JURNAL AWAL PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS PENETAPAN KADAR TABLET PARASETAMOL DENGAN METODE HPLC DISUSUN OLEH : GOLONGAN II KELOMPOK 9 DEWA AYU TRESNA MAHOTAMA DEWI (1708551085) IDA AYU MAS LAKSMI DEWI (1708551086) LUH PANDE PUTU TIRTA (1708551087) NI KADEK AYU PRAMESTI (1708551089) DESAK PUTU PUTRI SATRIYANI (1708551090) PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2019 PERCOBAAN III PENETAPAN KADAR TABLET PARASETAMOL DENGAN METODE HPLC 1. TUJUAN 1.1. Mahasiswa dapat memahami cara kerja instrumen HPLC 1.2. Mahasiswa dapat melakukan validasi metode 1.3. Mahasisa mampu menentukan kadar parasetamol dengan metode HPLC 1.4. Mahasiswa mampu melakukan Quality Control terhadap sediaan tablet parasetamol 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Parasetamol (C8H9NO2) Parasetamol atau Asetaminofen (Acetaminophenum) mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0% C8H9NO2 dihitung terhadap zat anhidrat. Parasetamol memiliki pemerian berupa hablur atau serbuk hablur putih, tidak berbau, memiliki rasa sedikit pahit. Parasetamol larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah larut dalam etanol. Memiliki suhu lebur 1690 sampai 1720 , bobot molekulnya sebesar 151,16 gram/mol serta memiliki khasiat sebagai antipiretikum dan analgetikum (Depkes RI, 2014). Penentuan kadar paracetamol adalah larutan baku ditimbang seksama sejumlah paracetamol BPFI, larutkan dalam air hingga kadar lebih kurang 12 μg per mL. Larutan uji ditimbang seksama lebih kurang 120 mg zat, masukkan ke dalam labu ukur 500 mL, larutan dalam 10 mL metanol P, encerkan dengan air sampai tanda dan campur. Ukur serapan larutan uji dan larutan baku pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 144 nm, terhadap air sebagai blangko. Hitung jumlah dalam mg asetaminofen, C8H9NO2 (Depkes RI, 2014). Berikut merupakan gambar struktur Parasetamol. 1 Gambar 1. Gambar Struktur Parasetamol (Depkes RI,1979). Parasetamol dalam larutan basa nilai absorbansinya sebesar 715b pada 𝜆𝑚𝑎𝑥 257 nm sedangkan dalam larutan asam sebesar 668a pada 𝜆𝑚𝑎𝑥 245 nm (Moffat et al., 2005). 2.2 Metanol Metanol (CH3OH) memiliki berat molekul 32,04 g/mol. Bobot jenis methanol adalah (15,50) 0,796 sampai 0,798. Metanol memiliki pemerian cairan tidak berwarna, jernih, bau khas. Kelarutan metanol yaitu dapat bercampur dengan air, membentuk cairan jernih tidak berwarna. Jarak didih Metanol adalah tidak kurang 99% tersuling pada suhu antara 64,50 dan 65,50 (Depkes RI, 1979). 2.3 Aqua Destillata Aqua destillata (air suling) memiliki berat molekul 18,02 g/mol. Aqua destillata memiliki pemerian yaitu cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, dan tidak mempunyai rasa. Disimpan dalam wadah tertutup baik (Depkes RI, 1979). 2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang sering disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk pemisahan dan pemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Kromatografi cair kinerja tinggi memiliki fase diam (berupa cairan atau polimer, yang disalut atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase diam berupa cairan harus 2 mempunyai sifat yang praktis tak bercampur dengan fase gerak, umumnya fase gerak perlu dijenuhkan dahulu dengan fase diam cair, agar fase diam tidak terbawa dari kolom. Fase diam yang berupa polimer disalutkan pada penyangga umumnya lebih dapat bertahan (Depkes RI, 1995). Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan adalah penukar ion, partisi, dan adsorpsi. Kromatografi penukar ion digunakan untuk pemisahkan zat-zat yang larut dalam air yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. Kromatografi partisi digunakan untuk fase diam dan fase gerak dengan polaritas yang berbeda. Jika fase geraknya bersifat polar dan fase diam non polar, dikenal sebagai kromatografi fase balik. Kromatografi adsorpsi digunakan untuk berbagai ragam senyawa non-ionik. Alat pada kromatografi cair terdiri dari sistem pompa, tempat penyuntikan analit, kolom kromatografi, detektor, penguat sinyal, dan perekam (Depkes RI, 1995). Kegunaan HPLC antara lain: Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis Analisis ketidakmurnian (impurities) Analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatile) Penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion Isolasi dan pemurnian senyawa Pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah yang sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. (Gandjar dan Rohman, 2007) 2.5 Validasi Metode ICH (International Conference on Harmanization) membagi karakteristik validasi metode menjadi beberapa bagian, antara lain presisi, akurasi, batas deteksi, batas kuantifikasi, spesifitas, linieritas, kisaran (range), ketahanan (robustness) dan kesesuaian sistem (Gandjar dan Rohman, 2007). 3 3 ALAT DAN BAHAN 3.1 Alat a. Timbangan analitik b. Batang pengaduk c. Sendok tanduk d. Beaker glass e. Erlenmeyer f. Labu ukur g. Pipet ukur h. Mortir dan stamper i. Botol vial j. Bulb filler k. Pipet tetes l. Kertas perkamen m. Membran filter n. Alat ultrasonik o. Syringe p. HPLC dengan kolom reversed phase C18 3.2 Bahan a. Tablet Parasetamol b. Serbuk baku parasetamol c. Metanol dan air (70:30 v/v) 4 4.1 PROSEDUR PRAKTIKUM Perhitungan Pembuatan Larutan a. Pembuatan Pelarut Metanol dan Air (70:30 v/v) Diketahui: - Volume Larutan = 500 mL - Perbandingan pelarut metanol dan air (70:30 v/v) Ditanya: Volume metanol dan air yang digunakan? Jawab: 4 - Metanol = 70 mL 100 mL = x 500 mL = 350 mL - Air = 30 mL 100 mL = x 500 mL = 150 mL Jadi untuk membuat 500 mL pelarut volume metanol yang digunakan sebanyak 350 mL dan air sebanyak 150 mL. b. Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 1 mg/mL Diketahui: - Kadar Parasetamol = 1mg/mL - Volume Larutan = 50 mL Ditanya: Massa parasetamol yang ditimbang? Jawab: Konsentrasi = massa volume massa 1 mg/mL = massa = 50 mg 50 mL Jadi massa parasetamol yang ditimbang sebanyak 50 mg. c. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol 100 μg/mL Diketahui : - Kadar Larutan stok = 1mg/mL = 1000 μg/mL - Kadar Larutan baku = 100 μg/mL - Volume Larutan yang dibuat = 10 mL Ditanya: Volume larutan stok yang dipipet? Jawab: V1 × C1 = V2 × C2 V1 × 1000 μg/mL = 10 mL × 100 μg/mL V1 = 1 mL Jadi volume larutan stok yang dipipet sebanyak 1 mL. d. Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol 5 Diketahui: - Kadar Larutan baku = 100 μg/mL - Kadar Larutan seri yang dibuat = 5 μg/mL; 10 μg/mL; 15 μg/mL; 20μg/mL; 25μg/mL. - Volume Larutan yang dibuat = 10 mL Ditanya: Volume larutan baku yang dipipet? Jawab: a. Konsentrasi 5 μg/mL V1 × C1 = V2 × C2 V1 x 100 μg/mL = 10 mL x 5 μg/mL V1 = 0,5 mL b. Konsentrasi 10 μg/mL V1 × C1 = V2 × C2 V1 x 100 μg/mL = 10 mL x 10 μg/mL V1 = 1 mL c. Konsentrasi 15 μg/mL V1 × C1 = V2 × C2 V1 x 100 μg/mL = 10 mL x 15 μg/mL V1 = 1,5 mL d. Konsentrasi 20 μg/mL V1 × C1 = V2 × C2 V1 x 100 μg/mL = 10 mL x 20 μg/mL V1 = 2 mL e. Konsentrasi 25 μg/mL V1 × C1 = V2 × C2 V1 x 100 μg/mL = 10 mL x 25 μg/mL V1 = 2,5 mL 4.2 Prosedur Kerja a. Pembuatan Pelarut Metanol : Air 6 Dipipet metanol 350 mL dan air 150 mL dengan perbandingan pelarut metanol dan air (70:30 v/v) kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 500 mL. Digojog hingga homogen. b. Pembuatan Larutan Stok Paracetamol 1 mg/mL Parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg menggunakan gelas beker, kemudian dilarutkan dengan sedikit metanol dan air (70:30 v/v). Larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL kemudian ditambahkan metanol dan air sampai tanda batas 50 mL. Digojog hingga homogen. c. Pembuatan Larutan Baku Paracetamol 100 μg/mL Dipipet larutan stok parasetamol 1 mg/mL sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas 10 mL. Digojog hingga homogen. d. Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol Larutan baku parasetamol 100 μg/mL dipipet masing-masing 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas 10 mL. Digojog hingga homogen. e. Pembuatan Larutan Sampel Ditimbang 3 tablet parasetamol dan digerus, kemudian ditimbang serbuk tablet parasetamol setara dengan 100 mg parasetamol. Dimasukkan ke dalam gelas beker dan dilarutkan dengan 20 mL metanol dan air (70:30 v/v). Larutan parasetamol dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas 100 mL. Larutan digojog homogen sehingga diperoleh sampel larutan parasetamol dengan konsentrasi 1 mg/mL. Larutan sampel 1 mg/mL dipipet sebanyak 10 mL ke dalam labu 100 mL dan ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas 100 mL. Digojog homogen dan diperoleh larutan sampel 100 µg/mL. Larutan sampel 100 μg/mL dipipet sebanyak 1,5 mL lalu dimasukan ke dalam labu ukur labu 10 mL kemudian ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) ke dalam labu sampai tanda batas 10 mL. Larutan 7 kemudian digojog homogen sehingga diperoleh larutan sampel parasetamol dengan konsentrasi 15 μg/mL. f. Pengkondisian Kolom HPLC Larutan pencuci kolom (metanol dan air (70:30 v/v) difiltrasi melalui membran. Kemudian diinjeksi sebanyak 10 μL metanol dan air (70:30 v/v) ke alat melalui selang pelarut dengan kecepatan alir 1 mL/menit. Metanol dan air (70:30 v/v) akan secara otomatis didegassing dalam instrumen. g. Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan seri parasetamol konsentrasi terendah difiltrasi sebanyak 20 μL kemudian diinjeksikan pada injektor HPLC. Larutan seri di scan pada panjang gelombang 200 nm - 300 nm untuk menentukan panjang gelombang maksimum. Panjang gelombang maksimum digunakan dalam pengukuran nilai AUC untuk setiap larutan seri. Dicatat masing-masing AUC yang didapat sebagai bahan pembuatan kurva kalibrasi parasetamol y = bx + a, dengan y = AUC dan x = konsentrasi (μg/mL). h. Penetapan Kadar Parasetamol Larutan sampel parasetamol difiltrasi dan dipipet sebanyak 20 μL kemudian diinjeksikan pada injector HPLC. Larutan di scan dengan panjang gelombang maksimum parasetamol yang sudah diperoleh. Dicatat masingmasing AUC yang diperoleh dengan cara mensubstitusikan nilai AUC ke dalam kurva kalibrasi parasetamol yang sudah diperoleh. Ditentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar pada kemasan sampel. i. Validasi Metode Analisis Dihitung persentase perolehan kembali (recovery) sebagai penentuan akurasi dan SD dan RSD sebagai penentuan presisi. j. Penentuan Nilai LOD dan LOQ Dibuat 5 variasi larutan parasetamol dengan konsentrasi yang berbeda. Nilai absorbansi ditentukan dari kelima variasi parasetamol, kemudian dibuat persamaan regresi liniernya, y = bx + a dengan y adalah absorbansi dari kelima variasi konsetrasi larutan parasetamol dan x adalah konsentrasi larutan parasetamol. Ditentukan nilai y" yaitu nilai absorbansi suatu 8 konsentrasi larutan parasetamol setelah dimasukkan kedalam persamaan liniernya. Ditentukan selisih dari y-y" dan kuadrat dari selisih y-y" kemudian ditentukan nilai simpangan baku residual (Sy/x). Ditentukan nilai LOD dan LOQ dari larutan parasetamol dengan persamaan: LOD = (3 x Sy/x) / b dan LOQ = (10 x Sy/x) / b. 5 SKEMA KERJA 5.1 Skema Kerja Pembuatan Pelarut Metanol : Air (70:30 v/v) Dipipet metanol 350 mL dan air 150 mL dengan perbandingan pelarut metanol dan air (70:30 v/v) Dimasukkan ke dalam labu ukur 500 mL Digojog hingga homogen 5.2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 1 mg/mL Ditimbang parasetamol sebanyak 50 mg menggunakan gelas beker Dilarutkan dengan sedikit metanol dan air (70:30 v/v) Larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 mL Ditambahkan metanol dan air sampai tanda batas 50 mL Digojog hingga homogen 5.3 Skema