Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Isolasi Mikroorganisme Dengan Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Aurelia Khezzia Assyifa Eman*(1), Adinda Dwi Maharani(2), Achmad Dani Baihaqi(3), Fikri Fahrezi (4), Pradnya Anggarda Sekar(5) Nurul Faizah S.Tr. M. T. Nari Dzakirah Kanaya Departemen Teknik Kimia Industri Institut Teknologi Sepuluh Nopember 16 Mei 2024 Abstrak Luasnya kemampuan mikroorganisme sebagai agen bioprocessing yang dapat menghasilkan metabolit dan senyawa baru, serta agen pemecah molekul kompleks, telah menjadikannya tren yang berkembang di industri. Hal ini ditandai dengan peningkatan permintaan komersial mikroorganisme terutamannya pada bidang industri pangan. Untuk itu, diperlukannya pengawasan mutu secara mikrobiologis untuk menjamin keamanan serta kelayakan produk pangan tersebut yang dapat dilakukan dengan melaksanakan pengujian laboratorium untuk mengisolasi dan melakukan penghitungan jumlah terhadap bakteri patogen yang disebut juga sebagai teknik enumerasi. Salah metode contoh enumerasi yaitu teknik perhitungan cawan dengan metode cawan tuang atau pour plate. Metode tersebut digunakan untuk menumbuhkan bakteri dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur bakteri, sehingga koloni bakteri akan tersebar secara merata di dalam media agar yang memadat. Dalam prinsipnya, cawan tuang menggunakan pengenceran bertingkat untuk mempermudah proses pengamatan. Kemudian tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mempelajari cara mengisolasi mikroorganisme menggunakan metode cawan tuang dan mengamati pertumbuhan jumlah sel mikroorganisme dengan variabel bebas pada percobaan ini meliputi jenis mikroba yang digunakan yaitu saccharomyces cerevisae dan escherichia coli, pengenceran dengan skala 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6; dan jenis bahan media yang digunakan yaitu Nutrient Broth. Selanjutnya variabel kontrol meliputi jumlah pengambilan larutan suspensi sebanyak 1 ml untuk melakukan pengenceran bertingkat dan dimasukkan ke dalam petridish, penambahan nutrient broth sebanyak 10 ml untuk ditambahkan ke petridish dan suhu inkubasi yang dijaga konstan pada 37oC. Berikutnya variabel terikat meliputi banyaknya jumlah koloni bakteri yang terbentuk setelah proses inkubasi. Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa semakin bertambah waktu inkubasinya maka mikroorganisme akan semakin berhenti tumbuh dan berhenti mengalami penambahan jumlah, hal ini dikarenakan mikroorganisme telah memasuki fase stasioner lalu kematian. Kata kunci : Cawan, Mikroorganisme, Pengenceran 1.0 1.1 Pendahuluan Latar Belakang Luasnya kemampuan mikroorganisme sebagai agen bioprocessing yang dapat menghasilkan metabolit dan senyawa baru, serta agen pemecah molekul kompleks, telah menjadikannya tren yang berkembang di industri. Hal ini ditandai dengan peningkatan permintaan komersial mikroorganisme. Sebagai contoh, industri ragi di Eropa kini telah dapat memproduksi hingga 1 juta ton ragi Saccharomyces cerevisiae setiap tahunnya, di mana sekitar 30% di antaranya diekspor untuk digunakan dalam proses fermentasi pada industri makanan dan minuman [1]. Eratnya penggunaan mikroorganisme dalam industri pangan menjadi alasan utama diperlukannya pengawasan mutu secara mikrobiologis untuk menjamin keamanan serta kelayakan produk pangan tersebut yang dapat dilakukan dengan melaksanakan pengujian laboratorium untuk mengisolasi dan melakukan penghitungan jumlah terhadap bakteri patogen seperti Escherichia coli, dengan teknik Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 yang dikenal sebagai teknik enumerasi, yaitu suatu teknik yang digunakan untuk mengestimasi jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan atau sampel [2]. Beberapa tahap yang perlu dilakukan untuk melakukan teknik enumerasi, yaitu tahap isolasi dan identifikasi. Isolasi dan identifikasi yakni metode yang digunakan untuk melakukan pemeriksaan mikroorganisme dengan menumbuhkan selnya di luar habitat alaminya untuk memperoleh kultur murni tanpa adanya campuran kehadiran mikroba lainnya. Kemudian proses identifikasi bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara mengamati sifat morfologi bakteri yang tumbuh [3]. Selanjutnya perhitungan bakteri digunakan untuk menghitung jumlah sel koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah bakteri dari suatu populasi bakteri dalam media biakan salah satunya yaitu metode perhitungan