1. Biologi Molekuler bagi Klinisi
advertisement
I. Fisiologi Reproduktif I.1 Biologi Molekuler bagi Klinisi 1. Biologi Molekuler bagi Klinisi Rangkaian DNA di atas jelas merupakan suatu mutan, namun fakta bahwa kita dapat mengenali kriptogram ini sebagai sebuah rangkaian nukleotida dan mendiagnosis adanya mutasi menunjukkan kemajuan yang luar biasa dalam pemahaman tentang biologi manusia. Biologi molekuler adalah suatu ilmu subspesialistik mengenai pemahaman struktur dan fungsi genom, pelengkap yang utuh dari DNA (asam deoksiribonukleat), makromolekul yang mengandung semua informasi herediter. Gregor Mendel, seorang biarawan Austria mempelajari kebun kacang polongnya sepanjang sebagian besar masa hidupnya di biara dan merupakan orang pertama yang mengungkapkan prinsip-prinsip hereditas pada tahun 1860an. Ia mendeskripsikan sifat dominan dan resesif dan hukum-hukum transmisi yang mengatur pewarisan homozigot dan heterozigot dari sifat-sifat tersebut. Teori Mendel tersebut baru dikemukakan pada tahun 1900. Sayangnya, Mendel meninggal dunia 16 tahun sebelum hasil kerjanya diakui Teori pembentukan pasangan dan pemisahan kromosom saat pembelahan sel dikemukakan pada tahun 1903, namun baru pada tahun 1946 di Universitas Yale, Edward Tatum dan Joshua Lederberg melakukan demonstrasi pada bakteri bahwa DNA membawa informasi herediter. James Watson dan Francis Crick, yang bekerja di Laboratorium Cavendish di Cambridge, mengusulkan struktur DNA pada 1953 dengan menciptakan suatu model berdasarkan parameter dari Maurice Wilkins dan Rosalind Franklin yang dikumpulkan melalui x-ray crystallography. Crick, Watson, dan Wilkins menerima Hadiah Nobel pada 1962; Franklin wafat pada 1958, dan Hadiah Nobel tidak diberikan kepada orang yang telah meninggal dunia. Replikasi DNA melibatkan berbagai sistem enzim. DNA polimerase diisolasi pada tahun 1958, sedangkan RNA polimerase diisolasi pada tahun 1960. Pada tahun 1978, Werner Arberm Hamilton Smith, dan Daniel Nathans menerima Hadiah Nobel atas penemuannya pada tahun 1960an tentang enzimenzim untuk penggabungan dan pemotongan DNA. Penggunaan enzim ligase dan restriction endonuclease memungkinkan produksi molekul DNA rekombinan, yang pertama kali dilakukan oleh Paul Berg di Universitas Stanford pada 1972. 1 Pada tahun 1975, E.M Southern dari Universitas Edinburgh mengembangkan teknik untuk mentransfer DNA dari gel agarose ke filter nitroselulosa, memungkinkan fragmen-fragmen DNA untuk digabungkan dengan radiolabeled RNA probes dan kemudian diisolasi. Kloning gen atau fragmen DNA mengikuti terobosan bahwa plasmid yang membawa molekul DNA asing dapat dimasukkan ke bakteri, memicu replikasi DNA asing tersebut. Genom adalah satu set lengkap DNA pada suatu organisme. Studi tentang fungsi dan interaksi seluruh gen pada genom membutuhkan suatu nama baru, yaitu genomik, yang dimuat dalam satu jurnal dengan judul yang sama pada 1987. Kita telah memasuki masa biologi molekuler. Tidak lama lagi, masalah-masalah endokrin akan dapat dijelaskan, didiagnosis, dan dirawat pada level molekuler. Sebentar lagi, pemeriksaan hormon tradisional akan segera ditinggalkan. Kekuatan biologi molekuler akan menyentuh kita semua, dan kontribusi-kontribusi biologi molekuler akan dipaparkan melalui buku ini. Sayangnya, biologi molekuler