Uploaded by User49251

288605265-Makalah-Teknologi-DNA-Rekombinan-TDR

advertisement
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Disusun Guna Memenuhi Tugas Mata Kuliah
Bioteknologi
Dosen Pengampu
Dr. drh. Heru Nurcahyo, M.Kes
Disusun Oleh
Kelompok 1
Andy Maryam
(12708251011)
Nurul Imtihan
(12708251026)
HBA Jayawardana (12708251036)
PRODI PENDIDIKAN SAINS
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA
2013
BAB I
PENDAHULUAN
Perkembangan bioteknologi sekarang ini sudah semakin pesat terutama di
negara-negara maju. Penerapan bioteknologi di bidang pangan dengan menggunakan
teknologi DNA rekombinan menghasilkan tanaman dan produk unggul karena
mengandung zat gizi yang berkualitas tinggi dibandingkan tanaman biasa, serta lebih
tahan terhadap hama penyakit dan tekanan lingkungan. Teknologi DNA rekombinan
adalah
rekayasa
genetika
untuk
menghasilkan
sifat
baru
dengan
cara
merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom.
Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua manfaat yaitu pertama, dengan
mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan
tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan
diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar
daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan
suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan
beberapa tahapan tertentu.
Tahapan-tahapan tersebut adalah isoasi DNA genomik yang akan diklon,
pemotongan molekul DNA menjdi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,
isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan
DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan,
reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Pada makalah ini secara khusus akan membahas mengenai prinsip dasar dalam
teknologi DNA rekombinan, proses pemotongan dan penyisipan gen.
1
BAB II
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
A. Prinsip Dasar Teknologi DNA Rekombinan
Teknik dalam manipulasi gen sangat kompleks dan beragam. Namun
prinsip-prinsip dasar dalam teknologi DNA rekombinan cukup sederhana yang
meliputi tahapan sebagai berikut (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
1. Generasi fragmen DNA dan pemilihan bagian yang diinginkan dari DNA
(misalnya gen manusia).
2. Memasukkan atau menyisipkan DNA yang terpilih ke dalam kloning vektor
untuk membuat DNA rekombinan.
3. Pengenalan vektor rekombinan ke sel inang (misalnya bakteri).
4. Perbanyakan dan seleksi klon yang mengandung molekul rekombinan.
5. Ekspresi gen untuk menghasilkan produk yang diinginkan.
Gambar 1. Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan
B. Aspek-aspek dalam Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan secara khusus mengacu pada aspek-aspek
diantaranya bahan molekuler rekayasa genetika, sel inang, vektor, metode
transfer gen, dan strategi dalam kloning gen (Chakrapani dan Satyanarayana,
2007).
2
1. Bahan Molekuler dalam Rekayasa Genetika
Perangkat rekayasa genetika atau bahan molekuler yang umum
digunakan dalam penelitian teknologi DNA rekombinan adalah enzim. Enzim
yang berperan penting dalam teknologi DNA rekombinan adalah enzim
restriksi dan enzim DNA ligase. Enzim restriksi merupakan suatu
endonuklease yang memiliki kemampuan mengenal dan memotong urutan
nukleotida pada basa-basa secara spesifik (DNA sekuens spesifik yang
panjangnya
empat
sampai
dengan
enam
pasang
basa),
sehingga
pemotongannya bersifat terarah (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
Enzim restriksi juga dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi
yang ditemukan oleh Werner Arber dan Hamilton Smith tahun 1960 dari
mikroba yang memotong DNA untai ganda. Enzim restriksi memotong DNA
pada tempat yang tepat (bukan sembarang tempat). Bagian yang dipotong oleh
enzim ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan
nukleotida (urutan basa) tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai
tempat atau bagian yang akan dipotongnya (Tjahjoleksono, 2010). Berikut ini
beberapa enzim restriksi, sekuens pengenal dan produk.
Sumber
EcoRI
(Escherichia coli)
Sekuens Pengenal
5’....G-A-A-T-T-C...3’
3’....C-T-T-A-A-G ... 5’
Produk
A-A-T-T-C...
G...
....G
C-T-T-A-A
BamHI
(Bacillus amyloliquefaciens)
HaeIII
(Haemophilus aegyptius)
HindIII
(Haemophilus influenza)
5’....G-G-A-T-C-C ... 3’
3’....C-C-T-A-G-G ... 5’
G-A-T-C-C...
G...
5’....G-G-C-C ... 3’
3’....C-C-G-G ... 5’
....G
....C-C-T-A-G
*C-C...
G-G...
5’....A-A-G-C-T-T ... 3’
3’....T-T-C-G-A-A ... 5’
....*G-G
.... C-C
A-G-C-T-T...
A...
...A
....T-T-C-G-A
3
Noti
(Nocardia otitidis)
5’....G-C-G-G-C-C-G-C... 3’
3’....C-G-C-C-G-G-C-G... 5’
G-G-C-C-G-C...
C-G...
...G-C
...C-G-C-C-G-G...
Catatan:tanda(-) merupakan daerah yang dipotong. Tanda (*) adalah produk dengan ujung tumpul
sedangkan yang lainnya adalah produk dengan ujung lancip/lengket
Tabel 1. Beberapa enzim restriksi, sekuens pengenal dan produk
Salah satu enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi
pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli
(Chakrapani dan Satyanarayana, 2007). Enzim EcoRI memotong DNA pada
bagian yang urutan basanya GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI). Pada
DNA untai ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens
yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap untai
dari untai ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Potongan-potongan atau
fragmen-fragmen DNA untai ganda yang dihasilkan akibat pemotongan di
setiap untainya akan memiliki ujung beruntai tunggal. Ujung ini dikenal
dengan istilah sticky ends atau cohesive ends (ujung kohesif) dan blunt ends
(ujung tumpul) (Tjahjoleksono, 2010). Fragmen DNA dengan sticky ends
adalah partikel yang digunakan untuk eksperimen DNA rekombinan. Hal ini
karena ujung untai tunggal DNA-nya mudah berpasangan dengan fragmen
DNA komplementer lain yang memiliki sticky ends (Chakrapani dan
Satyanarayana, 2007).