koloni bakteri secara tidak langsung (indirect method) yang dapat dilakukan dengan teknik perhitungan cawan [4]. Dalam praktikum kali ini, metode perhitungan bakteri yang digunakan adalah metode perhitungan dengan teknik pour plate atau cawan tuang yaitu teknik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam media padat (agar) dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur bakteri, sehingga koloni bakteri akan tersebar secara merata pada media agar. Dalam skala industri, metode cawan tuang juga sudah cukup banyak digunakan dalam berbagai bidang, yakni untuk pengujian kualitas pada produk makanan, kosmetik, dan farmasi sehingga pembelajaran dan pemahaman mengenai metode cawan tuang telah terbukti aplikatif dan bermanfaat [5].Oleh karena itu, Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan mengisolasi mikroorganisme dari suatu campuran dengan teknik cawan tuang. 2.0 Dasar Teori 2.1 Isolasi Bakteri Teknik isolasi mikroba merupakan salah satu upaya untuk menumbuhkan mikroorganisme di luar habitat alaminya. Teknik isolasi ini bertujuan untuk memperoleh bakteri kultur yang tidak lagi tercampur dengan bakteri lain, yang dikenal sebagai kultur murni. Prinsip dari isolasi mikroba sendiri adalah dengan memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya pada media padat, kemudian sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Adapun faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk mengisolasi mikroba yaitu dengan mempertimbangkan sifat dari setiap jenis mikroba yang akan diisolasi, kemudian habitat atau asal usul mikroba, media pertumbuhan yang sesuai, cara menginokulasi mikroba, cara menetaskan mikroba, cara menentukan bentuk kultur mikroba yang diisolasi sesuai dengan peruntukannya serta cara mempertahankan mikroba yang telah terisolasi agar tetap menjadi budaya murni [6]. 2.2 Metode Hitung Cawan Perhitungan koloni bakteri metode hitung cawan (plate count) merupakan metode menumbuhkan sel microorganisme (bakteri) yang masih hidup pada media agar, sehingga mikroorganisme akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa memerlukan bantuan mikroskop. Metode ini merupakan metode yang palingg sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme sehingga dapat digunakan untuk menghitung sel yang masih hidup, serta mengidentifikasi jenis mikroba tersebut [7]. Prinsip metode hitung cawan yaitu dengan menumbuhkan sel bakteri pada medium padat (agar) dan berdasarkan pembuatan seri pengenceran [8]. Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Metode hitung cawan memiliki beberapa keunggulan yang diantaranya yaitu memiliki kapasitas untuk menghitung jumlah bakteri, apabila terlalu banyak atau sedikit dapat menggunakan faktor pengenceran. Selain itu, metode perhitungan cawan juga hanya menghitunng bakteri yang layak dihitung atau bakteri yang hidup, tidak termasuk bakteri yang mati ataupun puing-puing yang terdapat pada media pertumbuhan. Akan tetapi, metode perhitungan cawan juga memiliki kekurangan yaitu perhitungannya tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena perhitungan dari kumpulan sel bakteri dapat salah terhitung sebagai koloni tunggal serta membutuhkan waktu dan bahan yang lama dan banyak[7]. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda dapat menghasilkan jumlah yang berbeda pula dan metode ini membutuhkan waktu inkubasi yang relatif lama karena hasil hitung cawan ini biasanya diperoleh setelah 1—3 hari [9]. 2.3 Metode Cawan Tuang Metode cawan tuang merupakan teknik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam media padat (agar) dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur bakteri, sehingga koloni bakteri akan tersebar secara merata pada media agar. Keunggulan dari metode cawan tuang (pour plate) yaitu dapat digunakan untuk memperoleh biakan murni karena resiko kontaminasinya lebih sedikit, selain itu, kultur bakteri juga memberikan hasil permukaan bakteri yang lebih halus dan merata di seluruh permukaan media pertumbuhan, sehingga pengukuran diameter koloni bakteri lebih mudah dilakukan dan waktu yang diperlukan untuk kultur lebih singkat [4]. Adapun tujuan pengamatan dengan metode cawan tuang ialah agar bakteri yang tumbuh dapat menyebar di seluruh media. 