Halaman 1 ULASAN Akses terbuka Vitrifikasi sperma manusia: keadaan seni Yong Tao * , Erika Sanger, Arpornrad Saewu dan Marie-Claude Leveille Abstrak Kriopreservasi sperma telah banyak digunakan dalam teknologi reproduksi berbantuan (ART) dan telah menghasilkan jutaan kelahiran hidup. Dua pendekatan utama telah diadopsi: pembekuan konvensional (lambat) dan vitrifikasi. Sebagai teknik tradisional, pembekuan lambat telah berhasil digunakan dan digunakan secara luas di klinik ART yang terakhir, proses untuk memadatkan cairan menjadi bentuk amorf atau kaca, dapat menjadi metode alternatif yang lebih cepat kriopreservasi sperma dengan manfaat yang signifikan terkait dengan peralatan sederhana dan penerapan di pusat kesuburan. Vitrifikasi sperma memiliki keterbatasannya sendiri. Pertama, volume kecil beban biasanya dimasukkan ke nitrogen cair mencapai laju pendinginan yang tinggi, yang membuat kriopreservasi sampel volume besar kurang memungkinkan. Kedua, kontak langsung dengan nitrogen cair meningkatkan potensi risiko kontaminasi. Baru-baru ini, operator baru telah dikembangkan ke memfasilitasi peningkatan kendali atas volume dan kecepatan, dan strategi baru telah diterapkan untuk meminimalkan risiko kontaminasi. Singkatnya, meskipun vitrifikasi sperma belum diterapkan dalam sperma rutin kriopreservasi, potensinya sebagai prosedur standar sedang berkembang. Kata kunci: Kriopreservasi, Vitrifikasi, Kontaminasi, Nitrogen cair, Spermatozoa, Semen Latar Belakang Lebih dari 8 dekade yang lalu, pada tahun 1938, Luyet dan Hoddap membentuk vitrifikasi pertama sperma katak di udara cair [ 1 ]. Polge dkk. [2 ] di National Institute for Medical Penelitian di London, Inggris menyatakan "Kebangkitan spermaatozoa ”setelah mereka berhasil membekukan sampel sperma berbagai spesies dengan gliserol [ 2 ]. Kriopreservasi sperma telah banyak digunakan dalam teknologi reproduksi berbantuan (ART), termasuk pengobatan infertilitas dan program pemeliharaan kesuburan pasien cer. Penerapannya dapat berupa solusi terapeutik untuk pasien infertilitas pria. Upaya pertama menggunakan sperma vitrifikasi untuk kehidupan manusia kelahiran dilaporkan pada tahun 1953 oleh dua peneliti dari State University of Iowa, menggunakan sperma yang dibekukan di atas es kering [3], dan segera setelah publikasi, kelahiran hidup normal dideklarasikan. Sekitar satu dekade kemudian, kelompok yang sama mencoba dengan nitrogen cair (LN 2 ) dan berhasil [4 , 5]. Hidup kelahiran dari sperma beku setelah disimpan selama 4 dekade di LN 2 telah dilaporkan [ 6]. Kriopreservasi spermatozoa telah menjadi cara yang paling berharga dan digunakan untuk melestarikan kesuburan laki-laki, termasuk mereka yang menjalani kemoterapiapy atau radioterapi, mereka dengan oligospermia berat atau gangguan ejakulasi, dan orang dengan gangguan yang mengarah ke kerusakan testis. Saat ini, ada dua metode utama yang diterapkan kriopreservasi sperma manusia, yaitu, pertemuan pembekuan regional dan vitrifikasi. Pembekuan konvensional, pembekuan lambat, teknik tradisional, telah berhasilsepenuhnya digunakan untuk kriopreservasi sperma manusia berkali-kali di masa lalu. Sebaliknya, vitrifikasi adalah a teknik baru, dan telah menjadi alternatif yang tive metode pembekuan cepat. Teknik kriopreservasi tradisional masih banyak digunakan digunakan di klinik ART di seluruh dunia, tetapi vitrifikasi menjadi lebih efektif untuk kriopreservasi manusia spermatozoa setelah upaya dalam dekade terakhir [7]. Vitrifikation, dengan langsung memasukkan sampel sperma ke LN 2 , © Penulis. Akses Terbuka 2020 Artikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative Commons Attribution 4.0, yang mengizinkan penggunaan, pembagian, adaptasi, distribusi, dan reproduksi dalam media atau format apa pun, selama Anda memberi kredit yang sesuai untuk penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke lisensi Creative Commons, dan tunjukkan jika perubahan dibuat. Gambar atau materi pihak ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam artikel Creative Commons lisensi, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit materi. Jika materi tidak termasuk dalam artikel Creative Commons lisensi dan tujuan penggunaan Anda tidak diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda harus mendapatkannya izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini, kunjungi http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ . Pengabaian Dedikasi Domain Publik Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) berlaku untuk data yang disediakan dalam artikel ini, kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit untuk data tersebut. * Korespondensi: [email protected] Pusat Kesuburan Ottawa, 100-955 Green Valley Crescent, Ottawa, ON K2C 3V4, Kanada Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 https://doi.org/10.1186/s12958-020-00580-5 Halaman 2 adalah metode yang cepat, sederhana dan hemat biaya untuk kriopreservasi spermatozoa manusia. Metode ini menyebabkan pembekuan cepat tidak ada kerusakan dari kristalisasi es intraseluler selama pendinginan. Kelahiran hidup dicapai dengan spermatozoa dengan injeksi sperma intrasitoplasma (ICSI) [ 8] dan oleh inseminasi intrauterine [9 ]. Kelahiran yang sehat menggunakan vitrisampel sperma fied baru-baru ini dilaporkan di Spanyol setelah Blastokista hari ke-5 dipantau dan dipindahkan [ 10]. Cryoinjury, juga disebut cryodamage, adalah kerusakan bahan biologis cryopreservasi karena fase air berubah pada suhu rendah. Mekanismenya melibatkan ruptur osmotik oleh pembentukan es ekstra- atau intra-seluler. Viabilitas sel sangat tergantung pada integritas plasma membran serta organel seluler di dalamnya [11]. Kecepatan pendinginan juga mempengaruhi fisikokimia dan reaksi biofisik, dan dengan demikian mengubah kelangsungan hidup. Munculnya proteomik dan transkriptomik mungkin memberikan beberapa inspirasi untuk memahami cryoinjury mekanisme [ 12- 14 ]. Perspektif lain diangkat untuk menjelaskan mekanisme Nisme cryoinjury menggunakan model spermatozoa ikan. ini diketahui bahwa perubahan potensial membran mitokondria terjadi selama kriopreservasi, dan perubahan ini mencerminkan normalitas fungsional spermatozoa yang dikriopreservasi. Dibandingkan dengan spermatozoa manusia, ikan memiliki spermatozoa kriostabilitas membran mitokondria yang lebih rendah. Karena itu, Spermatozoa ikan dapat digunakan sebagai model untuk diteliti cryostability pada kerusakan spermatozoa manusia [ 15 , 16]. Apakah vitrifikasi lebih unggul daripada pembekuan konvensional? Vitrifikasi sperma telah diusulkan sebagai alternatif setelah upaya di tahun-tahun sebelumnya [ 7]. Embrio manusia cryopelestarian yang telah terjalin dengan baik dapat vide beberapa petunjuk untuk kriopreservasi sperma. Reed dkk. [ 17] meninjau data laboratorium dan klinis untuk semua yang dibekukan siklus penggantian embrio dari 2012 hingga 2015 dan memahami bahwa vitrifikasi lebih efektif, seperti yang diindikasikan dengan kelangsungan hidup yang lebih tinggi dalam embrio vitrifikasi dibandingkan dengan kriopreservasi pendinginan lambat. Selanjutnya vitrifikasi juga dapat diandalkan dan mudah dipelajari dan diterapkan di laboratorium sementara kehamilan klinis dan implantasi hasil tingkat serupa [ 17 ], yang didukung oleh penelitian lain telah [ 18- 20 ]. Salah satu cara untuk mengatasi apakah vitrifikasi lebih unggul pembekuan konvensional adalah membandingkan keduanya secara langsung metode menggunakan sampel air mani yang sama di tempat yang sama belajar (Tabel 1). Dengan 33 sampel air mani manusia, sebuah studi terkontrol eksperimen menemukan keduanya lambat cryopengawetan dan vitrifikasi memiliki hasil yang serupa, tetapi yang terakhir lebih cepat, lebih mudah dan terkait dengan toksisitas yang lebih rendah dan biaya [28 ]. Le dkk. baru-baru ini melakukan komunikasi langsung perbandingan antara vitrifikasi dan kriopreservasi lambat [ 32]. Mereka menggunakan 105 sampel air mani segar manusia, sive dari cryptozoospermia dan azoospermia, membaginya menjadi bagian yang dicuci dan tidak dicuci, dan masing-masing kelompok dibagi menjadi dua alikuot: satu kelompok cryopreservasi