LAPORAN PRAKTIKUM PENGANTAR BIOTEKNOLOGI “ METODE ISOLASI DNA DARI DARAH ” Disusun Oleh: Nadila Ayu Rachmayani (061117022) Asti Pratiwi (08111 Dosen Pengampu : Dr. Wahyu Prihatini., M.Si. PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PAKUAN BOGOR 2020 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Didalam inti sel suatu organisme, terdapat materi genetik. Materi genetik ini harus mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara spesifik dan menggandakan suatu informasi secara tepat (NCBI-Griffiths dkk: 2000). Contoh dari materi genetik adalah DNA/RNA, gen dan kromosom. DNA dan RNA dimiliki oleh organisme prokariotik, sedangkan eukariotik hanya memiliki RNA. DNA/RNA adalah informasi genetik yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat untuk DNA atau Ribosanukleat untuk RNA (Solomon dkk 2005: 38). Sel prokariotik memiliki DNA yang tersebar di dalam sel dan DNA yang tidak berasosiasi dengan protein histon sehingga DNA terburai didalam sitoplasma. DNA pada sel prokariotik berbentuk rantai single helix. beberapa DNA tambahan pada bakteri dapat ditemukan diorganel bernama plasmid (Pierce 2005: 17). Sel eukariotik memiliki DNA yang berasosiasi dengan protein bernama histon lalu membentuk kuparan padat yang disebut kromosom (Pierce 2005: 17). DNA pada sel eukariotik terdapat didalam nukleus. Sebagian besar DNA pada sel hewan terdapat didalam inti sel dan sebagian kecil ada di dalam mitokondria. Sedangkan DNA pada sel tumbuhan terdapat pada nukleus, mitokondria juga kloroplas. Menurut Watson dan Crick, DNA disusun oleh basa purin yaitu adenin dan guanin, dan basa pirimidin yaitu timin dan sitosin. DNA juga mengandung gula deoksiribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen yang semuanya dinamakan susunan nukleotida (Suryo 2008: 68). Susunan basa kimia ini akan mengandung informasi untuk komposisi penyusun suatu organisme tertentu. DNA dapat menggandakan dirinya dan nantinya berperan dalam proses pembelahan sel (Genetic home refrence: 2015). Basa-basa nitrogen pada rantai yang satu dengan rantai lainnya saling berpasangan dengan ikatan hidrogen. Basa jenis purin selalu berpasangan dengan basa jenis pirimidin. Adenin akan berpasangan dengan timin dengan dua ikatan hidrogen. Guanin akan berpasangan dengan sitosin dengan tiga ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen berfungsi menstabilkan struktur DNA tersebut dan mempermudah penguraian DNA saat melakukan replikasi dan transkripsi. Struktur DNA adalah double helix atau pilinan berganda (Campbell dkk. 2008: 305-306). Berdasarkan letak ditemukannya di dalam sel, DNA eukariotik dikategorikan menjadi dua yaitu, DNA kromosomal dan DNA sitoplasma. DNA kromosomal merupakan DNA yang ditemukan di kromosom atau didalam nucleus, sedangkan DNA sitoplasma merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma khususnya mitokondria dan kloroplas (TNAU Agritech Portal 2012: 10). Nuclear DNA atau DNA inti merupakan DNA yang berbentuk linier dan berasosiasi dengan protein histon berada di dalam kromosom. DNA inti mengandung lebih banyak informasi genetik dibandingkan DNA lain. DNA inti mengandung 30.000-40.000 gen, sedangkan DNA mitokondria hanya mengandung 37 gen (University of North Texas 2007: 1). DNA mitokondria terletak di bagian matriks mitokondria, berbentuk sirkular, dan memiliki beberapa gen yang memproduksi protein metabolisme esensial. Dari 37 gen yang ada pada mitokondria, 13 gen memproduksi enzim yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif, atau pembentukan energi utama dari sel. 