Viabilitas Azotobacter pada Medium yang Terpapar Logam Besi (Fe)

JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
Viabilitas Azotobacter pada Medium yang
Terpapar Logam Besi (Fe)
Aiditya Pamungkas dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh
Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail: [email protected]
Abstrak—Besi merupakan logam yang dibutuhkan oleh
organisme untuk metabolismenya. Namun dalam konsentrasi
tinggi besi dapat membahayakan organisme dan lingkungan.
Beberapa bakteri mampu resisten terhadap besi. Salah satu
genus bakteri resisten besi adalah Azotobacter. Penelitian ini
bertujuan untuk mendapatkan isolat Azotobacter yang resisten
terhadap logam besi dan untuk mengetahui viabilitasnya
terhadap cekaman Fe. Uji resistensi Fe dilakukan di medium
Nutrient Agar-FeCl3.6H2O 25 mg/L sampai dengan konsentrasi
yang mampu ditoleransi isolat. Uji viabilitas isolat Azotobacter
dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada medium Nutrient
Broth-FeCl3.6H2O dengan konsentrasi 50, 100 dan 150 mg/L
dengan visualisasi kurva pertumbuhan isolat. Hasil dari
penelitian ini lima isolat Azotobacter yaitu A1a, A2, A7, A9 dan
A10 resisten terhadap logam besi (Fe) sampai dengan 200 mg/L..
Isolat Azotobacter A1a, A7 dan A9 memiliki kemampuan
viabilitas baik dalam medium Nutrient Broth terpapar Fe 50
mg/L dibandingkan dengan 100 dan 150 mg/L.
Kata Kunci—Azotobacter, besi (Fe), resisten, viabilitas.
I. PENDAHULUAN
B
ESI atau Ferrum (Fe) adalah metal berwarna putih
keperakan, liat, dan dapat dibentuk. Di alam didapat
sebagai senyawa hematit [1]. Besi sangat penting sebagai
komponen pigmen sitokrom pada respirasi seluler [2] dan
sebagai kofaktor enzim [3] pada mikroorganisme. Namun besi
dalam konsentrasi tinggi yang mencemari lingkungan dapat
menimbulkan bahaya bagi organisme. Menurut Peraturan
Menteri Pertanian Nomor 70 tahun 2011 baku mutu logam Fe
didalam tanah maksimal 50 mg/L.
Beberapa bakteri telah mengembangkan beberapa sistem
yang efisien untuk detoksifikasi logam. Mekanismenya dapat
digolongkan ke dalam 5 kategori, yaitu (1) penyerapan
intraseluler; (2) mengekspor; (3) mereduksi permeabilitas; (4)
penyerapan ekstraseluler; dan (5) detoksifikasi ekstraseluler
[4]. Hampir semua mekanisme resitensi bakteri dikode di
dalam plasmid dan transposon [4] dan hal itu memungkinkan
transfer gen atau mutasi spontan yang menyebabkan bakteri
resisten terhadap logam. Bakteri yang mampu resisten
terhadap logam diharapkan mampu meremediasi cemaran
logam di lingkungan. Resistensi bakteri terhadap logam dapat
melalui mekanisme biosorbsi dan bioakumulasi. Mekanisme
biosorpsi merupakan proses pasif sehingga logam tidak
meracuni bakteri. Sedangkan mekanisme bioakumulasi
merupakan proses aktif dimana logam berat dapat meracuni
sel bakteri [5]. Mekanisme toleransi mikroba terhadap logam
berat dengan cara memproduksi polisakarida ekstraselular
yang memiliki gugus fungsional yang berfungsi sebagai
bioakumulator yang efisien, produksi metabolit organik yang
memiliki sifat pengkelat dan membentuk kompleks dengan
logam, presipitasi, serta kristalisasi ekstraselular [6].
Beberapa genus mampu resisten terhadap logam, salah
satunya adalah Azotobacter. Sebuah penelitian menyebutkan
bahwa beberapa anggota genus Azotobacter resisten terhadap
logam berat Fe [8]. Genera Azotobacter merupakan genera
yang tergolong melimpah di alam [9]. Beberapa karakter yang
membedakan genus ini dengan genus bakteri yang lain yaitu
membentuk cysta [10], Gram negatif, bersifat aerobik dan
katalase positif [11].
Azotobacter koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan
Bioteknologi ITS diketahui resisten terhadap logam merkuri
[7]. Azotobacter tersebut belum diteliti resistensinya terhadap
logam Fe.
II. METODOLOGI
A. Uji Resistensi Azotobacter Terhadap FeCl3.6H2O
Isolat Azotobacter A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9
dan A10 berumur 24 jam ditumbuhkan secara aseptis pada
media Nutrient Agar-FeCl3.6H2O dengan konsentrasi mulai
dari 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, hingga
konsentrasi maksimum yang dapat ditoleransi oleh isolat.
Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Koloni
yang tumbuh merupakan isolat yang resisten terhadap logam
Fe. Kemudian dipilih 3 isolat yang memiliki kemampuan
resistensi terhadap FeCl3.6H2O lebih baik dibanding isolat lain
dan dipilih 3 konsentrasi di bawah konsentrasi maksimum
yang dapat ditoleransi isolat.
B. Uji Viabilitas Azotobacter Pada Medium Tercekam
FeCl3.6H2O
Sebelum uji viabilitas, dibuat kultur starter. Pembuatan
kultur starter dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama untuk
kultur starter I. Satu ose isolat Azotobacter berumur 24 jam
diinokulasikan secara aseptis ke dalam 10 ml medium NB
(Nutrient Broth) dalam Erlenmeyer, diinkubasi selama 18 jam
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
pada suhu ruang di atas rotary shaker (100 rpm). Selanjutnya
tahap kedua untuk kultur starter II. Setelah diinkubasi 18 jam,
5 ml kultur starter I diinokulasikan secara aseptis ke dalam 45
ml medium NB dalam Erlenmeyer dan diinkubasi selama 18
jam pada suhu ruang di atas rotary shaker (100 rpm).
Sebanyak 10 ml kultur starter II diinokulasikan secara
aseptis ke dalam Erlenmeyer berisi 90 ml medium NB
(Nutrient Broth) dengan penambahan FeCl3.6H2O sesuai
konsentrasi yang dibutuhkan. Untuk kontrol tidak
ditambahkan FeCl3.6H2O. Setiap 2 jam sebanyak 1,5 ml
kultur diambil dan dimasukkan ke dalam kuvet kemudian
diukur nilai Optical Density (OD) nya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang (λ) 600 nm [12].
Pengukuran OD dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke 24. Data
OD yang didapatkan kemudian dibuat kurva pertumbuhan
dengan sumbu x sebagai waktu (t) dan sumbu y sebagai nilai
OD.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Resistensi Isolat Azotobacter Terhadap Logam Fe
Uji resistensi dilakukan untuk mengetahui kemampuan
isolat tumbuh dalam medium yang mengandung logam Fe.
Hasil yang didapat, isolat Azotobacter A1a, A2, A7, A9 dan
A10 mampu tumbuh pada media yang mengandung logam
FeCl3.6H2O sampai dengan 200 mg/L (Tabel 1 dan Gambar
1). Azotobacter mampu tumbuh dengan baik pada medium
yang mengandung Fe (III) konsentrasi rendah. Semua isolat
Azotobacter mampu tumbuh dalam medium yang
mengandung Fe karena Fe dibutuhkan dalam metabolisme sel
bakteri. Hal tersebut juga dinyatakan oleh [14] secara umum
semua mikroorganisme, termasuk Azotobacter membutuhkan
Fe untuk aktivitas metabolisme dan juga sebagai komponen
struktural utama pada beberapa enzim, sedangkan konsentrasi
Fe yang terlalu tinggi dapat menyebabkan DNA terdenaturasi
sehingga bakteri mati [12].
Tabel 1. Hasil Uji Resistensi FeCl3.6H2O
Isolat
Pertumbuhan Isolat Azotobacter pada Medium NA yang
mengandung FeCl3.6H2O (mg/L)
25
50
75
100
125
150
175 200 225 250
A1a
A1b
A2
A3
A5
A6
A7
A8
A9
A10
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
+++
++
++
++
+++
++
+++
+++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Keterangan: (+++) = tumbuh baik, (++) = tumbuh sedang, (+) =
tumbuh rendah, (-) = tidak tumbuh
A.
B.
C.
Gambar 1. Hasil Uji Resistensi Azotobacter
Ket: A. Sangat Resisten (+++), B. Cukup Resisten (+) dan C. Tidak
Resisten (-).
