Ekstraksi RNA dan DNA Part 2 PT. Inti Kemika Sejahtera Metode Ekstraksi RNA/DNA Metode Ekstraksi Phenol Chloroform 1. Lisis SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) mengikat protein dan lemak pada membran sel sehingga membran sel terbuka dan semua isi sel keluar. Proteinase K menghancurkan protein STE (Salt Tris EDTA) buffer untuk mencegah kerusakan DNA dengan mempertahankan pH dalam keadaan normal (pH 8) 2. Purifikasi memurnikan DNA/RNA dari makromolekul sel lainnya setelah sel dihancurkan. Fenol + CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol) mengikat protein, lipid dan karbohidrat NaCl jenuh memekatkan DNA/RNA Makromolekul protein dan CIAA mengendap di dasar tabung, DNA dan air berada dilapisan atas. 3. Presipitasi Alkohol Absolut memisahkan DNA/RNA yang masih terlatut dalam air Etanol dan sisa garam sentrifuge, untuk memurnikan DNA/RNA Etanol diuapkan dalam ruang vakum untuk memurnikan DNA/RNA. Aquadest pengenceran DNA/RNA. Metode Ekstraksi Phenol Chloroform Dianggap sebagai salah satu standar “emas” 2. Protokol dibuat dengan baik 3. RNA distabilkan dengan cepat 4. Metode ekstraksi RNA besar/kecil dapat menggunakan metode ini. 1. 1. 2. 3. 4. 5. Tidak cocok untuk “troughput (tingkat produksi)” tinggi Pekerjaan melelahkan Penggunaan bahan kimia berbahaya Pemipetan yang susah Membutuhkan sentrifuge berpendingin. Metode Ekstraksi RNA/DNA Metode Spin Coloumn/ Kit Ekstraksi Metode tersebut memanfaatkan penggunaan spin kolom berbasis filter yang akan mengikat RNA / DNA yang sudah terisolasi. Membran dalam kolom spin mengandung silika atau serat kaca yang mengikat asam nukleat Spin coloumn biasanya sudah disertai dalam kit ekstraksi Prinsip kerja Ekstraksi RNA/DNA dengan Spin Coloumn Penghancuran sampel Pengikatan Pencucian Penambahan elution buffer Metode Ekstraksi Spin Coloumn 1. 2. 3. 4. Prosedur lebih simpel dan sudah tersedia Kebanyakan protokol tidak membutuhkan sentrifuge berpendingin Cocok digunakan untuk sampel dengan troughput tinggi Sebagian format kit sudah dalam bahasa yang mudah dan nyaman 1. 2. 3. 4. Terbatas untuk penggunaan sampel Homogenisasi yang tidak lengkap dapat menyumbat membran Hasil ekstraksi yang rendah Membran kolom yang berbeda memiliki kapasitas pengikatan yang berbeda. Metode Magnetik Metode ini menggunakan prinsip pemisahan magnetik untuk purifikasi RNA/DNA. RNA/DNA akan mengikat ke permukaan manikmanik magnetik, meninggalkan kontaminan dalam supernatan. 1. Baik digunakan untuk proses ekstraksi dengan troughput tinggi 2. Tidak terdapat limbah berbahaya 1. Kemungkinan kontaminasi dengan residu magnetik 2. Sampel yang kental dapat mengganggu kinerja manik-manik magnetik. Produk Ekstraksi DNA General Extraction Nama Produk Cat. No. Keterangan G-Spin Total DNA Extraction Mini Kit 17045 (50 col), 17046 (200 col) Ekstraksi DNA yang dapat digunakan dari sampel darah, sel, jaringan dan bakteri (-). G-Dex Ilc Genomic DNA Extraction Kit (for cell/tissue) 17231 (300 test) Ekstraksi DNA yang dapat digunakan dari sampel sel, jaringan dan bakteri. Dapat digunakan dari sampel yang memiliki jumlah kecil sampai besar. G-Dex Ilb Genomic DNA Extraction Kit (for Blood) 17241 (200 test) Ekstraksi DNA yang dapat digunakan dari sampel klinis serta berdasarkan jumlah sampel awal. i-genomic Stool plus DNA Extraction Mini Kit 17452 (50 col) i-genomic Urine DNA Extraction Mini Kit i-genomic clinic DNA Extraction Mini Kit Ekstraksi DNA yang digunakan dari sampel kotoran baik manusia maupun hewan Ekstraksi DNA dari bakteri (+/-) dan yeast dari urine tanpa mendegradasi lysozyme 17384 (10 test) Ekstraksi DNA yang dapat digunakan dari sampel klinis baik dari manusia maupun hewan serta deteksi patoghen gram (-) Plant Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan i-genomic Plant plus DNA Extraction Maxi Kit 17372 (10 test) Didesign untuk ekstraksi gDNA dari jaringan tanaman, baik dari sampel fresh/frozen ataupun jaringan tanaman yang sudah dikeringkan. i-genomic plant DNA Extraction Kit 17371 (50 col.) Extraksi DNA dari sampel Gramineae/rumput2an dan biji-bijian atau makanan yang sudah di olah. Fast plant Genomic DNA Isolation Kit 17233 (50 test) Ekstraksi gDNA yang berasal dari tanaman fresh ataupun frozen, dapat digunakan pada bagiam daun akar dan biji. BYF Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan i-genomic BYF DNA Extraction 17361 (50 col) mini Kit Digunakan untuk ekstraksi DNA pada bakteri gram +, yeast dan Fungi yang digunakan pada tanaman. G-Spin genomic DNA Extraction Kit (for Bacteria) Digunakan untuk ekstraksi gram negatif dan positif, baik bakteri yang terdapat pada sampel sel, jaringan, darah maupun yeast. 