oleh pembekuan ventilasi sedangkan yang lainnya dengan vitrifikasi. Dulu menunjukkan bahwa pembekuan konvensional menghasilkan motilitas dan viabilitas yang lebih tinggi, sementara spermatozoa di bawah vitrifikasi lebih sehat dari segi morfologi dan memiliki lebih sedikit cacat pada kepala, bagian tengah, dan ekor sperma [ 32]. Baru-baru ini, Pabon et al. [ 33 ] menggunakan 47 manusia sampel sperma untuk membandingkan efisiensi vitrifikasi dan protokol pembekuan konvensional. Mereka menemukan vitrifikation optimal untuk kriopreservasi sperma sebagai vitrifikasi. protokol kation menghasilkan pemulihan motilitas yang lebih baik dan aktivitas mitokondria yang lebih tinggi [ 33]. Hasil serupa itu dilaporkan sebelumnya oleh peneliti lain [22, 24 , 25, 27]. Sebuah studi baru-baru ini merekrut 20 pria subfertil dengan air mani karakteristik oligoasthenozoospermia parah menjadi kompare efek dari dua pendekatan dan menemukan bahwa metode vitrifikasi hanya menggunakan cryopro- nonpermeabel tektan merupakan alternatif yang efektif untuk konvensional teknik slow-freeze [ 31 ]. Menggunakan epididimis dan tesspermatozoa ticular, Epis et al. juga menunjukkan itu vitrifikasi menghasilkan membran mitokondria yang lebih tinggi potensi dan motilitas daripada pembekuan konvensional [34]. Untuk membandingkan keefektifan dua metode, itu juga sah untuk mereview dan meringkas sebelumnya diterbitkan dan artikel terkait. Baru-baru ini, pengembalian sistematis pandangan dan meta-analisis dilakukan untuk membandingkan ini metode [ 35 ]. Para penulis meninjau total 2428 pubartikel yang dipinjamkan dan 13 uji coba terkontrol secara acak termasuking 486 vitrifikasi dan 486 kriopreservasi konvensional sampel sperma. Mereka menyimpulkan bahwa vitrifikasi cukup perior ke pembekuan konvensional dalam motilitas pasca-pencairan, ditermasuk motilitas total dan motilitas progresif, meskipun khasiat vitrifikasi bervariasi menurut vitrifikasi protokol dan kualitas sampel [ 35 ]. Secara kolektif, vitrifikasi sperma manusia telah menunjukkan potensi lipatan meskipun prosedur membutuhkan lebih lanjut optimasi seperti yang dibahas nanti. Krioprotektan dan alat kriode dalam vitrifikasi sperma Berbeda dengan vitrifikasi embrio, vitrifikasi dengan sperma krioprotektan yang sangat terkonsentrasi dan permeabel tidak sesuaimampu untuk spermatozoa karena spermatozoa mamalia ex- diajukan ke kondisi hipertonik selama kriopreservasi menyebabkan syok osmotik, dan menyebabkan ekor sperma melilit di ujung distal [36 ]. Paling umum digunakan permeabel krioprotektan termasuk dimetil sulfoksida, gliserol, glikol, etilen dan metanol, sedangkan albumin, dekstran dan telur kuning telur sitrat sering digunakan sebagai krioprotek nonpermeabeltants. Diketahui bahwa mengendalikan osmolaritas selama kriopreservasi sangat penting. Menggunakan permeabel krioprotektan dalam media kriopreservasi meningkatkan osmolaritas, yang berfluktuasi antara 600 hingga 1000 mOsm / L. Sebaliknya, media vitrifikasi sperma berada di antara isosmolar Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 2 dari 10 Halaman 3 Tabel 1 Perbandingan studi untuk pembekuan dan vitrifikasi konvensional spermatozoa manusia Penulis (tahun) Sampel direkrut Pembekuan konvensional prosedur Prosedur vitrifikasi Hasil perbandingan Saritha dan Bongso [21] 57 sampel air mani manusia a Gliserol digunakan. RT 10 mnt, cryotube 0.85 mL, LN 2 uap, 15 + 15 menit. RT yang dicairkan 30-45 menit. Gliserol digunakan. RT 10 menit Cryotube 0,85 mL. Terjun ke LN 2 . Hangatkan RT 30-45 menit. Tidak ada perbedaan motilitas ditemukan antara dua metode. Nawroth dkk. [ 22 ] 30 sampel air mani manusia. Asli atau swim-up. Gliserol digunakan. 0,25 mL jerami RT 10 mnt. 22 ° C hingga 4 ° C kali - 5 ° C / menit; 4 ° C sampai - 30 ° C oleh 10 ° C / menit; - 30 ° C hingga - 140 ° C oleh 20 ° C / menit. Dicairkan di bak air 37 ° C 50 s. Dengan atau tanpa krioprotektan permeabel. Lingkaran tembaga, 20 μl atau 0,25 mL sedotan. Terjun ke LN 2 . Dihangatkan 37 ° C sedang 5–10 menit. Krioprotektan permeabelvitrifikasi gratis menggunakan loop tembaga menghasilkan motilitas yang lebih tinggi dengan sampel swim-up dari pembekuan konvensional. Tidak perbedaan morfologi. Chang dkk. [23] 30 manusia sehat sampel air mani Media pembekuan digunakan. Freezer biologis digunakan. Pencairan tidak ditentukan. Media pembekuan digunakan. Terjun ke LN 2 . Pemanasan tidak ditentukan. Tidak ada perbedaan motilitas atau fragmentasi DNA ditemukan di antara dua metode. Vutyavanich dkk. [ 24 ] 30 normospermik sampel air mani manusia Media pembekuan digunakan. 0,25 mL sedotan, RT 10 menit. 20 ° C sampai 5 ° C kali - 1 ° C / menit; - 5 ° C sampai - 85 ° C oleh 10 ° C / menit. Dicairkan 25–28 ° C air ledeng. Gliserol digunakan. 0,25 mL jerami, 4 ° C 10 menit. Terjun ke LN 2 . Dihangatkan pada 25–28 ° C keran air. Vitrifikasi memberikan keunggulan motilitas dan cryosurvival dibandingkan pembekuan konvensional. Tidak ada perbedaan morfologi atau integritas DNA. Moskovtsev dkk. [ 25 ] 11 air mani manusia sampel. Dicuci. Media pembekuan digunakan. Uap LN 2 . Mencair tidak ditentukan. Krioprotektan permeabel Gratis. Pemanasan tidak ditentukan. Hasil vitrifikasi motilitas yang lebih tinggi dan motilitas progresif. Agha-Rahimi dkk. [26] 30 normozoospermik sampel. Dicuci. Gliserol digunakan. Cryotube, LN 2 uap 30 menit. Dicairkan dalam bak air 37 ° C 10 menit. Dengan atau tanpa gliserol. 30 μl drop, Dicelupkan ke dalam LN 2 . Dihangatkan pada 37 ° C sedang 5–10 detik. Kedua metode tersebut menghasilkan motilitas serupa, kelangsungan hidup, tingkat pemulihan dan DNA fragmentatioin.dll Tidak krioprotektan permeabel diperlukan untuk vitrifikasi. Zhu dkk. [27] 58 air mani manusia sampel. Dicuci. Gliserol digunakan. RT 5 menit LN 2 uap 30 menit. Kriogenik vial, 0,5 mL, uap LN2 30 menit. Dicairkan pada suhu 37 ° C mandi air sampai meleleh. Krioprotektan permeabel Gratis. Botol kriogenik, 0,25 mL, RT 1 menit. Terjun ke LN 2 . Dihangatkan dalam penangas air 42 ° C 1 menit, penangas air 37 ° C sampai meleleh. Vitrifikasi dengan optimal konsentrasi sukrosa menghasilkan lebih tinggi motilitas progresif, membran plasma dan integritas akrosom dari pembekuan konvensional. Tidak ada perbedaan motilitas atau stabilitas DNA. Ali Mohamed [ 28 ] 33 sampel air mani manusia Media pembekuan digunakan. 0,25 mL sedotan, RT 10 menit, LN 2 uap 30 menit. Dicairkan 37 ° C penangas air sampai meleleh. krioprotektan permeabel gratis, 37 ° C 5 menit, 100 μl sedotan, Terjun ke LN 2 . Dihangatkan di 42 ° C medium. Kedua metode memiliki kesamaan motilitas, kelangsungan hidup dan membran mitokondria potensi. Slabbert dkk. [20] 35 air mani manusia sampel. Dicuci. Media pembekuan digunakan. RT 10 menit. 0,5 mL sedotan, LN 2 uap 15 menit. Dicairkan 23 ° C 5 menit. krioprotektan permeabel Gratis. 300 μl sampel dalam 1,5 mL jerami RT 10 mnt. Terjun ke LN 2 . Dihangatkan di 42 ° C sedang 20 detik. Vitrifikasi lebih tinggi membran mitokondria potensial dan lebih rendah persentase DNA fragmentasi dari pembekuan konvensional. Tidak ada perbedaan motilitas. Tongdee dkk. [ 29 ] 37 manusia normal sampel air mani. Dicuci. Media pembekuan digunakan. RT 10 mnt, Cryovial, 0,5 mL, 25 ° C sampai 5 ° C kali - 1 ° C / menit; 5 ° C sampai - 85 ° C kali - 10 ° C / menit. RT yang dicairkan 15-20 menit. Media pembekuan digunakan. RT 10 menit, Cryovial, 0,25 mL, terjun ke LN 2 . Hangat RT 15-20 menit. Motilitas menurun lainnya dengan vitrifikasi. Tidak perbedaan morfologi atau intergritas DNA antara dua metode. Aizpurua dkk. [30] 18 normozoospermik sampel air mani manusia. Gliserol digunakan, tabung 1,8 mL, 4 ° C 30 menit, uap LN 2 30 menit. RT dicairkan 30 menit. krioprotektan permeabel gratis, 37 ° C 5 menit, penurunan 20 μl, Terjun ke LN 2 . Hangat pada 37 ° C 5 menit. vitrifikasi lebih tinggi motilitas dan normal morfologi, dan lebih rendah Fragmentasi DNA dari pembekuan konvensional. Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 3 dari 10 Halaman 4 300 hingga 396 mOsm / L, yang dapat dicapai dengan penggunaan krioprotektan nonpermeable atau kombinasi. Vitrification spermatozoa, bebas dari krioprotektan permeabel, sedang penting untuk menjaga potensi pembuahan sperma seperti kapasitasi, reaksi akrosom, dan integritas sitomembran plasmik dan mitokondria. Memang, tidak seperti hasil yang disebutkan di atas, menggunakan krioprotektan permeabel di mengakibatkan vitrifikasi sperma terganggu atau bahkan lebih rendah motilitas daripada pembekuan konvensional dengan cryo- permeabel pelindung [21- 23 , 29] (Tabel 1 ). Isachenko dkk. [ 18, 19 ] menggunakan 52 ejakulasi yang disiapkan renang manusia untuk vitrification tanpa krioprotektan permeabel. Mereka menemukannya di Berbeda dengan pembekuan konvensional dengan gliserol, vitrifikasi sperma menunjukkan motilitas yang lebih tinggi dan tingkat integritas cytomembran plasmik dan akrosom, sementara tidak ada perbedaan cryo-kapasitasi spontan atau reaksi akrosom diamati [ 18]. Slabbert dkk. [20] menggunakan 35 sampel air mani manusia untuk vitrifikasi bebas krioprotektan permeabel. Mereka menemukan bahwa teknologi bebas krioprotektan menghasilkan lebih tinggi potensi membran mitokondria tetapi fragmen DNA lebih rendah mentasi tanpa perbedaan dalam komposisi motilitas pasca-pencairan dikupas ke pembekuan lambat konvensional [20]. Aizpurua dkk. [ 30] menggunakan 18 sperma normozoospermic sampel untuk menguji vitrifica- bebas krioprotektan permeabel protokol tion. Mereka menemukan bahwa itu menghasilkan pemulihan yang lebih baik. tingkat sperma yang berkualitas baik dan pemeliharaan yang lebih baik kualitas sperma dibandingkan pembekuan lambat tradisional [30 ]. Di Selain itu, mereka juga menunjukkan sifat yang permeabel vitrifikasi bebas krioprotektan menunjukkan kinerja yang lebih tinggi. persentase spermatozoa hidup, pengawetan acrosomes, dan menurunkan fragmentasi DNA. Selanjutnya, menggunakan imunositokimia α-tubulin untuk menunjukkan sperma sitoskeleton, mereka menemukan bahwa sperma vitrifikasi memiliki kemiripan pola pelabelan di ekor untuk sperma segar, tetapi berbeda dari pembekuan lambat [ 30 ]. Namun, Agha-Rahimi dkk. [ 26] melakukan vitrifikasi pada 30 sampel normospermik manusia dengan dan tanpa krioprotektan, dan mereka menemukan bahwa sperma zen dalam krioprotektan permeabel tidak menunjukkan adanya racun icity atau perbedaan apa pun dalam motilitas pasca-pencairan, DNA fragmentasi, atau potensi pengikatan hyaluronan [ 26]. Dalam hal krioprotektan nonpermeable, beberapa mungkin berkinerja lebih baik daripada yang lain pada konsentrasi tertentu. Untuk Misalnya, Schulz dkk. membandingkan dua nonpermekrioprotektan mampu in vitrifikasi dengan sukarelawan sehat sampel air mani dan menemukan motilitas sperma pasca pemanasan menggunakan 0,1 mol / L trehalosa (69%) lebih tinggi dibandingkan sukrosa 0,25 mol / L yang banyak digunakan (58%). Selanjutnya, simiHasil lar diperoleh pada 6 dan 12 jam pasca-pencairan. 0,1 mol / Sperma yang diawetkan dengan l trehalosa telah meningkatkan membran tegritas pada 0 jam pasca pencairan, meskipun tidak ada peningkatan yang signifikanments pada 6 jam atau 12 jam dibandingkan dengan sukrosa [ 37 ]. Lain studi menemukan butylhydroxytoluene (BHT), sintetis analog vitamin E, vitrifikasi dipertahankan secara efektif fungsi sperma pada 1 mmol / L, termasuk progresif lebih tinggi motilitas sperma setelah pemanasan, integritas DNA, dan penurunan spesies oksigen reaktif [38 ]. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk menyelidiki krioprotektan nonpermeable optimal, Tabel 1 Perbandingan studi untuk pembekuan dan vitrifikasi konvensional spermatozoa manusia (Lanjutan) Penulis (tahun) Sampel direkrut Pembekuan konvensional prosedur Prosedur vitrifikasi Hasil perbandingan Karthikeyan dkk. [ 31 ] 20 parah oligoasthenozoospermia (SOA) dan sampel yang sangat SOA b Media pembekuan digunakan. 0,5 mL sedotan, - 85 ° C masuk lemari es 1 jam. Dicairkan pada RT 10 menit. krioprotektan permeabel Gratis. Cryologic dengan stripper. Dihangatkan dalam media 37 ° C Vitrifikasi terungkap vitalitas motilitas yang lebih tinggi dengan sampel yang sangat SOA daripada konvensional pembekuan. Le dkk. [32] 105 air mani manusia sampel. Dicuci dan belum dicuci. Gliserol digunakan. Cryotube RT 10 menit Uap LN 2 15 menit. Dicairkan pada suhu 37 ° C mandi air 5 menit. Gliserol digunakan. RT 10 menit 30 μl drop, dimasukkan ke dalam LN 2 . Dihangatkan pada 37 ° C air mandi 5 menit. Pembekuan konvensional metode menghasilkan motilitas yang lebih tinggi, viabilitas sementara vitrifikasi menghasilkan lebih tinggi morfologi normal. Pabon dkk. [ 33 ] 47 air mani manusia sampel, Swim-up Gliserol digunakan. RT 10 menit 50 μl tetes di atas es kering, cryotube. RT yang dicairkan 10 menit, kemudian 37 ° C 10 menit. krioprotektan permeabel Gratis. RT 3 menit. Pengumpulkisi, tetes 5–10 μl, terjun ke LN 2 . Dihangatkan di 44 ° C sedang 3 menit. Vitrifikasi disajikan motilitas yang lebih tinggi, viabilitas dan aktivitas mitokondria dibandingkan pembekuan konvensional. Spis dkk. [ 34 ] 1 epididimis dan 1 sampel sperma testis Gliserol digunakan. 20 + 8 kapiler. Uap LN 2 30 menit. Dicairkan pada suhu 37 ° C mandi air 50 s. krioprotektan permeabel Gratis. 20 + 8 kapiler. Terjun ke LN 2 . Hangat dalam 37 ° C sedang 20 detik Vitrifikasi lebih tinggi membran mitokondria potensi dan motilitas masuk baik epididimis dan kapiler testis dari pembekuan konvensional c . sebuah sampel 57 manusia semen termasuk 15 sampel dicuci normozoospermic, 15 dicuci, 15 sampel dicuci normozoospermic oligozoospermic, 12 oligozoospermic dicuci b Oligoasthenozoospermia sangat parah (VSOA) mengacu pada sampel dengan konsentrasi <1 juta / mL, motilitas progresif <10% c Tiga bayi sehat lahir setelah ICSI menggunakan vitrifikasi epididimis (1 bayi) dan spermatozoa testis (2 bayi) Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 4 dari 10 Halaman 5 konsentrasi mereka, atau kombinasinya tergantung pada perbedaan parameter semen manusia yang berbeda atau untuk tujuan klinis. Selain sistem terbuka seperti cryoloop, sejumlah pembawa tertutup telah dikembangkan dan diterapkan secara in vitrification, termasuk straw-in-straw, vitrifica- keamanan tinggi sedotan, Cryotip, VitriSafe, Cryopette, cryoLogic, Rapid-i, sistem S3, dan perangkat S3 μS-VTF [39 -42], banyak di antaranya telah terbukti efektif untuk tujuan yang berbeda. pose. Lebih banyak operator diharapkan untuk dikembangkan dan dioptimalkan untuk memfasilitasi vitrifikasi sperma di masa depan. Dengan kemajuan pesat teknologi pencetakan 3-D, itu benar sekarang mungkin untuk merancang dan mencetak perangkat pembekuan. Ini teknik bisa menjadi fleksibel, murah dan pendekatan standar untuk menghasilkan perangkat pembekuan [43]. Satu dari termoplastik pencetakan 3-D, asam polylactic, memiliki terbukti sangat cocok digunakan untuk kegiatan kriogenik dan sudah biasa digunakan di printer 3-D. Karena teknik pencetakan kelas 3-D dapat dengan mudah menjadi standarized dan dimodifikasi, pencetakan 3-D untuk membentuk dewakil telah menunjukkan aplikasi potensinya dalam sperma kriopreservasi. Apakah vitrifikasi harus pembekuan sangat cepat? Dipercaya bahwa, untuk menghindari kerusakan krio dalam vitrifikasi, volume pemuatan sampel di setiap pembawa harus cukup rendah untuk mencapai tingkat pendinginan yang tinggi [ 44 , 45 ]. Reduvolume cing juga membantu mengurangi kemungkinan inti esasi. Dengan terjun langsung ke LN 2 , sampel sperma bisa mencapai laju pendinginan 2, 000–10, 000 ° C / menit. Namun, mengurangi volume sampel membatasi efisiensi dalam praktiknya, karena terlalu banyak unit beku dengan volume kecil (≤20 μl) tidak hanya membuat proses operasi memakan waktu, tetapi juga membuatnya sulit untuk mengumpulkan cukup banyak moubin sperma setelah pemanasan. [ 30] membandingkan efisiensi lambat dan sangat cepat pembekuan dan menentukan tingkat fragmentasi DNA setelah pembekuan-pencairan lambat dan pemanasan-vitrifikasi. Dengan 18 sampel air mani manusia normal, mereka menemukan itu pembekuan sangat cepat menghasilkan motil- progresif yang lebih tinggi ity (18% vs 11%), tingkat morfologi mormal lebih tinggi, vitality, dan fragmentasi DNA sperma lebih rendah (20% vs 27%) dibandingkan dengan pembekuan lambat. Mereka