HHS Public Access Author manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. dalam bentuk yang diedit akhir sebagai: J Chromatogr A . 2015 2 Oktober; 1414: 158–162. doi: 10.1016 / j.chroma.2015.08.050. Metode Langsung dan Cepat untuk Menentukan Sianida dalam Urin dengan Elektroforesis Kapiler Qiyang Zhang , Naveen Maddukuri , dan Maojun Gong * Departemen Kimia, Universitas Negeri Wichita, Wichita, Kansas, 67260, AS Abstrak Author Manuscript Sianida adalah bahan kimia beracun yang banyak terdapat di alam dan proses industri serta kebakaran yang tidak disengaja. Penentuan paparan sianida yang cepat dan akurat akan memfasilitasi penyelidikan forensik, diagnosis medis, dan pemantauan sianida kronis. Di sini, metode cepat dan langsung dikembangkan untuk menentukan ion sianida dalam sampel urin. Teknik ini didasarkan pada sistem elektro- phoresis kapiler yang terintegrasi ditambah dengan pendeteksian laser-induced fluorescence (LIF). Ion sianida diderivatisasi dengan naphthalene-2,3dicarboxaldehyde (NDA) dan amine primer (glisin) untuk deteksi LIF. Tiga pereaksi terpisah, NDA, glisin, dan sampel sianida, wAda campuran online, yang mengamankan kondisi seragam antara sampel untuk derivasi sianida dan mengurangi risiko pembentukan presipitasi campuran. Kondisi dioptimalkan; derivatisasi selesai dalam 2-4 menit, dan pemisahan tersebut disajikan pada 25 s. Batas deteksi (LOD) adalah 4,0 nM pada sinyal-to-noise ratio 3 kali lipat untuk buffer sianida standar. Tingkat sianida dalam sampel urin dari perokok dan bukan perokok ditentukan dengan menggunakan metode penambahan standar, yang menunjukkan perbedaan tingkat kadar sianida yang signifikan dalam sampel urin dari dua kelompok orang. Metode yang dikembangkan cepat dan akurat, dan diharapkan dapat diterapkan pada deteksi sianida dalam air limbah dengan modifikasi yang sesuai. Author Manuscript Kata kunci Sianida; Air seni; Naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde; Glycine; Elektroforesis kapiler; Fluoresens 1. Pendahuluan Author Manuscript Sianida dalam bentuk hidrogen sianida (HCN) dan garam logam alkali (seperti NaCN dan KCN dll.) Adalah bahan kimia yang sangat beracun yang banyak terdapat di alam dan proses industri [1,2]. Keracunan sianida yang disengaja atau tidak disengaja jarang terjadi tetapi mungkin pada manusia atau hewan yang terlibat [3]. Paparan sianida kecelakaan yang paling umum adalah penghirupan asap dari kebakaran perumahan dan industri yang menghasilkan sianida * Penulis Berkorespondensi, Tel: (316) 978-7381. Faks: (316) 978-3431. [email protected]. Penafian Penerbit: Ini adalah file PDF dari manuskrip yang belum diedit yang telah diterima untuk publikasi. Sebagai layanan kepada pelanggan kami, kami menyediakan versi awal manuskrip ini . Naskah akan menjalani penyalinan, penyusunan huruf, dan peninjauan bukti yang dihasilkan sebelum diterbitkan dalam bentuk citable akhir. Harap dicatat bahwa selama proses produksi, kesalahan dapat ditemukan yang dapat memengaruhi konten, dan semua penafian hukum yang berlaku untuk jurnal terkait. Zhang et al. Page 2 Author Manuscript bahan bakar yang mengandung nitrogen [4]. Sumber alami sianida terutama dikaitkan dengan produk metabolisme nitrogen bakteri, jamur dan ganggang dan degradasi glikosida sianogen di beberapa tanaman termasuk almond pahit, akar singkong, dan sorgum utuh [5]. Merokok tembakau juga menghasilkan sianida sehingga meningkatkan kadar sianida dalam darah dan urin perokok tetapi jarang memabukkan. Di sisi lain, sianida memiliki aplikasi industri penting termasuk pestisida, elektroplating, kilang mineral , dan sintesis polimer [1,6], di mana sianida mungkin dilepaskan ke lingkungan. Oleh karena itu, paparan sianida sulit untuk dihindari, dan dengan demikian identifikasi cepat potensi keracunan sianida berharga untuk pengujian laboratorium forensik, mencegah paparan sianida tingkat rendah kronis, dan pemantauan peperangan kimia . Author Manuscript Author Manuscript Berbagai metode telah dikembangkan dan ditinjau untuk deteksi