memiliki bahasanya sendiri, bahasa yang hampir tidak bisa dimengerti oleh orang awam. Bab ini menawarkan panduan kedokteran molekuler. Untuk memulai suatu buku klinis dengan bab tentang biologi molekuler dan biokimia hanyalah ditujukan untuk menekankan bahwa keputusan klinis yang kompeten ditemukan di dasar-dasar ilmu pengetahuan. Di sisi lain, praktik klinis tidak membutuhkan kemahiran ilmu sains dasar yang teknis dan rumit. Tujuan dari 2 bab pertama ini bukan untuk menyajikan pelajaran intensif tentang ilmu sains dasar, namun lebih untuk meninjau prinsip-prinsip yang paling penting dan informasi yang diperlukan untuk perkembangan konsep-konsep fisiologis dan klinis yang perlu diikuti. Lebih jauh lagi, bab tersebut dimaksudkan sebagai referensi dari detail-detail tertentu yang sulit diingat. 2. Kromosom Kita semua adalah eukariot, organism dengan sel-sel yang memiliki nukleus yang dibatasi oleh membran nuklear, dan bermultiplikasi melalui mitosis. Bakteri adalah prokariot, organism tanpa nukleus yang sebenarnya, dan reproduksinya melalui pembelahan sel. Kecuali DNA dalam mitokondria, semua DNA kita dikemas dalam suatu nukleus yang dikelilingi oleh membran nuklear. Mitokondria dipercaya sebagai keturunan dari bakteri primitif yang ditelan oleh nenek moyang kita, dan mitokondria masih mengandung beberapa gen yang penting. Karena ova kaya akan mitokondria, penyakit2 penyakit yang disebabkan oleh gen-gen mitokondrial (misalnya neuropati optik Leber) ditransmisikan melalui ibu. Mitokondria pada sperma tereliminasi selama fertilisasi. Kromosom merupakan paket-paket materi genetik yang mengandung molekul DNA (yang mengandung banyak gen) yang ditempeli oleh sejumlah besar protein yang mempertahankan struktur kromosom serta memainkan peranan penting dalam ekspresi gen. Sel somatik manusia mengandung 46 kromosom, 22 pasang autosom, dan sepasang kromosom seks. Semua sel somatik adalah diploid, dengan 23 pasang kromosom. Hanya gamet yang haploid, dengan 22 kromosom autosom dan 1 kromosom seks. Ukuran kromosom bervariasi, mulai dari 50 juta sampai 250 juta pasangan basa. Kromosom 1 mengandung gen terbanyak (2.968), sedangkan kromosom Y memiliki jumlah paling sedikit (231). Semuanya mengandung sebuah bagian kecil yang disebut sentromer, yang membagi kromosom menjadi 2 lengan, yaitu lengan p yang lebih pendek dan lengan q yang lebih panjang. Kedua anggota dari semua pasangan autosom bersifat homolog, tiap homolog adalah turunan dari masing-masing orangtua. Jumlah kromosom tidak menunjukkan level dari kerumitan evolusi; anjing memiliki 78 kromosom, sedangkan ikan gurami memiliki 104! Suatu gen merupakan suatu unit dari DNA dalam kromosom yang dapat diaktivasi untuk mentranskripsikan suatu RNA spesifik.Lokasi suatu gen pada kromosom tertentu is designated lokusnya. Karena ada 22 pasang autosom, sebagian besar gen berpasangan. Pasangan tersebut bersifat homozigot bila mirip dan bersifat heterozigot bila tidak mirip. Hanya 2% dari genom manusia yang mengandung gen yang mengkode sintesis protein. Karyotipe manusia yang umum merupakan suatu rangkaian dari kromosomkromosom menjadi pasanga-pasangan, biasanya setelah perlakuan proteolitik dan pengecatan Giemsa untuk menciptakan pola banding yang khas, memungkinkan adanya blueprint yang berguna untuk penentuan