potensi citrulline sebagai agen kokemoterapi doxorubicin pada sel

POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI
DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7:
STUDI IN VITRO DAN IN SILICO
SKRIPSI
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
Mencapai derajat sarjana S-1
Diajukan Oleh:
Latifah
1008010102
Fakultas Farmasi
Universitas Muhammadiyah Purwokerto
Purwokerto
2014
i
xi
xii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
iii
xiii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
Iv
xiv
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
INTISARI
LATIFAH. Potensi Citrulline Sebagai Agen Kokemoterapi Doxorubicin Pada Sel
Kanker Payudara MCF-7: Studi In Vitro dan In Silico
Dibawah bimbingan NUNUK ARIES NURULITA dan ASMIYENTI DJALIASRIN
DJALIL
Latar Belakang: Doxorubicin adalah agen kemoterapi kanker payudara pilihan
pertama yang masih banyak digunakan. Namun doxorubicin dapat menimbulkan efek
toksik terhadap sel normal tubuh berupa kardiotoksis. Doxorubicin dapat
menghambat endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) yang menyebabkan produksi
Nitric oxide (NO) berkurang. Sehingga terjadi vasokontriksi dan toksik pada jantung.
Citrulline adalah asam amino non esensial yang merupakan hasil metabolisme
arginine. Penambahan citrulline secara eksogen daengan bantuan L –
arginosuccinate dapat mengubah citrulline menjadi arginine yang diindikasikan
dapat memproduksi NO dengan bantuan NOS. Sehingga terjadi relaksasi otot polos.
Tujuan penelitian: Untuk menentukan potensi sitotoksik antara citrulline tunggal
dan kombinasi yang dikombinasikan dengan doxorubicin terhadap sel kanker
payudara MCF-7 serta mengetahui interaksi antara citrulline dengan arginase secara
in silico.
Metode Penelitian: Uji sitotoksik dilakukan menggunakan metode MTT.
Konsentrasi larutan citrulline yang digunakan untuk sitotoksik tunggal adalah 5, 20,
25, 50, 75, 100 µM dan 25, 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 nM. Sedangkan
konsentrasi kombinasi yang digunakan adalah 50, 100, 250, dan 500 nM untuk
citrulline dan doxorubicin dengan masa inkubasi 24 jam. Pengamatan apoptosis
dilakukan dengan metode double staining. Sedangkan uji docking dilakukan dengan
metode PLANTS.
Hasil: IC50 citrulline dan doxorubicin masing – masing adalah 744.243 nM dan
2375.688 nM. Kombinasi doxorubicin dan citruline tidak menimbulkan efek
sitotoksik. Uji apoptosis menunjukkan adanya induksi kematian sel secara apoptosis.
Uji docking dilakukan dengan metode PLANTS dan diperoleh hasil berupa best score.
Best score menyatakan energi interaksi. Energi interaksi protein arginase dengan
ligan dan citrulline dengan masing-masing adalah -19,997 dan -17,5506.
Kesimpulan: Citrulline memiliki efek sitotoksik pada sel kanker payudara MCF-7
pada penggunaan tunggal namun tidak pada kombinasi. Ikatan citrulline dengan
protein arginase tidak lebih kuat dibandingkan dengan ligannya.
Kata kunci : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS
v
xv
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
ABSTRACT
LATIFAH. Cytotoxicity Potential of Citrulline as a co-Chemotherapy Agent in Breast
Cancer Cell MCF-7: In vitro and In silico studies
Under direction NUNUK ARIES NURULITA and ASMIYENTI DJALIASRIN DJALIL.
Background: Doxorubicin is a first line chemotherapy agent that used widely in the
world. Doxorubicin has toxic effect in cell normal. Doxorubicin can inhibit
endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) that can reduce production of Nitric Oxide
(NO) caused vasoconstriction. Citrulline is a non essential amino acid and product of
arginine. Exogenous citrulline with L-arginosuccinate change citrulline to arginine
that indicated produce NO caused smooth muscle relaxation.
Objective: This research was aimed to determine the cytotoxic potential of citrulline
and combination with doxorubicin in breast cancer MCF-7 and also showed
interaction of citrulline and arginase by in silico study.