sianida [5,7-9]. Metodemetode ini mungkin didasarkan pada spektrofotometri, potensiometri, atau fluorometri [7]. Instrumentasi yang terlibat dapat berupa HPLC (kromatografi cair kinerja tinggi), CE (elektroforesis kapiler), GC (kromatografi gas), UV / V adalah absorbansi, atau sensor. Meskipun sebagian besar teknik ini memenuhi persyaratan aplikasi, ada batasan operasional seperti kerumitan dan beberapa langkah pretreatment sampel. Oleh karena itu, metode sederhana dan cepat sangat diinginkan untuk memfasilitasi petunjuk cepat paparan sianida sehingga pasien yang terlibat dapat diobati secara tepat waktu dan tepat. Indikator keracunan sianida dapat berupa penanda biologis (tiosianat dan asam 2aminothiazoline-4-karboksilat (ATCA)) atau pengukuran langsung ion sianida (CN - ) [8]. Persyaratan sensitivitas deteksi tergantung pada sumber cairan biologis. Sebagai contoh, konsentrasi ion sianida berada dalam rentang mikromolar dalam darah sedangkan dalam nanomolar dalam urin disebabkan oleh proses metabolisme yang cepat yang mengubah sianida menjadi tiosianat (~ 80%) dan spesies lain [8]. Waktu paruh khas CN - adalah sekitar 20-60 mnt [8], yang lebih lanjut menunjukkan bahwa metode konservasi sianida yang tepat atau pengukuran cepat dilakukan. Perokok tembakau memaparkan diri mereka pada sianida dan akan meningkatkan kadar sianida dalam darah dan urin. Penentuan tingkat cya nide yang cepat dan akurat akan membantu untuk menyelidiki efek merokok antara perokok dan bukan perokok. Di sini kami melaporkan metode elektroforetik langsung untuk penentuan sianida dalam urin dengan cepat. Dalam metode ini, sampel urin dicampur secara online dengan reagen fluorogenik , NDA (naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde) dan glisin, untuk menghasilkan turunan neon. Campuran itu kemudian disuntikkan untuk pemisahan elektroforesis. Pemisahan selesai dalam 25 detik dan injeksi berturut-turut dapat dilakukan. Konsentrasi sianida secara cepat diukur dengan menggunakan metode penambahan standar 1. Eksperimental Author Manuscript 1.1. Bahan dan reagen Sodium tetraborate dan semua asam amino dibeli dari Sigma (St. Louis, MO, USA). Potassium cyanide, acetonitrile (ACN), dimethylsulfoxide (DMSO ), dimethylformamide (DMF), asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA), kreatinin, creatine, urea, dan natrium hidroksida dibeli dari Fisher Scientific (Chicago, IL, USA). NDA dipesan dari Invitrogen (Eugene, OR, USA) .Glycine amide [5- (aminoacetamid o) fluorescein] (FL- J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 3 Author Manuscript Gly) dibeli dari Setareh Biotech (Eugene, OR, USA). Kapiler silika menyatu dibeli dari Polymicro Technologies (Phoenix, AZ, USA). Solusi berair disiapkan dalam air deionisasi (DI), dan larutan stok NDA berada di DMF. Solusi stok KCN (100 mM) disiapkan dalam air DI. Solusi standar sianida disiapkan dengan mengencerkan solusi stok KCN. Larutan penyangga dengan pH 9,2 disiapkan dalam air DI dengan menggunakan natrium tetraborat (Na 2 B 4 H 7 0,10 H 2 O). Larutan amina (glisin, alani ne, glutamin, dan glutamat) disiapkan dalam air DI, dan diencerkan ke konsentrasi yang sesuai dengan air DI atau buffer borat 1.2. Instrumentasi Author Manuscript Sistem deteksi mikrofluida telah dijelaskan di tempat lain [10]. Secara singkat, sinar 442-nm (Laser glow Technologies, Toronto, ON, Kanada) difokuskan pada kapiler pemisahan melalui tujuan perendaman 40 × minyak (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood , NY, USA), dan fluoresensi dikumpulkan dengan menggunakan tujuan yang sama dan kemudian diangkut ke tabung photomultiplier (Hamamatsu Photonics, Jepang) setelah penyaringan emisi (482 ± 17 nm). Injeksi dan pemisahan sampel dilakukan dengan menggunakan catu daya usia volt tinggi (Model CZE1000R) yang dibeli dari Spellman High Voltage Electronics Corporation (Hauppauge, NY, USA). Steker sampel disuntikkan secara elektrokinetik melalui metode injeksi gated flow, dan kemudian dipisahkan. Prosedur ini dikendalikan oleh program