24 gen lainnya menyediakan informasi untuk pembuatan tRNA dan rRNA (Genetic Home Refrence 2015: 1). DNA mitokondria hanya diwariskan dari ibu, karena saat proses fertilisasi, mitokondria pada sel sperma tidak ikut masuk ke dalam sel telur. Hal ini menyebabkan DNA mitokondria dapat digunakan untuk melacak garis keturunan keluarga dan untuk identifikasi forensik. DNA mitokondria juga dapat mempelajari hubungan antar kelompok populasi manusia di dunia (University of North Texas 2007: 1). DNA kloroplas hanya terdapat pada sel tumbuhan dan terletak pada stroma kloroplas, berbentuk sirkular, berukuran lebih besar daripada DNA mitokondria (McClean 1997: 1). DNA kloroplas mengandung DNA molekul yang homogen dan terdapat 30-50 gen RNA dan beberapa gen pengkode (De Las Rivas dkk 2015: 1). Secara keseluruhan DNA kloroplas mengandung 100-200 gen yang berfungsi untuk fotosintesis dan beberapa fungsi lain dari kloroplas (Howe 2012: 1). Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap awal suatu analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel sel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan pengawetan DNA (Gaikwad 2010: 2). DNA manusia dan hewan biasanya diperoleh dari darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga dapat diektraksi dari semen, saliva, akar rambut, urine, dan gigi (Medical Genomics 2004: 1). Isolasi DNA juga berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat mengetahui kelainan genetik yang diderita (University of Utah 2015: 1). Aplikasi dari isolasi DNA adalah untuk identifikasi forensik, beberapa gen tertentu dapat diproduksi secara massal untuk mengobati penyakit tertentu, dan teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk rekayasa genetika (University of Utah 2015: 1). Sel hewan dapat diisolasi lewat darah, sedangkan pada sel tumbuhan umumnya diisolasi dari organ daun. Metode tradisional untuk mengisolasi DNA tumbuhan dengan menggunakan teknik CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). Hal penting yang harus diperhatikan pada teknik CTAB yaitu pelisisan dinding sel agar DNA dapat diamatai. Pada saat pemurnian DNA, partikel lain akan dipisahkan lewat sentrifugasi dengan kloroform. Reagen yang digunakan antara lain CTAB buffer, etanol 70%, amonium asetat, kloroform, tris-EDTA, RNAse, dan isopropanol. Teknik CTAB melibatkan proses cukup rumit karena tumbuhan harus digerus yang selanjutnya di inkubasi pada waterbath, dan terakhir di sentrifugasi (University of Queensland 2003: 1-3). Isolasi DNA tumbuhan juga dapat dilakukan dengan teknik yang lebih modern, atau disebut dengan teknik KIT (QuickExtract Plant DNA Extraction). Kelebihan dari metode KIT ini adalah prosedur kerja yang simpel, proses pengerjaan yang cepat, dan tidak menggunakan bahan kimia berbahaya seperti kloroform dan memerlukan penanganan yang mudah. Metode KIT tersebut hanya memerlukan satu jenis reagen dan dua kali inkubasi tanpa proses penggerusan dan sentrifugasi (University of Queensland 2003: 4). 1.2 Tujuan : Praktikum ini dilakukan dengan tujuan mengisolasi DNA dari darah, dan memahami tehnik pengisolasian DNA dari darah.. BAB II METODOLOGI 2.1 Alat dan Bahan Sebelum pelaksanaan isolasi dna , terlebih dahulu dipersiapkan alat dan bahan yang diperlukan yaitu: Alat: -tabung mikrosentrifugasi berfungsi / tabung ependol sebagai wadah bahan untuk isolasi dna -Sentrifus Berfungsi untuk pemisah zat dalam cairan sehingga dapat mengendap -Rak tabung berfungsi sebagai tempat meletakan tabung sentrifus -Pipette dan micropippet berfungsi sebagai alat