Methods: Cytotoxic effect by using MTT method. Concentrastiom of citrulline use two
series. First series are 5, 20, 25, 50, 75, 100 µM and second series are 25, 50, 100,
250, 500, 750, dan 1000 nM. Concentration combination of citrulline and
doxorubicin use 50, 100, 250, dan 500 nM with an incubation period of 24 hours.
Apoptosis effect by using double staining method. While docking test was conducted
using PLANTS.
Results: IC50 citrulline and doxorubicin, respectively 744.243 nM 2375.688 nM.
Combination of citrulline and doxorubicin did not showed cytotoxic effect. Test
showed apoptosis induction of apoptotic cell death. Docking test was conducted
using PLANTS and resulted in the best score obtained. Best score interaction energy
states. Interaction the energy of arginase with ligand and citrulline, respectively 19,9997 and -17,5506.
Conclusion: Single citrulline has cytotoxic effects better than combination in breast
cancer cells MCF-7 and citrulline ties with arginase is not stronger than the ligand.
Key word : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS
vi
xvi
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
MOTTO
Tujuan hidup adalah menjalani hidup
dengan tujuan.
vii
xvii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
PERSEMBAHAN
Alhamdulillah, Maha suci Allah yang telah melimpahkan ridha dan
karuniaNya yang tiada henti dan terima kasih kepada semua yang telah
membantu dan membimbingku hingga mencapai tahap ini. Skripsi ini
kupersembahkan untuk kalian semua yang menyayangiku.
•
Alm. Ayah dan Ibu tercinta, yang selalu menginspirasiku, memberikan doa,
dukungan semangat dan tak pernah lelah memberikan nasehat padaku.
•
Adik – adikku tersayang Dzulkifli dan Dzakiyyah yang selalu
memberikan semangat dan dukungan.
•
Agung Pratama terima kasih telah mengajariku banyak hal. Terima kasih
untuk segalanya.
•
Sahabat-sahabatku, Anis, Via, Tantri, wening, Mutia, dan Prita terima kasih
selalu menghibur dan mememaniku selama ini.
•
Teman-teman seperjuangan di kampus, Ayu, Dwi, Dewi, Novi, Wulan,
Richam tetap semangat ya. Terima kasih atas tawa, canda, tangis, harapan
yang telah kalian berikan selama ini.
viii
xviii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat,
hidayah serta inayahNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian (skripsi)
yang berjudul “POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI
DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO
DAN IN SILICO”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh
gelar S1 di fakultas farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak
dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Oleh karena itu pada kesempatan ini
penulis mengucapkan terima kasih kepada :
1. Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah
Purwokerto
2. Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si.,Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen
pembimbing I, yang telah memberikan bimbingan, arahan dan petunjuk dalam
penyusunan skripsi ini dengan penuh kesabaran, ketekunan, sehingga dapat
diselesaikan dengan baik.
3. Dr. Asmiyenti Djaliasrin Djalil, M.Si. selaku dosen pembimbing II, yang telah
memberikan petunjuk dan motivasi yang tinggi, sehingga penyusunan skripsi ini
dapat terlaksana hingga selesai.
4. Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga
dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini.
5. Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan
perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis sehingga penulis dapat
memahami tentang penelitian ini lebih dari sebelumnya.
6. Ibu Rumbiwati yang telah membimbing dan membantu jalannya penelitian ini.
7. Kedua orang tuaku tercinta yang telah memberikan dukungan moral, material dan
spiritual.
ix
xix
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
8. Siti Komerawati dan Agustina Olivia Nezar yang telah berjuang bersama,
terima kasih atas kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian
berlangsung.
9. Teman-teman seperjuangan Fakultas Farmasi Kelas B angkatan 2010 (Ayu,
Dewi, Dwi, Novi, Wulan, Richam), terima kasih atas kekompakan dan
kebersamaannya selama ini.
10. Kekasihku Agung Pratama dan sahabat – sahabatku Mutia, Anis, Via, Tantri,
Wening, dan Prita terima kasih atas dukungan dan do’a serta waktu yang
selama ini telah diberikan.
11. Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan satupersatu.
