//panen sel
Pengumpulan
sel--sel
DNA dapat diisolasi/dimurnikan dari sumber sel
apapun (yaitu sel-sel yang berisi inti sel!)
SEL-SEL PERLU DIPANEN “cell harvesting” dari:
 jaringan langsung (contoh daging buah,
sel-sel epitelial mulut, sel-sel kulit, dll),
 darah,
 sperma,
 dll
Pemecahan sel
sel--sel
Ikatan antara sel-sel jaringan serta membran
sel, membran inti sel harus dihancurkan biar
molekul DNA dapat dikeluarkannya
TEKNIK-TEKNIK: homogenisasi dgn detergen
membran
detergen
Konsekuensi:
membran
dipecah
Pencernaan protein
agar DNA lepas dari
kompleksnya
DNA
kromatin
DNA terbungkus dalam
protein histon serta
protein kromosom yang
non-histon
kromosom
nukleosom
Pengendapan Protein dan DNA
Protein serta asam nukleik
merupakan makromolekul yang
bersifat polar - akibatnya keduaduanya larut dalam larutan yang
berdasarkan akuades.
KONSENTRASI GARAM YANG TINGGI:
berperan untuk menetralisasi muatan positif
dan negatif pada makromolekul dengan
akibatnya sifat polar makromolekul tsb
semakin lemah  tidak melarut lagi dalam
buffernya.
Pengendapan DNA dalam etanol
etanol::
Etanol mempunyai dielektrik
konstan yang tidak sekuat
dielektrik konstan akuades.
Akibatnya bagian
makromolekul yang
bermuatan positif dan negatif dapat
berinteraksi satu dengan yang lain dan sifat
polar (hidrofilik) pada makromolekul tersebut
dikurangi  tidak melarut lagi dalam buffernya
Pengendapan DNA dengan etanol
PENGARUH TEMPERATUR:
Menurut pendapat orang banyak, semakin
dingin temperatur suatu larutan, semakin
kurang jumlah pelarut yang dapat
dilarutkan dalamnya.
????
Dasarnya secara kimiawi kurang kuat, tapi kita akan
ikut yang berpengalaman itu dan menggunakan etanol
yang dingin untuk pengendapan sempel DNA kita
Pemurnian Protein
(praktikum 6 - minggu depan)
Tujuan jelas...yaitu “Why?” sudah dijawab
(misalnya mau meneliti struktur protein
tertentu supaya mengerti fungsinya atau
dapat mendesain obat, dll; mau pakai
dalam assay diagnostik; mau buat
antibodi; dll)
Caranya yg dipakai berdasarkan sifat
protein yang ingin diisolasi
Pakai assay yang sesuai dengan tujuan,
dan yang memungkinkan/feasible untuk
mengetahui preparat semakin murni
Pemurnian Protein…
Molekul protein sangat beragam dibanding
dengan asam nukleat (DNA atau RNA)
Kenapa??
Kenapa
??
Sifat protein yang boleh dipakai untuk
memisahkan satu tipe protein dari yang lain
 Solubility
 Binding interactions
 Surface-exposed hydrophobic residues
 Charged surface residues
 Isoelectric Point
 Size and shape
Basic scheme of protein purification
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
Guidelines for protein purification

Define objectives

Define properties of target protein

Identify critical contaminants

Minimize the number of steps

Use a different technique at each step

Develop analytical assays
Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
How pure should my protein be?
Application
Therapeutic use, in vivo
studies
Biochemical assays, X-ray
crystallography
N-terminal sequencing,
antigen for antibody
production, NMR
Required Purity
Extremely high > 99%
High 95-99%
Moderately high < 95%
Adapted from: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
Basic scheme of protein purification
Cell growth,
protein overexpression
Cell lysis
Removal of
cell debris
Reversible
precipitation
with salt or
organic
molecules
Liquid
chromatography
(lower resolution,
lower cost)
Liquid
chromatography
(higher resolution,
higher cost)
PRAKTIKUM 6: ISOLASI PROTEIN DARI DARAH
DARAH UTUH
sentrifugasi
SEL-SEL DARAH
PLASMA
Lisis Sel
(buffer hemolisis)
“salting out”
ethanol precipitation
sentrifugasi
sentrifugasi
Protein dlm supernatan
Gs
Protein dlm supernatan
Es
sentrifugasi
Protein membran
M
Protein sitoplasmik
S
Protein dlm endapan
Gp
Protein dlm endapan
Ep
PCR: polymerase chain reaction
http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerasechain-reaction/
PCR
3 langkah per
siklus
Denaturasi
Annealing
(penempelan)
Ekstensi
(penambahan)
Praktikum 5: Praktikum
Isolasi DNA dan PCR
Isolasi DNA dari buah dan sel2 epitelial
(protokol untuk isolasi DNA dari darah
termasuk dalam bahan penuntun, tapi
tidak akan dilaksanakan)
** tolonglah bawa buah** (~50 g per
macam buah yang ingin diperiksa)
2-3 kelompok mulai dengan isolasi dari
buah dan kelompok lain mulai dgn isolasi
dari sel-sel epitelial mulut
References::
References
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts,
K. & Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell
(5th ed), Garland Science, Taylor & Francis Group,
New York.
Holme, D. J. & Peck, H. 1998. Analytical
Biochemistry (3rd ed), Addison Wesley Longman
Inc., New York.
http://sciencebiotech.net/mengenal-pcrpolymerase-chain-reaction/
Protein Purification Handbook. Amersham
Biosciences. 18-1132-29, Edition AC