2.4 Perhitungan Hasil Hitung Cawan Jumlah koloni bakteri dari sampel dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut [6] : 1 Koloni/gr = 𝛴 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑎𝑤𝑎𝑛 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 Hasil perhitungan dengan menggunakan metode perhitungan cawan ini dalam ini dalam Colony Forming Unit (CFU). CFU ini menunjukkan jumlah koloni yang tumbuh tiap gram atau milimeter sampel yang dihitung dari jumlah cawan, faktor pengenceran, dan volume yang digunakan. Adapun beberapa hal dan syarat yang perlu diperhatikan saat menghitung jumlah koloni bakteri dari sampel yaitu[9] : 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang cawan mengandung jumlah koloni antara 30-300 CFU/g. Jika jumlah koloni tiap sampel lebih dari 300 CFU/g maka dikategorikan terlalu banyak untuk dihitung. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu atau berada pada satu deret rantai koloni yang terikat sebagai suatu garis dihitung sebagai satu koloni. 3. Koloni yang tumbuh menutup lebih besar dari setengan luas cawan petri, tidak disebut sebagai koloni melainkan spreader. 4. Jika hasil perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya adalah < 2 maka hasilnya dirata-rata. Namun jika hasilnya ≥ 2, maka menggunakan jumlah mikroba dari hasil pengenceran sebelumnya (pengenceran terkecil). 2.5 Pengenceran Bertahap Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Pengenceran bertahap adalah metode yang digunakan untuk memperkirakan konsentrasi (jumlah koloni, organisme, bakteri, atau virus) dari sampel yang tidak diketahui dengan menghitung jumlah koloni yang dikultur dari pengenceran bertahap sampel kemudian melacak kembali jumlah yang diukur pada konsentrasi yang tidak diketahui [10]. Pengenceran juga digunakan untuk menumbuhkan koloni mikroba atau bakteri yang terbatas dan untuk mengurangi kepadatan bakteri pada sampel [3]. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Azzahra dkk., (2021) dapat disimpulkan bahwa jumlah koloni bakteri berbanding terbalik dengan tingkat pengenceran di mana jumlah koloni bakteri semakin berkurang saat tingkat pengencerannya tinggi karena jumlah koloni yang tersebar pada tiap sampel berdasarkan pada prinsip pengenceran, yaitu semakin tinggi faktor pengenceran semakin rendah jumlah koloni bakteri, sedangkan semakin rendah faktor pengenceran maka semakin tinggi jumlah bakteri [11]. 3.0 3.1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 3.2 1. 2. 3. 4. 5. 3.3 3.3.1 Alat dan Bahan Penelitian Alat Sumbat kapas Kertas sampul coklat Alkohol 70%. Petridish steril Pipet ukur steril Karet penghisap Mikropipet Blue tip Beaker glass Kawat ose Tabung reaksi Rak tabung reaksi Erlenmeyer Pengaduk batang L steril Bunsen Bahan Media Nutrient Broth Agar (NBA) steril yang masih kondisi hangat cair. Media Nutrient Broth Agar (NBA) steril yang sudah memadat. Suspensi bakteri Biakan mikroba dalam media miring (tabung reaksi) Aquades steril Variabel Percobaan Variabel Bebas Variabel bebas pada percobaan ini adalah jenis mikroba yang digunakan yaitu saccharomyces cerevisae dan escherichia coli, pengenceran dengan skala 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6 3.3.2 Variabel Kontrol Variabel kontrol pada percobaan ini adalah jumlah pengambilan larutan suspense sebanyak 1 ml untuk melakukan pengenceran bertingkat dan dimasukkan ke dalam petridish, penambahan nutrient broth sebanyak 10 ml untuk ditambahkan ke petridish. 3.3.3 Variabel Terikat Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Variabel terikat pada percobaan ini adalah banyaknya jumlah koloni bakteri yang terbentuk setelah proses inkubasi 3.4 Metode Percobaan 3.4.1 Tahap Persiapan 1. Ambil 6 tabung reaksi dan beri label No. 1-6 2. Isi setiap tabung reaksi dengan 9 mL aquades 3. Ambil 1 mL suspensi bakteri dengan micropipet dan masukkan ke tabung reaksi no. 1 kemudian kocok dengan vortex 4. Ambil 1 mL larutan di Tabung reaksi No. 1 dan masukkan ke tabung reaksi No. 2 kemudian kocok dengan vortex 5. Ambil 1 mL larutan di tabung reaksi No. 2 dan masukkan ke tabung reaksi No. 3 kemudian kocok dengan vortex 6. Ambil 1 mL larutan di Tabung reaksi No. 3 dan masukkan ke tabung reaksi No. 4 kemudian kocok dengan vortex 7. Ambil 1 mL larutan di tabung reaksi No. 4 dan masukkan ke tabung reaksi No. 5 kemudian kocok dengan vortex 8. Ambil 1 mL larutan di tabung reaksi No. 5 dan masukkan ke tabung reaksi No. 6 kemudian kocok dengan vortex 3.4.2 Tahap Percobaan 1. Ambil 5 petridish dan beri label no. 1-5 2. Ambil 1 mL larutan dari tabung reaksi No. 1 dan tuang ke petridish No 1 3. Ambil 1 mL larutan dari tabung reaksi No. 2 dan tuang ke petridish No 2 4. Ambil 1 mL larutan dari tabung reaksi No. 3 dan tuang ke petridish No 3 5. Ambil 1 mL larutan dari tabung reaksi No. 4 dan tuang ke petridish No 4 6. Ambil 1 mL larutan dari tabung reaksi No. 5 dan tuang ke petridish No 5 7. Kemudian tuangkan media agar cair ke petridish No. 1 8. Putar petridish No. 1 searah jarum jam kemudian putar berlawanan arah jarum jam, lalu putar petridish membentuk angka 8. 