ANDI NUR IFAH DEWI AM H31114501 DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2018 RNA Menurut Sambrook dan Russel (2001), sel mamalia mengandung RNA sebesar 10-5 μg, 80% - 85% dari total RNA Polinukleotida Nukleotida Basa nitrogen Gula pentosa Gugus Fosfat Seperti halnya DNA, RNA dapat diisolasi dengan menggunakan beberapa metode sesuai dengan tujuan isolasi, pemurnian dan analisisnya bagaimanakah bagaimana struktur RNA? teknik isolasi, pemurnian dan analisis RNA ? untuk mengetahui struktur RNA? untuk mengetahui teknik isolasi, pemurnian dan analisis rna ? Gen pada semua organisme prokariot dan eukariot terbuat dari DNA. Pada virus gen terbuat dari DNA atau RNA (asam ribonukleat). RNA, seperti halnya DNA, merupakan polimer panjang tidak bercabang yang terdiri dari nukleotidanukleotida yang bersambung dengan ikatan 3' 5' fosfodiester Struktur kovalen RNA berbeda dengan DNA dalam dua hal : 1. unit - unit gula dalam RNA berupa ribosa bukan deoksiribosa 2. satu dari keempat basa utama dalam RNA adalah urasil (U) yang menggantikan timin (T). 1. 2. RNA genetik memiliki fungsi yang sama dengan DNA, yakni merupakan molekul genetik yang secara keseluruhan bertanggung jawab dalam membawa segala materi genetis, seperti yang dimiliki oleh DNA. RNA nongenetik merupakan RNA yang tidak berperan sebagai DNA. RNA nongenetik dimiliki oleh makhluk hidup yang materi genetiknya diatur oleh DNA. RNA duta (mRNA) 1 RNA nongenetik 3 RNA ribosom (rRNA) 2 RNA transfer (tRNA) Isolasi adalah prosedur yang digunakan unutk memisahkan suatu bagian dari bagian lain dengan tujuan tertentu. Tujuan isolasi RNA digunakan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan RNA murni. Prinsip isolasi RNA sebenarnya tidak jauh berbeda dengan isolasi DNA. 1.Ekstraksi RNA Metode untuk ekstraksi RNA mirip dengan metode ekstraksi DNA. Namun, molekul RNA relatif lebih pendek dan lebih sulit rusak dengan pemotongan sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun demikian, RNA sangat mudah dihancurkan oleh RNase yang terdapat endogen dengan konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari tangan. Sehingga, untuk ekstraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. 2. Presipitasi RNA Untuk melihat RNA yang sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi tetapi banyak bentuk yang berhubugan gen di bagian bawah tube. 3. Pemurnian RNA Tingkat kemurnian RNA berbanding lurus dengan nilai absorbansi dan berkolerasi positif, apabila nilai rasio absorbansi sama dengan 2, maka sampel tidak terkontaminasi pada pengukuran spektrofotometer UV. 1. Metode Guanidin Tiosianat Prinsip kerja : melisiskan membran sel dan membuat RNA larut di dalam larutan yang mengandung guanidin tiosianat. Penambahan larutan fenol/ kloroform pada larutan guanidin tiosianat dapat membuat pH larutan menjadi asam (pH 4). Di bawah kondisi asam, protein dan fragmen DNA (50 bp - 10.000 bp) akan berada pada fase interfase, sedangkan RNA berada pada fase cair 2. Metode modifikasi Guanidin Tiosianat Prinsip kerja : modifikasi dari purifikasi RNA metode guanidium menggunakan tiosianat. prosedur ini Isolasi RNA membutuhkan waktu selama 4 jam dan memberikan hasil dengan tingkat kemurnian yang tinggi. 3. Metode Kromatografi Selulosa Oligo-deoxythymine (DT) Dengan metode ini RNA Poli (A)+ dapat diisolasi dari RNA total menggunakan seleksi selulosa oligo (dT) ata u langsung dari sampel jaringan dan kultur sel. Purifikasi mRNA dari RNA total direkomendasikan untuk jaringan dan sel yang bersumber dari bagian yang kaya RNase, sebagai upaya untuk meminimalisir kemungkinkan degradasi RNA selama proses ekstraksi 4. Metode Trizol ( Modifikasi Guanidin tiosianat) Metode Trizol merupakan salah satu modifikasi lainnya dari Guanidin tiosianat. 