Penulis telah berusaha semaksimal mungkin agar penyusunan skripsi ini dapat
tersusun dengan sempurna, namun penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari
berbagai pihak penyusunan skripsi ini tidak akan berjalan baik. Dengan segala
kerendahan hati dan lapang dada, penulis menerima kritik dan saran yang
membangun dari para pembaca untuk kesempurnaan di masa datang.
Purwokerto, Maret 2014
Penulis
x
xx
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
RIWAYAT HIDUP
Nama
: Latifah
Tempat, Tanggal Lahir
: Jakarta, 13 Januari 1993
Nama Orang Tua:
a. Ayah
: Alm. Ismail
b. Ibu
: Lulis Praptiwi
Riwayat Pendidikan
a. Sekolah Dasar
: SD Negeri 05 Semper Timur tahun 1998 - 2004
b. Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 8 Purwokerto tahun 2004 – 2007
c. Sekolah Menengah Atas
: SMA Negeri 2 Purwokerto tahun 2007 – 2010
d. Perguruan Tinggi
: Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah
Purwokerto
xi
xxi
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN ............................................................................. ii
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iiI
SURAT PERNYATAAN ..................................................................................... iv
INTISARI.............................................................................................................. v
ABSTRACT ......................................................................................................... vi
MOTTO ............................................................................................................... vii
PERSEMBAHAN ................................................................................................ viii
PRAKATA ........................................................................................................... ix
RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... xi
DAFTAR ISI ........................................................................................................ xii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................... xv
DAFTAR SINGKATAN ............................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................... xvii
BAB I
BAB II
PENDAHULUAN
•
Latar Belakang ............................................................................... 1
•
Perumusan Masalah ....................................................................... 2
•
Tujuan Penelitian ........................................................................... 3
•
Manfaat Penelitian ......................................................................... 3
TINJAUAN PUSTAKA
•
Kanker Payudara ............................................................................ 4
•
Sel MCF-7 ...................................................................................... 6
•
Kokemoterapi ................................................................................. 6
•
Doxorubicin .................................................................................... 7
•
Ctrulline ......................................................................................... 9
•
Arginase…………………………………………………………... 12
xii
xxii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
•
Metode Docking .............................................................................. 12
BAB III METODE PENELITIAN
•
Jenis dan Rancangan Penelitian ..................................................... 14
•
Variabel Penelitian .......................................................................... 14
•
Definisi Variabel Operasional ........................................................ 14
•
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 15
•
Bahan dan Alat ............................................................................... 15
•
•
•
Bahan ........................................................................................ 15
•
Bahan Utama ....................................................................... 15
•
Agen Kemoterapi ................................................................ 15
•
Sel MCF-7 cell line ............................................................. 15
•
Bahan Uji Sitotoksisitas ...................................................... 16
•
Bahan Uji Apoptosis ........................................................... 16
•
Bahan Docking Molecular .................................................. 16
Alat ............................................................................................ 17
Cara Penelitian ............................................................................... 17
•
Pembuatan Larutan Uji ............................................................. 17
•
Uji Sitotoksisitas Citrulline dan Doxorubicin Tunggal dengan
Metode MTT ............................................................................. 17
•
•
Uji Sitotoksisitas Kombinasi Doxorubicin dan Citrulline……. 18
•
Uji Apoptosis Tunggal dan Kombinasi ..................................... 18
•
Docking ..................................................................................... 18
Analisis Hasil ................................................................................. 19
•
Uji Sitotoksisitas ....................................................................... 19
•
Analisis Apoptosis .................................................................... 19
•
Analisis Docking ....................................................................... 19
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
•
Potensi Sitotoksik Citrulline dan Doxorubicin Tunggal ................ 21
xiii
xxiii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
•
Potensi Sitotoksik Kombinasi Citrulline dan Doxorubicin............. 27
•
Potensi Apoptosis Citrulline dan Doxorubicin ............................... 29
•
Docking Molekuler .......................................................................... 31
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
•
Kesimpulan .................................................................................... 35
•
Saran ............................................................................................... 35
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
xiv
xxiv
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
DAFTAR TABEL
Tabel 1.
Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 .......................................