Beberapa spesies Azotobacter resisten terhadap logam Fe
sampai dengan 100 mg/L [13]. Menurut [5], bakteri yang
diisolasi dari lingkungan yang tercemar logam berat
merupakan bakteri yang mempunyai resistensi tinggi terhadap
logam berat di sekitarnya. Azotobacter uji diketahui resisten
terhadap logam Hg [11], sehingga memiliki toleransi yang
baik terhadap logam, sebab Hg merupakan logam berat yang
paling toksik dibandingkan logam berat lainnya. Mikroba
yang hidup pada lingkungan kaya logam cenderung lebih
resisten terhadap logam berat daripada yang hidup di
lingkungan tidak kaya logam [17]. Resistensi tersebut melalui
mekanisme adaptasi [18], hal ini karena adanya perbedaan
kromosomal, transposon, dan plasmid yang mengatur sistem
resistensi pada masing-masing bakteri [14] Pada dasarnya,
populasi mikroorganisme yang resisten terhadap logam
melibatkan perubahan kelarutan dari logam melalui reduksi,
akumulasi, dan immobilisasi in-situ [14]. Menurut [18] salah
satu mekanisme penting resistensi pada bakteri terhadap
logam adalah adanya protein RND (Resistence, Nodulation,
Cell Division) yang mengatur transportasi logam melalui
membran sel. Pada Azotobacter pengambilan Fe diatur melalui
produksi siderofor (senyawa pengkelat Fe). Dalam kondisi
lingkungan yang kaya akan Fe, produksi siderofor menurun
[19]. Siderofor merupakan senyawa organik dengan berat
molekul ringan yang mampu membentuk kompleks dengan
Ferri (Fe3+) dan menyalurkannya ke dalam sel [12] kemudian
diubah menjadi bentuk Ferro (Fe2+) [15].
Berdasarkan hasil uji resistensi, isolat Azotobacter A1a,
A2, A7, A9 dan A10 mampu tumbuh pada media Nutrient
Agar yang mengandung logam FeCl3.6H2O sampai dengan
200mg/L. Isolat yang dipilih untuk uji viabilitas adalah A1a,
A7 dan A9 dan konsentrasi yang digunakan yaitu 50, 100, dan
150 mg/L.
B. Viabilitas Azotobacter Pada Medium Tercekam Logam Fe
Kurva pertumbuhan isolat Azotobacter dalam medium
Nutrient Broth yang tercekam logam Fe digunakan untuk
mengetahui kemampuan hidup pada medium yang terpapar
logam Fe. Kemampuan hidup isolat uji dapat dilihat dari kurva
pertumbuhan isolat pada masing-masing media Nutrient Broth
yang mengandung logam Fe (Gambar 2-5).
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
Azotobacter A1a
Absorbansi (OD 600 nm)
1.4
1.2
1
kons. Fe 50 ppm
0.8
kons. Fe 100 ppm
0.6
kons. Fe 150 ppm
0.4
tanpa Fe
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Inkubasi Jam KeGambar 2. Kurva Pertumbuhan Azotobacter A1a yang Terpapar
Logam Fe.
Azotobacter A7
Absorbansi (OD 600 nm)
0.6
0.5
0.4
Berdasarkan pola pertumbuhan pada Gambar 3–4, pada
Azotobacter A1a dan A9 menunjukkan pola pertumbuhan
yang hampir serupa, sedangkan Azotobacter A7 memiliki pola
pertumbuhan yang berbeda dengan A1a dan A9. Azotobacter
A7 mengalami peningkatan nilai OD ketika ditumbuhkan pada
medium Nutrient Broth dengan Fe. Nilai OD semakin tinggi
dengan semakin meningkatnya konsentrasi logam. Hal
tersebut dapat terjadi karena Azotobacter resisten terhadap
logam Fe pada medium Nutrient Broth hingga konsentrasi 200
mg/L, sehingga dalam medium Nutrient Broth tercekam
logam Fe pada media Nutrient Agar yang , Azotobacter masih
mampu tumbuh dengan baik. Hal tersebut disebabkan logam
besi (Fe) penting sebagai komponen pigmen sitokrom pada
respirasi seluler [20] dan sebagai kofaktor enzim [21], juga
adanya protein Fur pada Azotobacter dapat menekan sistem
pengambilan Fe berlebih saat kondisi lingkungan bakteri kaya
akan Fe [19].
Kurva pertumbuhan pada isolat Azotobacter A1a dan A9
mengalami penurunan nilai OD jika dibandingkan dengan
kontrol (tanpa logam Fe). Hal ini dapat terjadi karena kondisi
medium NB yang berupa cairan memungkinkan paparan
logam Fe yang lebih besar terhadap sel bakteri yang tersebar
bebas di dalam medium daripada di medium padat.
Azotobacter A1a, A7 dan A9 diketahui viabel pada medium
dengan Fe.
kons. Fe 50 ppm
0.3
IV. KESIMPULAN
kons. Fe 100 ppm
0.2
kons. Fe 150 ppm
tanpa Fe
0.1
0
Lims isolat Azotobacter yaitu A1a, A2, A7, A9 dan A10
resisten pada medium Nutrient Agar yang mengandung besi
FeCl3.6H2O sampai dengan 200 mg/L. Isolat A1a, A7 dan A9
dapat tumbuh dan mempunyai viabilitas pada medium
Nutrient Broth yang mengandung besi FeCl3.6H2O.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Inkubasi Jam Ke-
UCAPAN TERIMA KASIH
Gambar 3. Kurva Pertumbuhan Azotobacter A7 yang Terpapar
Logam Fe.