17121 (50 col) Halal Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan Halal Food Nucleic Acid Extraction Kit 17402 (50 test) Dapat digunakan untuk menganalisis bahan baku makanan mentah maupun jadi baik dari bahan daging, lemak dan gelatin untuk mengklasifikasi makanan haram Produk Ekstraksi RNA General Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan Easy-BlueTotal RNA Extraction Kit 17061/17061L (100 ml/ 5x100 ml) Tipe solution untuk ekstraksi RNA dari sel jaringan, tanaman, bakteri gram negativ, dll. (harus adanya penambahan bahan2 lain, spt chloroform dan isopropanol) Easy-Red Total RNA Extraction Kit 17063 (100 ml) Tipe solution untuk ekstraksi RNA dari sampel klinik (darah, serum, dll), sel, jaringan, bakteri dan feses. Easy- Spin Total RNA 17221 (50 col) Extraction Kit Sampel yang digunakan dari sel dan jaringan. Kombinasi dari metode manual dengan spin coloumn. RNA spin Total RNA Extraction Kit Ekstraksi yang diambil dari sampel sel dan jaringan. 17211 (50 col) miRacle miRNA 17521 (50 test) Extraction Kit (Dual) miRNA mikro RNA, RNA berukuran kecil hanya 22 nukleotida. Sampel yang digunakan: sel, jaringan dan darah. Bacteria, Fungi, Yeast, Protozoa Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan Fast HQ RNA Extraction Kit 17213 (50 col) Ekstraksi RNA dari berbagai sampel diantaranya adalah bakteri, yeast, darah, sel, protozoa, dan fungi. Plant Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan iQeasy Plus Plant RNA Extraction Kit 17491 (50 col) Ekstraksi RNA dari spesimen tumbuhan seperti daun, biji, akar dan tanaman legum/kacang-kacangan. Easy Spin Ilp Plant RNA Extraction Kit (Mini-Prep) 17310 (50 col) Ekstraksi RNA dari berbagai jaringan tumbuhan (daun, batang, akar, benih dll). Double-RNAViral dsRNA Extraction Mini 17412 (50 col) Ekstraksi RNA pada virus double strain Kit (for Plant Tissue) yang terdapat pada jaringan tumbuhan. Pathogene Extraction Nama Produk Cat. No Keterangan Pathogene Spin DNA/RNA Extraction Kit 17154 (50 col) Ekstraksi DNA/RNA dari sampel virus atau bakteri seperti plasma, darah, serum, sel, jaringan dll. Viralgene Spin DNA/RNA Extraction Kit Ekstraksi DNA/RNA dari sampel yang didapatkan dari variasi sampel klinik seperti serum, plasma, sel, urin dll. Untuk mencari RNA/DNA virus yang terdeteksi. 17151 (50 col) Bonus RNaseWiper (21131/200 ml) Remove RNase dan Kontaminasi DNA. Dapat digunakan pada area ventilasi/ruangan lab. Diaplikasikan pada peralatan yang akan digunakan. Aman untuk digunakan. DNase Pemurnian RNA, menghilangkan DNA yang mengkontaminasi. RNase Pemurnian DNA, menghilangkan RNA yang mengkontaminasi. RNase Wiper by iNtRON Menghilangkan RNase serta mengurangi kontaminasi DNA. DNase Hasil RNA Maksimal Cek Hasil DNA/RNA Nano Drop Pengukuran tingkat kemurnian asam nukleat dari hasil ekstraksi pada percobaan ini menggunakan Pembacaan hasil akan terlihat rasio dari nilai absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm dan 260/230 nm dilihat pada layar untuk melihat tingkat purifikasi. Sedangkan A260/A280 menentukan tingkat kemurnian dari RNA, terdapat hubungan linear positif antara kemurnian RNA dengan ratio A260/A280. Kemurnian RNA yang ideal didapatkan dari proses isolasi RNA adalah 95-100% dengan absorbansi sebesar 2,00±0,05, RNA dengan nilai ratio A260/A280 sama dengan 2,0 memiliki tingkat kemurnian sebesar 100%. Panjang gelombang dengan ukuran 240 nm mampu diserap oleh kontaminan, 260 nm untuk asam nukleat, 280 nm untuk protein dan 320 nm kemungkinan kontaminan juga. Tingkat kemurnian DNA yang baik dari hasil isolasi, sekitar 1,8-2,0. Kemurnian DNA di atas 2,0 kemungkinan terkontaminasi dengan RNA dan di bawah 1,8 terkontaminasi protein dan larutan fenol. Elektroforesis Elektroforesis merupakan metode pemisahan serta analisis makromolekul (DNA, RNA, protein) dan fragmennya, berdasarkan ukuran dan muatan. Elektroforesis dalam larutan bebas atau gel berpori seperti 1-2 % agarose memisahkan sebagian besar protein menurut titik isoelektrik atau muatannya. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). 1. Peralatan yang digunakan sangat sederhana, 2. Relatif murah dan 3. Pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik. 1. Memerlukan waktu yang relatif lebih lama 2. Memerlukan keterampilan 3. Bahan yang digunakan relatif lebih banyak. Contoh Hasil Elektroforesis. HATUR NUHUN