Tatanama enzim restriksi mengikuti standar prosedur berdasarkan
sumber bakteri yang diisolasi. Huruf pertama pada enzim yang ditulis miring
menunjukkan nama genus, diikuti dua huruf berikutnya juga ditulis miring
menunjukkan spesies, selanjutnya adalah strain organisme dan terakhir angka
Romawi yang menunjukkan urutan penemuan. Beberapa contoh penamaan
enzim seperti berikut ini. EcoRI adalah enzim yang berasal dari Escherichia
(E) coli (co), strain Ry13 (R), dan merupakan endonuklease pertama (I) yang
ditemukan. HindIII adalah Haemophilus (H) influenzae (in), strain Rd (d), dan
merupakan endonukleus ketiga (III)yang ditemukan.
4
Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung atau menyisipkan
DNA. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil
membuat molekul DNA rekombinan. Mereka menggabungkan fragmenfragmen DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu
fragmen
dengan
ujung
sticky
ends
fragmen
lainnya,
kemudian
menyambungkan kedua ujung fragmen tersebut secara kovalen dengan
menggunakan enzim DNA ligase (Tjahjoleksono, 2010).
Keberadaan enzim DNA ligase sangat diperlukan untuk menangkap
potongan DNA asing. Selain kedua enzim tersebut enzim (restriksi dan enzim
DNA ligase), terdapat beberapa enzim yang ikut berperan dalam teknologi
DNA rekombinan seperti dalam tabel berikut.
Enzim
Alkalin posfatase
Bal 31 nuklease
DNA ligase
DNA polymerase I
Dnase I
Endonuklease III
λ eksonuklease
Polynukleotida kinase
Enzim restriksi
Transkriptase balik
Rnase A
Rnase H
Taq DNA polymerase
SI nuclease
Terminal transferase
Kegunaan/Reaksi
Menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada untai
ganda/tunggal DNA (atau RNA)
For the progressive shortening of DNA
Menyambungkan dua mulekul/fragmen DNA
Mengisi kekosongan dalam dupleks dngan penambahan
nukleotida pada ujung 3’
Memproduksi single-standed nicks dalam DNA
Menghilangkan residu nukleotida dari ujung 3’ untai
DNA
Menghilangkan residu nukleotida dari ujung 5’ suatu
dupleks untuk membuka ujung 3’ untai tunggal
Menambah fosfat pada ujung 5’-OH polinukleotida untuk
melabel atau melangsungkan terjadinya ligasi
Memotong untai ganda DNA pada urutan basa yang
spesifik
Membuat salinan DNA dari molekul RNA
Memotong dan mencerna RNA (tidak termasuk DNA)
Memotong dan mencerna untai RNA pada RNA-DNA
heterodupleks
Digunakan dalam PCR (Polymerase Chain Reaction)
Mendegradasi untai tunggal DNA dan RNA
Menambahkan ekor homopolimer pada ujung 3-OH
dupleks linier
Tabel 2. Beberapa enzim yang biasa digunakan dalam teknologi DNA rekombinan/rekayasa
genetika (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
5
2. Sel Inang
Sel inang merupakan sistem kehidupan atau sel yang membawa
molekul DNA rekombinan. Jenis sel inang pada prokariotik (bakteri) berbeda
dengan sel inang pada eukariotik (jamur, hewan dan tumbuhan). Beberapa
contoh sel inang yang digunakan dalam rekayasa genetika dapat dilihat pada
tabel sebagai berikut.
Kelompok
Prokariotik
Bakteri
Eukariotik
Fungi
Contoh
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Streptomyces sp
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus nidulans
Hewan
Insect cells
Oocytes
Mammalian cells
Whole organisms
Tumbuhan
Protoplasts
lntact ells
Whole plants
Tabel 3. Beberapa contoh sel inang yang digunakan dalam rekayasa genetika
Selain efektif menggabungkan materi genetik vektor, sel inang juga mudah
dibudidayakan di laboratorium untuk menghasilkan produk. Secara umum,
mikroorganisme lebih banyak dimanfaatkan sebagai sel inang karena
kemampuan berkembang biaknya lebih cepat dibandingkan dengan sel-sel dari
organisme tingkat tinggi (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
Sel inang prokariotik. Escherichia coli merupakan mikroorganisme
pertama yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan dan terus menjadi
inang pilihan oleh para ilmuwan. Bacillus subtilis adalah bakteri non-patogen
berbentuk batang. Bakteri ini telah digunakan sebagai sel inang dalam bidang
industri untuk memproduksi enzim, antibiotik, insektisida dan lain-lain.
Beberapa ilmuwan menggunakan
Bacillus
subtilis sebagai pengganti
Escherichia coli (Chakrapani dan Satyanarayana, 2007).
6
Sel inang eukariotik. Organisme eukariotik merupakan sel inang yang
banyak digunakan untuk memproduksi protein manusia karena memiliki
struktur yang komplek sehingga cocok untuk mensintesis protein komplek.
Organisme eukariotik yang sering digunakan adalah ragi (Saccharomyces
cerevisiae). Selain ragi, sel inang yang dapat digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan adalah sel
mamalia (seperti
sel-sel
tikus). Keuntungan
menggunakan sel mamalia sebagai sel inang adalah beberapa protein komplek
yang tidak dapat disintesis oleh bakteri dapat diproduksi oleh sel mamalia
seperti jaringan aktivator plasminogen. Hal ini karena sel-sel mamalia memiliki
mekanisme untuk memodifikasi protein ke bentuk aktif (modifikasi setelah
proses translasi).
