TRANSLASI Sintesis Protein Pretest • Apa itu teknik PCR ? • Jelaskan tahapan yang terjadi dalam teknik PCR ? TRANSLASI • TRANSLASI : adalah proses penterjemahan informasi genetik yang ada pada mRNA kedalam rantai polipeptida/protein • Informasi genetik pada mRNA berupa rangkaian basa atau kodon, akan diterjemahkan menjadi rangkaian asam amino pada rantai polipeptida • ---- AGU UCG CAC GAC UUC UCU GAG ---• ---- Ser - Thr - His - Asp - Phe - Ser - Glu ----- Hubungan Gen dengan Protein • Pada penderita penyakit yang bersifat genetis terdapat kelainan enzim • Percobaan mutasi menunjukan bahwa pada mutan terjadi perubahan enzim • Pada hemoglobin penderita anemia terlihat perubahan asam amino dari rantai hemoglobin b Asam amino, Polipeptida, Protein R1 I HN -C -C H R2 I HN -C -C H R1 R2 I I HN -C -C - N -C -C H H Asam amino : molekul dasar penyusun protein Polipeptida: rangkaian asam amino Protein: molekul yang telah berfungsi tersusun dari satu atau lebih polipeptida Perangkat Translasi : mRNA sebagai model Protein • Polipeptida dibentuk dengan menggunakan rangkaian basa mRNA sebagai modelnya • Rangkaian basa mRNA mengandung informasi yang akan diterjemahkan menjadi rangkaian asam amino pada rantai polipeptida • ---- AGU UCG CAC GAC UUC UCU GAG ---• ---- Ser - Thr - His - Asp - Phe - Ser - Glu ----• Setiap satu asam amino disandikan oleh satu kombinasi tiga basa yang disebut kodon Ruas Penyandi Translasi : diapit kodon awal dan kodon akhir 5’ mRNA Prokariot (poligen) AUG UAA Shine-Dalgarno Kodon awal AUG UAG 3’ Kodon akhir 5’ 3’ AUG UGA mRNA Eukariot (monogen) AAAAAAAA tRNA : penterjemah kodon dan pengangkut asam amino Ujung 3’ACC penerima asam amino Simpul antikodon Ribosom : tempat penterjemahan kodon menjadi asam amino tRNA mRNA Komponen Ribosom Prokariot Subunit kecil Subunit besar Eukariot rRNA 5S 23S 30-38 protein 16S rRNA 18S 5S 5.8S 45-50 protein 28S Struktur dan Fungsi Ribosom Situs mRNA : mRNA dikenali oleh rRNA16S yang terdapat pada subunit kecil Situs P: tempat peptidil-tRNA Situs enzim peptidiltransferase Situs A: tempat aminoasiltRNA. Proses Translasi 1 Inisiasi translasi pada kodon awal Pertumbuhan polipeptida Sintesis 2 perpanjangan polipeptida Akhir translasi pada 3 kodon akhir Insiasi Translasi Dimulai dengan penempelan subunit kecil ribosom kecil pada situs Shine Dalgarno, penempelan tRNA-met inisiator pada kodon awal (situs P), dan pempelan subunit besar ribosom SD 30S Kodon awal Kompleks translasi AminoasiltRNA Situs A Sintesis Perpanjangan Polipeptida Amino asil-tRNA masuk ke situs A, Perangkaian asamamino dari situs P ke situs A, Pergeseran ribosom membaca kodon berikutnya Proses Akhir Translasi Asam amino Polipeptida A Kodon akhir Bila ribosom mencapai kodon akhir tidak ada tRNA yang cocok. Akan masuk RF di situs A, reaksi dengan H2O, dan pembebasan polipeptida, mRNA, tRNA dan ribosom Sifat Sandi Genetik • Kodon disusun oleh tiga basa yang berdampingan • Antara dua kodon tidak ada penyelang • Terdapat 61 kodon • penyandi 20 asam amino; dan tiga kodon stop • Satu kodon menyandi satu asam amino, satu asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu kodon • Kodon-kodon yang menyandi satu asam amino yang sama disebut kodon sinonim Sandi Genetik Hampir Universal • Keuniversalan sandi genetik terlihat dari kesamaan sandi antara berbagai spesies, misal antara bakteri dan tumbuhan • Ketidak universalan terlihat bahwa antara gen mitokondria dengan gen inti terdapat perbedaan sandi genetik Hierarkhi Struktur Protein • Struktur primer : berbentuk rantai asama amino linear sebagaimana polipeptida yang dihasilkan oleh suatu translasi • Struktur sekunder : perkembangan berupa pelipatan dari struktur primer akibat adanya ikatan hidrogen antar asam amino (tiap 5 aa) • Struktur tersier: bentuk tiga dimensi hasil pelipatan struktur sekindar berkat ikatan ion, ikatan disulfida antar gugus R asam-amino • Struktur kuartener: Gabungan beberapa poliprptida berstruktur tersier Struktur Sekunder Heliks-a terbentuk akibat munculnya ikatan hidrogen antara gugus NH dengan CO antara 2 asam amino (tiap 5 aa) Heliks a Lembaran b Lembaran b terbentuk ikatan hidrogen antara dua utas peptida yang berdampingan Struktur Tersier Protein Bentuk 3 dimensi yang dihasilkan berkat terbentuknya ikatan antar gugus R berbagai asam amino Ikatan hidrogen, ikatan ion, atau ikatan disulfida antar dua sistein Struktur ini juga dibentuk oleh orientasi gugus R, internal atau