5. Metode Langsung Isolasi RNA menggunakan Reagen kit Saat ini metode langsung untuk teknik isolasi pada analisis biologi molekuler menggunakan reagen kit sudah banyak diproduksi. Di antaranya yaitu protokol ekstraksi RNA virus yang diproduksi oleh Qiagen. Mesokarp Kelapa sawit - Ditimbang sebanyak 50 – 100 mg - Dipotong kecil-kecil dengan ukuran(± 2 cm x 3 cm) - Dipindahkan ke mortat yang sudah disiram dengan nitrogen cair - Potongan jaringan digerus dan dengan sekali-kali disiram nitrogen cair sampai menjadi bubuk halus. Bubuk Sampel Bubuk sampel - Dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL bebas-RNase yang telah didinginkan dengan nitrogen cair yang berisi 450 μL buffer lisis (RLT, RLC) dan 5 μL βmerkaptoetanol ditambahkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi. - Lisat dipindahkan ke dalam spincolumn QIAshredder (warna ungu) yang sudah dipasang pada tabung koleksi 2 mL dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 2 menit. - Supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi 1,5 mL yang baru. Sebanyak 250 μL EtOH absolut ditambahkan. - Campuran dihomogenkan dengan pipetting (up-down). - Tabung diinkubasi selama 1-2 menit pada 37°C. - Campuran dipindahkan ke dalam spin-column Rneasy (warna merah muda) yang sudah dipasang pada tabung koleksi 1,5 mL dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit. - Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang. Spin-column dipasang kembali pada tabung koleksi. Sebanyak 700 μL buffer RW1 ditambahkan ke dalam spin-column RNeasy dan campuran disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit. - Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spin-column dipasang kembali pada tabung koleksi. - Sebanyak 500 μL buffer RPE ditambahkan ke dalam membran spin-column RNeasy dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit - Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spincolumn dipasang kembali pada tabung koleksi. - Sebanyak 500 μL buffer RPE ditambahkan ke dalam spincolumn RNeasy dan campuran disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 2 menit. - Cairan yang berada di tabung koleksi dibuang dan spin-column dipasang ke dalam tabung koleksi 2 mL yang baru. - Sebanyak 30-50 μL air bebas RNase atau air yang sudah diberi DEPC ditambahkan ke filter membran spin-column dan disentrifugasi (13.000 rpm; 25°C) selama 1 menit. Spincolumn RNeasy dibuang dan tabung koleksi disimpan pada suhu -80°C. Kualitas dan kuantitas hasil isolasi RNA diperkirakan melalui elektroforesis gel agarosa 1% dan pengukuran absorbansi. Hasil Agarosa - - Konsentrasi agarosa 1% digunakan untuk memeriksa hasil isolasi RNA. Dipadatkan menjadi gel, sisir dilepaskan dari cetakan dan dipasang pada bak elektroforesis. Buffer TAE 1× digunakan untuk merendam gel dalam bak elektrofores is. Loading mixture disiapkan dengan mencampurkan loading dye 6× dengan 4 μL isolat RNA di atas kertas parafilm. Loading mixture dimasukkan ke dalam masing-masing petak sumur. Sebanyak 3 μL marker DNA ladder (1 kb) juga dimasukkan ke dalam petak sumur. Bak elektroforesis ditutup dengan mengatur bagian kutub negatif pada kepala sumur. Mesin elektroforesis dinyalakan. Besar tegangan dan waktu operasi yang digunakan pada penelitian bervariasi antara 80-100 V selama 30-50 menit. Setelah selesai, mesin dimatikan dan gel dikeluarkan. Gel diamati di UV transilluminator dalam ruang gelap. Dokumentasi dilakukan dengan kamera yang dihubungkan dengan perangkat komputer. Sinar UV memendarkan pita DNA sehingga dapat ditangkap kamera dan dilihat melalui monitor komputer. Foto visualisasi gel disimpan dalam hard-disk komputer. Hasil Tahap purifikasi RNA melalui resuspensi antara RNA (1 μg/μL) dengan DNAse RNAse free Thermo Scientific Kits dengan menggunakan metode Wiame (2000) dan Zilienskiene (2012). 1. Struktur kovalen RNA berbeda dengan DNA dalam dua hal yaitu 1) unit - unit gula dalam RNA berupa ribosa bukan deoksiribosa. Ribosa mengandung sebuah gugus 2' -hidroksil yang tidak terdapat deoksiribosa. 2) keempat basa utama dalam RNA adalah urasil (U) yang menggantikan timin (T). Urasil, seperti timin, dapat membentuk pasangan basa dengan adenin, tetapi tidak mengandung gugus metil yang terdapat dalam timin. 2. a.Teknik Isolasi RNA dapat terbagi sebagai berikut: - Metode Guanidin Tiosianat - Metode modifikasi Guanidin Tiosianat - Metode Kromatografi Selulosa Oligo-deoxythymine (DT) - Metode Trizol ( Modifikasi Guanidin tiosianat) - Metode Langsung Isolasi RNA menggunakan Reagen kit b. Upaya purifikasi RNA merupakan tahapan penting menjaga kemurnian RNA terhadap kontaminasi RNAse. Ribonuklease (RNAse) merupakan enzim yang dapat mendegradasi RNA. Purifikasi RNA diperlukan karena struktur kimia RNA lebih rentan terhadap kontaminasi RNAse dari lingkungan, jika dibandingkan dengan DNA.