3. Vektor/Pembawa
Vektor dalam DNA rekombinan adalah molekul DNA yang membawa
fragmen DNA asing yang akan dikloning.
a. Plasmid
Plasmid merupakan DNA bakteri yang ekstrakromosomal karena
terpisah dari kromosom bakteri. DNA plasmid dapat berbentuk doublestranded (untai ganda) dan sirkular serta memiliki kemampuan mereplikasi
diri. Hampir semua bakteri memiliki plasmid baik dalam jumlah yang
sedikit (1-4 per sel) bahkan memiliki jumlah yang banyak (10-100 per sel).
Ukurannya bervariasi antara 10-500 kb. Plasmid menyumbang 0,5-5% dari
jumlah DNA bakteri.
Plasmid yang digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika
memiliki sifat-sifat sebagai berikut:
(1) Ukuran kecil, sehingga mudah diisolasi dalam keadaan utuh.
(2) Mempunyai bentuk DNA sirkuler sehingga tetap stabil pada saat
diisolasi.
(3) Melangsungkan replikasi sendiri sehinga berlangsung di luar kontrol
sel.
(4) Terdapat dalam beberapa copy di dalam sel
(5) Berisi sisi pengenal tunggal untuk satu atau lebih enzim restriksi.
(6) Memiliki gen resistensi terhadap antibiotik sehingga memudahkan
deteksi dan seleksi terhadap plasmid yang berisi gen yang diinginkan.
7
Plasmid yang memenuhi kriteria sifat tersebut yang paling banyak
digunakan sebagai vektor adalah pBR322 (untai DNA 4,361 bp). pBR322
membawa gen yang resisten untuk ampicilin (Amp′) dan tetracycline (Tel′)
sebagai penanda yang dikenal sebagai klon yang membawa plasmid.
Plasmid pBR322 ini memiliki pengenalan yang baik pada reaksi enzim
endonuklease retriksi pada EcoRI, HindIII, BamHI, SalI dan PstlI.
Gambar 3. Plasmid dalam sel bakteri dan plasmid pBR322
Sifat-sifat plasmid pBR322 adalah sebagai berikut:
(1) Relatif kecil dengan berat molekul 2,6 x 106
(2) Stabil, bertahan pada sel inang (host) dengan jumlah 1 – 0 copy/sel.
(3) Dapat diperbanyak jumlahnya sampai 1.000 – 3.000 copy tiap sel
(dengan jalan menghambat sintesis protein).
(4) Dapat menyisipkan DNA asing yang besar (sampai 10 kb).
(5) Memiliki urutan nukleotida secara komplit sebanyak 4.362
(6) Mempunyai sisi pemutus tunggal untuk enzim restriksi PstI, SaII,
EcoRI, HindIII, BamHI.
(7) Mempunyai dua penanda reistensi untuk antibiotik ampicilin dan
tetrasiklin sehingga mudah diseleksi.
8
Jenis plasmid lain adalah pUC19 (2,686 bp) memiliki gen yang
resisten terhadap ampicilin. Sedangkan yang lain adalah derivat pBR322pBR325, pBR328 dan pBR329.
b. Bakteriofag
Bakteriofag adalah virus yang bereplikasi di dalam tubuh bakteri.
DNA bakteriofag menyatu dan tinggal secara permanen di dalam
kromosom bakteri. Fag sebagai vektor mampu menerima fragmen DNA
asing ke dalam genomnya. Penggunaan fag sebagai vektor menguntungkan
sebab memiliki kemampuan membawa DNA yang lebih besar daripada
plasmid. Oleh karena itu, fag lebih disukai untuk rekayasa genom sel
manusia. Jenis fag yang sering dipakai adalah bacteriophage λ (phage λ)
dan bachteriophage (M13).
Gambar 4. Struktur fag λ
c. Cosmid
Cosmid merupakan vektor yang memiliki karakteristik campuran
antara plasmid dan bacteriophage λ. Nama cosmid terdiri atas dua kata
yaitu “cos” yang menunjukkan bahwa cosmid mengandung ujung kohesif
(kompak/lengket) atau cossite (wadahcos). Bagian ujung tersebut perlu
untuk mengemas DNA ke dalam kepala fag. Kata yang kedua adalah “mid”
menunjukkan bahwa cosmid membawa sifat plasmid yang bisa bereplikasi.
Cosmid dibentuk dengan menambahkan fragmen DNA phage λ termasuk
cos site ke dalam plasmid. DNA asing dapat disisipkan ke dalam cosmid
DNA menjadi DNA rekombinan yang bisa dikemas dalam bentuk fag.
Kemudian fag tersebut diinjeksikan ke dalam E.coli. Perilaku fag
seperti plasmid membuat fag tersebut memiliki kemampuan bereplikasi.
9
pBR322-plasmid dapat dimodifikasi menjadi cosmid. Sebagai
plasmid, cosmid ini memiliki kemampuan replikasi dan pengenalan
terhadap enzim retriksi (Zubey et al., 1995). Setelah reaksi pengemasan
dilakukan, partikel yang terbentuk dipakai untuk menginfeksi sel E.coli.
Keuntungan dari penggunaan cosmid adalah kemampuannya yang bisa
membawa fragmen DNA asing yang lebih besar daripada plasmid.
d. Artificial Chromosome Vector (vektor buatan)
Dikenal tiga jenis vektor buatan yaitu:
(1) Human Artificial Chromosome (HAC)
HAC dikembangakn tahun 1997 oleh H. Willard berupa kromosom
manusia buatan. Kromosom ini merupakan vektor DNA yang dibuat
secara sintetis dan memiliki kareteristik seperti kromosom manusia.
