Keanekaragaman Anggota Genus Azotobacter Resisten

1
Keanekaragaman Anggota Genus Azotobacter
Resisten Merkuri dengan Karakter Koloni dan
Sel
Afina Dhuhaini dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas MIPA, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail: [email protected]
Abstrak— Azotobacter merupakan salah satu genus bakteri
yang memiliki peranan dalam proses biologi di dalam tanah.
Genus Azotobacter mempunyai beberapa anggota spesies.
Keanekaragamannya dapat dipelajari dengan pendekatan
karakter koloni dan sel. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui keanekaragaman anggota genus Azotobacter dengan
karakter koloni dan sel. Terdapat 6 isolat yang dikarakterisasi
yaitu A1a, A3, A5, A6, A7 dan A9. Isolat tersebut terbagi
menjadi dua grup utama yaitu grup A terdiri dari A5, A6 dan A7
yang memiliki warna koloni putih-krem dan grup B yaitu A1a,
A3, dan A9 yang memiliki warna koloni kuning-coklat. Masingmasing grup memiliki bentuk pertumbuhan koloni pada agar
tegak dan agar miring filiform untuk grup A dan echinulate
untuk grup B.
Kata Kunci— Azotobacter, karakter fenotipik, koloni, sel.
I. PENDAHULUAN
A
ZOTOBACTER merupakan bakteri yang hidupnya bebas
dan secara dominan ditemukan di tanah, bakteri ini
merupakan bakteri heterotrof nonsimbion yang mampu
mengikat nitrogen bebas [1]. Selain kemampuannya
menambat nitrogen, Azotobacter juga mampu menghasilkan
antibiotik, siderofor, IAA (asam indol asetat), vitamin, enzim
ACC (1 aminocyclopropane-1-carboxylate) deaminase dan
fitohormon seperti auksin, giberelin, etilen dan sitokinin [2].
Keanekaragaman genus Azotobacter dipengaruhi oleh sifat
fisika-kimia tanah antara lain keberadaan senyawa organik,
pH, suhu, kelembaban, dan interaksi antara mikrobia di dalam
tanah [3]. Beberapa genus Azotobacter merupakan bakteri
yang mampu hidup pada medium yang mengandung NaCl 610% [4] dan resisten terhadap antibiotik ampisilin, tetrasiklin
dan kloramfenikol [5]. Beberapa genus Azotobacter juga
resisten kadmium dan merkuri dengan spektrum luas karena
mampu mendegradasi organomerkuri dan memvolatilisasi
merkuri anorganik, selain itu juga resisten kadmium [6] [7].
Percontohan pertanian ramah lingkungan telah dilakukan
ITS melalui program Eco Campus sejak tahun 2011 yaitu Eco
Urban Farming. Dalam kegiatan pertanian organik,
dibutuhkan pupuk organik untuk meningkatkan unsur hara di
dalam tanah, namun unsur hara tersebut tidak bisa langsung
tersedia sehingga diperlukan peran serta mikroorganisme
tanah, seperti bakteri anggota genus Azotobacter dengan
bermacam-macam spesiesnya. Mempelajari keanekaragaman
bakteri tidak semudah mempelajari keanekaragaman
organisme makroskopis sebab bakteri mempunyai struktur
yang sederhana dan sulit dibedakan dengan pengamatan
morfologi sel saja.
Keanekaragaman bakteri pada tingkat takson genus,
spesies atau strain dapat dikaji dari berbagai karakter
yang dipunyai bakteri tersebut.
II. METODOLOGI
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Februari-Mei 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi
ITS.
B. Isolasi Bakteri
Sampel tanah didapatkan dari lahan Eco Urban Farming
ITS. Tanah diambil secara komposit kemudian dilakukan
isolasi dengan cara memasukkan 10 gram sampel kedalam 90
ml larutan fisiologis. Dibuat seri pengenceran 10-1 sampai 10-7
dan ditumbuhkan pada media selekif Azotobacter agar
(Himedia®) yang berisi 0,1 mg/L HgCl 2 , diinkubasi pada suhu
ruang selama 24-72 jam. Koloni yang tumbuh adalah isolat
Azotobacter yang resisten merkuri. Koloni yang mempunyai
warna dan bentuk koloni berbeda diisolasi kembali dan
disubkultur serta diberikan kode.
C. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana dilakukan untuk melihat kemurnian
sel. Satu tetes akuades diletakkan pada ujung tengah kaca
objek. Satu ose bakteri dicampurkan dengan tetesan tersebut
dan diratakan. Preparat difiksasi dengan dilewatkannya di
atas api bunsen sampai akuades kering, diwarnai dengan
methylene blue (Merck®) dan ditutup dengan menggunakan
kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop. Sel yang
seragam menunjukkan kultur telah murni.