9. Lakukan Langkah 7-8 untuk petridish No. 2-5. 10. Setelah media agar telah beku, bungkus petridish No. 1-5 menggunakan kertas coklat. 11. Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37 oC (sesuai dengan jenis mikroba) dengan posisi petridish terbalik. 12. Lakukan pengamatan. 3.4.3 Tahap Analisa 1. Tentukan nilai pengenceran pada setiap tabung reaksi. 2. Ambil foto setiap petridish setelah inkubasi. 3. Hitung jumlah koloni pada setiap petridish. Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Gambar 1. Skema Alat Percobaan 4.0 Hasil dan Pembahasan Upaya untuk meisahkan satu jenis mikroba dari lingkungannya yang mengandung campuran mikroba lain dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan disebut sebagai metode isolasi. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan kultur murni yang diinginkan tanpa kontaminasi mikroba lainnya [12]. Ada beberapa cara untuk memperoleh hasil biakan murni yakni dengan metode cawan tuang dan cawan sebar. Pada percobaan ini, proses isolasi bakteri diamati berdasarkan metode cawan tuang atau pour plate. Metode cawan tuang adalah teknik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam media padat (agar) dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur bakteri, sehingga koloni bakteri akan tersebar secara merata pada media agar. Tujuan digunakannya metode ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara mengisolasi mikroorganisme dengan menggunakan metode cawan tuang serta menghitung jumlah sel mikroorganisme dari hasil inokulasi yang dilakukan. Prosedur dilakukan dengan proses preparasi sampel yang dilakukan di dalam ruang yang aseptic, yaitu Laminar Air Flow (LAF) yang merupakan alat untuk bekerja secara aseptic. Hal ini dikarenakan alat tersebutmemiliki pengaturan dan aliran udara sehingga menjadi steril dan aplikasi sinar UV beberapa jam sebelum digunakan [13]. Selanjutnya tahap preparasi sampel dilakukan dengan mengecerkan sampel dengan perbandingan penggunaan sampel dan pelarutnya adalah 1:9. Perbandingan ini bertujuan agar pengenceran pertama hingga selanjutnya akan didapatkan 1/10 sel mikroorganisme dari pengenceran sebelumnya [14]. Selanjutnya pengenceran dilakukan secara bertingkat yang bertujuan untuk mengurangi kepadatan bakteri, pengenceran bertingkat diawali dengan pengambilan 1 ml sampel dari larutan induk yang telah dibuat kemudian diencerkan di dalam tabung reaksi dengan larutan pengencer sebanyak 9 ml. Selanjutnya larutan sampel dihomogenkan secara vortex, dilanjutkan dengan mengambil 1 ml sampel dari tabung reaksi pertama untuk dipindahkan ke dalam tabung reaksi dua dan diencerkan kembali dengan larutan pengencer sebanyak 9 ml. Langkah yang sama kemudian terus Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 dilakukan secara berulang dengan sehingga diperoleh pengenceran 10-6. Pengenceran 106 dilakukan berdasarkan prinsip faktor pengenceran yang menyatakan bahwa semakin tinggi faktor pengenceran maka semakin rendah jumlah koloni mikroba sehingga akan mempermudah dalam proses pengamatan nantinya [15]. Setelah pengenceran sampel bertingkat selesai, langkah selanjutnya yaitu memindahkan mikroorganisme menggunakan metode cawan tuang. Pertama-tama siapkan lima petridish kosong, kemudian larutan sampel dari tabung reaksi ke-2 diambil sebanyak 1 ml untuk dipindahkan ke dalam petridish pertama, berikutnya dilanjutkan dengan menuangkan sebanyak 10 ml nutrient broth cair ke dalam petridish, begitu pula untuk proses penuangan selanjutnya, petridish ke-2 diisi dengan larutan sampel dari tabung reaksi ke-3 dan ditambahkan nutrient broth cair ke dalamnya dengan jumlah yang sama. Setelah kelima petridish telah terisi dengan suspensi bakteri dan nutrient broth, proses homogenisasi keduanya dilakukan dengan memutar petridish sesuai arah jarum jam, berlawanan arah jarum jam, dan mengikuti pola angka delapan. Hal ini dilakukan untuk memungkinkan terjadinya kontak antara mikroorganisme dengan substrat atau media nutrient broth yang efektif [16]. Setelah media