HAC adalah mikrokromosom yang dimungkinkan mampu mereplikasi
diri dengan rentang ukuran 1/10 – 1/5 bagian dari kromosom manusia.
Keuntungan dari penggunaan HAC adalah kemampuannya membawa
gen manusia yang ukurannya cukup panjang. Lebih jauh lagi HAC
berfungsi untuk membawa gen yang diintroduksi (dikenalkan) ke dalam
sel untuk keperluan terapi gen.
(2) Yeast Artificial Chromosome (YACs)
Yeast Artificial Chromosome (YACs) merupakan DNA sintesis yang
bisa menampung DNA asing dalam jumlah besar (khususnya DNA
manusia). Dengan vektor ini dapat dilakukan kloning potongan DNA
dalam ukuran besar.
(3) Bacterial Artificial Chromosome (BACs)
Struktur BACs berdasarkan F-plasmid yang memiliki ukuran lebih
besar dari plasmid lain yang difungsikan sebagi vektor. BACs dapat
menerima sisipan DNA sekitar 300 kb.
e. Vektor Khusus
Salah satu faktor utama yang mempengaruhi pemilihan suatu vektor adalah
ukuran dari fragmen DNA asing yang akan disisipkan. Efisiensi proses ini
sangat penting untuk menentukan kesuksesan kloning. Tabel di bawah
menunjukkan ukuran DNA sisipan.
10
Vetor
Inang
Phage λ
Cosmid λ
Plasmid
artificial
chromosome (PAC)
Bacterial
artificial
chromosome (BAC)
Yeast chromosome
E. coli
E. coli
E. coli
Ukuran DNA
yang disisipkan
5-25 kb
35-45 kb
100-300 kb
E. coli
100-300 kb
E. coli
200-2000 kb
asing
Tabel 4. Contoh berbagai Ukuran fragmen DNA yang disisip dan vektor
4. Metode Transfer Gen
a. Transformasi
Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari
lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA
asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari
sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari
lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena
transformasi ini telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery
(1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak
virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya
menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan sifat
ini disebabkan karena strain yanng tidak virulen (strain kasar) dicampuran
dengan sel-sel bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan.
Gambar 5. Bagan Transformasi Gen
Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa
perubahan sifat atau transformasi dari bakteri kasar menjadi bakteri halus
11
atau perubahan dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh
adanya DNA dari sel bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar.
Berdasarkan pada mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan
transformasi bakteri secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat
memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana
yaitu mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu
di dalam tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi
sel-sel bakteri yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut.
Gambar 6. Transformasi Gen
b. Konjugasi
Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke
dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua
sel. Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel
resipien (sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh
sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan
berpindah ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah
proses konjugasi selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah
konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan jumlah sel tidak
bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel). Oleh karena itu,
proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual
yang tidak reproduktif.
12
Gambar 7. Konjugasi, Transformasi, Transduksi Gen
c. Elektroporasi
Elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik
untuk memperbesar pori-pori membran sel sehingga meningkatkan
permeabilitas membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus terlebih
dahulu ditumbuhkan pada media hingga mencapai masa di sekitar
pertengahan fase log. Kemudian sinyal elektrik akan menginduksi
perbesaran pori-pori membran sehingga molekul yang berukuran kecil
seperti DNA dapat masuk (Gruber, 1995; Watson JD, 2008).
Gambar 8. Peralatan Elektroporasi
Metode ini memiliki kemungkinan berhasil yang tinggi serta
efisiensi yang tinggi dibanding metode transformasi lainnya namun
memiliki risiko kematian sel bakteri yang lebih besar serta biayanya
pun relatif mahal. Tingkat keberhasilan dari metode ini juga tergantung
13
pada kandungan garam yang ada di lingkungan. Selain elektroporasi,
metode untuk memasukkan DNA plasmid ke dalam suatu sel adalah
dengan menggunakan perlakuan gelembung liposom (berukuran nano)
serta kejutan suara ( Oswald, 2007; Suzuki, 2008)
Metode elektroporasi sudah diaplikasikan dalam berbagai bidang.
Dalam
bidang
pertanian,
elektroporasi
dapat
digunakan
untuk
memodifikasi mikroorganisme agar dapat menambat nitrogen bebas yaitu
dengan menyisipkan gen yang dapat menambat nitrogen bebas. Selain itu
juga dapat dihasilkan tanaman transgenik yang memiliki genotipe yang
lebih istimewa (seperti
peningkatan
mutu,
rasa
dan
ketahanan
misalnya). Dalam bidang kedokteran, elektroporasi juga dapat digunakan
untuk menyisipkan gen ke dalam suatu bakteri untuk
produk komersil seperti hormon insulin
yang
penghasilan
berguna
untuk
penderita diabetes. Selain itu, di bidang bioremediasi, elektroporasi dapat
digunakan
untuk
memodifikasi
mikroorganisme
sehingga
mikroorganisme dapat digunakan untuk mengatasi permasalahan seperti
tumpahan
minyak
di
laut
dengan
memindahkan gen yang
menyandikan enzim yang dapat menguraikan minyak pada bakteri target
(Seidman, 2001; Madigan, 2009)
d. Transfer gen dengan mediasi liposom
Liposom adalah molekul lipid sirkular, yang memiliki interior cair
yang dapat membawa asam nukleat. Beberapa teknik telah dikembangkan
untuk merangkum DNA dalam liposom. Transfer gen dengan mediasi
liposom disebut sebagai lipofection.