L ab VIEW. Pompa 4-jarum suntik (Chemyx Inc., Stafford, TX, USA) digunakan untuk memasok reagen sampel dan derivatisasi melalui masing-masing syringe Hamilton yang kedap gas (Reno, Nevada, USA). Gerbang aliran dan antarmuka lainnya dibuat dengan poli (dimeth ylsiloxane) (PDMS) seperti yang dijelaskan dalam referensi [10]. Sebuah kapiler panjang 17 cm dengan panjang efektif 10 cm, ID 10 μm, dan OD 360 μm digunakan untuk melakukan pemisahan dan deteksi. Injeksi flow-gated dijalankan pada −5 kV × 0,5 s dengan tegangan tinggi diterapkan ke sisi outlet kapiler, dan sisi inlet dibumikan. Pemisahan dilakukan di bawah −23 kV, dan buffer pemisahan adalah 20-mM tetraborate dengan pH 9,2 Author Manuscript 1.3. Derivatisasi sianida Author Manuscript Derivatisasi dilakukan melalui pencampuran secara offline atau online dari tiga solusi: NDA dalam DMF / air dengan volume 50/50 volume, glisin dalam buffer dengan EDTA (5,0 mM), dan KCN dalam buffer atau dalam urin pada suhu kamar. Rasio pencampuran NDA / glisin / sampel adalah 1: 1: 1 atau 1: 1: 2 dengan volume seperti yang ditunjukkan pada Gambar c aptions dan / atau teks. Konsentrasi NDA, Gly dan CN - menunjukkan konsentrasi asli dalam tiga larutan terpisah sebelum pencampuran. Sampel urin disumbangkan oleh tiga pria perokok reguler dan tiga pria non-perokok di usia mereka 20-30 tahun. Tidak ada informasi pribadi yang dicatat kecuali mereka perokok atau bukan perokok. Sampel urin dikumpulkan segar pada hari percobaan dan diencerkan dengan menambahkan larutan NaOH (15 mM akhir dalam urin) untuk menghemat sianida. Sampel dengan penambahan standar disiapkan melalui solusi standar KCN; dan volume akhir masing-masing sampel terdiri dari 95% urin ditambah NaOH (15 mM) dan KCN standar (berbagai konsentrasi). J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 4 Author Manuscript 1.4 Tambahan standar dan analisis data Sianida standar (KCN) disiapkan dalam air DI, dan diencerkan dengan konsentrasi yang sesuai. Konsentrasi yang ditambahkan ke sampel urin adalah 0, 100, 200, 300, 400, dan 500 nM sebelum dicampur dengan reagen derivatisasi. Sianida yang mungkin ada dalam air dan / atau DMF dikurangi dengan menggunakan sinyal latar belakang yang diperoleh melalui penggantian cabang sampel urin dengan larutan NaCl dengan konduktivitas yang setara dengan jumlah urin yang cukup. Setelah pemisahan, puncak turunan sianida diintegrasikan dan daerah puncak dicatat dan dirata-rata (> 5 injeksi berulang). Kurva kalibrasi dibangun dan kadar sianida dalam urin dihitung sebagai nilai absolut intersep sumbu x. 2. Hasil dan Diskusi Author Manuscript 2.1 Derivatisasi fluorogenik dari ion sianida NDA pertama kali dikembangkan untuk menderivatisasi amina primer secara efisien pada keberadaan ion sianida pada tahun 1986 [11]. Beberapa tahun terakhir telah terlihat penerapan luas NDA-derivatisasi neurotransmiter asam amino untuk deteksi fluoresensi yang diinduksi laser (LIF) yang sensitif [12-14]. Untuk mengukur amina dalam sampel, NDA dan CN - yang berlebihan (biasanya dalam kisaran mM) sering digunakan untuk menderivatisasi amina sampai batas tertinggi. Di sisi lain, strategi derivatisasi ini juga telah digunakan untuk mengukur ion sianida dengan menggunakan konsentrasi tinggi NDA dan senyawa amina seperti glisin dan taurin [15-19]. Demikian pula, NDA dan amina yang berlebihan digunakan untuk memfasilitasi derivatisasi ion sianida sehingga secara kuantitatif menentukan tingkat sianida dalam air limbah, darah, dan urin. Author Manuscript Author Manuscript Namun, NDA dan amina primer bereaksi untuk menghasilkan imina. Spesies yang tidak larut dalam air menyebabkan larutan berwarna kuning, coklat, dan akhirnya hitam seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a. NDA pada 5,0 mM dan glisin atau taurin pada 20 mM dicampur pada 1: 1 dengan volume pada pH 9,2; campuran berubah warna dengan cepat (~ 2 mnt). Eksperimen juga menunjukkan bahwa konsentrasi amina dan / atau NDA yang lebih tinggi mempercepat perubahan warna, yang menunjukkan bahwa laju reaksi bergantung pada konsentrasi amina dan / atau NDA . Jackson et al. mengamati fenomena serupa ketika mereka mencampur NDA dan taurin [1], dan pembentukan spesies NDAditaurine diusulkan mengingat molekul NDA memiliki dua kelompok aldehida yang dapat bereaksi dengan amina primer. Ketika campuran reaksi dianalisis dengan CE, penyumbatan kapiler mungkin terjadi karena curah hujan dan harus dihindari. Untuk mengkonfirmasi reaksi antara NDA dan amina primer, FL-Gly dan NDA dicampur dan kemudian dipisahkan dengan CE, dan sinyal dideteksi dengan LI F pada eksitasi 491-nm dan emisi 520nm. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1b, imina turunan dari FL-Gly dan NDA diamati sebagai puncak lebar dengan tampilan, yang mungkin termasuk turunan dari NDA dengan bi-glisin dan / atau mono-glisin. Konsentrasi NDA yang lebih tinggi ( sama dengan 80 μM versus 20 μM dari FL-Gly) menghasilkan puncak NDA-FL-Gly maksimum sementara puncak FL-Gly menghilang. Peningkatan konsentrasi lebih lanjut (0,5 atau 1,0 mM) dari NDA tidak mengubah magnitudo sinyal turunan dan bentuk puncak, yang menunjukkan bahwa de rivative dari NDA dan FL-Gly tidak tergantung pada konsentrasi NDA ketika konsentrasi NDA cukup untuk membuat turunan semua FL -Gly dalam campuran. Telah diantisipasi bahwa glisin, mirip dengan FL-Gly, bereaksi dengan NDA untuk membentuk endapan gelap (Gambar 1a). Ada kedepan, diusulkan untuk campuran Gly dan NDA secara online. J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 5 Author Manuscript Untuk meningkatkan throughput analitik, pencampuran online dari reagen derivatisasi dan sampel dilakukan dengan menggunakan tiga jarum suntik untuk pengiriman cairan, masingmasing, ke mixer 4 arah yang disiapkan dengan PDMS [10]. Format ini dapat menghindari petting pi berurutan yang terlibat dalam pencampuran offline, dapat mempertahankan kondisi derivatisasi, terutama waktu reaksi (waktu dari mixer ke gerbang aliran), dan dapat mengurangi risiko penyumbatan kapiler oleh presipitasi. Kapiler reaksi 100μm (ID) × 30 cm digunakan untuk memiliki 2-4 menit untuk reaksi derivatisasi dengan laju aliran total dalam kisaran 600-1200 nL / mnt. Sampel baru dalam jarum suntik alternatif dapat diganti dengan cepat sambil mempertahankan reagen derivatisasi. Author Manuscript Solusi stok NDA dapat disiapkan dalam metanol atau asetonitril [1,13,16]. Namun, asetonitril tidak sesuai karena mengandung jumlah mikro hidrogen sianida seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, yang juga diamati oleh Sano et al. [20] Kelarutan NDA dalam metanol tidak mencukupi , dan keberadaan metanol sering mendorong pembentukan gelembung karena volatilitasnya. Gelembung ini dapat mengganggu injeksi dan pemisahan sampel. Untuk melarutkan NDA secara efisien tetapi mentolerir isi garam saat pencampuran, pelarut polar adalah opsi potensial seperti DMSO dan DMF. Namun, DMSO, seperti asetonitril, mengandung hidrogen sianida yang ditunjukkan pada Gambar. 2. Oleh karena itu, DMF akhirnya dipilih sebagai pelarut untuk menyiapkan larutan stok NDA dan digunakan untuk percobaan berikut. 2.1. Optimalisasi Kondisi Author Manuscript Author Manuscript Untuk membuat percobaan nyaman, tiga solusi kerja disiapkan: (1) NDA, NDA pada konsentrasi spesifik disiapkan dalam DMF / air pada 50/50 volume; (2) Gly, glisin pada konsentrasi yang sesuai disiapkan dalam buffer borat dengan EDTA (5,0 mM) ditambahkan ed; dan (3) sampel, KCN standar yang larut dalam buffer borat atau sampel urin dengan / tanpa penambahan standar. NDA sedikit larut dalam air dan larutan kerjanya disiapkan dalam DMF / air pada volume 50/50. Konsentrasi NDA pada 2,0-10,0 mM biasanya digunakan untuk mendeteksi amina primer [14]. Untuk melakukan pencampuran dan derivatisasi online, waktu reaksi dimanipulasi dengan memilih kombinasi laju aliran dan panjang kapiler reaksi ( ID 100 μm ). Selain itu, kombinasi yang tepat dari konsentrasi NDA dan amina dioptimalkan pada laju aliran yang dipilih (total 800 nL / mnt) dan kapiler reaksi (panjang ID 100 