BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Praktikum isolasi DNA dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan gedung 3 lantai 1 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran pada hari Rabu, 20 Maret 2019 pukul 14.00 – 17.00 WIB. 3.2 Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum isolasi DNA adalah sebagai berikut. 3.2.1 Alat Praktikum Berikut merupakan alat yang digunakan dalam kegiatan praktikum. Tabel 1. Alat Praktikum No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Nama Alat Alumunium foil Gunting High pure filter tube Masker Microsentrifuge MIcrotips Microtube Mikro pipet Mortar Neraca Analitik Pinset Sarung tangan Sumpit plastik Vortex Waterbath Fungsi Untuk wadah sampel/bahan Menggunting sirip ikan untuk dijadikan sampel Menyaring DNA murni Melindungi wajah Menghomogenkan larutan / memisahkan partikel Menunjang mikro pipet saat mengambil larutan Wadah sampel Mengambil sampel dengan ukuran spesifik Menghaluskan bahan Menimbang sampel atau bahan Mengambil sampel Menjaga kesterilan Menggerus sampel Menghomogenkan larutan Menginkubasi DNA 3.2.1 Bahan Praktikum Berikut merupakan bahan yang digunakan dalam kegiatan praktikum. Tabel 2. Bahan Praktikum No. 1. 2. Nama Bahan Alkohol Binding buffer / Lysis buffer Fungsi Larutan preservasi Bahan Isolasi DNA (lisis sel sirip ikan) 1 No. 3. 3. 4. 5. 6. Nama Bahan Elution buffer Gliserol Inhibitor removal buffer Larutan Isopropanol Protease K 7. 8. Sirip ikan koki Wash buffer Fungsi Mengikat bahan kontaminan selain DNA Larutan preservasi Pemurnian DNA Memisahkan bagian terlarut dan menggumpal Menghancurkan dan memisahkan DNA dari protein Sampel DNA Mencuci DNA dari inhibitor dan cairan yang ada di collection tube 3.3 Prosedur Praktikum Adapun prosedur praktikum isolasi DNA adalah sebagai berikut. 3.3.1 Persiapan Sampel 1. Ambil sampel bagian sirip ikan yang akan diamati, potong menggunakan gunting bedah bagian sirip 2. Jika akan digunakan beberapa hari kemudian, sampel sirip dapat disimpan dengan direndam pada larutan preservasi (alkohol : gliserol <4:1>) 3. Simpan pada suhu terjaga 4. Jika sampel akan digunalan maka timbang masing-masing 0,025 g dengan dialaskan alumunium foil 3.3.2 Isolasi Sampel 1. Sebelum dimulai prosedur, panaskan Elution Buffer 70oC menggunakan waterbath dan siapkan waterbath 55o C untuk tahap 2 2. Tambahkan 25 mg sampel yang sudah ditimbang, tambahkan 200µl tissue Lysis Buffer lalu gerus dengan penggerus, tambahkan 40µl Proteinase K campurkan dengan digoyangan. 3. Inkubasi selama 1 jam pada suhu 55o C 4. Tambahkan 200µl Binding Buffer lalu Inkubasi selama 10 menit pada suhu 70o C 5. Tambahkan 100µl isopropanol dan campurkan. (Ambil menggunakan tips biru sampel yang tidak dapat dilarutkan lalu dipisahkan dan dibuang 6. Masukkan High Pure Filter Tube pada 1 buah Collection Tube, Pindahkan cairan sampel ke atas Filter tube 2 7. Sentrifugasi 1 menit pada 8000 xg 8. Selanjutnya untuk prosedur pemurnian DNA setelah sentrifugasi tambahkan 500µl Inhibitor Removal Buffer 9. Sentrifugasi 1 menit 8000 xg 10. Buang cairan yang tersisa dibawahnya 11. Tambahkan 500µl Wash Buffer ke atas tube 12. Sentrifugasi 1 menit 8000 xg 13. Buang cairan yang tersisa dibawahnya 14. Tambahkan 500µl Wash Buffer ke atas tube 15. Sentrifugasi 1 menit 8000 xg 16. Buang cairan yang tersisa dibawahnya 17. Gunakan microsentrifuge 1,5ml yang baru, tambahkan 200µl Elution buffer yang sudah disimpan di waterbath 70o C 18. Sentrifugasi 10 detik 13000 xg 19. Buang cairan yang tersisa dibawahnya 20. Template DNA sudah siap 3