Pada transfer fragmen DNA dengan liposom, potongan-potongan
DNA bisa dikemas dalam liposom. Liposom ini dapat melekat pada
membran sel dan menyatu dengan mereka untuk mentransfer fragmen
DNA. Dengan demikian, DNA memasuki sel dan kemudian menuju
nukleus.
e. Transfer langsung
Transfer DNA ke dalam nukleus secara langsung juga dapat menggunakan
teknik mikro injeksi dan penembakan/pengeboman partikel.
14
5. Strategi Pengkloningan Gen
Kloning gen merupakan suatu terobosan baru untuk mendapatkan
sebuah gen yang mungkin sangat dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning
gen
meliputi
serangkaian
dari genom suatu organisme,
proses isolasi fragmen DNA
penentuan
sekuen DNA,
spesifik
pembentukan
molekul DNA rekombinan, dan ekspresi gen target dalam sel inang.
Penentuan
sekuen
DNA
melalui
sekuensing
bertujuan
untuk
memastikan fragmen DNA yang diisolasi adalah gen target sesuai dengan
kehendak.
Gen
target
yang
diperoleh
selanjutnya
diklon dalam
sebuah vektor (plasmid, fag, atau cosmid) melalui teknologi DNA rekombinan
yang selanjutnya membentuk molekul DNA rekombinan. DNA rekombinan
yang dihasilkan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya
sel bakteri, misalnya strain E. coli) untuk diproduksi lebih banyak. Gen-Gen
target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan menghasilkan
produk gen yang kita inginkan.
Aplikasi kloning gen misalnya adalah produksi insulin. Fragmen DNA
spesifik penyandi insulin diisolasi dan diklon dalam suatu vektor membentuk
DNA rekombinan yang selanjutnya produksi insulin dilakukan di dalam sel
inang bakteri E. coli.
Tujuan pengkloningan gen adalah untuk:
a. Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
b. Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
c. Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
d. Mengidentifikasi muntasi yang terjadi pada kecacatan gen yang
mengakibatkan penyakit bawaan
e. Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi
insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Sumber DNA untuk dikloning dapat diperoleh dari DNA kromosom,
cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai
cetakan (template), dan DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan
PCR. Sedangkan komponen-komponen yang diperlukan untuk kloning yaitu:
a. Enzim endonuklease restriksi
15
b. Enzim ligase
c. Vektors
d. Inang (Host)
e. Metode atau mekanisme untuk memasukkan/menyisipkan DNA ke dalam
sel inang.
Mekanisme penyisipan gen atau DNA tersebut yaitu:
a. DNA yang ingin disisipkan, diisolasi, dan dipotong oleh enzim
endonuklease restriksi, di tempat yang urutan nukleotidanya spesifik.
b. DNA yang akan digunakan sebagai inang, misalnya plasmid bakteri E. coli,
diisolasi dan dipotong pula oleh enzim yang sama. Plasmid ini biasanya
disebut sebagai vektor pengklon.
c.
Fragmen DNA kemudian disisipkan ke dalam vektor dan disatukan oleh
enzim endonuklease ligase.
d. Plasmid yang telah disisipi, dimasukkan kembali ke dalam bakteri,
kemudian bakteri tersebut dikembangbiakkan menjadi banyak sehingga
rekombinan pun ikut bertambah banyak, demikian pula hasil ekspresi
gennya.
Gambar 9. Mekanisme Kloning Gen
16
C. Teknik DNA Rekombinan
1. Isolasi dan Pemurnian DNA
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diisolasi atau diekstraksi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008).
Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan
dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa
dilakukan untuk semua spesies, metode yang dilakukan tidak boleh
mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana
dan cepat.
Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada
berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam
hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih
mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan
sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti
Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada hewan digunakan
GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-tahapan isolasi
DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan
dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan manual
memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki
kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara
kekurangannya membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang
diperoleh tergantung jenis sampel.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.
Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan
17
cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle
dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan
iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan
kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi
seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel
sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara
enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan
membran pada sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai
polipeptida dalam komponen sel (Surzycki (2000).
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent
seperti
ethylenediamine
tetraacetic
acid
(EDTA)
yang
berperan
menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi,
EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium
dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan
Rapley, 2008).
DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu
dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti
polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian
yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein,
ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan
kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan
dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008).
Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah
sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada
lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan
RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein
yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase
organik. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform
atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi
protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA
sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian
RNAse.
18
Gambar 10. Proses Pemurnian DNA
Tahap terakhir adalah pemurnian DNA. Pemurnian DNA dari
ekstrak sel dengan menggunakan salah satu kemikalia seperti berikut ini:
Fenol, kloroform, Isopropanol, isoamyl alkohol. Selain itu untuk pemurnian
DNA
dari
kontaminan protein
Pronase atau Proteinase-K
dan
digunakan
enzim
kontaminan
protease
RNA
yaitu
dengan
menggunakan RNase. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat
dilakukan dengan menggunakan densitas gradien sentrifugasi Cesium
Chlorida (CsCl), dengan cara ini DNA akan terpisah pada band yang berbeda
dengan protein dan RNA bahkan antara linier DNA dan sirkuler DNA. Selain
itu, dengan menggunakan garam dengan konsentrasi tinggi, seperti 0,25 M
sodium acetate atau 0,1 M sodium chlorida (Fatchiyah, 2011).
2. Teknik Blotting DNA
Teknik blotting adalah teknik pemindahan molekul DNA, RNA, atau
protein yang telah terpisahkan berdasarkan prinsip tertentu (misal berat
molekul) dari gel ke membrane, misal membrane nitroselulosa. Molekul yang
telah berada pada membrane tersebut selanjutnya dianalisis lebih lanjut
(Juniarka, 2011)
19
Teknik blotting pada dasarnya ada tiga macam yaitu southern blotting
(untuk blotting DNA), northen blotting (untuk RNA), dan dot blotting (untuk
DNA/RNA), kemudian muncul istilah-istilah lain misalnya western blotting,
eastern blotting, dan sebagainya, tetapi intinya sama yaitu teknik untuk
memblotting. Dalam makalah ini hanya akan dijelaskan mengenai teknik
southern blotting saja karena lebih fokus ke DNA.