menyimpulkan bahwa pembekuan sperma sangat cepat lebih baik daripada pembekuan lambat [ 30]. Baru-baru ini, Hosseini et al. [ 46 ] mempersiapkan manusia sampel dari normozoospermic ejakulasi oleh swim-up, dan rendahnya jumlah spermatozoa manusia yang dibekukan langsung tenggelam di LN 2 atau uapnya. Mereka menemukan itu perendaman langsung menghasilkan sperma yang lebih tinggi progresifnya motilitas dan tingkat motilitas total, perubahan yang lebih rendah pada kromatin sperma ditunjukkan dengan chromomycin-A3 dan Pewarnaan Aniline Blue, tetapi tidak mempengaruhi morfologi, acintegritas rosome atau kerusakan DNA [ 46]. Menggunakan ukuran sedotan yang berbeda untuk vitrifikasi, kelompok pencari melakukan vitrifikasi pada 22 sperma donor manusia yang subur sampel dengan sedikit spermatozoa. Mereka menggunakan sedotan mikro (50–100 μl) serta sedotan tradisional (0,25 ml dan 0,5 ml). Bandingkan dengan sampel sperma yang dibekukan secara tradisional sedotan, sperma yang dibekukan dalam sedotan mikro menunjukkan lebih tinggi motilitas sperma setelah pembekuan-pencairan tidak ada perbedaan dalam morfologi, akrosom, atau integritas DNA [47 ]. Itu penulis mengira sedotan mikro lebih tipis dan mereka menyimpan volume yang sangat kecil, tingkat pembekuannya banyak lebih cepat. Membekukan sejumlah kecil sperma manusiaatozoa, pelat mini multi-sumur baru saja dikembangkan untuk vitrifikasi menggunakan tetesan ~ 1 μl. Sperma dibekukan menggunakan metode ini menunjukkan tingkat pemulihan keturunan dan pos mencairkan motilitas [ 48 ]. Pendekatan baru ini dikomentari oleh Paffoni dan Palini [ 49] [ 49 ]. Seperti disebutkan di atas, beberapa ilmuwan menyarankan untuk menggunakan ikan model pembekuan spermatozoa untuk menyelidiki mekanisme nisme mengapa vitrifikasi bebas krioprotektan untuk manusia ejakulasi lebih baik daripada pembekuan konvensional dan vitrifikasi. kation dengan krioprotektan [ 15 , 16, 50 ]. Sebaliknya, Isachenko et al. [51] menemukan pendinginan kecepatan tidak harus sangat cepat. Mereka membandingkan kualitas metode vitrifikasi sperma manusia (720, 000 ° C / menit) dan pendinginan relatif lambat menggunakan uap LN 2 (150-250 ° C / menit) tanpa agen krioprotektan oleh cryoloop. Mereka menemukan kedua mode pendinginan menyebabkan comhasil perumpamaan dalam hal motilitas, kemampuan pemupukan ity, dan integritas DNA dari spermatozoa yang dihangatkan [51]. Tampaknya berbagai tingkat pendinginan diterapkan sanggup. Jika kecepatan pendinginan selama vitrifikasi fleksibel, vitrifikasi aseptik dengan double straw yang mengandung lebih tinggi volume 0,1 hingga 0,5mL akan memungkinkan penggunaan ini teknik dalam ART manusia [18, 19 ]. Menariknya, pada manusia vitrifikasi embrio manusia, kelangsungan hidup embrio lebih tinggi untuk vitrifikasi bervolume besar, yang memiliki laju pendinginan lebih rendah sebanding dengan vitrifikasi mikro-volume [ 17 ]. Pemanasan spesimen vitrifikasi Selain pembekuan kecepatan tinggi (2, 000 ° C / mL), kecepatan pemanasan air juga harus tinggi di dalam spermatozoa berpindah dari keadaan seperti kaca menjadi cair tanpa pembentukan kristal es. Menggunakan spermatozoa manusia sampel, Sanchez et al. [52 ] menemukan suhu di Proses devitrifikasi sangat penting untuk dilestarikan keutuhan morfologi membran dan fungsi sperma [ 52]. Lebih lanjut, Mansilla et al. [ 53] mencoba untuk menentukan suhu pemanasan optimal setelah sperma manusiavitrifikasi atozoa dan menemukan motilitas progresif pada sampel sperma dihangatkan pada 42 ° C (65%) lebih tinggi dari mereka yang berada pada suhu 38 ° C (26%) dan 40 ° C (57%) dan fungsi bran juga lebih baik dipertahankan pada suhu 42 ° C [53]. Ali Mohamed [28 ] juga menghangatkan sperma manusia yang mengalami vitrifikasi sampel dalam media yang dihangatkan pada suhu 42 ° C [ 28]. Pabon dkk. menghangatkan mikropil spermatozoa manusia yang vitrifikasi (5–10 μl masing-masing) dalam 500 μl medium sebelum dan Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 5 dari 10 Halaman 6 dipertahankan pada 44 ° C selama 5 detik dan penurunan yang diamati setelah mencairkan motilitas dan aktivitas mitokondria [ 33]. Lain laporan yang disebutkan di atas sperma manusia vitrifikasi yang dihangatkan samples (pelet 30 μl) dalam penangas air 37 ° C selama 5 menit hasilmasuk ke dalam sperma motil dan subur [ 32], menunjukkan fleksibilitas prosedur pemanasan. Apa resiko kontaminasi menggunakan sperma vitrifikasi? Sebagian besar metode vitrifikasi sperma yang diusulkan, seperti itu sebagai cryoloop, dijelaskan sebagai sistem terbuka untuk mendapatkan tingkat pendinginan yang tinggi [51 ]. Hal ini membawa disadvan besarTage risiko kontaminasi potensial sebagai ex- sistem terbuka taruh sampel air mani langsung ke LN 2 . Nitrogen pertama kali dicairkan pada tahun 1883 oleh fisioterapis Polandia. cists Wroblewski dan Olszewski. Bekas cairan ke gas rasio ekspansi nitrogen adalah 1: 694. Nitrogen cair adalah diproduksi secara komersial dengan mengompresi udara dan menggunakan distilasi fraksional. Kecuali diminta secara khusus, nitrogen cair komersial yang disediakan oleh pemasok tidak steril. Oleh karena itu, ini merupakan sumber potensial kontaminasi seperti yang dapat dilakukan oleh sejumlah agen infeksius bertahan hidup pada suhu kriogenik. Sudah baik mendokumentasikan bahwa pos LN 2 komersial yang tidak steril saudara kandung membawa mikroorganisme yang meningkatkan risiko penularan dan penyebaran penyakit. Besar Berbagai spesies bakteri, virus dan jamur telah banyak ditemukan dalam nitrogen cair [54 -57 ]. Bakteri umum kontaminan termasuk Pseudomonas spp. , Enterobacter cloacae, Staphylococcus sciuri, Acinetobacter calcoaceticus, dan Flavobacterium spp. [ 54]. Memang, kelangsungan hidup patogen kriogenik di LN 2 menghasilkan kemungkinan kontaminasi silang antara LN 2 dan sampel yang disimpan karena LN 2 yang steril dapat tercemar dari sampel semen terkontaminasi yang disimpan sehingga menjadi sumber pencemaran itu sendiri [50 , 54, 58]. Bahan yang digunakan selama kriopreservasi, terutama Secara khusus, krioprotektan dan media meningkatkan daya tahan kemampuan patogen tersebut. Selanjutnya diulang pembekuan dan pemanasan dapat mempengaruhi kelangsungan hidup patogen dengan cara yang berbeda [ 59]. Secara relatif, jamur itu sensitif terhadap pembekuan sementara bakteri memiliki toleransi yang tinggi. Piasecka-Serafin [60] melaporkan translokasi bakteri dari pelet semen yang terinfeksi, ke LN 2 steril , lalu ke pelet semen steril. Hanya dalam 2 jam dari cryostorage, sebanyak 94% dari sampel steril menjadi kontaminan. dikaitkan dengan E. coli dan S. aureus [ 60]. Kemampuan jalangen untuk bertahan hidup di LN 2 lebih lanjut didemonstrasikan di LN 2 terkontaminasi dengan stomatitis vesikuler menular virus [61 ] dan kemudian kontaminasi silang dengan hepatitis B. dari sumsum tulang cryostored karena kebocoran kemasan. Kebocoran ini mempengaruhi 4 pasien yang menerima tulang kriostor sumsum [62]. Kemampuan bahan kriopreservasi untuk menjadi taminated setelah penyimpanan di terkontaminasi LN 2 telah ditampilkan di LN 2 yang sengaja dibubuhi virus berbeda. Di penelitian ini, embrio sapi di vitrifikasi di standar tersegel 0,25 ml atau sedotan tarik terbuka yang dimodifikasi atau dalam cryovial plastik tertutup dan kemudian dimasukkan ke dalam nitrogen fase cair tercemar. Setelah 3–5 minggu penyimpanan di LN 2 yang terkontaminasi , embrio sapi dicairkan dan dicuci secara berurutan. Hanya mereka yang memiliki zona pelusida utuh (ZP) dikumpulkan bersama dan diuji untuk virus diare virus sapi (BVDV), sapi herpesvirus-1 (BHV-1), dan imunodefisiensi sapi virus (BIV). Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua embrio kontrol vitrifikasi dalam cryovial tertutup dan sedotan bebas kontaminasi virus, tetapi 13 dari 61 (21%) kumpulan bekas terhadap BVDV dan BHV-1 positif untuk ciation sementara tidak ada dari 22 batch yang terpapar BIV di kontainer yang tidak disegel BIV-positif [ 54, 56]. Anehnya, Cobo dkk. [ 63] menyaring budaya medium dan LN 2 digunakan untuk vitrifikasi oosit dan embrio 24 wanita untuk RNA dan DNA virus. Mereka menemukan itu Tidak satupun dari 33 sampel menggunakan media kultur atau 27 menggunakan LN 2 sampel positif HIV, virus hepatitis B. (HBV) atau kontaminasi virus hepatitis C (HCV), bahkan menggunakan perangkat terbuka untuk vitrifikasi [ 63]. Total 6, 11, dan 6 pasien seropositif untuk HIV, HCV, dan HBV, masing-masing, sedangkan 1 pasien menunjukkan koinfeksi hubungan dengan HCV dan HBV. Tujuh pasien mempresentasikan posisi Lima viral load darah (1 HIV, 1 HBV, 5 HCV). Itu Hasil penelitian ini mungkin terbatas karena relatif ukuran sampel rendah. Molina dkk. [ 64] secara langsung membandingkan kontaminasi risiko bakteri dan jamur antara kaca terbuka dan tertutup perangkat fikasi dengan oosit dan embrio manusia. Antarsecara estetika, mereka juga menemukan bahwa bakteri risiko kontaminasi tidak lebih besar untuk wadah terbuka daripada untuk wadah tertutup dalam vitrifikasi dan tidak ada bakteriKontaminasi ial atau jamur diamati baik di tempat terbuka atau perangkat tertutup yang menyimpan oosit dan embrio manusia setelah penyimpanan 1–2 tahun [64]. Untuk mengidentifikasi bakteri, sussampel yang dicurigai diinokulasi pada piring agar yang berbeda dan berbudaya 2–3 hari. Jika ada koloni yang disajikan setelah inokulasi, masing-masing disubkultur ke yang baru piring untuk kemurnian. Kultur murni kemudian diwarnai Gram untuk morfologi dan teridentifikasi. Deteksi jamur adalah mobilmenggunakan agar dekstrosa Sabouraud dengan chloranphenicol dan jamur berserabut diidentifikasi di dasar dari fitur morfologi makroskopis dan mikroskopis tures. Mereka menemukan kelima kontainer yang digunakan untuk menyimpan oosit dan embrio selama 1–17 tahun terkontaminasi dengan bakteri, terutama Bacillus spp , Stenotrophomonas maltophilia dan Enterobacter spp ., sebelum dan sesudah LN 2 mengisi, tetapi tidak ada jamur meskipun media, perangkat atau LN 2 yang digunakan bebas dari bakteri atau jamur Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 6 dari 10 Halaman 7 sebelum digunakan. Ada Acinetobacter lwoffii , Alcaligenes faecalis ssp. faecalis , dan Sphingomonas paucimobilis di bagian bawah wadah penyimpanan tetapi tidak ada jamur yang melayani. Kontaminasi tidak memiliki korelasi dengan jumlah sampel yang disimpan atau waktu penampung telah digunakan. Sumber patogen ini bisa jadi lingkungan kriopreservasi [ 64 ]. Joaquim dkk. [58 ] meninjau potensi bahaya dari transmisi fektif melalui cryopreserved dan banked gamet dan embrio di LN 2 selama kriopreservasi ditermasuk virus, bakteri dan jamur [58 ]. Dalam beberapa tahun terakhir, Zika vius telah meluas, dan diketahui menyebabkan serious cacat lahir yang dikenal sebagai microcephaly. Itu masih belum diketahui jika virus Zika mampu bertahan di LN 2 , tetapi British Fertility Society telah menyarankan kemungkinan [65 , 66 ]. Pengendalian kontaminasi Tidak ada metode pembekuan yang benar-benar aman. Sering dibersihkan peralatan bekas harus menjadi ukuran dasar, termasuk pengirim kering, tangki, dewar, kaleng, tongkat, dan sampel operator. Namun, pemeliharaan seperti itu mungkin membutuhkan samples untuk dikeluarkan dari penyimpanan, yang bisa menempatkan spesimen yang disimpan berisiko [ 54 -56, 58, 67 ]. Dasar lainnya Aturan untuk menghindari kontaminasi adalah menyimpan yang tercemar sampel secara terpisah di karantina untuk meminimalkan risiko kontaminasi silang jika memungkinkan. Diproduksi secara komersial LN 2 sendiri dapat mengandung patogen kriogenik dan datang sumber kontaminasi. Namun, memperoleh a sejumlah kecil LN 2 steril dapat dilakukan dengan mensterilkan udara yang digunakan untuk membuat LN 2 . Misalnya, McBurnie dan Bardo [68 ] menunjukkan bahwa filtrasi udara dengan 0,22 μm polytetrafluoroethylene secara efisien mempertahankan Brevundimonas diminuta dengan suhu ekstrim, tekanan tinggi yakin, laju aliran tinggi, dan konsentrasi bakteri tinggi sebelum produksi LN 2 . Atau, penyaringan LN 2 biasa tetapi tidak steril sebelum sampel dikeluarkan berpose bisa lebih sederhana. Memang, sebuah perangkat bernama CLAir dikembangkan untuk digunakan dalam vitrifikasi pada manusia oosit dan embrio tikus [ 69 ]. Filter 0,22 μm dilengkapi di dalam tabung dapat menghasilkan cairan steril udara pada suhu yang sama dengan LN 2 sehingga sampel disimpan dalam tabung tertutup (esther) hanya terkena udara cair steril. Udara cair menunjukkan vitrifikasi yang sama hasil dengan oosit manusia dan embrio tikus tapi tanpa kontaminasi sementara kontaminan dalam jumlah besar inasi dengan LN 2 biasa diamati. Agaknya, perangkat semacam itu dapat digunakan untuk mencegah kontaminasi di proses vitrifikasi sperma. Strategi dasar lain untuk mengendalikan kontaminasi adalah dengan hindari kontak langsung dengan LN 2 . Oleh karena itu di bawah standable bahwa pembawa tertutup seperti yang digunakan dalam konvensional pembekuan menunjukkan insiden kontaminasi yang lebih rendah dalam perbandingan dengan yang terbuka. Cryoloop, perangkat yang banyak digunakan di dimana spesimen langsung terendam di LN 2 , menghasilkan efek vitrifikasi yang cukup besar dengan mengorbankan kontaminasi sampel yang parah [55 ]. Seperti menggunakan tertutup pembawa dalam proses vitrifikasi tidak selalu layak, bukti telah menunjukkan bahwa menggunakan uap nitrogen cair, dibukan LN 2 itu sendiri, untuk menyimpan sampel sperma manusia bisa menurunkan risiko kontaminasi silang virus [ 70]. FortuAkhir-akhir ini, upaya untuk meningkatkan penggunaan operator tertutup di vitrifikasi sperma telah dibuat dan telah menunjukkan hasil yang menggembirakan. Misalnya, Isachenko et al. [ 18, 19 ] mengembangkan teknologi aseptik untuk spermatozoa manusia vitrifikasi. Mereka digunakan dalam sedotan inseminasi 0,5mL untuk inseminasi intrauterin segera dan tercapai hasil yang memuaskan dengan normozoospermic dan se- sampel benar-benar oligozoospermic [18 ]. Slabbert dkk. [20 ] menggunakan sedotan 0,5 ml untuk memuat 300 μl sampel agar cukup ruang udara yang efisien di dalam sedotan untuk mencegah pecah saat dibenamkan ke LN 2 . Metode ini berhasil dengan suksessepenuhnya dengan 35 sampel air mani manusia yang mengalami vitrifikasi [ 20 ]. DiazJimenez dkk. [71 ] cryopreservasi enam ejakulasi keledai, yang di vitrifikasi dengan larutan sperma 30 μl suspensi bola atau 100 μl dalam sedotan 0,25 ml dengan 0,1 Sukrosa M tanpa gliserol. Mereka menemukan sedotannya Metode menghasilkan motilitas total dan progresif yang lebih tinggi sementara tidak ada perbedaan dalam integritas membran plasma [71]. Tampaknya vitrifikasi sperma tidak berkompromi motilitas pasca-pencairan saat menggunakan pembawa tertutup. Sedotan desain sedotan, atau sedotan ganda, memungkinkan adanya sedotan bagian dalam berisi spesimen dan kemudian disegel dan dimasukkan ke jerami luar, dan kemudian seluruh unit terendam LN 2 jadi tidak ada paparan langsung ke LN 2 . Desain menunjukkan hasil vitrifikasi yang cukup besar dengan 82 tikus Embrio D2 / D3 dalam larutan 30 μl [72 ] dan 113 manusia oosit dan 93 blastokista menggunakan media 1 μl [ 73]. Masih, saat dimuat, spesimen berisi jerami bagian dalam bisa meledak selama pembekuan dan pemanasan karena udara fluktuasi tekanan. Sebab, tipis, berdinding sempit kapiler dikembangkan untuk mempercepat suhu konduksi dan mengurangi volume udara [ 74- 76 ]. Kontrainsiden pencemaran metode jerami ganda ini harus tidak lebih besar dari metode konvensional. Ada metode perantara yang merupakan hibrida dari terbuka dan sistem tertutup untuk mencapai manfaat masing-masing metode. Sampel dapat di vitrifikasi dengan kontak langsung ke a sejumlah kecil LN 2 yang dimurnikan , lalu disegel dan disimpan dalam jumlah banyak LN biasa 2 . Metode ini memiliki telah dilaporkan dalam vitrifikasi embrio manusia [ 77], dan dapat diuji kemanjurannya dalam vitrifikasi sperma. Sinar ultraviolet (UV) juga bisa menjadi solusi yang memungkinkan untuk mengurangi risiko kontaminasi pada sampel sperma vitrifikasi ples. Mengobati volume kecil LN 2 dengan sinar UV di a dosis radiasi yang sesuai telah dibuktikan efektif efektif mengurangi jumlah patogen, termasuk bakteri teria, virus, dan jamur [ 78 ]. Dilaporkan bahwa 8, Sinar UV 000 μW / cm 2 dapat memusnahkan virus hepatitis B. Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 7 dari 10 Halaman 8 sedangkan 330.000 μW / cm2 memusnahkan cendawan Aspergillus niger . Kebanyakan virus menjadi tidak aktif oleh sinar UV pada saat dosis dari 200, 000 μW / cm 2 [ 79 ] sementara virus Zika mungkin memilikinya resistensi yang lebih tinggi terhadap sinar UV [ 79 ]. Karena itu, sinar UV bisa menjadi solusi yang layak untuk mengurangi kontaminasi tarif di LN 2 non-steril . Sayangnya, penerapan sinar UV untuk LN 2 conmencemari sampel manusia masih kontroversial. Sinar UV digunakan juga dapat menyebabkan penyimpangan genetik yang parah spermatozoa yang disimpan, dan selanjutnya ke embrio yang telah dibuahi, meskipun sebuah penelitian dengan oosit manusia telah menunjukkannya tidak ada efek samping [ 80]. Solusi sederhana adalah mensterilkan LN 2 dengan sinar UV sebelum digunakan untuk membekukan dan menyimpan sampel air mani. Membilas sampel yang terkontaminasi dengan sterile LN 2 secara signifikan dapat mengurangi patologi kontaminan gen. Parmegiani dkk. [75] mencuci oosit manusia dan embrio yang sengaja terkontaminasi dengan bakteri ( P. aeruginosa , E. coli, dan S. maltophilia ) dan jamur (A. Niger) tiga kali dalam LN 2 disterilkan dengan sinar UV. Mencucimemasukkan sampel-sampel ini dalam LN 2 yang disterilkan menghilangkan taminasi bakteri (0/65) dan jamur (0/25) sementara sampel yang tidak dicuci tetap sangat terkontaminasi dikategorikan dengan bakteri (92/117) dan jamur (25/25) [75]. Perhatian lain dengan penggunaan sinar UV untuk mensterilkan LN 2 adalah pembangkitan ozon, yang dapat merusak efek mental pada sistem penyangga di mana file sampel kriogenik disimpan. Untungnya, formasi ozon dari sinar UV tidak signifikan saat ozon terbentuk dengan pemecahan molekul oksigen oleh aksi Radiasi UV. Ketika atom oksigen ini terpisah, mereka bergabung dengan molekul oksigen lain untuk membentuk ozon. Namun, karena LN 2 hampir bebas dari oksigen, ini seharusnya tidak menjadi masalah dengan sterilisasi sinar UV LN 2 [ 80 ]. Secara umum, tidak ada cara yang mudah tetapi hemat biaya sepenuhnya menghilangkan semua potensi risiko kontaminasi dalam vitrifikasi sperma. Tapi berdasarkan improvinsi dalam beberapa tahun terakhir, adalah mungkin untuk mengontrol risiko kontaminasi vitrifikasi ke tingkat kontaminasi pembekuan ventilasi. Apakah ada protokol vitrifikasi universal untuk semua jenis sampel sperma? Pengoptimalan protokol pengawetan yang cermat dapat ous, membingungkan dan mahal karena perangkat tertentu dan reagen diperlukan. Apakah mungkin untuk mengembangkan universal protokol untuk semua spesies dan semua sampel? Kedengarannya tidak mungkin karena cryotolerance spermatozoa debergantung pada fitur sperma seperti ukuran, bentuk, dan lipid komposisi, yang membuatnya menantang untuk menghasilkan dosagle prosedur pembekuan standar untuk semua spesies. Bahkan dalam manusia, ada bermacam-macam spesimen sperma, seperti sampel normospermik, oligospermik, azoospermik, tesaspirasi sperma ticular (TESA), dan episampel dengan aspirasi sperma didymal (PESA) berbeda parameter seperti volume, konsentrasi, motilitas, dan fitur plasma mani. Selain itu, sulit untuk menilai tablish model stereotip universal untuk melayani yang berbeda tujuan kriopreservasi di klinik manusia. Rozati dkk. [ 81 ] mengulas perangkap cryopreservation, terutama penyimpanan sperma untuk pasien kanker [81]. Faktanya, ada upaya untuk membangun vitrifikasi universal. metode kation untuk hampir semua sampel termasuk oosit, sel primer, sel induk, dan sel yang dimodifikasi secara genetik. Itu metode yang diusulkan konsentrasi rendah krioprotektan ditermasuk 1,5 M propanediol dan 0,5 M trehalosa di industri kelas microcapillaries terbuat dari sil- sil yang sangat konduktif ica. Itu menunjukkan bahwa protokol universal ini mencapai tingkat pemulihan dan viabilitas yang tinggi setelah vitrifikasi untuk sel epitel susu manusia, hepatosit tikus, tumor sel dari efusi pleura, dan beberapa garis sel kanker [ 82]. Sayangnya, karena karakteristik yang berbeda spermatozoa dari jenis sel yang diuji, metode ini akan tidak mungkin lebih unggul dari cryopreser sperma khususprotokol vation yang ada saat ini. Kesimpulan Dalam dekade terakhir, aplikasi vitrifikasi klinis salah satu pencapaian terpenting dalam ART pada manusia. Saat ini, pembekuan sperma konvensional masih menjadi yang utama metode yang digunakan untuk kriopreservasi sperma di klinik ART, tetapi vitrifikasi sperma telah menunjukkan keuntungan besar. Secara teknis, vitrifikasi sperma memiliki perbedaan substansial dari pembekuan lambat tional dan dari oosit dan embrio vitrifikakarena kecenderungan sperma untuk berkembang cryodamaged. Semakin banyak penelitian menunjukkan bahwa a pendekatan vitrifikasi bebas dari kriopro non-permeabel tektan bekerja lebih baik daripada pembekuan lambat konvensional protokol untuk cryopreseravtion sperma manusia. Vitrifica spermation biasanya membutuhkan volume beban yang kecil untuk mencapai tinggi laju pendinginan, yang membuatnya kurang layak dengan sampel volume besar, tetapi dalam beberapa tahun terakhir, banyak desain baru volume yang lebih besar telah diuji dan dikembangkan, dan promhasil ising telah tercapai. Potensi risiko kontrapencemaran dari menggunakan operator terbuka untuk mendapatkan ultra-cepat kecepatan pembekuan telah menjadi perhatian vitrifikasi sperma. Baru-baru ini, semakin banyak strategi telah diangkat menjadi mengurangi risiko kontaminasi, termasuk vitrifikasi baru pembawa / desain untuk mengontrol risiko dan meningkatkan cryoefisiensi pengawetan. Kemajuan pencetakan 3-D diuji dalam beberapa tahun terakhir dapat memberikan pendekatan baru untuk manufaktur perangkat pembekuan yang meminimalkan kontaminasirisiko asi. Dalam hal potensi risiko kontaminasi ke varDari sekian banyak patogen kriogenik, banyak solusi yang mungkin dimiliki telah diidentifikasi untuk mengontrol dan mengurangi risiko kontaminasi tingkat yang dapat diterima. Terakhir, tergantung jenis air mani parameter dan tujuan pribadi di klinik ART, pendekatan kriopreservasi sperma spesifik harus dilakukan secara indi dirancang secara visual untuk mencapai hasil yang optimal. Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 8 dari 10 Halaman 9 Singkatan 3-D: 3 dimensi; ART: Teknologi reproduksi berbantuan; BHT: Butylhydroxytoluene; BHV-1: Bovine herpesvirus-1; BIV: Sapi virus imunodefisiensi; BVDV: Virus diare virus sapi; HBV: Hepatitis B virus; HCV: Virus hepatitis C; HIV: Virus human immunodeficiency; ICSI: Injeksi sperma intrasitoplasma; LN 2 : Nitrogen cair; PESA: Aspirasi sperma epididimis perkutan; TESA: Sperma testis aspirasi; UV: Ultraviolet; ZP: Zona pellucida Ucapan Terima Kasih Kami berterima kasih atas bantuan Bpk. Christopher Lavergne dan Nona Dandan Tao dengan bahasa. Kami menghargai dukungan literatur dari Tn. Guolong Mo dan Dr. Zhibin Ning. Kontribusi penulis YT menyusun dan menyusun naskah, ES, AS dan MCL dibaca dan direvisi naskah. Semua penulis menyetujui versi final. Pendanaan Tinjauan ini tidak menerima hibah khusus dari lembaga pendanaan di sektor publik, komersial, atau nirlaba. Ketersediaan data dan bahan T/A Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi T/A Persetujuan untuk publikasi Penulis memberikan persetujuan kami untuk informasi yang akan dipublikasikan di Biologi Reproduksi dan Endokrinologi. Yong Tao: [email protected] ; Erika Sanger: [email protected] ; Arpornrad Sae-wu: [email protected] ; MarieClaude Leveille: [email protected]. Minat yang bersaing Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki kepentingan yang bersaing. Diterima: 2 November 2019 Diterima: 28 Februari 2020 Referensi 1. Luyet BJ, Hodapp EL. Kebangkitan spermatozoa Katak yang membatu di udara cair. Exp Berbagai Med. 1938; 39: 433–4. 2. Polge C, Smith AU, Parkes AS. Kebangkitan spermatozoa setelah vitrifikasi dan dehidrasi pada suhu rendah. Alam. 1949; 164: 666. 3. Bunge RG, Sherman JK. Kapasitas pemupukan spermatozoa manusia beku. Alam. 1953; 172: 767–8. 4. Perloff WH, Steinberger E, Sherman JK. Konsepsi dengan manusia spermatozoa dibekukan dengan teknik uap nitrogen. Pupuk Steril. 