eksternal Struktur Kuartener Protein, merupakan gabungan dari beberapa polipeptida berstruktur tersier Hemoglobin TMV PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode molekuler untuk penggandaan DNA secara in vitro menggunakan enzim dan sepasang primer yang bersifat spesifik terhadap DNA target. Pertama kali dirumuskan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, dan berkat jasa temuannya ini ia memperoleh hadiah Nobel bidang kimia pada tahun 1993. Perkembangan dan aplikasi PCR sangat ditunjang oleh penemuan enzim DNA polimerase yang bersifat tahan panas. Enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq polimerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus. PCR digunakan secara rutin pada berbagai laboratorium seperti di perguruan tinggi, lembaga riset, industri farmasi, maupun laboratorium klinik. Denaturasi dan Renaturasi Reversible Strand Separation One of the most useful properties for the experimental analysis of DNA is its ability to undergo denaturation by heat and alkali conditions into singlestranded molecules and then to renature into a complementary basedpaired double helix (nucleic acid hybridization). These processes occur naturally and transiently during DNA replication and can be produced experimentally in the lab. Denaturation and Renaturation Conditions that favor denaturation destabilize the DNA double helix: a. Increased temperature. b. Decreased ionic concentration of solution. c. Addition of formamide or urea, both of which destabilize hydrogen bonding in the helix. d. Alkaline or basic pH, which also destabilizes hydrogen bonding in the helix. Conditions that favor renaturation stabilize the DNA double helix: a. Decreased temperature. b. Increased ionic concentration of solution PCR REACTION SETUP PCR menggunakan PCR Master Mix KAPA 2G Fast Component Volume in a 25 µL rxn PCR-Grade water 16.4µL 5X KAPA 2GBuffer A 5.0 µL dNTP Mix (10 mM each dNTP) 0.50 µL Forward Primer (10 µM) 1.0 µL Reverse Primer (10 µM) 1.0 µL KAPA 2GFast DNA Polymerase (5 U/µL) Template DNA 0.10 µL 1.0 µL PCR Cycling Parameters Step Temperature Duration Cycles 95 ˚C 5 min 1 94 ˚C 15 sec Annealing 50 ˚C 15 sec Extension 72 ˚C 15 sec Final extension 72 ˚C 3 min Initial denaturation Denaturation 35 1 Advantages of PCR Quick Reliable Sensitive Relatively easy Specific Disadvantage of PCR Need for equipment Taq polymerase is expensive Contamination False reactions Internal control Cross-reaction Enrichment steps in (contaminated) samples Capacity building needed Unspecific amplification Applications of PCR Detection of specific genome – Classical with a primer pair – Nested – amplification of larger area then specific detection in multiplied genome part (more sensitive) – Real time PCR to quantify the amount of genome in sample – Detection of RNA with reverse transcriptase Screening specific genes for unknown mutations Genotyping using short primers or primer pairs that are often repeated in the genome ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA to estimate the size of DNA fragments, after digesting with restriction enzymes Hasil PCR dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% (b/v) yang ditambahkan larutan etidium bromida (EtBr). Manfaat 1. Membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom; 2. DNA finger printing; 3. Mendeteksi kelainan genetik; 4. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu; 5. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau percobaan perlakuan gen; Manfaat Elektroforesis (lanjutan…) 6. Mempelajari evolusi tingkat molekular; 7. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam; 8. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu; 9. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu; 10.Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid Pembuatan gel agarosa Loading dan Running Preparasi sampel Pewarnaan gel (staining gel) Visualisasi UV How Gel Electrophoresis of DNA Works HASIL yang Baik Gel electrophoresis based image analysis. Agarose gels, stained by Ethidium bromide (A) and UV light (B). Contoh pemunculan pita fragmen ~1 kb Standar dalam penentuan ukuran fragmen hasil penggandaan digunakan pUC19/HinfI (lajur 1). Kontrol positif (lajur 2) dan kontrol negatif (lajur 3). Lajur 4, 5, 6, 7 menunjukkan fragmen 1 kb hasil penggandaan DNA dengan teknik PCR. Elektroforegram hasil PCR 1 2 3 23.1 kb 9.4 kb 6.5 kb 2,6 kb 4.3 kb 2.3 kb 1 2 32.0 kb 0,2 kb