lokasi. Pengecatan karakterisitik membagi tiap lengan menjadi region-regio, dan tiap regio menjadi band (pita) yang diberi nomor dari sentromernya ke arah luar. Suatu titik pada suatu kromosom dinyatakan dengan urutan sebagai berikut: nomor kromosom, simbol lengan (p untuk lengan pendek dan q untuk lengan panjang), nomor regio, dan nomor band. Misalnya, 7q31.1 adalah lokasi gen fibrosis sistik. Mitosis 3 Semua eukariot, dari yeast hingga manusia, mengalami pembelahan dan multiplikasi sel yang mirip. Proses pembelahan inti sel pada semua sel somatik disebut mitosis, di mana tiap kromosom mebelah menjadi 2. Untuk perutmbuhan dan perkembangan normal, seluruh informasi genomik harus direproduksi pada setiap sel. Mitosis terdiri dari tahaptahap berikut: Interfase Pada fase ini, semua aktivitas sel normal terjadi kecuali pembelahan aktif. Pada tahap ini, kromosom X inaktif (Barr body atau kromatin seks) dapat dilihat di sel perempuan. Profase Saat pembelahan dimulai, kromosom memadat dan kedua kromatid terlihat. Membran nuklear menghilang. Sentriol adalah organel di luar nukleus yang membentuk spindle untuk pembelahan sel; sentriol menduplikasi dirinya sendiri, dan kedua sentriol tersebut bermigrasi ke kutub-kutub sel yang berlawanan. Metafase Kromososm bermigrasi ke bagian tengah sel, membentuk suatu garis yang menandai piringan ekuatorial. Saat ini, kromosom-kromosom telah terkondensasi maksimal. Pada tahap ini terbentuk spindle, suatu mikrotubulus protein yang menyebar dari sentriol dan melekat pada sentromer. Anafase Pembelahan terjadi pada plane longitudinal dari sentromer. Kedua kromatid berpindah ke sisi yang berlawanan dari sel karena kontraksi spindle. Telofase Pembelahan sitoplasma dimulai pada plane ekuatorial, berakhir dengan pembentukan 2 membran sel yang utuh. Kedua kelompok kromosom dikelilingi oleh membran nuklear yang membentuk nuklei baru. Tiap strand DNA bertindak sebagai template, dan DNA pada sel berlipat ganda Meiosis Meiosis adalah pembelahan sel yang membentuk gamet, masing-masing dengan jumlah kromosom yang haploid. Meiosis memiliki 2 tujuan: reduksi jumlah kromosom dan rekombinasi untuk mentransmisikan informasi genetik. Pada meisois I, kromosom homolog berpasangan dan kemudian berpisah. Meiosis II mirip dengan mitosis, dimana kromosom yang telah terpisah membelah dan bersegregasi menjadi sel baru. 4 Meiosis I Profase Lepoten Zigoten Pakiten Kondensasi kromosom Kromosom yang homolog berpasangan (sinapsis) Tiap pasangan kromosom menebal untuk membentuk 4 strand. Pada tahap ini dapat terjadi crossing over atau rekombinasi (pertukaran DNA antara segmen-segmen homolog antara 2 dari 4 strand). Chiasmata adalah tempat dimana crossover terjadi (dan dapat divisualisasikan). Pergerakan blok-blok DNA ini adalah suatu metode untuk menciptakan keragaman genetik. Di sisi lain, penyakit genetik dapat disebabkan oleh insersi of sequences saat gametogenesis. Rekombinasi transposisional, yang menggunakan enzim yang mengenali rangkaian asam nukleat spesifik, dapat menyebabkan terjadinya insersi elemen genetik ke regio apapun pada kromosom. Metode Diploten ini digunakan oleh virus (misalnya HIV) untuk mentransformasi sel host. Perpisahan longitudinal dari tiap kromosom Metafase, Anafase, dan Telofase Meiosis I Membran nuklear menghilang, dan