1964; 15: 501–4. 5. Sherman JK. Peningkatan metode pengawetan spermatozoa manusia oleh pembekuan dan pengeringan beku. Pupuk Steril. 1963; 14: 49–64. 6. Szell AZ, Bierbaum RC, Hazelrigg WB, Chetkowski RJ. Kelahiran hidup dari beku air mani manusia disimpan selama 40 tahun. J Assist Reprod Genet. 2013; 30: 743–4. 7. Kuznyetsov V, Moskovtsev SI, Crowe M, Lulat AG, Librach CL. Vitrifikasi sejumlah kecil spermatozoa di normozoospermic dan parah sampel oligozoospermic. Syst Berbagai Reprod Med. 2015; 61: 13–7. 8. Isachenko V, Isachenko E, Petrunkina AM, Sanchez R. Spermatozoa manusia vitrifikasi tanpa adanya krioprotektan permeabel: kelahiran dua orang sehat bayi. Reprod Fertil Dev. 2012; 24: 323–6. 9. Sanchez R, Isachenko V, Petrunkina AM, Risopatron J, Schulz M, Isachenko E. Kelahiran hidup setelah inseminasi intrauterin dengan spermatozoa dari pasien oligoasthenozoospermic vitrifikasi tanpa permeabel krioprotektan. J Androl. 2012; 33: 559–62 49: 1-3. 10. Medrano L, Enciso M, Gomez-Torres MJ, Aizpurua J. Kelahiran pertama yang sehat bayi setelah injeksi sperma intra-sitoplasma menggunakan permeabel baru protokol vitrifikasi sperma bebas krioprotektan. Kriobiologi. 2019; 87: 117–9. 11. Jang TH, Park SC, Yang JH, Kim JY, Seok JH, Park US, Choi CW, Lee SR, Han J. Kriopreservasi dan aplikasi klinisnya. Res medis integratif 2017; 6: 12–8. 12. Hezavehei M, Sharafi M, Kouchesfahani HM, Henkel R, Agarwal A, Esmaeili V, Shahverdi A. Kriopreservasi sperma: tinjauan tentang kriobiologi molekuler saat ini dan pendekatan lanjutan. Reprod BioMed Online. 2018; 37: 327–39. 13. Lv C, Wu G, Hong Q, kriopreservasi Quan G. Spermatozoa: seni rupa dan masa depan pada ruminansia kecil. Biopreserv Biobank. 2019; 17: 171–82. 14. Paoli D, Lombardo F, Lenzi A, Gandini L. Kriopreservasi sperma: efek pada struktur kromatin. Adv Exp Med berbagai. 2014; 791: 137–50. 15. Isachenko V, Sanchez R, Rahimi G, Mallmann P, Isachenko E, Merzenich M. Vitrifikasi spermatozoa bebas krioprotektan: ikan sebagai model manusia. Andrologia. 2019; 51: e13166. 16. Xin M, Siddique MAM, Dzyuba B, Cuevas-Uribe R, Shaliutina-Kolesova A, Linhart O. Kemajuan dan tantangan vitrifikasi sperma ikan: ulasan mini. Theriogenology. 2017; 98: 16–22. 17. Reed ML, Kata AH, DJ Thompson, Caperton CL. Vitrifikasi volume besar blastokista yang dibiopsi dan tidak dibiopsi: teknik yang sederhana dan kuat untuk kriopreservasi. J Assist Reprod Genet. 2015; 32: 207–14. 18. Isachenko V, Maettner R, Petrunkina AM, Mallmann P, Rahimi G, Sterzik K, Sanchez R, Risopatron J, Damjanoski I, Isachenko E. Bebas krioprotektan vitrifikasi spermatozoa manusia dalam volume besar (hingga 0,5 mL): sebuah novel teknologi. Clin Lab. 2011a; 57: 643–50. 19. Isachenko E, Rahimi G, Mallmann P, Sanchez R, Isachenko V. Novel pendekatan untuk kriopreservasi spermatozoa manusia: sejarah dan pengembangan teknologi Vitrifikasi spermatozoa. J Reprod Stem Biotechnol sel. 2011b; 2: 128–45. 20. Slabbert M, du Plessis SS, Huyser C. Volume besar bebas krioprotektan vitrifikasi: alternatif kriopreservasi konvensional untuk manusia spermatozoa. Andrologia. 2015; 47: 594–9. 21. Saritha KR, Bongso A. Evaluasi komparatif manusia segar dan dicuci sperma kriopreservasi dalam fase uap dan cairan nitrogen cair. J Androl. 2001; 22: 857–62. 22. Nawroth F, Isachenko V, Dessole S, Rahimi G, Farina M, Vargiu N, Mallmann P, Dattena M, Capobianco G, Peters D, Orth I, Isachenko E.Vitrifikasi spermatozoa manusia tanpa krioprotektan. Cryo Lett. 2002; 23: 93–102. 23. Chang HJ, Lee JR, Chae SJ, Jee BC, Suh CS, Kim SH. Studi perbandingan dua metode kriopreservasi spermatozoa manusia: vitrifikasi versus pembekuan lambat. Pupuk Steril. 2008; 90: S280. 24. Vutyavanich T, Piromlertamorn W, Nunta S. Pembekuan cepat versus lambat pembekuan spermatozoa manusia yang dapat diprogram. Pupuk Steril. 2010; 93: 1921–8. 25. Moskovtsev SI, Lulat GM, Librach CL. Kriopreservasi manusia spermatozoa dengan vitrifikasi vs. pembekuan lambat: Pengalaman Kanada. Curr Cryobiol depan. 2012: 77–100. 26. Agha-Rahimi A, Khalili MA, Nabi A, Ashourzadeh S. Vitrifikasi tidak lebih dari pembekuan cepat spermatozoa normozoospermic: efek pada parameter sperma, Fragmentasi DNA dan pengikatan hyaluronan. Reprod BioMed Online. 2014; 28: 352–8. 27. Zhu J, Jin RT, Wu LM, Johansson L, Guo TH, Liu YS, Tong XH. Pembekuan ultra-cepat bebas krioprotektan dari spermatozoa manusia secara kriogenik botol kecil. Andrologia. 2014; 46: 642–9. 28. Ali Mohamed MS. Kriopreservasi lambat tidak lebih baik dari vitrifikasi pada spermatozoa manusia; sebuah studi terkontrol eksperimental. Iran J Reprod Med. 2015; 13: 633–44. 29. Tongdee P, Sukprasert M, Satirapod C, Wongkularb A, Choktanasiri W. Perbandingan sperma manusia yang dikriopreservasi antara pembekuan sangat cepat dan pembekuan lambat yang dapat diprogram: berpengaruh pada motilitas, morfologi, dan DNA integritas. J Med Assoc Thailand. 2015; 98: S33–42. 30. Aizpurua J, Medrano L, Enciso M, Sarasa J, Romero A, Fernandez MA, Gomez-Torres MJ. Metode baru vitrifikasi bebas krioprotektan permeabel untuk sperma manusia asli. Reprod Hum. 2017; 32: 2007–15. 31. Karthikeyan M, Arakkal D, Mangalaraj AM, Kamath MS. Perbandingan dari pembekuan lambat konvensional versus vitrifikasi bebas krioprotektan permeabel sampel air mani abnormal: uji coba terkontrol secara acak. J Reprod Manusia Sci. 2019; 12: 150–5. 32. Le MT, Nguyen TTT, Nguyen TT, Nguyen VT, Nguyen TTA, Nguyen VQH, Cao NT. Kriopreservasi spermatozoa manusia dengan vitrifikasi versus pembekuan cepat konvensional: efek pada motilitas, viabilitas, morfologi dan cacat seluler. Berbagai Reprod Eur J Obstet Gynecol. 2019; 234: 14-20. 33. Pabon D, Meseguer M, Sevillano G, Cobo A, Romero JL, Remohi J, de Los SMJ. Sistem baru kriopreservasi sperma: evaluasi kelangsungan hidup, motilitas, DNA oksidasi, dan aktivitas mitokondria. Andrologi. 2019; 7: 293–301. 34. Spis E, Bushkovskaia A, Isachenko E, Todorov P, Sanchez R, Skopets V, Isachenko V. Pembekuan konvensional vs. vitrifikasi epididimis bebas krioprotektan (MESA) dan testis (TESE) spermatozoa: tiga kelahiran hidup. Kriobiologi. 2019; 90: 100–2. 35. Li YX, Zhou L, Lv MQ, Ge P, Liu YC, Zhou DX. Vitrifikasi dan konvensional metode pembekuan dalam kriopreservasi sperma: tinjauan sistematis dan metaanalisis. Berbagai Reprod Eur J Obstet Gynecol. 2019; 233: 84–92. Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 9 dari 10 Halaman 10 36. Oldenhof H, Gojowsky M, Wang S, Henke S, Yu C, Rohn K, Wolkers WF, Sieme H. Stres osmotik dan perubahan fase membran selama pembekuan kuda jantan sperma: cara kerja agen krioprotektif. Reprod Biol. 2013; 88: 68. 37. Schulz M, Risopatron J, Matus G, Pineda E, Rojas C, Isachenko V, Isachenko E, Sanchez R. Trehalose mempertahankan motilitas sperma pasca pencairan yang lebih tinggi daripada sukrosa dalam sperma manusia vitrifikasi. Andrologia. 2017; 49: 1–3. 38. Merino O, Aguaguina WE, Esponda P, Risopatron J, Isachenko E, Isachenko V, Sanchez R. Efek perlindungan dari butylated hydroxytoluene pada sperma fungsi dalam kriopri spermatozoa manusia diawetkan dengan teknik vitrifikasi. Andrologia. 2015; 47: 186–93. 39. Cohen J, Garrisi GJ, Congedo-Ferrara TA, Kieck KA, Schimmel TW, Scott RT. Kriopreservasi spermatozoa manusia tunggal. Reprod Hum. 1997; 12: 994–1001. 40. Endo Y, Fujii Y, Shintani K, Seo M, Motoyama H, Funahashi H. Sederhana vitrifikasi untuk sejumlah kecil spermatozoa manusia. Reproduksi BioMed On line. 2012; 24: 301–7. 41. Herrler A, Eisner S, Bach V, Weissenborn U, Beier HM. Kriopreservasi spermatozoa dalam kapsul asam alginat. Pupuk Steril. 2006; 85: 208–13. 42. Stein A, Shufaro Y, Hadar S, Fisch B, Pinkas H. Berhasil menggunakan Cryolock perangkat untuk kriopreservasi ejakulasi dan testis manusia yang langka spermatozoa. Andrologi. 2015; 3: 220–4. 43. Hu E, Childress W, Tiersch TR. Pencetakan 3-D memberikan pendekatan baru untuk standarisasi dan reproduktifitas perangkat pembekuan. Kriobiologi. 2017; 76: 34–40. 44. Cobo A, Domingo J, Perez S, Crespo J, Remohi J, Pellicer A. Vitrifikasi: an pendekatan baru yang efektif untuk penyimpanan oosit dan menjaga kesuburan pada kanker pasien. Clin Transl Oncol. 