Pengamatan
ukuran sel dilakukan dengan mengelompokkan bakteri dari
ukuran sel 2,8-3,8µm dan 3,8-4,8µm.
2
D. Pewarnaan Kista
Pewarnaan kista dilakukan untuk mengetahui apakah
isolat yang diujikan memiliki kista atau tidak dan bakteri
tersebut merupakan anggota genus Azotobacter. Sebelum
dilakukan pewarnaan, isolat bakteri ditumbuhkan pada Burk’s
mediumdan diinkubasi selama 7 hari. Komposisi Burk’s
medium adalah 0,12 gr K 2 HPO 4 , 0,03 gr KH 2 PO 4 , 0,03 gr
MgSO 4 .7H 2 O, 0,015 gr CaCl 2 .2H 2 O, 0,0015 gr
FeSO 4 .7H 2 O, butanol 0,3 ml dan 3,75 gr agar. Masingmasing bahan dilarutkan ke dalam 150 ml akuades. Setelah
diinkubasi selama 7 hari, isolat kemudian diwarnai
menggunakan pewarna gimsa selama 30 menit dan diamati
dibawah mikroskop. Pengamatan di bawah mikroskop
mencakup ketebalan kista <0,5 µm dan >0,5 µm.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Karakterisasi Morfologi Koloni
Dari hasil isolasi didapatkan lima isolat bakteri yang
resisten HgCl 2 0,1 mg/L yaitu A1a, A3, A5, A6, A7 dan A9.
Ukuran koloni mayoritas kecil, hanya isolat A7 punctiform
dan isolat A1a besar. Warna koloni terkelompokkan menjadi 4
warna koloni yang berbeda, warna krem mendominasi
sebanyak 3 isolat yaitu A5, A6 dan A7, koloni lain berwarna
coklat adalah isolat A1a, warna putih kekuningan adalah isolat
A9 dan warna kuning adalah isolat A3. Bentuk koloni
circular, keculai isolat A1a dan A9 berbentuk irregular.
Elevasi koloni ada flat, convex dan pulvinate. Margin koloni
entire, undulate dan erose. Tekstur koloni semua halus,
kenampakan cerah dan buram, semuanya opaque,
pertumbuhan agar miring dan agar tegak filiform dan
echinulate (Tabel 1).
Koloni Azotobacter chroococcum tampak setelah 24 jam
inkubasi dengan ciri putih basah dan berubah menjadi coklat
gelap setelah 3-5 hari. Sedangkan koloni Azotobacter paspali,
setelah inkubasi 48 jam, pusat koloni menjadi kuning yang
disebabkan asimilasi bromtimol biru dan pengasaman pada
medium [8]. Sementara itu warna putih
kekuningan
merupakan ciri dari Azotobacter agilis [9].
Tabel. 1. Karakter Morfologi Koloni pada Isolat Azotobacter
A1a A3 A5 A6 A7
Karakter
Morfologi Koloni :
Ukuran Koloni
Punctiform
Small
Moderate
Large
Warna koloni
Krem
Putih Kekuningan
Coklat
Kuning
Bentuk Koloni
Circular
A9
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
+
+
-
Lanjutan Tabel. 1.
Azotobacter
Karakter Morfologi Koloni pada Isolat
Irregular
Elevasi Koloni
Flat
Convex
Pulvinate
Raised
Margin Koloni
Entire
Undulate
Erose
Tekstur Koloni
Smooth
Rough
Appearance Koloni
Shiny
Dull
Optical Property (OP)
Opaque
Translucent
Transparan
Pertumbuhan di agar miring
Filiform
Echinulate
Pertumbuhan di agar tegak
Filiform
Echinulate
+
-
-
-
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
Azotobacter ada yang memiliki warna krem dengan ukuran
diameter koloni 3-8 mm, mengkilap, bentuknya irregular
dengan tekstur koloninya halus (smooth), selain itu juga ada
yang mempunyai koloni yang transparan, dengan diameter
koloni 2-5 mm [10].
Pengamatan pertumbuhan isolat Azotobacter uji pada agar
miring dan agar tegak menghasilkan bentuk pertumbuhan
yang berbeda di antara isolat Azotobacter yang satu dengan
yang lainnya. Bentuk pertumbuhan A1a, A3, dan
B. Karakterisasi Morfologi Sel
Sel Azotobacter pada isolat uji memiliki ukuran sel antara
3-3.6 µm x 0.8-1 µm untuk isolat A1a, A6, dan A7,
sedangkan isolat A3, A5 dan A9 memiliki ukuran sel 3.8- 4.8
µm x 1.1-1.5 µm dengan bentuk sel semuanya basil pendek
(Tabel 2).