Gambar 9. Prinsip Dasar Southern Blotting
Gambar 11. Mekanisme Southern Blotting
Southern blotting merupakan proses perpindahan fragmen DNA yang
terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran. Metode ini diambil dari
20
nama penemunya yaitu Edward M. Southern. Prinsipnya adalah kapilaritas,
dimana bufer yang merupakan fase gerak diasumsikan akan membawa
fragmen DNA dari gel ke membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan
muatan membran positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada
membran. Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah
membran nitroselulosa (Watson, 2004: 77-85; Zuppaedo, 1998: 2601-26006)
Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk
memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian
ditransfer
ke membran filter untuk selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan probe
(pelacak). Untuk mengidentifikasi ataupun melacak suatu fragmen DNA
spesifik, diperlukan suatu pelacak (probe). DNA dipisahkan terlebih dahulu
dengan elektroforesis. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita
DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang
diinginkan (Southern, 1975:503-517).
Tahap awal metode shoutern blotting adalah penguraian DNA dengan
enzim restriksiendonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen DNA yang
lebih
kecil.
Kemudian
DNA
dipisahkan
sesuai
ukuran
dengan elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan
DNA ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap
blotting. Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari
gel
agarosa. Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran
diletakkan pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel
untuk memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer
berlangsung dengan memanfaatkan dayakapilaritas. Setelah DNA ditransfer
ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan dengan suhu tinggi (60oC-100oC)
kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan
permanen antara pita-pita DNA dengan membran. Lalu, membran dicampur
dengan probe (pelacak) yang telah dilabeli radioaktif, tetapi dapat juga
digunakan label nonradioaktif yang dapat berpendar. Probe yang digunakan
adalah DNA untai tunggal yang memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe
diinkubasi dengan membran agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada
pada membran. Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari
membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di
21
membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi
dengan visualisasi pada
film X-ray melalui autoradiografi (Molecular Station, 2013)
Teknik Blot Southern telah digunakan dalam berbagaia aplikasi di
bidang kesehatan maupun pada rekayasa genetika. Salah satunya digunakan
untuk menganalisis sistem major histokompatibilitas pada tikus dan
menganalisis penyusunan klon dari gen T-cell receptor penyakit luka yang
diakibatkan oleh mikosis dari fungoides (Gunther, 1989: 1257-1261; Dosaka,
1989: 626-629)
3. DNA Sequencing (sekuen DNA)
Sekuen DNA merupakan proses penyusunan dan pengenalan DNA yang
dilakukan untuk mengetahui fungsi gen dan kemunginan adanya penyakit
yang diwariskan melalui gen. Teknik sekuen DNA menggunakan bantuan
pereaksi kimia ataupun enzim.
a. Teknik Maxam dan Gilbert
Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian
fragmen DNA yang akan disekuens. Perlakuan kimia menghasilkan
pemutusan pada proporsi yang kecil satu atau dua dari empat basa
nukeotida pada masing-masing reaksi (G, A+G, C, C+T). Sehingga
sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang
diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul. Fragmen pada
ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk
pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel
diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. Dan menghasilkan
sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen
DNA yang diradiolabel.
b. Metode Dideoxynucleotid
Metode ini lebih disukai dibandingkan teknik Maxam dan Gilbert.
Metode dideoxynucleotide menggunakan molekul dideoxynucleotide
yang tidak memiliki gugus hidroksil pada karbon no-3 dari gula,
sedangkan deoxyribonucleotide normal memiliki group 3-hydroxyl pada
unit gulanya. Selama replikasi DNA, deoxynucleoside triphosphate yang
datang berikatan pada 5-phosphate dengan 3-hydroxyl dari nukleotida
22
yang sudah ada. Tetapi jika yang berikatan adalah dideoxynucleotide,
maka sintesis DNA akan berhenti.
Teknik
dideoxynucleotide
memerlukan primer sebagai pemula
reaksi sintesis untai komplementer.
Reaksi sintesis untai DNA dimulai
dengan
penambahan
polimerase
Klenow dan masing-masing dari ke-4
deoksinukleotid (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP). Di samping itu ditambahkan
pula satu nukleotide yang dimodifikasi
yaitu
dideoksi
dideoxinukleotid
ATP).
menyebabkan
(misalnya
Nukeotid
penghentian
ini
sintesis
untai selanjutnya. Jika dideoksi ATP
ditambahkan, penghentian akan terjadi
pada posisi yang berlawanan dengan
timidin pada DNA cetakan. Tetapi
penghentian tidak selalu terjadi pada
timidin pertama, karena dATP yang
Gambar 12. Teknik Maxam Dan Gilbert
normal juga terdapat dan mungkin
digabungkan lebih dulu daripada dideoxinukeotida. Rasio dATP terhadap
dideoxinukeotida
adalah
sedemikian
sehingga
tiap-tiap
untai
mengalamisasi polimerisasi sampai cukup panjang sebelum dideoxy-ATP
ditambahkan. Sehingga diperoleh kumpulan untai baru yang semua
memiliki panjang yang berbeda tetapi masing-masing berakhir pada
dideoxi-ATP.
Reaksi sintesis untai DNA dilakukan empat kali secara paralel.