2008; 10: 268–73. 45. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S, Kato O. Perbandingan buka dan tutup metode untuk vitrifikasi embrio manusia dan penghapusan potensi kontaminasi. Reprod BioMed Online. 2005; 11: 608–14. 46. Hosseini A, Khalili MA, Talebi AR, Agha-Rahimi A, Ghasemi-Esmailabad S, Woodward B, Yari N. Kriopreservasi jumlah manusia yang rendah spermatozoa; mana yang lebih baik: fase uap atau pencelupan langsung dalam cairan nitrogen? Hum Fertil. 2019; 22: 126–32. 47. Liu F, Zou SS, Zhu Y, Sun C, Liu YF, Wang SS, Shi WB, Zhu JJ, Huang YH, Li Z. Sedotan mikro baru untuk kriopreservasi sejumlah kecil manusia spermatozoa. Asian J Androl. 2017; 19: 326–9. 48. Berkovitz A, Miller N, Silberman M, Belenky M, Itsykson P. Solusi baru untuk membekukan sejumlah kecil spermatozoa menggunakan vitrifikasi sperma alat. Reprod Hum. 2018; 33: 1975–83. 49. Paffoni A, Palini S. Ada metode baru lain untuk kriopreservasi kecil jumlah sel sperma manusia. Ann Transl Med. 2019; 7 (Suppl 1): 1–4. 50. Isachenko V, Rahimi G, Mallmann P, Sanchez R, Isachenko E. Teknologi dari vitrifikasi bebas krioprotektan dari spermatozoa manusia: aseptisitas sebagai kriteria efektivitas. Andrologi. 2017; 5: 1055–63. 51. Isachenko V, Isachenko E, Katkov II, Montag M, Dessole S, Nawroth F, Mobil Van Kriopreservasi bebas Der Ven H. Cryoprotectant dari spermatozoa manusia oleh vitrifikasi dan pembekuan dalam uap: efek pada motilitas, integritas DNA, dan kemampuan pemupukan. Reprod Biol. 2004; 71: 1167–73. 52. Sanchez R, Fontecilla J, Isachenko E, Mora B, Isachenko V, Cabrillana ME. Temperatur dalam proses devitrifikasi sangat penting untuk dilestarikan keutuhan morfologi membran dan fungsi sperma pada manusia spermatozoa. Pupuk Steril. 2013; 100: S183. 53. Mansilla MA, Merino O, Risopatron J, Isachenko V, Isachenko E, Sanchez R. Suhu tinggi sangat penting untuk melestarikan fungsi sperma manusia selama proses devitrifikasi. Andrologia. 2016; 48: 111–3. 54. Bielanski A. Sebuah tinjauan tentang risiko kontaminasi air mani dan embrio selama kriopreservasi dan tindakan untuk membatasi kontaminasi silang selama penyimpanan mencegah penularan penyakit dalam praktek ET. Theriogenology. 2012; 77: 467–82. 55. Bielanski A. Keamanan hayati dalam kriopreservasi embrio dan semen, penyimpanan, manajemen dan transportasi. Adv Exp Med berbagai. 2014; 753: 429–65. 56. Bielanski A, Nadin-Davis S, Sapp T, Lutze-Wallace C. Kontaminasi virus embrio diawetkan dalam nitrogen cair. Kriobiologi. 2000; 40: 110–6. 57. Morris GJ. Asal, ultrastruktur, dan mikrobiologi sedimen terakumulasi dalam bejana penyimpanan nitrogen cair. Kriobiologi. 2005; 50: 231–8. 58. Joaquim DC, Borges ED, Viana IGR, Navarro PA, Vireque AA. Resiko dari kontaminasi gamet dan embrio selama kriopreservasi dan tindakan untuk mencegah kontaminasi silang. Biomed Res Int. 2017; 2017: 1840417. 59. Harrison AP Jr. Kelangsungan hidup bakteri setelah pembekuan dan pencairan berulang. J Bakteriol. 1955; 70: 711–7115. 60. Piasecka-Serafin M. Pengaruh sedimen terakumulasi dalam wadah dalam kondisi eksperimental pada infeksi air mani disimpan langsung di nitrogen cair (−196 derajat C). Bull Acad Pol Sci Berbagai. 1972; 20: 263–7. 61. Schafer TW, Everett J, Silver GH, Datang PE. Biohazard: terkontaminasi virus nitrogen cair. Ilmu. 1976; 191: 24–6. 62. Tedder RS, Zuckerman MA, Goldstone AH, Hawkins AE, Fielding A, Briggs EM, Irwin D, Blair S, Gorman AM, Patterson KG, dkk. Penularan hepatitis B. dari tangki kriopreservasi yang terkontaminasi. Lanset. 1995; 346: 137–40. 63. Cobo A, Bellver J, de los Santos MJ, Remohi J. Viral screening budaya yang dihabiskan sampel media dan nitrogen cair oosit dan embrio dari hepatitis B, hepatitis C, dan virus human immunodeficiency virus menginfeksi wanita secara kronis menjalani siklus fertilisasi in vitro. Pupuk Steril. 2012; 97: 74–8. 64. Molina I, Mari M, Martinez JV, Novella-Maestre E, Pellicer N, Peman J. Bacterial dan Resiko kontaminasi jamur pada oosit manusia dan kriopreservasi embrio: terbuka versus sistem vitrifikasi tertutup. Pupuk Steril. 2016; 106: 127–32. 65. Mansuy JM, Dutertre M, Mengelle C, Fourcade C, Marchou B, Delobel P, Izopet J, Martin-Blondel G. Zika virus: viral load menular tinggi dalam air mani, a patogen baru yang ditularkan secara seksual? Lancet Infect Dis. 2016; 16:405. 66. Nicastri E, Castilletti C, Liuzzi G, Iannetta M, Capobianchi MR, Ippolito G. Persistent deteksi RNA virus Zika dalam air mani selama enam bulan setelah onset gejala a wisatawan yang kembali dari Haiti ke Italia, Februari 2016. Euro Surveill. 2016; 21: 30314. 67. Schiewe MC, Freeman M, Whitney JB, VerMilyea MD, Jones A, Aguirre M, Leisinger C, Adaniya G, Synder N, Chilton R, Behnke EJ. Luas penilaian risiko penyimpanan kriogenik dan masalah manajemen kualitas: pedoman praktik terbaik untuk laboratorium ART. J Assist Reprod Genet. 2019; 36: 5–14. 68. McBurnie LD, Bardo B. Validasi filtrasi steril nitrogen cair. Pharm Technol. 2002: 74–82. 69. Arav A, Natan Y, Levi-Setti PE, Menduni F, Patrizio P. Metode baru untuk mendinginkan dan menyimpan oosit dan embrio dalam lingkungan bersih -196 derajat C. Reprod BioMed Online. 2016; 33: 71–8. 70. Hu J, Zhao S, Xu C, Zhang L, Lu S, Cui L, Ma J, Chen ZJ. Nitrogen cair uap sebanding dengan nitrogen cair untuk penyimpanan kriopreservasi manusia sperma: bukti dari ciri-ciri sperma manusia pasca pencairan. Pupuk Steril. 2015; 104 (1253–1257): e1251–2. 71. Diaz-Jimenez M, Dorado J, Pereira B, Ortiz I, Consuegra C, Bottrel M, Ortiz E, Hidalgo M. Vitrifikasi pada sedotan menjaga fitur motilitas lebih baik daripada bola dalam sperma keledai. Reprod Domest Anim. 2018; 53 (Suppl 2): 56–8. 72. Kuleshova LL, Shaw JM. Sebuah strategi untuk pendinginan cepat embrio tikus dalam sedotan ganda untuk menghilangkan risiko kontaminasi selama penyimpanan dalam nitrogen cair. Reprod Hum. 2000; 15: 2604–9. 73. Perez O, Guerrero CA, Ferguson T, Douglas J, Rodriguez A, Hammitt D. Sistem sedotan ganda tertutup yang disederhanakan untuk oosit, embrio, dan blastokista vitrifikasi. Pupuk Steril. 2010; 94: S105–6. 74. De Munck N, Santos-Ribeiro S, Stoop D, Van de Velde H, Verheyen G. Open versus vitrifikasi oosit tertutup dalam program donasi oosit: a studi prospektif saudara kandung secara acak. Reprod Hum. 2016; 31: 377–84. 75. Parmegiani L, Accorsi A, Bernardi S, Arnone A, Cognigni GE, Filicori M. A prosedur yang andal untuk dekontaminasi sebelum pencairan manusia spesimen yang disimpan dalam nitrogen cair: tiga kali pencucian dengan cairan steril nitrogen (SLN2). Pupuk Steril. 2012; 98: 870–5. 76. Vajta G, Rienzi L, Ubaldi FM. Sistem terbuka versus tertutup untuk vitrifikasi oosit dan embrio manusia. Reprod BioMed Online. 2015; 30: 325–33. 77. Hasil Chen Y, Zheng X, Yan J, Qiao J, Liu P. Neonatal setelah transfer blastokista vitrifikasi: sistem vitrifikasi tertutup versus terbuka. Reprod Biol Endokrinol. 2013; 11: 107. 78. Parmegiani L, Cognigni GE, Filicori M. Sterilisasi cairan ultra-violet nitrogen sebelum vitrifikasi. Reprod Hum. 2009; 24: 2969. 79. Lahon A, Arya RP, Kneubehl AR, Vogt MB, Dailey Garnes NJ, Rico-Hesse R. Karakterisasi isolat virus Zika dari Kolombia. PLoS Negl Trop Dis. 2016; 10: e0005019. 80. Parmegiani L, Cognigni GE, Bernardi S, Cuomo S, Ciampaglia W, Infante FE, Tabarelli de Fatis C, Arnone A, Maccarini AChChang HJ, ang HJ, M, Filicori M. Efisiensi vitrifikasi terbuka aseptik dan cryostorage kedap udara manusia oosit. Reprod BioMed Online. 2011; 23: 505–12. 81. Rozati H, Handley T, Jayasena CN. Proses dan perangkap sperma kriopreservasi. J Clin Med. 2017; 6: 1–13. 82. Heo YS, Nagrath S, Moore AL, Zeinali M, Irimia D, Stott SL, Toth TL, Toner M. Vitrifikasi sel "universal" dengan pendinginan ultra-cepat. Teknologi. 2015; 3: 64–71. Penerbit ' s Note Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi di peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan. Tao dkk. Biologi Reproduksi dan Endokrinologi (2020) 18:17 Halaman 10 dari 10 Teks asli If the cooling speed during vitrification is flexible, Sumbangkan terjemahan yang lebih baik