mengambil, memasukkan dan menghomogenkan bahan unntuk isolsi dna -Alat vortex berfungsi sebagai alat untuk homogenisasi bahan untuk isolasi DNA -Kulkas berfungsi sebagai alat untuk inkubasi -Kertas tissue berfungsi sebagai ttempat untuk mengeringkan pellet dna -Sarung tangan berfungsu untuk proteksi diri Bahan : -Sampel darah vena (darah EDTA) berfungsi sebagai sampel yang menjadi bahan isolasi dna -Isopropanol untuk mengikat dna dalam supernatant -Ethanol 70 untuk mencuci isopropanol Kit isolasi dna berisi : 1. Larutra sel lisis berfungsi untuk melisiskan sel darah merah oleh karena isolasi dna dilakukan pada sel yang berinti yaitu sel darah putih 2. Larutan nuclei lisis berfungsi untuk melisiskan sel darah putih agar inti sel keluar. Larutan ini mengandung EDTA untuk menghilangkan kation divalent dan menghambat DNAse serta SDS untuk melarutkan membrane sel dan denaturasi protein 3. Larutan protein presipitation berfungsi untuk memisahkan protein dari larutan 4. Larutan rehidrasi DNA 2.2 Metode Kerja Proses utama yaitu pemeriksaan isolasi DNA berikut merupakan Langkah-langkah pemeriksaan isolasi dna: -Lakukan sentrifugasi untuk mendapatkan bafikot dari sampel darah vena -Ambil satu tabung mikrosentrifus steril lalu isikan dengan 900 mikroliter sel lisis -Ambil 300 mikroliter bafikot dan masukan ke dalam tabung centrifus -Campur cairan di dalam dengan baik kemudian vortex -Inkubasi tabung centrifus 10 menit di dalam freezer kulkas untuk melisiskan sel-sel darah merah -Centrifugasi tabung pada 13000 ribu rpm selama 1 menit -Buang supernatant sebanyak mungkin tanpa mengganggu pilet putih yang nampak -Lakukan Langkah tersebut diatas sebanyak kurang lebih 5 kali hingga larutan jernih -Tambahkan 300 mikroliter larutan nuclelisis kedalam suspense diatas , Campur dengan menggunakan pipet 5-6 kali untuk melisiskan sel sel darah putih, larutan akan menjadi fiskos atau kental -Tambahkan larutan protein prisipitation sebanyak 100 mikroliter kedalam larutan yang diperoleh pada Langkah sebelumnya dan vortex dengan kuat selama 10 – 20 detik -Centrifugasi dengan 13000 rpm selama 3 menit pindahkan supernatant kedalam tabung mikosentrifus steril yang berisi 300 mikroliter isopropanol -Tabung dibalikan perlahan-lahan supaya larutan tercampur dan akan terlihat masanya seperti benang-benang putih/dna -Centrifugasi dengan 13000 rpm selama 1 menit pada temperature ruangan, DNA akan terliahat sebagai pellet kecil yang putih -Buang supernatant dan tambahkan 300 mikroliter 70% ethanol -Sentrifugasi lagi seperti pada Langkah sebelumnya -Dengan hati-hati aspirasikan etanol dengan menggunakan pipet jangan sampai palette nya terbuang -Letakan tabung secara terbalik di atas kertas absolut dan keringkan di udara selama kurang lebih 60 menit -Tambahkan 100 mikroliter larutan refridasi DNA , DNA disimpan pada temperature 2-8o celcius atau untuk jangka Panjang temperature -20o celcius . BAB III PENUTUP Kesimpulan DNA merupakan informasi genetik berbentuk rantai ganda berpilin yang terdiri atas komponen fosfat, gula ribosa, dan basa nitrogen. DNA dapat ditemukan pada seluruh sel makhluk hidup dan dapat diisolasi dengan berbagai teknik. Isolasi DNA dapat dilakukan salah satunya dari sampel darah manusia. Hasil yang diperoleh adalah tube sampel yang berubah warna dari merah menjadi bening sebagai tanda hasil praktikum sesuai dengan literatur. Daftar Pustaka https://youtu.be/TSU9Z_Y0sl NCBI. 2000. Buku: An Introduction to Genetic Analysis. 7th ed. 1 hlm. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22104/. 10 Mei 2015, pk. 13.04