Terdapat juga reaksi dengan dideoxy-TTP, dideoxy-GTP dan dideoxyCTP. Langkah selanjutnya adalah memisahkan komponen tiap-tiap
kelompok yang dapat dilakukan dengan gel elektroforesis. Kondisinya
harus diatur dengan baik agar dapat terjadi pemisahan dengan panjang
yang berbeda hanya satu nukeotida. Elektroforesis dilakukan dengan gel
23
poliakrilamid yang sangat tipis dan panjang. Tiap pita dalam gel akan
mengandung DNA dalam jumlah kecil sehingga diperlukan autoradiografi
dengan memasukkan deoksinukeotide radioaktif.
Dalam perkembangan selanjutnya, radioaktif digantikan dengan
label fluorescent.label fluorescent berikatan dengan dideoxynucleotide,
sehingga tiap molekul chain-terminated membawa label tunggal pada
ujung 3’. Fluorochrome yang berbeda dapat digunakan untuk tiap dideoxyNTP. Deteksi signal fluorescent dapat dilakukan dengan sistem
imaging yang khusus yang menggunakan komputer untuk membaca
sekuens
DNA.
Teknologi
sekuen
DNA
terbaru
antara
lain
AutomatedDNASequencing (sekuen DNA otomatis) dan DNA Chips
(microarray).
4.
Metode Transfer Gen
(Sudah dijelaskan)
5. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik untuk menghasilkan suatu
jenis DNA spesifik dalam jumlah besar secara in vitro. PCR dipakai untuk
menghasilkan fragmen DNA dan RNA yang ingin dianalisis. Teknik ini
melalui tiga tahap yaitu:
-
Denaturasi: fragmen DNA dipanaskan pada temperatur tinggi (95°C)
sehingga mengurangi jumlah DNA dobel heliks menjadi untai tunggal
(untai primer).
-
Annealing: Setelah DNA menjadi untai tunggal, suhu diturukan ke
kisaran 40-60°C selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi
primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen
dengan sekuen primer.
-
Ekstensi/elongasi: Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu
kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72°C. Pada tahap ini
DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada
pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang
dNTP, dan seterusnya. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga
ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang
akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
24
6. Produksi Antibodi Monoklonal
Antibodi monoklonal adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber
tunggal atau sel klona yang hanya mengenal satu jenis antigen. Pembentukan
antibodi monoklonal dilakukan dengan menggunakan kelinci atau tikus.
Gambar 13. Gambaran sederhana proses produksi antibodi monoklonal
7. Pustaka Genom
Koleksi fragmen DNA disimpan dalam pustaka genom untuk
menyempurnakan koleksi gen yang diisolasi dari sel. Gen-gen tersebut
dipotong dalam bentuk fragmen dan diklon pada vektor yang sesuai. Pustaka
genom/bank gen berhasil mengoleksi gen manusia dalam berbagai ukuran
fragmen DNA.
Pembuatan pustaka genom dilakukan dengan penguraian genom sel
dengan enzim retriksi untuk meproduksi fragmen DNA dalam jumlah
25
banyak. Saat ini, dengan adanya mesin PCR sangat membantu proses
tersebut.
Proses ini membutuhkan
beberapa
bahan
tersedianya
baku
seperti
prekursor
DNA
(dNTP), enzim polimerase, dan
primer.
Pustaka
genom
yang
dimiliki dijadikan sebagai bahan
analisis
menurut
kebutuhan.
Teknik analisisnya antara lain:
Random Amplified Polymorphic
DNA
(RAPD),
Restricted
Fragment Length Polymorphism
(RFLP), Degradative Gradien Gel
Electrophoresis (DGGE), analisis
sekuen
dan
Fragment
Macro-restricted
LengthPolymorphism
(MFLP).
Gambar 14. Pustaka Genom
8. Site-Directed Mutagenesis dan Rekayasa Protein
Side-directed mutagenesis adalah teknik untuk menghasilkan asam
amino dengan melakukan rekayasa pada kode DNA. Teknik ini
memungkinkan
produksi
enzim
spesifik.
Dua
jenis
protein
yang
dikembangkan dengan teknik Site-directed mutagenesis dan rekayasa protein
adalah Tissue Plasminogen Activator (tPA) dan Hirudin. Protein yang sudah
direkayasa tersebut disebut mutan.
Rekayasa
protein
bisa
didefinisikan
sebagai
suatu
proses
pengembangan secara logika dari suatu protein untuk mencapai sifat-sifat
protein yang diinginkan dengan cara mengganti atau mengubah sifat-sifat
fisiologis protein. Sifat fisiologis ini bisa dengan cara mengubah aktivitas
atau fungsinya.
26
Teknik rekayasa protein dilakukan dengan cara: (a) pointmutan:
penyisipan mutan pada urutan asam amino tertentu; (b) delesimutan:
penguraian asam amino pada untainya; (c) hibrid/penggabungan; (d)
pembuatan protein baru dengan komposisi baru; (e) penghubungan fungsi
dan struktur; (e) menghasilkan protein minimal berbentuk satu jenis protein
yang ingin diproduksi. Tujuan utama dari rekayasa protein adalah
meningkatkan “nilai jual” pemanfaatan protein untuk aplikasi industri atau
medis.
27
BAB V
PENUTUP
1. Kesimpulan
a. Teknologi DNA Rekombinan (TDR) merupakan teknologi untuk merekayasa
genetika yang mebutuhkan teknik pemotongan dan penyisipan DNA dengan
berbagai jenis teknik.
b. Proses pemotongan dan penyisipan gen melibatkan berbagai aspek yaitu: (1)
bahan molekular dalam TDR (enzim restriksi dan enzim ligase); (2) sel inang;
(3) Vektor; (4) metode transfer gen; (5) strategi pengkloningan gen
c. Teknik dan metode DNA Rekombinan terus dikembangkan melalui berbagai
cara yang pada prinsipnya selalu melibatkan pemotongan dan penyisipan gen.