Kerja Pembuatan Larutan Baku Parasetamol 100 μg/mL Dipipet larutan stok parasetamol 1 mg/mL sebanyak 1 mL 9 Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas 10 mL Digojog hingga homogen 5.4 Skema Kerja Pembuatan Seri Larutan Standar Parasetamol Dipipet larutan baku parasetamol 100 μg/mL dipipet 0,5 mL Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL Ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) sampai tanda batas 10 mL Digojog hingga homogen Diulangi cara kerja diatas untuk pembuatan seri 1 mL; 1,5 mL; 2 mL; 2,5 mL 5.5 Skema Kerja Pembuatan Larutan Sampel Ditimbang 3 tablet parasetamol dan digerus Ditimbang serbuk tablet parasetamol setara dengan 100 mg parasetamol Dimasukkan ke dalam gelas beker dan dilarutkan dengan 20 mL metanol dan air (70:30 v/v) 10 Larutan parasetamol dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas 100 mL Larutan digojog homogen sehingga diperoleh sampel larutan parasetamol dengan konsentrasi 1 mg/mL Larutan sampel 1 mg/mL dipipet sebanyak 10 mL Dimasukkan dalam labu 100 mL dan ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) hingga tanda batas 100 mL Digojog homogen dan diperoleh larutan sampel 100 µg/mL Larutan sampel 100 μg/mL dipipet sebanyak 1,5 mL Dimasukan ke dalam labu ukur labu 10 mL kemudian ditambahkan metanol dan air (70:30 v/v) ke dalam labu sampai tanda batas 10 mL Larutan digojog homogen sehingga diperoleh larutan sampel parasetamol dengan konsentrasi 15 μg/mL 5.6 Skema Kerja Pengkondisian Kolom HPLC Larutan pencuci kolom metanol dan air (70:30 v/v) difiltrasi melalui membran Diinjeksi sebanyak 10 μL metanol dan air (70:30 v/v) ke alat melalui selang pelarut dengan kecepatan alir 1 mL/menit 11 Metanol dan air (70:30 v/v) akan secara otomatis didegassing dalam instrumen 5.7 Skema Kerja Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan seri parasetamol konsentrasi terendah difiltrasi sebanyak 20 μL kemudian diinjeksikan pada injektor HPLC Larutan seri di scan pada panjang gelombang 200 nm - 300 nm Dicatat masing-masing AUC yang didapat 5.8 Skema Kerja Penetapan Kadar Parasetamol Larutan sampel parasetamol difiltrasi dan dipipet sebanyak 20 μL kemudian diinjeksikan pada injector HPLC Larutan di scan dengan panjang gelombang maksimum parasetamol yang sudah diperoleh Dicatat masing-masing AUC yang diperoleh dengan cara mensubstitusikan nilai AUC ke dalam kurva kalibrasi parasetamol yang sudah diperoleh Ditentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar pada kemasan sampel 5.9 Skema Kerja Validasi Metode Analisis Dihitung persentase perolehan kembali (recovery) sebagai penentuan akurasi dan SD dan RSD sebagai penentuan presisi 12 5.10 Skema Kerja Penentuan Kadar LOD dan LOQ Dibuat 5 variasi larutan parasetamol dengan konsentrasi yang berbeda Nilai absorbansi ditentukan dari kelima variasi parasetamol dibuat persamaan regresi liniernya, y = bx + a dengan y adalah absorbansi dari kelima variasi konsetrasi larutan parasetamol dan x adalah konsentrasi larutan parasetamol DAFTAR PUSTAKA Ditentukan nilai y" yaitu nilai absorbansi suatu konsentrasi larutan parasetamol setelah dimasukkan kedalam persamaan liniernya Ditentukan selisih dari y-y" dan kuadrat dari selisih y-y" kemudian ditentukan nilai simpangan baku residual (Sy/x) Ditentukan nilai LOD dan LOQ dari larutan parasetamol dengan persamaan: LOD = (3 x Sy/x) / b dan LOQ = (10 x Sy/x) / b 13 DARTAR PUSTAKA Depkes RI. 1979. Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Depkes RI. 2014. Farmakope Indonesia. Edisi V. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2012. Analisis Obat secara Spektroskopi dan Kromatografi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Moffat, A. C., M. D. Osselton, B. Widdop, dan L. Y. Galichet. 2005. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons. Edisi Ketiga. London: Pharmaceutical Press. 14