m × 30 cm). Rasio pencampuran NDA / Gly / sampel adalah 1: 1: 1 atau 1: 1: 2 volume yang menghasilkan konsentrasi setara dari [NDA] / 3, [Gly] / 3, dan [CN - ] / 3, atau [NDA] / 4, [Gly] / 4, dan [CN - ] / 2 dalam campuran reaksi, masing-masing (Catatan: tanpa notasi khusus, konsentrasi menunjukkan sebelum pencampuran). Untuk mempelajari efek matriks pada kinetika derivatisasi, variasi puncak adalah dengan waktu dicatat untuk KCN dilarutkan dalam buffer borat dan dalam urin. Campuran diperoleh dengan mencampur tiga larutan NDA 2,0mM, 80,0mMGly dan 5,0 μMCN - dalam buffer borat mencapai dataran tinggi fluoresensi dalam 3,0 menit (data tidak ditampilkan), sementara itu butuh 11 menit untuk campuran disiapkan dengan CN - dalam matriks urin (Gbr. 3a, [NDA] = 2,0 mM). Rupanya, matriks urin memperlambat kinetika reaksi. Untuk mempercepat reaksi, konsentrasi NDA ditingkatkan menjadi 8,0 mM, dan waktu reaksi dipersingkat menjadi 3,0 menit (Gbr. 3a, [NDA] = 8,0 mM). Karena itu, 8,0 mM NDA dipilih untuk pencampuran online bila menggunakan rasio pencampuran 1: 1: 2 yang menghasilkan konsentrasi NDA reaksi akhir pada 2,0 mM. Demikian pula, konsentrasi Gly dioptimalkan dengan tetap mempertahankan konsentrasi NDA pada 8,0 mM dan sianida pada 5,0 μM di J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 6 Author Manuscript air seni. Seperti dapat dilihat pada Gambar. 3b, 80 mM dari Gly menghasilkan sinyal optimal. Oleh karena itu, 80 mMGly digunakan untuk rasio pencampuran 1: 1: 2. Author Manuscript Sampel target adalah cairan biologis dari urin yang mengandung ion anorganik (Na + , K + , Cl - , Mg 2+ , Ca 2+ , NH + , SO 2 - , dan PO 3− , dll.), Asam amino, urea, kreatinin, dan kreatin, dll. [21]. Kompleksitas komposisi urin mungkin memiliki efek matriks pada CN - pengukuran. Misalnya, asam amino dalam urin mungkin memiliki persaingan dengan Gly standar untuk jumlah ion sianida yang terbatas , yang akan mengurangi ukuran puncak analit yang terkait dengan Gly. Namun, kadar khas asam amino urin pada orang dewasa yang sehat rendah (<0,5 mM) [21,22]. Selain itu, konsentrasi urea (~ 150mM) dan kreatinin (~ 5mM) relatif besar ada dalam urin [22]. Untungnya, kedua senyawa memiliki amina terkonjugasi yang jarang bereaksi dengan NDA pada keberadaan ion sianida sehingga kurang berpengaruh pada deteksi sianida. Glycine dipilih karena penelitian sebelumnya telah membuktikan bahwa Gly memiliki tine kine reaksi cepat lebih dari yang lain, dan konsentrasi inheren Gly urin lebih besar dari asam amino lainnya [11,19,21,23]; dan taurin juga bisa menjadi opsi yang menjanjikan yang telah dilaporkan [17]. Konsentrasi Gly di satu sisi mempengaruhi kinetika derivatisasi, dan di sisi lain itu mengurangi efek dari amina primer kompetitif yang melekat dalam urin. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.3b, peningkatan konsentrasi Gly dapat meningkatkan sinyal turunan fluoresen terkait - CN sampai mencapai maksimum pada 80 mM. Namun , konsentrasi tinggi Gly juga mempromosikan reaksi antara NDA dan Gly yang membentuk imina atau endapan sehingga mengarah ke masalah eksperimental (Gbr. 1). Oleh karena itu, 80 mMGly (20mM setelah pencampuran) dipilih bersama dengan 8,0 mM NDA yang mencapai CN - recovery ~ 88% dalam urin. 2.2. Gangguan Potensial Author Manuscript Selain efek matriks urine, gangguan potensial lainnya termasuk tiosianat (SCN - ), tiol (R-SH), sulfida (S 2- ), dan sulfit (SO 2- ) [9,24]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar.4, potensi gangguan ini pada konsentrasi CN 3 kali lipat - sedikit menurunkan ketinggian puncak derivatif CN - . S 2- , tiol, dan SCN - menurun sinyal CN-derivatif sebesar 10% sedangkan SO 2- efek itu sepele. Di sisi lain, tidak ada puncak tambahan yang diamati, yang menunjukkan bahwa spesies yang berpotensi mengganggu tidak bereaksi dengan NDA / Gly atau produk mereka tidak berfluoresensi pada panjang gelombang eksitasi / emisi yang dipilih. Author Manuscript Mempertimbangkan efek matriks dan gangguan potensi yang ada dalam sampel urin, metode penambahan standar dipekerjakan untuk secara kuantitatif menentukan CN - tingkat dalam urin. Tingkat komposisi dari masing - masing individu pada berbagai waktu juga dapat bervariasi, sehingga efek matriks pada CN - bervariasi, yang dapat diamati pada berbagai kemiringan kurva kalibrasi seperti yang terlihat pada Tabel 1. 