memadat, petridish dibungkus menggunakan kertas coklat atau aluminium foil. Selain itu, pada saat inkubasinya, petridish diletakkkan secara terbalik agar tutup petridish dapat terhindar tetesan dari uap air hasil penguapan media selama inkubasi berlansung, sehingga proses pengamatan akan menjadi lebih mudah [17]. Selanjutnya inkubasi dilakukan dalam suhu 37oC dengan rentang waktu 24 jam, 96 jam, dan 120 jam hingga pada akhirnya didapatkan data pengamatan sebagaimana yang tercantum pada tabel berikut : Tabel 4.0.1 Hasil Pengamatan BakteriPengenceran Jenis Waktu Bakteri Pengamatan 10 10 10 10 10 -2 E. Coli 24 jam Terbentuk gumpalan koloni yang saling menempel , menjadi satu sehingga sulit diamati -3 Koloni bakteri terlihat masih saling menempel dengan satu sama lain. -4 Koloni bakteri mulai terlihat jelas, karena jaraknya yang mulai saling merengga ng -5 Jarak antara koloni sudah semakin melebar sehingga bakteri mulai terlihat jelas -6 Koloni yang tampak jelas mengala mi penamb ahan Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 96 jam 120 jam Saccharomy ces 24 jam Koloni yang tumbuh tampak sama dengan pengamatan pertama yaitu sulit untuk diamati Tumbuh koloni bakteri yang sama dari pengamatan kedua yang masih sulit untuk diamati Koloni yang terdapat pada petridish masih sulit untuk diamati dengan jelas koloni bakteri masih cukup sulit untuk diamati koloni Koloni bakteri masih bakteri belum mulai tterlalu terlihat terlihat dari permukaa n Koloni bakteri sudah terlihat jelas dan mudah untuk diamati Koloni bakteri sudah mulai terlihat dengan jelas, sama seperti pengalama n sebelumya Koloni bakteri dapat terlihat jelas seperti pengam atan pada hari sebelum nya Koloni bakteri yang terdapat dalam petridish sudah terlihat Koloni bakteri sudah terlihat cukup jelas Sama seperti pengam atan kedua, koloni bakteri tampak jelas dan Koloni yang terlihat dan dapat diamati mengalami penambahan jumlah Koloni bakteri tampak semakin banyak dan mudah teramati Koloni sudah terlihat denga n sangat jelas Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 96 Jam 120 jam 4.1 Koloni yang terlihat dan dapat diamati mengalami penambahan jumlah Koloni yang terlihat dan dapat diamati mengalami penambaha n jumlah Koloni yang terlihat dan dapat diamati mengalami penambaha n jumlah Jumlah koloni bakteri sama dengan pengamatan kedua, yakni sulit untuk diiamati Koloni bakteri masih sulit untuk diamati koloni bakteri mulai terlihat banyak dan sedikit bisa diamati Koloni Koloni yang yang terlihat terlihat dan dan dapat dapat diamati diamati mengala mengala mi mi penamb penamb ahan ahan jumlah jumlah Adanya penamb ahan jumlah koloni bakteri yang terlihat dari permuk aan Koloni bakteri sudah tampak terlihat sangat jelas dan mudah diamati Analisa Hasil Pengamatan Bakteri Escherichia coli Berdasarkan hasil pengamatan terhadap bakteri Escherichia coli, didapatkan hasil percobaan yang menunjukan adanya peningkatan jumlah koloni bakteri yang terlihat setelah proses pengenceran bertingkat dilakukan, pada pengenceran pertama jumlah koloni bakteri yang terbentuk masih belum bisa diteliti dengan jelas dan dihitung karena masih berbentuk gumpalan suspensi selanjutnya setelah dilakukan pengenceran yang ke5 diperoleh hasil yang menunjukkan adanya perluasan jarak antar koloni bakteri sehingga bakteri menjadi lebih mudah untuk diamati dan terlihat seolah mengalami penambahan jumlah. Jika diamati berdasarkan waktunya pada jam ke-24 hingga jam ke-120 tidak terdapat perubahan yang begitu signifikan, hal ini dikarenakan pertumbuhan Escherichia coli yang semakin menurun seiring bertambahnya waktu. Pada penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Rosmania dan Yanti yang membahas mengenai fase kehidupan dari bakteri Escherichia coli diperoleh data yang menunjukan fase lag atau adaptasi Escherichia Coli yang dinyatakan pada jam ke-0 hingga jam ke-3 yang memberikan arti bahwa bakteri mengalami pertumbuhan yang baik, Dalam penelitian lainnya yang dilakukan Kurniati, dinyatakan bahwa bakteri pathogen E.coli dapat tumbuh pada suhu 7oC—44oC dan tumbuh lebih optimal pada suhu 37oC dengan pH optimum 7—7,5[18]. Hal ini telah sesuai dengan pengondisian media Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 pada awal percobaan yang menggunakan variabel kontrol berupa suhu sebesar 37oC yang disesuaikan dengan kebutuhan bakteri E.coli untuk mendukung kehidupannya. Akan tetapi, pada fase kehidupan selanjutnya, Escherichia