Genus Azotobacter dapat dibedakan dengan genus bakteri
yang lain karena genus Azotobacter membentuk kista
(Gambar 1). Kista berfungsi untuk melindungi dari keadaan
lingkungan yang ekstrim, misalnya kekeringan, sinar
ultraviolet dan radiasi ion [11]. Semua isolat yang diamati
memiliki ketebalan kista < 5µm kecuali isolat A6.
Gambar. 1. A. Kista Azotobacter ;B. Sel Azotobacter perbesaran
1000x
3
Tabel. 2. Karakter Morfologi Sel pada Isolat Azotobacter
A1a A3
Karakter
A5 A6 A7
Morfologi Sel :
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Cysta
+
+
+
+
+
Bentuk Sel
Basil Panjang
Basil Pendek
+
+
+
+
+
Basil Ovoid
Ukuran Sel
3-3.6 µm x 0.8-1 µm
+
+
+
3.8- 4.8 µm x 1.1-1.5
+
+
Ketebalan Cysta
< 0.5 µm
+
+
+
+
> 0.5 µm
+
Ukuran Cysta
1.1-1.3 µm x 1.1-1.2 µm
+
+
+
1.8 µm x 1.2-1.4 µm
+
+
-
[9]
A9
+
+
+
+
+
-
IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Terdapat 6 isolat anggota genus Azotobacter yang resisten
HgCl 2 yang didapatkan dari lahan Eco Urban Farming ITS
yaitu A1a, A3, A5, A6, A7 dan A9. . Isolat A5, A6 dan A7
memiliki kemiripan pada warna koloni yaitu putih-krem,
elevasi koloni convex, pertumbuhan di agar miring dan agar
tegak filiform dan isolat A1a, A3 dan A9 memiliki kemiripan
pada warna koloni kuning-coklat, dan bentuk pertumbuhan di
agar miring dan agar tegak echinulate.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis A.D mengucapkan terima kasih kepada Dr. Enny
Zulaika yang telah memberi saran pada penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
R. Kizilkaya. “Nitrogen Fixation Capacity of Azotobacter spp. Strains
Isolated from Soils in Different Ecosystems and Relationship Between
Them and the Microbiological Properties of Soils”. Journal
Environmental Biology Vol 30 (2009) 1-18.
N.K. Singh, F.K Chaudhary, and D.B. Patel. “Effectiveness of
Azotobacter bio-inoculant for Wheat Grown Under Dryland Condition.”
Journal of Environmental Biology Vol 34 (2013) 927-932.
A. Lenart. “Occurance, Characteristics, and genetic Diversity of
Azotobacter chroccocum in Various Soils of Shotern Poland.” Poland
Journal Environmental Study Vol 21 (2012) 415-424.
M.S. Akhter, S.J. Hossain, S.A. Hossain, and R.K. Datta. “Isolation and
Characterization of Salinity Tolerant Azotobacter sp.” Greener Journal
of Biological Sciences Vol 2 (2012) 043-051.
E. Zulaika, L. Sembiring, and A. Soegianto. “Characterization and
Identification Of Mercury-resistant Bacteria From Kalimas River
Surabaya-Indonesia by Numerical Phenetic Taxonomy.” Journal of
Basic and Applied Scientific Research Vol 7 (2012) 7263-7269.
S. Ghosh, P.C. Sadhukhan, D.K. Ghosh, J.Chaudhuri, and A. Mandal.
“Elimination of Mercury and Organomercurials by Nitrogen-Fixing
Bacteria.” Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology Vol
58 (1997) 993-998.
E.R. Hindersah. “Biosorpsi Kadmium dan Komposisi Eksopolisakarida
Azotobacter sp. Pada Dua Konsentrasi CdCl 2 .” Agrinimal Vol 1 (2011)
33-37.
R. Saraswati, E. Husen, and R.D.M. Simanungkalit. Metode Analisis
Biologi Tanah. Bogor.: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Sumber Daya Lahan Pertanian (2007).
J.G. Holt, N.R. Krieg, P. Sneath, J. T. Staley and S.T. Williams.
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition. USA:
Williams and Wilkins Pub (1994).
[10] D.J. Jiménez, J.S. Montaña, and M.M. Martínez. Characterization of
Free Nitrogen Fixing Bacteria of the Genus Azotobacter in Organic
Vegetable-grown Colombian Soils. Brazilian Journal of Microbiology
Vol 42 (2011) 846-858.
[11] M.T Madigan and J.M. Martinko. Brock Biology of Microorganisms.
11nd. New Jersey: Upper Saddle River, Pearson Education, Inc (2006).