2.3. Penggunaan Sianida untuk Perokok dan bukan perokok Kondisi optimal dan metode penambahan standar yang diterapkan untuk CN - deteksi dalam sampel urin dari perokok dan non-perokok. Sampel dikumpulkan segar dengan 15mMNaOH ditambahkan. Serangkaian larutan sampel urin disiapkan dengan menambahkan larutan KCN standar dalam air, dan urin asli mengambil 95% volume. Tiga solusi: sampel NDA, Gly, dan urin, dikirim melalui tiga jarum suntik kedap gas individu dengan perbandingan volume 1: 1: 2 yang dilakukan dengan menggunakan pompa jarum suntik Hamilton. Itu J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 7 Author Manuscript tiga aliran dicampur pada mixer PDMS dengan kapiler reaksi dengan panjang 100 μm ID × 30 cm. Laju aliran total dalam kapiler reaksi adalah 800 nL / mnt yang menjamin waktu reaksi ~ 3 menit. Seperti ditunjukkan pada Gambar.5, CN - ketinggian puncak turunan meningkat dengan konsentrasi penambahan standar. . The electropherograms pada Gambar 5 juga menunjukkan sinyal tambahan sebelum dan sesudah puncak derivatif, yang con vinced bahwa pemisahan elektroforesis yang diperlukan meskipun puncak utama adalah CN - derivatif. Puncak-puncak tambahan yang tidak teridentifikasi ini kemungkinan disebabkan oleh produk sampingan dari glisin dan reaksi NDA. Untuk penentuan CN - dalam sampel urin, setiap seri sampel menghasilkan kurva kalibrasi, dan hasilnya dirangkum dalam Tabel 1. Sampel urin disumbangkan oleh tiga perokok pria biasa dan tiga pria bukan perokok pria. Perokok mendapat CN - level urin 518 ± 123nM, sementara yang bukan perokok memiliki 217 ± 6nM. Hasil ini dalam perjanjian yang adil dengan hasil yang dipublikasikan [8,25] mungkin karena perbedaan lingkungan hidup. Uji t siswa menunjukkan bahwa perbedaan tingkat perokok dan bukan perokok adalah signifikan. Author Manuscript Perhatikan bahwa area puncak telah ditentukan untuk kuantifikasi CN - dalam urin. Matriks urin mengandung sejumlah besar elektrolit yang menyebabkan ketidaksesuaian konduktivitas antara campuran derivatisasi dan buffer pemisahan. Ketidakcocokan ini menghasilkan perluasan puncak dan variasi puncak ketinggian yang tidak sebanding dengan konsentrasi penambahan standar. Koreksi area puncak tidak dilakukan karena waktu migrasi setiap seri penambahan standar memiliki% RSD di <1,3%. Keterangan Penutup Author Manuscript Metode yang dilaporkan mengambil keuntungan dari properti derivatisasi CN - fluorogenic dengan NDA pada keberadaan amina primer. Strategi pencampuran dan derivatisasi online dengan tiga jarum suntik terpisah untuk pengiriman reagen dan sampel menyederhanakan dan mempercepat prosedur analisis. Reaksi membutuhkan waktu sekitar 2-4 menit untuk derivasi, dan pemisahan cepat memfasilitasi analitik melalui put yang penting ketika hasil awal diinginkan. Strategi ini juga menghindari hilangnya oksidatif ion sianida dalam sampel dengan pencampuran online, dan deteksi LIF sensitif (LOD 4.0 nM pada 3 kali lipat S / N untuk sianida standar dalam buffer). Metode penambahan standar dengan banyak titik mungkin melemahkan manfaat pemisahan cepat dalam 25 detik, tetapi penambahan standar dua-titik alternatif dapat digunakan untuk memperkirakan kadar sianida dalam urin dalam hitungan menit. Juga diantisipasi bahwa metode yang dikembangkan dapat berpotensi diperluas untuk mendeteksi ion sianida dalam sampel darah setelah pretreatment sampel yang tepat dan optimalisasi kondisi. Ucapan Terima Kasih Para penulis berterima kasih kepada Dr. Susan M. Lunte (University of Kansas) atas bimbingannya yang konstruktif dan saran-saran berharga. Penelitian ini didukung secara finansial oleh Institut Nasional Ilmu Kedokteran Umum dengan nomor hibah P20 GM103418. Author