coli akan mengalami fase log atau eksponensial pada jam ke-3 sampai jam ke-18. Lalu diakhiri dengan fase kematian Escherichia coli yaitu setelah jam ke-18 [19]. Dengan demikian, hasil percobaan ini telah sesuai dengan alur fase hidup bakteri Escherichia coli yang mengalami pertumbuhan pada jam ke-3 hingga ke-18 dan kematian pada jam ke-18 sehingga dapat dikatakan bahwa masa hidup E.coli kurang dari jam ke24 sehingga pada jam-jam berikutnya seperti jam ke-96 dan jam ke-120 bakteri E.coli tidak lagi mengalami pertumbuhan atau penambahan pada jumlah koloni. Salah satu keterbatasan dari percobaan ini adalah tidak menunjukkan jumlah bakteri yang sebenarnya, karena perhitungan hanya berdasarkan oleh kumpulan sel bakteri yang dapat salah terhitung sebagai koloni tunggal, selain itu, proses perhitungan dari koloni bakteri ini juga masih dilakukan secara manual karena tidak adanya alat Colony Counter yang dapat digunakan untuk mempermudah proses perhitungan. Oleh karena itu pada penelitian selanjutnya disarankan untuk melakukan pengamatan dengan bantuan Colony Counter untuk mempermudah proses perhitungan [4]. 4.2 Analisa Hasil Pengamatan Bakteri Saccharomyces Cerevisae Berdasarkan hasil pengamatan mikroorganisme Saccharomyces Cerevisae, diperoleh data yang menunjukan adanya peningkatan jumlah koloni bakteri yang terlihat setelah proses pengenceran bertingkat dilakukan, pada pengenceran pertama jumlah koloni bakteri yang terbentuk belum bisa diteliti dengan jelas dan dihitung, dan mengalami peningkatan setelah pengenceran yang ke-5. Hasil peningkatan ini menunjukkan bahwa semakin tinggi tingkat pengencerannya maka jumlah koloni bakteri yang dapat teramati semakin meningkat. Hal ini dikarenakan proses pengenceran membantu dalam mengurangi kepadatan koloni bakteri sehingga jarak antar koloni bakteri yang terbentuk akan semakin merenggang dan mempermudah dalam proses pengamatannya, membuat bakteri terlihat lebih mudah untuk diamati [8]. Berdasarkan penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Azzahra telah diperoleh data yang menunjukkan bahwa proses pengenceran bertingkat yang diulang hingga pengenceran ke 10-6 telah berhasil mengurangi kepadatan koloni bakteri yang terbentuk [11]. Alasan ini kemudian diperkuat oleh penelitian lainnya dari Mursalim yang menyebutkan bahwa tujuan pengenceran adalah untuk mengurangi jumlah populasi mikroorganisme di mana apabila pengenceran tidak dilakukan, maka pertumbuhan koloni bakteri yang terbentuk akan tumpang tindih atau saling menumpuk sehingga akan menyulitkan dalam proses perhitungan jumlah koloni [20]. Sementara itu, apabila diamati berdasarkan waktunya, tidak terdapat perubahan yang begitu signifikan dari jam ke-24 hingga jam ke-120, hal ini dikarenakan pertumbuhan Saccharomyces Cerevisae yang semakin menurun seiring bertambahnya waktu. Sesuai dengan teori yang ada, hal ini dapat diakibatkan oleh waktu inkubasi yang sudah melewati batas maksimal sehingga sel mengalami fase kematian [21]. Menurut Khofiya, fase hidup Saccharomyces Cerevisae di dapatkan hasil yang menunjukkan pertumbuhan sel pada jam ke-18 hingga jam ke-42 yang disebut sebagai fase lag di mana pada fase ini sel mengalami pertumbuhan yang signifikan karena telah mampu beradaptasi dengan mediumnya. Kemudian pada jam ke-48 hingga jam ke-60 pertumbuhan saccharomyces cerevisae memasuki fase stasioner, yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan sel secara signifikan, selanjutnya pada jam ke-66 hingga ke- Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 72 jumlah sel mulai mengalami penurunan yang menandakan bahwa sel saccharomyces cerevisae telah mengalami fase kematian[22]. Hasil percobaan ini telah membuktikan bahwa proses pengenceran bertingkat adalah metode yang dapat diandalkan untuk mengurangi kepadatan populasi dalam media dan memudahkan dalam melakukan perhitungan [19]. Serta telah membuktikan kebenaran mengenai dari teori 4 fase pertumbuhan sel di mana pada fase lag, bakteri memerlukan waktu untuk menyesuaikan diri dengan lingkungan barunya, kemudian fase pertumbuhan eksponensial adalah fase pertumbuhan secepat mungkin. Lalu fase stasioner yaitu fase di mana tidak adanya pertumbuhan. Akan tetapi, meskipun secara stasioner tidak ada pertumbuhan fase, bakteri terus bertambah banyak sementara beberapa terus mati. Hal ini dikarenakan oleh menipisnya nutrisi penting, dan adanya substrat beracun. Fase terakhir adalah fase kematian. Dalam