Kajian Dan Manajemen Struktur Komunitas Mikrobia

Kajian Dan Manajemen
Struktur Komunitas
Mikrobia Tanah Untuk
Menekan Penyakit
Dipresentasikan Oleh:
Andi Suryadi
Catur Joko Widodo
João Boavida da Cruz
Pendahuluan
• Ekologi mikrobia tanah, dan pengaruhnya
thd fungsi ekosistem tanaman, dinamika,
dan produktivitas tanah saat ini banyak
mendapatkan perhatian utk diteliti
• Komunitas mikrobia tanah, struktur dan
fungsinya sangat komplek dipahami
• Para peneliti berusaha menerapkan
metode2 yg dpt mengkaji komunitas
mikrobia tanah tersebut
Metode Yang Digunakan
• Teknik tradisional : menjelaskan
komposisi dan keragaman populasi
mikrobia pd tanah didasarkan pada
karakteristik fenotip.(terbatas pada
organ yang bisa dikulturkan)
• Teknik molekuler : dapat menetukan
ciri biologi/keragaman spesiesspesies mikrobia tanah
Pendekatan Karakterisasi
Mikroflora Tanah
1. Metode integratif : penekanan pada
komposisi struktur dan fungsi komunitas
mikrobia tanah berdasarkan pada
pengaruh praktek, proses, atau
gangguan pada aktivitas mikrobia tanah.
2. Metode fisiologi dan molekular :
didasarkan pada teknik berbasis kultur
dan DNA
Metode Integratif
1. Substrate Utilization Profile
2. Fatty Acid Methyl Ester Profiles
Substrate Utilization Profile
• Mendeteksi perbedaan/pengaruh praktek
pengelolaan diantara komunitas mikrobia
• Sistem BIOLOG®, didasarkan pd level fisiologi
komunitas
– Sistem tersebut dipengaruhi o/ tipe tanah, spesies
tumbuhan, inokulan mikrobia dan teknik budidaya
• Sistem BIOLOG (GN) didasarkan pada
pemanfaatan 95 sumber karbon yg berbeda
– Tidak terlalu banyak memberikan sumbangan
informasi
Fatty Acid Methyl Ester(FAME)
Profiles
• Pemahaman sifat-sifat komunitas mikrobia
yg didasarkan pd PLFA atau FAME
• PLFA adalah molekul penanda yg
bermanfaat pd membran sel hidup
– Kelebihan : dapat langsung memberi
informasi ttg struktur mikrobia tanah
– Kelemahan: komposisi dan keragaman
komunitas mikrobia tdk dpt dijelaskan secara
keseluruhan
Metode Fisioloig Dan Molekular
1.
2.
3.
4.
5.
DNA-Based Methods
PCR Methods
Real-Time PCR
DNA Arrays
Metagenomig Libraries
DNA-Based Methods
• Memiliki potensi yg luas utk memperluas
pengetahuan ttg struktur dan fungsi
komunitas mikroba
• Metode ini dpt menjelaskan komposisi
phylogenetik dan status fungsional
komunitas mikrobia
PCR Methods
• Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik
amplifikasi sekuen DNA secara in vitro dengan jalan
ekstensi secara simultan dari primer yang komplementer
dengan DNA target.
• Primer tersebut berupa sepasang oligonukleotida yang
mempunyai sekuen dan terletak pada DNA template yang
mengapit (flank) segmen DNA yang akan diamplifikasi.
• Cetakan (template) DNA mula-mula didenaturasi dengan
pemanasan di dalam campuran yang juga mengandung
oligonukleotida primer dengan jumlah yang cukup banyak
serta dNTP-deoxyNucleotida TriPhosphates (dATP, dCTP,
dGTP & dTTP) yang bersifat enzymatic extension.
• Proses dikelompokkan tiga tahap :
 Denaturasi template
 Annealing (penempelan) pasangan
primer pd untai tunggal DNA target
 Extension
(pemanjangan/polimerisasi)
• Ketiga tahapan tersebut dapat terus
berulang sesuai dg jumlah siklus yang
diinginkan
Schematic drawing of the PCR cycle. (1) Denaturing at 94-96°C. (2) Annealing at (eg)
68°C. (3) Elongation at 72°C (P=Polymerase). (4) The first cycle is complete. The two
resulting DNA strands make up the template DNA for the next cycle, thus doubling the
amount of DNA duplicated for each new cycle (a total of three cycles is shown above).