Manuscript Referensi 1. Jackson R, Oda RP, Bhandari RK, Mahon SB, Brenner M, Rockwood GA, Logue BA. Development of a Fluorescence-Based Sensor for Rapid Diagnosis of Cyanide Exposure. Anal. Chem. 2014; 86:1845–1852. [PubMed: 24383576] J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 8 Author Manuscript Author Manuscript Author Manuscript Author Manuscript 2. Ma JA, Dasgupta PK, Blackledge W, Boss GR. Cobinamide-Based Cyanide Analysis by Multiwavelength Spectrometry in a Liquid Core Waveguide. Anal. Chem. 2010; 82:6244–6250. [PubMed: 20560532] 3. Reade MC, Davies SR, Morley PT, Dennett J, Jacobs IC. Review article: Management of cyanide poisoning. Emerg. Med. Australas. 2012; 24:225–238. [PubMed: 22672162] 4. Logue BA, Kirschten NP, Petrikovics I, Moser MA, Rockwood GA, Baskin SI. Determination of the cyanide metabolite 2-aminothiazoline-4-carboxylic acid in urine and plasma by gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2005; 819:237–244. 5. Xu Z, Chen X, Kim HN, Yoon J. Sensors for the optical detection of cyanide ion. Chem. Soc. Rev. 2010; 39:127–137. [PubMed: 20023843] 6. Tian Y, Dasgupta PK, Mahon SB, Ma J, Brenner M, Jian H, Boss GR. A disposable blood cyanide sensor. Anal. Chim. Acta. 2013; 768:129–135. [PubMed: 23473259] 7. Ma JA, Dasgupta PK. Recent developments in cyanide detection: A review. Anal. Chim. Acta. 2010; 673:117–125. [PubMed: 20599024] 8. Logue BA, Hinkens DM, Baskin SI, Rockwood GA. The Analysis of Cyanide and its Breakdown Products in Biological Samples. Crit. Rev. Anal. Chem. 2010; 40:122–147. 9. Lindsay AE, Greenbaum AR, O'Hare D. Analytical techniques for cyanide in blood and published blood cyanide concentrations from healthy subjects and fire victims. Anal. Chim. Acta. 2004; 511:185–195. 10. Zhang Q, Gong M. Prototyping of poly(dimethylsiloxane) interfaces for flow gating, reagent mixing, and tubing connection in capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A. 2014; 1324:231– 237. [PubMed: 24331370] 11. De Montigny P, Stobaugh JF, Givens RS, Carlson RG, Srinivasachar K, Sternson LA, Higuchi T. Naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde/cyanide ion: a rationally designed fluorogenic reagent for primary amines. Anal. Chem. 1987; 59:1096–1101. 12. Nandi P, Scott DE, Desai D, Lunte SM. Development and optimization of an integrated PDMS based-microdialysis microchip electrophoresis device with on-chip derivatization for continuous monitoring of primary amines. Electrophoresis. 2013; 34:895–902. [PubMed: 23335091] 13. Wang M, Roman GT, Schultz K, Jennings C, Kennedy RT. Improved Temporal Resolution for in Vivo Microdialysis by Using Segmented Flow. Anal. Chem. 2008; 80:5607–5615. [PubMed: 18547059] 14. Shou M, Ferrario CR, Schultz KN, Robinson TE, Kennedy RT. Monitoring Dopamine in Vivo by Microdialysis Sampling and On-Line CE-Laser-Induced Fluorescence. Anal. Chem. 2006; 78:6717–6725. [PubMed: 17007489] 15. Akiyama H, Toida T, Sakai S, Amakura Y, Kondo K, Sugita-Konishi Y, Maitani T. Determination of cyanide and thiocyanate in Sugihiratake mushroom using HPLC method with fluorometric detection. J. Health Sci. 2006; 52:73–77. 16. Lu Q, Collins GE, Evans T, Hammond M, Wang J, Mulchandani A. Vapor and liquid phase detection of cyanide on a microchip. Electrophoresis. 2004; 25:116–122. [PubMed: 14730575] 17. Chinaka S, Tanaka S, Takayama N, Tsuji N, Takou S, Ueda K. High-Sensitivity Analysis of Cyanide by Capillary Electrophoresis with Fluorescence Detection. Anal. Sciences. 2001; 17:649– 652. 18. Chinaka S, Takayama N, Michigami Y, Ueda K. Simultaneous determination of cyanide and thiocyanate in blood by ion chromatography with fluorescence and ultraviolet detection. J Chromatogr. B. 1998; 713:353–359. 19. Gamoh K, Sawamoto H. Determination of cyanide ion by high-performance liquidchromatography with fluorometric detection. Anal. Sciences. 1988; 4:665–666. 20. Sano A, Takezawa M, Takitani S. High-performance liquid-chromatography determination of cyanide in urine by pre-column fluorescence derivatization. Biomed. Chromatogr. 