RESPON ISOLASI DNA TANAMAN 1. Sebutkan dan jelaskan beberapa metode isolasi DNA secara konvensional. a. Phenol Chloroform Isoamly Alcohol (PCIA). Metode ini menggunakan perpaduan reaksi kimia dari berbagai macam reagen kimia yang digunakan dalam metode ini. PCIA merupakan serangkaian larutan yang terdiri dari larutan phenol, klorofrom, dan isoamil-alkohol yang digunakan untuk mengekstrak DNA yang kemudian dikenal sebagai salah satu metode ekstraksi DNA. Metode ini sering digunakan untuk mengekstrak DNA dari beberapa macam wujud sampel, antara lain berupa daging/otot, sirip, darah, dan beberapa wujud sampel lainnya. Kelebihan utama penggunaan metode ini adalah ekstrak DNA yang diperoleh berupa pelet DNA transparan yang dapat teramati, sehingga mempermudah peneliti untuk memastikan keberadaan ekstrak DNA di akhir proses ekstraksi. Adapaun kelemahan metode ini adalah larutan fenol dan larutan klorofrom merupakan dua larutan bercaun dan karsinogenik yang dapat mengganggu saluran pernafasan. b. Metode Ion Exchange Resin Chelex. Metode ini menggunakan suatu reagen yang terkandung dalam produk tersebut adalah sebuah resin yang dapat digunakan untuk ekstraksi DNA yaitu resin Chelex. Resin Chelex digunakan untuk mengekstrak DNA dengan cara memanaskannya pada suhu tertentu., biasanya dilakukan dengan menggunakan hot plate pada suhu 95-100°C selama 30-45 menit. Kelebihan dari proses ekstraksi ini yaitu waktu yang dibutuhkan relatif singkat dan juga proses pembuatan resin Chelex sangat praktis. 2. Sebutkan dan jelaskan secara singkat berbagai macam perusahaan kit isolasi DNA, apa itu Filter Column, GD column, Collection tube. kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Isolasi DNA menggunakan Kit Nucleon-Phytopure merek illustra DNA Extraction Kit PhytopureTM RPN 1851 yang terdiri dari Reagen 1, Reagen 2 dan Resin. Filter column berfungsi untuk menahan debris sel dan juga ampas daun, dan yang turun ke bawah setelah disentrifugasi. GD column berfungsi untuk menahan atau mengikat DNA. 3. Jelaskan secara detail apa itu pelisisan dinding dan membran sel, purifikasi dan presipitasi pada isolasi DNA Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan proses metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik atau sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Presipitasi. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. 4. Apa fungsi dari elusi buffer dan pada suhu berapa DNA hasil isolasi disimpan, bagaimana jika suhu terlalu tinggi. Penggunaan buffer TE atau aquadest steril ini memiliki fungsi sebagai pengelusi agar DNA terlepas dari diatom dan berada pada supernatan, sehingga tahap akhir diambil supernatan yang mengandung DNA. Hasil isolasi DNA disimpan dalam suhu ruangan yaitu berkisar antara 20-25°C. Jika disimpan pada suhu yang terlalu tinggi, DNA akan mengalami denaturasi. 5. Apa tujuan dilakukannya isolasi DNA dan bagaimana cara mengecek keberhasilan dari proses isolasi DNA Jawab : Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