fase kematian, nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri terpenuhi seluruhnya terpakai [23]. Keterbatasan dalam percobaan ini yaitu masih adanya sebagian koloni yang berkerumun pada media padat, sehingga untuk membuktikan bahwa metode ini telah menjamin kemurnian dari bakteri tersebut diperlukan peningkatan suhu inkubasi untuk mengurangi produksi "lendir" di antara anggota kumpulan mikroba yang diuji [24] dengan memahami dan mampu mengatasi keterbatasan ini, diharapkan proses percobaan isolasi mikroorganisme dengan metode cawan tuang dapat dioptimalkan lagi untuk menghasilkan hasil yang membuktikan kebenaran teori yang telah ada. 5.0 Kesimpulan Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa metode cawan tuang atau pour plate adalah teknik yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri dalam media padat (agar) dengan cara mencampurkan media yang masih cair dengan stok kultur sel, sehingga koloni bakteri akan tersebar secara merata pada media agar. Kemudian metode cawan tuang juga erat kaitannya dengan pengenceran bertingkat. Karena pengenceran bertingkat dapat membantu mengurangi kepadatan sel pada sampel sehingga pengamatan dan perhitungan sel dalam sampel dapat lebih mudah dilakukan. Akan tetapi, pertumbuhan mikroorganisme juga akan sangat terpengaruh oleh fase kehidupan mikroorganisme tersebut. Apabila mikroorganisme telah mengalami fase kematian maka pertumbuhan mikroorganisme akan terhenti seperti pada sampel Escherichia coli dan Saccharomyces cerevisae yang berhenti mengalami peningkatan jumlah setelah jam ke-24. Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Daftar Pustaka [1] M. Parapouli, A. Vasileiadis, A. S. Afendra, And E. Hatziloukas, “Saccharomyces Cerevisiae And Its Industrial Applications,” Aims Microbiology, Vol. 6, No. 1. Aims Press, Pp. 1–31, 2020. Doi: 10.3934/Microbiol.2020001. [2] D. Artati Dan Moh Oman, “Evaluasi Penggunaan Petrifilm Aerobic Count Plate (Pacp) Pada Pengujian Angka Lempeng Total (Alt) Di Laboratorium Mikrobiologi Balai Riset Pemuliaan Ikan Sukamandi,” Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, Vol. 16, No. 1, Pp. 5–9, 2018. [3] A. N. Kadri, K. Tono, P. Gelgel, I. Gusti, And K. Suarjana, “Perbedaan Cara Penyebaran Suspensi Terhadap Jumlah Bakteri Pada Media Eosin Methylene Blue Agar (Difference Method To Total Bacteria Spreading In Suspension Emba Media),” Indonesia Medicus Veterinus Juni, Vol. 4, No. 3, Pp. 205–212, 2015. [4] Y. S. Kurniawan, P. Ariami, And Rohmi, “Si Pinter Sebagai Alat Penghitung Koloni Bakteri Penunjang Laboratorium Mikrobiologi,” Jurnal Biotek, Vol. 11, No. 1, Pp. 87–97, 2023. [5] I. Terrones-Fernandez Et Al., “Improvement Of The Pour Plate Method By Separate Sterilization Of Agar And Other Medium Components And Reduction Of The Agar Concentration,” Microbiol Spectr, Vol. 11, No. 1, Feb. 2023, Doi: 10.1128/Spectrum.03161-22. [6] R. F. Jufri, “Microbial Isolation,” Journal La Lifesci, Vol. 1, No. 1, Pp. 18–23, 2020. [7] O. I. Angelia, “Penggunaan Metode Cawan Tuang Terhadap Uji Mikroba Pada Tepung Kelapa (Use Of Pour Plate Methods On Microbial Test On Coconut Flour),” Journal Agritech Of Science, Vol. 4, No. 1, Pp. 43–51, 2020. [8] N. H. Laili, I. W. Abida, And A. S. Junaedi, “Nilai Total Plate Count (Tpc) Dan Jumlah Jenis Bakteri Air Limbah Cucian Garam (Bittern) Dari Tambak Garam Desa Banyuajuh Kecamatan Kamal Kabupaten Bangkalan,” Juvenil:Jurnal Ilmiah Kelautan Dan Perikanan, Vol. 3, No. 1, Pp. 26–31, Feb. 2022, Doi: 10.21107/Juvenil.V3i1.15075. [9] E. Soesetyaningsih And Azizah, “Akurasi Perhitungan Bakteri Pada Daging Sapi Menggunakan Metode Hitung Cawan (Calculation Accuracy Of Bacterical In Beef Meat Using Total Plate Count Method),” Berkala Sainstek , Vol. 8, No. 3, Pp. 75–79, 2020. [10] A. Ben-David And C. E. Davidson, “Estimation Method For Serial Dilution Experiments,” J Microbiol Methods, Vol. 107, Pp. 214–221, Dec. 2014, Doi: 10.1016/J.Mimet.2014.08.023. [11] S. C. Azzahra, Y. Effendy, And S. Slamet, “Isolasi Dan Karakterisasi Bakteri Pemacu Pertumbuhan Tanaman (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) Asal Tanah Desa Akar-Akar, Lombok Utara,” Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains Dan Teknologi, Vol. 6, No. 2, P. 70, Sep. 2021, Doi: 10.36722/Sst.V6i2.662. [12] E. N. Taib, H. Maya, R. Shabirah, D. Fadilah, And R. Siregar, “Isolasi Dan Identifikasi Mikroba Pada Tanah Bekas Pertumbuhan Bawang Merah (Allium Cepa L.) Isolation And Identification Of Microorganisms From Onion-Used Soil (Allium Cepa L.),” Jurnal Biologi Edukasi Edisi, Vol. 15, No. 2, Pp. 96–104, 2023. Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 [13] N. M. Dewi, Wigayanti, P. Fatmawati, R. Visca, J. Suriawati, And R. S. Rahmawati, “Analisa Cemaran Bakteri Jamu Beras Kencur Sediaan Cair Dengan Metode Angka Lempeng Total,” Jurnal Serambi Engineering, Vol. 7, No. 4, Pp. 4059–4064, 2022. [14] E. D. Tyas, N. Widyorini, And A. Solichin, “Perbedaan Jumlah Bakteri Dalam Sedimen Pada Kawasan Bermangrove Dan Tidak Bermangrove Di Perairan Desa Bedono, Demak,” Journal Of Maquares, Vol. 7, No. 2, Pp. 189–196, 2018, [Online]. Available: Https://Ejournal3.Undip.Ac.Id/Index.Php/Maquares [15] F. Hardianti And Sukmawati, “Analisis Total Plate Count (Tpc) Mikroba Pada Ikan Asin Kakap Di Kota Sorong Papua Barat,” Jurnal Biodjati, Vol. 3, No. 1, P. 72, 2018, [Online]. Available: Http://Journal.Uinsgd.Ac.Id/Index.Php/Biodjati [16] D. Adelia And S. Santosa, “Pengaruh Pengadukan Terhadap Proses Pembuatan Biogas,” Distilat Jurnal Teknologi Separasi , Vol. 6, No. 2, Pp. 468–475, 2020, [Online]. Available: Http://Distilat.Polinema.Ac.Id [17] I. N. Handayani, M. Moenir, S. I. Nanik, And M. R. Awaludin, “Isolasi Bakteri Heterotrofik Anaerobik Pada Pengolahan Air Limbah Industri Tekstil Isolation Of Anaerobic Heterotrophic Bacteria In Textile Industry Waste Water Treatment,” Jurnal Riset Teknologi Pencegahan Pencemaran Industri, Vol. 7, No. 1, Pp. 37–44, 2016. [18] E. Kurniati, V. T. Huy, F. Anugroho, A. A. Sulianto, N. Amalia, And A. R. Nadhifa, “The Effect Of Ph And Temperature On Desinfection Process Using Microbubble And Pressurized Carbon Dioxide,” Jurnal Pengelolaan Sumberdaya Alam Dan Lingkungan, Vol. 10, No. 2, Pp. 247–256, 2020, Doi: 10.29244/Jpsl.10.2.247-256. [19] Rosmania And F. Yanti, “Perhitungan Jumlah Bakteri Di Laboratorium Mikrobiologi Menggunakan Pengembangan Metode Spektrofotometri,” Jurnal Penelitian Sains, Vol. 22, No. 2, Pp. 76–86, 2020, [Online]. Available: Http://Ejurnal.Mipa.Unsri.Ac.Id/Index.Php/Jps/Index [20] Mursalim, “Pemeriksaan Angka Lempeng Total Bakteri Pada Minuman Sari Kedelai Yang Diperjualbelikan Di Kecamatan Manggala Kota Makassar,” Jurnal Media Analis Kesehatan, Vol. 1, No. 1, 2018. [21] Y. Jiwintarum, M. W. Diarti, And B. L. Zaeniati, “Variasi Suhu Inkubasi Mempengaruhi Jumlah Sel Vegetatif Dan Spora Bacillus Sphaericus Incubation Temperature Variation Affecting The Number Of Vegetative Cells And Spora Bacillus Sphaericus,” Jurnal Ilmu Kesehatan, Vol. 15, No. 1, Pp. 76–83, 2021, Doi: 10.33860/Jik.V15i1.415. [22] Z. N. Khofiya, R. Winarsa, And K. Muzakhar, “Hidrolis Kulit Buah Kopi Oleh Kapang Pestalotiopsis Sp. Vm 9 Serta Pemanfaatan Hidrolisatnya Sebagai Medium Produksi Protein Sel Tunggal Saccharomyces Cerevisiae (Hydrolysis Coffea Pulp Using Extracelluler Enzymes Of Pestalotiopsis Sp. Vm 9 And Utilization Of Protein Hydrolysis For Medium Production Single Cell Saccharomyces Cerevisiae),” Berkala Sainstek , Vol. 7, No. 1, Pp. 19–23, 2019. [23] M. Muloiwa, S. Nyende-Byakika, And M. Dinka, “Comparison Of Unstructured Kinetic Bacterial Growth Models.,” S Afr J Chem Eng, Vol. 33, Pp. 141–150, Jul. 2020, Doi: 10.1016/J.Sajce.2020.07.006. [24] Lenhart T. And Gorsuch J., “Incubation Temperature And Culture Medium Formulation Impact The Accuracy Of Pour-Plate Techniques For The Enumeration Of Industrial Bacillus Assemblages,” J Microbiol Methods, 2021 Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Laporan Sementara Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6 Lembar Revisi Modul : Isolasi Mikroorganisme Dengan Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Kelompok : 6A Tanggal Percobaan : 16 Mei 2024 Tanggal Tanggal Keterangan revisi kembali - Menambah sitasi mengenai alasan pengenceran hingga 10-6 pada pembahasan - Memparafrase kata-kata definitif - Membuat sub-bab yang membahas hasil pengamatan Saccharomyces cerevisae dan 5 Juni 2024 11 Juni 2024 Escherichia coli secara terpisah - Menambahkan gambar pada tabel - Menambahkan tentang fase hidup dalam kesimpulan - Merevisi bagian kesimpulan dalam abstrak agar lebih general - Merevisi format pembahasan sesuai urutan, 15 Juni 2024 17 Juni 2024 kesimpulan terlebih dahulu lalu keterbatasan - Merevisi latar belakang Surabaya, 5 Juni 2024 Mengetahui, Asisten Laboratorium ( Nari Dzakirah Kayana) Jurnal Mikrobiologi 2024, Vol. 6, No. 6