1989; 3:209– 212. [PubMed: 2804427] 21. Tan IK, Gajra B. Plasma and urine amino acid profiles in a healthy adult population of Singapore. Ann. Acad. Med. Singap. 2006; 35:468–475. [PubMed: 16902722] 22. Brooks T, Keevil CW. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett. Appl. Microbiol. 1997; 24:203–206. [PubMed: 9080700] J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 9 Author Manuscript 23. Carlson RG, Srinivasachar K, Givens RS, Matuszewski BK. New derivatizing agents for amino acids and peptides. 1. Facile synthesis of N-substituted 1-cyanobenz[f]isoindoles and their spectroscopic properties. J. Org. Chem. 1986; 51:3978–3983. 24. Sano A, Takezawa M, Takitani S. Spectrofluorimetric determination of cyanide in blood and urine with naphthalene-2,3-dialdehyde and taurine. Anal. Chim. Acta. 1989; 225:351–358. 25. Jermak S, Pranaityte B, Padarauskas A. Headspace single-drop microextraction with in-drop derivatization and capillary electrophoretic determination for free cyanide analysis. Electrophoresis. 2006; 27:4538–4544. [PubMed: 17058310] Author Manuscript Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 10 Author Manuscript Author Manuscript Fig. 1. (a) Gambar warna gelap untuk taurin (20,0 mM) dan glisin (20,0 mM) dicampur dengan NDA (5,0 mM) setelah 2,0 menit. (B) Electropherograms FL-Gly (20,0 μM) pada berbagai ko nentrasi NDA ditambahkan. Buffer 20,0 mM borat pada pH 9,2. Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 11 Author Manuscript Author Manuscript Fig. 2. Tinggi puncak turunan oleh NDA, glisin dan CN - . NDA (5,0 mM) dilarutkan dalam pelarut organik / air pada volume 50/50; glisin dilarutkan dalam buffer borat 60,0mM pH9.2; dan air DI. Ketiganya dicampur offline pada rasio 1: 1: 1 berdasarkan volume. CN - itu disumbangkan oleh pelarut organik dan / atau air. Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 12 Author Manuscript Fig. 3. Author Manuscript (a) Area puncak berubah dengan waktu pada dua konsentrasi NDA yang berbeda. Glisin pada 80,0 mM. Catatan: Ada 60 detik sebelum injeksi pertama. (B) Area puncak (maksimum) pada berbagai konsentrasi glisin. NDA pada 8,0 mM. Untuk keduanya, NDA dalam DMF / air (50/50 menurut volume e), glisin dalam buffer borat (80,0 mM, pH 9,2) dan EDTA (5,0 mM), dan KCN (5,0μM) dalam urin / air (95/5 oleh volume). Rasio pencampuran offline adalah 1: 1: 2 (2 untuk KCN) berdasarkan volume. Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 13 Author Manuscript Author Manuscript Fig. 4. Efek gangguan pada CN - turunan puncak ketinggian. NDA (5,0 mM) dalam DMF / air (50/50 volume), glisin (80,0 mM) dalam buffer borat (80,0 mM, pH 9,2), dan KCN (1,0μM dalam air DI) saja, KCN (1,0 μM) ditambah Na 2 S, Na 2 SO 3 , mercaptoethanol, dan KSCN pada 3 μM, masing-masing. Mencampur tikus secara offline io adalah volume 1: 1: 2 (2 untuk KCN). Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 14 Author Manuscript Author Manuscript Fig. 5. Electropherograms dari penambahan standar dengan urin dari bukan perokok. Konsentrasi KCN yang ditambahkan ditunjukkan. Puncak utama menunjukkan turunan dari NDA, KCN dan glisin. NDA (8,0 mM) dalam DMF / air (50/50 volume), glisin dalam buffer borat (80,0 mM, pH 9,2) dan EDTA (5,0 mM), dan KCN dalam urin / air (95/5 volume). Rasio pencampuran online adalah 1: 1: 2 (2 untuk KCN) dengan laju aliran. Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02. Zhang et al. Page 15 Table 1 Author Manuscript Summarized results of smokers and non-smokers. * Calibration Curve R2 CN− (nM) in Urine Non-smoker 1 y = 0.606x + 129 0.9943 224 Non-smoker 2 y = 0.556x + 112 0.9981 212 Non-smoker 3 y = 0.624x + 127 0.9998 214 Smoker 1 y = 0.709x + 300 0.9970 445 Smoker 2 y = 0.687x + 294 0.9972 450 Smoker 3 y = 1.058x + 663 0.9973 660 * Ave±s 217±6 518±123 CN− concentrations were calculated for urine of 95% sample volumes. Author Manuscript Author Manuscript Author Manuscript J Chromatogr A. Author manuscript; available in PMC 2016 October 02.