Azotobacter A9
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Enny
Zulaika, MP atas dukungannya melalui pendanaan PNBP ITS
tahun
anggaran
2015
sesuai
nomor
kontrak
003246.IT2.11/PN.08/2015.
Absorbansi (OD 600 nm)
1.6
DAFTAR PUSTAKA
1.4
[1]
1.2
[2]
1
kons. Fe 50 ppm
0.8
kons. Fe 100 ppm
0.6
kons. Fe 150 ppm
0.4
tanpa Fe
0.2
[3]
[4]
[5]
[6]
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
[7]
Inkubasi Jam KeGambar 4. Kurva Pertumbuhan Azotobacter A9 yang Terpapar
Logam Fe.
[8]
[9]
S. Yudo, “Kondisi Pencemaran Logam Berat di Perairan Sungai DKI
Jakarta,” (2006) JAI 2: No 1.
M. T. Madigan, J. M. Martinko, D. A. Stahl, and D. P. Clark, “Brock
Biology of Microorganims,” San Fransisco: Pearson Education (2012).
Prescott, Harley, and Klein, “Microbiology, Seventh Edition,” New
York: McGraw-Hill (2008).
I. Sheramati and A. Varma, “Soil Biology: Soil Heavy Metals,” New
York: Springer Heidelberg Dordrecht (2010).
K. Chojnacka, “Biosorption and Bioaccumulation-The Prospects for
Practical Applications”, (2010) Environment International 36: 299-307.
R. Saraswati dan E. Yuniarti, “Metode Analisis Biologi Tanah”, Balai
Besar Litbang Sumberdaya Lahan Pertanian, Badan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian, Departemen Pertanian (2007).
E. Zulaika dan K. Khotimah, Azotobacter sebagai Bioakumulator
Merkuri. Jurnal Sains POMITS 3 : 2337-3539.
A. Kraepiel, J. Bellenger dan Morel. Multiple roles of siderophores in
free-living nitrogen-fixing bacteria 22 : 573-481
K. Elder, D. Baker, and J. Ribes, “Infections, Infertility, and Assisted
Reproduction”, Cambridge: Cambridge University Press (2005).
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
[10] M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K. H. Schleifer, and E.
Stackebrand, “The Prokaryotes: A Handbook on The Biology of
Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria”, Springer Science Bussiness Media
(2006).
[11] M. Mathuselvan dan Balagurunathan, “Siderophore Production from
Azotobacter sp. and its application as biocontrol agent”. J Cur Res Rev
(11).
[12] Harley and Prescott, “Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth
Edition”, The McGraw-Hill Companies (2002).
[13] V. Baby, S. Rajakumar, and P. M. Ayyasamy, “Prevalence and
Screening of Potential Fe(III) and Mn(VI) Resistant Microorganisms in
Industrial Soil”, (2014) International Journal of Innovative Research in
Science, Engineering and Technology Vol. 3: 7.
[14] V. Baby, S. Rajakumar, and P. M. Ayyasamy, “Reduction of Ferric Iron
in Synthetic Medium Amended with Acetate As A Sole Carbon Source”,
(2013) International Journal of Current Microbiology and Applied
Sciences Vol. 2 No. 12: 501-513.
[15] R. Kumar, Nongkhlaw, C. Acharya, and S. R. Joshi, “Growth Media
Composition and Heavy Metal Tolerance Behaviour of Bacteria
Characterized From The Sub-Surface Soil of Uranium Rich Ore Bearing
Site of Domiasiat in Meghalaya”, (2013) Indian Journal of Biotecnology
Vol. 12: 115-119.
[16] C. Nithya, B. Gnanalakshmi, and S. K. Pandian, “Assesment and
Characterization of Heavy Metal Resistance in Palk Bay Sediment
Bacteria”, (2011) Marine Envioronmental Research: 283-294.
[17] M. Fuangthong, A. F. Herbig, N. Bsat, dan J. D. Helmann, “Regulation
of The Azotobacter fur and perR Genes by PerR: Not All Members of
The PerR Regulon Are Peroxide Inducible”, (2002) Journal of
Bacteriology: 3276-3286.
[18] M. T. Madigan, J. M. Martinko, D. A. Stahl, and D. P. Clark, “Brock
Biology of Microorganisms”, San Fransisco: Pearson Education (2012).
[19] Prescott, Harley, Klein, “Microbiology, Seventh Edition”, New York:
McGraw-Hill (2008).
[20] K. R. Aneja, “Experiments in Microbiology, Plant Pathology, and
Biotecnology”, New Age International Publisher (2003).