s
Real-Time PCR
• Dapat mendeteksi sedikit banyaknya DNA
jasad renik dari sampel lingkungan yg
kompleks
• Telah digunakan scr permanen untuk studi
penekanan penyakit
• Secara relatif beberapa studi telah
menerapkan teknik ini utk esktrak DNA dr
tanah
• Sande Weert et al (1959), telah menguji
penggunaan metode molekuler, termasuk
Rt-PCR utk menekan pertumbuhan relatif,
dan kemampuan bersaing dr 2 spesies
jamur ektomikoriza pd akar pinus
• Analisa dilakukan dg DGGE, Rt-PCR thd
ekstrak DNA dr tanah
• Analisa molekuler dan PLFA  terdpt satu
penambahan/perubahan yg tdk signifikan pd
pertumbuhan jamur mikoriza yg diinokulasi scr
individual
• Sebaliknya penggunaan semua metode
molekuler (kecuali PLFA), mendeteksi suatu
penambahan target DNA Sullius, dan penurunan
kuantitatif DNA dr Paxillus ketika jamur tlh
diinokulasikan pd bibit cemara
• Pada penemuan ini menunjukkan bahwa
S. bovines menghambat pertumbuhan dr
P. involutus
• Mendemonstrasikan kemampuan
molekular dlm mempelajari interaksi
antara mikroorganisme, yg tidak dapat
dipelajari dg pendekatan fisiologi
DNA Array
• Metode DNA array digunakan untuk
identifikasi isolat Phytium spp dan
Phytophthora spp yg belum diketahui.
• Phytium spp mrp penyakit penting pd
apel
• Bbrp spesies dilaporkan dpt
berasosiasi dg tanaman tahunan
Building the Chip:
MASSIVE PCR
cDNA arrays: the
process
PCR PURIFICATION
and PREPARATION
PREPARING SLI DES
PRINTING
Preparing RNA:
CELL CULTURE
AND HARVEST
Hybing the Chip:
POST PROCESSING
ARRAY HYBRIDIZATION
RNA ISOLATION
DATA ANALYSIS
cDNA PRODUCTION
PROBE LABELING
DNA Array
excitation
cDNA clones
(probes)
cDNA arrays
in summary
PCR product amplification
purification
printing
laser 2
scanning
laser 1
emission
mRNA target)
overlay images and normalise
0.1nl/spot
microarray
Hybridise
target to
microarray
analysis
• Analisa DNA Array meningkatkan deteksi
Phytium pd kebun buah-buahan
• Secara relatif dpt mengidentifikasi
keanekaragaman spesies pd tanah
• Beberapa spesies baru dpt dideteksi,
dikarakterisasi hubungannya dg anggota
genus yg lain, serta bentuk asosiasi dg
tanaman inang
(Figure 1 Legend) Construction and
analysis of metagenomic libraries from
soil, hot spring outflow, deep ocean
tube worms and sponge tissue
using function-driven and sequencedriven approaches. This strategy was
originally proposed by Pace et al. [3]
and executed by Stein et al. [28].
(The photograph of non-phototrophic
organisms flanked by phototrophs in
hot spring outflow from the Porcelain
Basin Area of the Norris
Geyser Basin at Yellowstone National
Park is reproduced with permission
from CLE Fisher. Licensed for use,
ASM Microbe Library linked to
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Analysis



Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
merupakan salah satu teknik kultur independen
berdasarkan pemisahan amplikon polymerase chain
reaction (PCR) yang berukuran sama namun berbeda
sekuen.
PCR-DGGE biasanya diterapkan utk mengetahui
struktur komunitas mikroba tanpa kultivasi, dan utk
mempelajari dinamika komunitas sbg respon thd
faktor-faktor lingkungan
DGGE mrp metode yg dpt mendeteksi perbedaan
potongan DNA yang berukuran sama namun berbeda
sekuennya  potongan DNA dipisahkan dlm gel
denaturing gradient berdasarkan perbedaan profil
denaturasinya (melting)
Soil Community Analysis Using DGGE of 16S
rDNA Polymerase Chain Reaction Products
Denaturing gradient gel electrophoresis gel
of Bacteria 16S rDNA polymerase chain
reaction products (Bases 968 to 1406
relative to the E. coli rRNA sequence)
amplified from USA (Lanes 1–4) and
Norwegian (Lanes 5–6) soil-DNA extracts.
Gel gradient ranging from 30 to 55%
denaturant. Lane 1, no-till corn field; Lane 2,
no-till soybean field; Lane 3, plowed corn
field; Lane 4, plowed soybean field; Lane 5,
fallow field; Lane 6, pastureland
• Management of Soil Suppressiveness :
- Crop rotation
- Input system
- Tillage and fertilization
• 2,4-DAPG-producing fluorescent
pseudomonad  biological control
Penutup
• Aplikasi metode2 molekuler utk
mempelajari mikrobiologi tanah telah
menyediakan banyak informasi pd
identifikasi mikroorganisme tanah dan
kelimpahannya
• Teknik ini dpt memberikan dokumentasi yg
lengkap dr status mo tanah sepanjang
waktu
• Pengkajian cepat thd pengaruh praktek
pengelolaan pd mo target
• Penekanan seperti itu scr kritis untuk
mengidentifikasi keefektifan strategi
pengelolaan mo antagonis, jg dpt
memberikan penjelasan yg tepat bagi
kegagalan yg diharapkan utk mendorong
jumlah dan aktivitas dr populasi tersebut