23
Tabel 2.
Persen viabilitas doxorubicin terhadap MCF-7 ..................................
23
Tabel 3.
Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 .......................................
26
Tabel 4.
Persen viabilitas sel MCF-7 yang diberi perlakuan citrulline dan
doxorubicin ........................................................................................
28
Skor docking terhadap protein 4IXV ..................................................
34
Tabel 5.
v
xxv
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.
Morfologi MCF-7 di bawah mikroskop .........................................
6
Gambar 2.
Struktur doxorubicin .......................................................................
7
Gambar 3.
Struktur kimia citrulline ..................................................................
9
Gambar 4.
Perkiraan skema siklus regulasi L – citrulline / L- arginine ..........
11
Gambar 5.
Struktur arginase (4IXV) ................................................................
16
Gambar 6.
Struktur native ligan (Beta-mercaptoethanol ) ...............................
17
Gambar 7.
Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase di dalam
mitokondria menghasilkan kristal formazan ...................................
21
Gambar 8.
Morfologi sel MCF-7 diamati di mikroskop cahaya ......................
23
Gambar 9.
Perbandingan morfologi sel MCF-7 yang digunakan dengan
ATCC.. ............................................................................................
25
Gambar 10. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin dengan
citrulline tunggal.. ...........................................................................
27
Gambar 11. Morfologi sel MCF-7 setelah perlakuan kombinasi doxorubicin
dan citrulline ...................................................................................
28
Gambar 12. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin tunggal
dan kombinasi doxorubicin.. ...........................................................
28
Gambar 13. Efek perlakuan kombinasi doxorubicin – citrulline terhadap
penghambatan pertumbuhan sel MCF-7 pada konsentrasi 50 nM –
500 nM.. ..........................................................................................
29
Gambar 14. Morfologi sel akibat perlakuan citrulline dan doxorubicin setelah
pengecatan dengan menggunakan double staining.. .......................
31
Gambar 15. Visualisasi protein 4IXV menggunakan aplikasi YASARA. ........
33
Gambar 16. Visualisasi ligan BME menggunakan aplikasi YASARA ..............
33
Gambar 17. Hasil RMSD BME ..........................................................................
xvi
34
xxvi
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
DAFTAR SINGKATAN
FBS (Fetal Bovine Serum)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)
MTT {(3-(4,5-dimethylthyazoyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide)
PBS (Phosphate Buffered Saline)
DMEM (Dulbecco’s Modified Ecgle Medium)
SDS (Sodium Duodecyl Sulphate)
NOS (Nitric Oxide Synthase)
nNOS (neural Nitric Oxide Synthase)
eNOS (endhothelial Nitric Oxide Synthase)
iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase)
NO (Nitric Oxide)
BME (Beta-mercaptoethanol)
xvii
xxvii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Lampiran 1. Perhitungan seri konsentrasi pertama citrulline dan doxorubicin
pada uji sitotoksik tunggal..............................................................
41
Lampiran 2. Perhitungan seri konsentrasi kedua citrulline dan doxorubicin
pada uji sitotoksik tunggal .............................................................
44
Lampiran 3. Perhitungan seri konsentrasi untuk uji sitotoksik kombinasi
citrulline dan doxorubicin ..............................................................
47
Lampiran 4. Perhitungan seri konsentrasi untuk apoptosis .................................
50
Lampiran 5. Pemetaan dan hasil absorbansi seri konsentrasi pertama doxorubicin
dan citrulline uji sitotoksik tunggal ................................................ 52
Lampiran 6. Pemetaan dan hasil absorbansi seri konsentrasi kedua doxorubicin
dan citrulline uji sitotoksik tunggal ................................................
53
Lampiran 7. Pemetaan dan hasil absorbansi kombinasi doxorubicin dan
citrulline ..........................................................................................
54
Lampiran 8. Perhitungan IC50 doxorubicin .........................................................
55
Lampiran 9. Perhitungan IC50 citrulline ..............................................................
59
Lampiran 10. Perhitungan t tabel tak berpasangan . .............................................
62
xviii
xxviii
Potensi Citrulline Sebagai..., Latifah, Fak. Farmasi UMP, 2014