2. Saran
Teknologi DNA Rekombinan terus berkembang secara pesat sehingga teknik
baru banyak ditemukan. Perlu bagi pembaca untuk memperluas wawasan dengan
belajar dari berbagai sumber bacaan terbaru.
28
DAFTAR PUSTAKA
Andy
Vierstraete.
1999.
Polymerase
Chain
Reaction.
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html (21 Februari 2013)
Avery, McCleod, dan McCarty. 1944. Studi on The Chemical Nature of The
Substance Incuding Transformation of Pneumococcal Types. J. Exp. Med. 79:
137-158
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools
andTechniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.
Dosaka N, Tanaka T, Fujita M, Miyachi Y, Horio T, Imamura S. 1989. Southern blot
analysis of clonal rearrangement of T-cell receptor gene in plaque lesion of
mycosis fungoides. Journal Invest Dermatology 93;626-629.
Fakultas
Pertanian
Universitas
Udayana.
DNA
Sequensing.
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/dna-sequencing/ (25
Februari 2013)
Fatchiyah. 2011. Isolasi DNA. Malang: Universitas Brawijaya
Frederick A. Bettelheim, Joseph Marvin Landesberg. 2007. Laboratory Experiments
for General, Organic And Biochemistry. USA: Brooks
Gerald Carp. 2008. Cell and Molecular Biology: Conceps and Experiment.
Michigan: Universitas Michigan
Gruber CE. 1995. Electropotation Protocols for Microorganisms. Vol. 47 : 67-79.
Gunther E, Wurst W, Wonigeit K, Epplen JT. 1989. Analysis of the rat major
histocompatibility system by Southern blot hybridization. Journal of
Immunol 143(2);1257-1261.
I Gede Agus Juniarka. 2011. Westernblot Untuk IgG dan IgM. Program
Pasacasarjana Farmasi UGM
IPGRI and Cornell University. 2003. Using Molecular Marker Technology in Studies
on Plant Genetic Diversity DNA Based Technologies PCR-based,
Technologies
PCR
basics.
http://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversityDocs/Training/mo
lecular_markers_volume_1/english/MolMarkers%20Vol1%20III%20PCR%2
0basics.pdf
29
James R. Griffith. 1928. Reinforced Concrete Design Simplified. Virginia: University
of Virginia
K.H. Khan. 2009. Vector Used in Gene Manipulation, a Retrospective. Advance
Biotech Journal-online.
Luigi Giacomazzi, P. Umari, and Alfredo Pasquarello. 2005. MediumRange Structural Properties of Vitreous Germania Obtained through First
Principles
Analysis
of
Vibrational
Spectra. Phys. Rev. Lett 95,
075505
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2009. Brock Biology of
Microorganisms. San Fransisco: Pearson Education, Inc.
Mochamad
Saeffulloh.
Antibodi
Monoklonal.
http://2.bp.blogspot.com/eKoGS2K8RIU/UBxSIBNo9ZI/AAAAAAAAAeE/ozuXSZgIaSM/s1600/jpg
(25 Februari 2013)
MolecularStation.
2008.
Southern
Blot.
http://www.molecularstation.com/dna/southern-blot/ [22 Februari 2013].
Oswald N. 2007. E.coli Electroporation vs Chemical Transformation. [terhubung
berkala]. http://bitesizebio.com/2007/09/18/ecoli-electroporation-vschemical-transformation/ [23 Mar 2009].
Seidman CE, Struhl K, Sheen J, Jessen T. 2001. Introduction of plasmid DNA into
cells. Curr Protoc Mol Biol. 1 : 1.8.
Southern EM. 1975. Detection of Specific Sequences Among DNA Fragments
Separated by Gel Electrophoresis. Journal of Molekular Biologi 98:503-517.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.
Suzuki R, Takizawa T, Negishi Y, Utoguchi N, Maruyama K. 2008. Effective gene
delivery with novel liposomal bubbles and
ultrasonic
destruction
technology. International Journal of Pharmaceutics 354 (1-2):49-55.
The
Pennsylvania State University. Isolating and Analyzing Genes.
http://www.personal.psu.edu/rch8/workmg/Isolat_analyz_genes_Chpt3.htm
(25 Februari 2013)
30
U. Satyanarayana dan U. Chakrapani. 2007. Biochemistry. Kalkuta: Books and
Allied (P) Ltd.
Universitas
Sains
Malaysia.
2003.
Gene
Libraries.
http://www.ppsk.usm.my/lecturers/mravi/PDF_FIles/Genelibraries2003_PF.p
df (21 Februari 2013)
Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R. 2004. Molecular
Biology of The Gene 5th ed. San Fransisco : Benjamin Cummings.
Wells KE, McMahon J, Foster H, Ferrer A, Wells DJ. 2008. Gene Delivery to
Dystrophic Muscle. Methods Mol Biol 423:421-31.
Yepy Hardi Rustam. 2009. Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction).
http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/
(22
Februari 2013)
Zuppaedo AB, Siebeling RJ. 1998. An Epimerase Gene Essential for Capsule
Synthesis in Vibrio vulnificus. Infect Immun 66(6): 2601–2606
31
Download
Random flashcards
hardi

0 Cards oauth2_google_0810629b-edb6-401f-b28c-674c45d34d87

Rekening Agen Resmi De Nature Indonesia

9 Cards denaturerumahsehat

Nomor Rekening Asli Agen De Nature Indonesia

2 Cards denaturerumahsehat

Tarbiyah

2 Cards oauth2_google_3524bbcd-25bd-4334-b775-0f11ad568091

Create flashcards