kromosom berpindah ke bagian tengah sel. Satu anggota dari tiap pasangan berpindah ke tiap kutub, dan sel membelah. Meiosis I sering disebut sebagai pembelahan reduksi, karena produk yang dihasilkan memiliki jumlah kromosom yang haploid. Pewarisan Mendel terjadi pada meiosis I. Crossover yang terjadi sebelum metaphase menghasilkan kombinasi baru dari materi genetik, baik kombinasi yang diinginkan maupun yang tidak diinginkan. Meiosis II Meiosis II mengikuti meiosis I tanpa adanya replikasi DNA. Pada oosit, meiosis II terjadi setelah fertilisasi. Hasil akhirnya adalah 4 sel haploid. *gambar* 3. Struktur dan Fungsi DNA DNA adalah materi gen yang bertanggungjawab atas pengkodean pesan genetik as transmitted melalui protein spesifik. Sehingga, DNA adalah molekul terpenting dalam kehidupan dan merupakan mekanisme fundamental dari evolusi. Gen adalah segmen dari 5 DNA yang mengkode protein spesifik, bersama dengan rangkaian yang mengapit dan menghalangi yang memiliki fungsi pengontrol dan regulator. Tiap molekul DNA memiliki sebuah backbone gula deoksiribosa, sekelompok gula deoksiribosa identik berulang yang terhubung melalui ikatan fosfodiester. Tiap deoksiribosa menempel secara urut (memberi individualitas dan spesifisitas) pada satu dari empat asam nukleat, basa-basa nuklear antara lain: Purin : adenine atau guanine Pirimidin : timin atau sitosin Suatu nukleotida adalah dasar dari DNA. Nukleotida terdiri dari 3 komponen utama: gula deoksiribosa, satu grup fosfat, dan satu basa asam nukleat. Linkage fosfatgula adalah asimetris; fosfornya berhubungan dengan 5-karbon dari satu gula dan dengan 3-karbon dari gula berikutnya. Sehingga, satu ujungnya adalah ujung 5 (5 prime), sedangkan ujung lainnya adalah ujung 3 (3 prime). Menurut kesepakatan, DNA dan rangkaian asam nukleatnya ditulis dari kiri ke kanan, dari ujung 5 ke ujung 3, sesuai arah proses transkripsi. Ujung 5 membentuk ujung amino dari protein, sedangkan ujung 3 membentuk ujung karboksi dari protein. DNA terdiri dari 2 strand deoksiribosa yang terpilin searah jarum jam satu sama lain dalam suatu heliks ganda, dengan asam nukleat di dalamnya dan basa nuklear berpasangan melalui hydrogen bonding, adenine dengan timin, dan sitosin dnegan guanine. RNA berbeda dengan DNA karena RNA memiliki strand tunggal, gulanya adalah ribose, dan timin digantikan oleh urasil. *gambar* *gambar* Bagaimana suatu DNA sel, yang bila diuraikan berukuran hampir 2 meter, bisa muat dalam satu sel? Watson dan Crick menemukannya saat mereka mengusulkan suatu helix terpilin dengan dua strand, double helix. Seperti halnya sentimeter yang merupakan ukuran panjang, pasangan basa (base pair: bp) adalah unit ukuran DNA. Pasangan basanya adalah adenine-guanin atau sitosin-timin, asam nukleat dari satu rantai berpasangan dengan asam nukleat dari rantai lain yang berhadapan. Sehingga, satu fragmen DNA diukur dari jumlah pasangan basa, misalnya suatu fragmen 4.800-bp (fragmen 4,8 kb). Diperkirakan bahwa kita memiliki 3,2 milyar bp DNA, dan hanya sebagian kecil yang mengkode protein. 6 DNA tidak terdapat dalam sel sebagai molekul telanjang. Rantai nukleotida membungkus suatu inti protein (histon) untuk membentuk nukleosom. Nukleosom berkondensasi menjadi banyak band yang dikenali dalam preparasi karyotipe. Kondensasi ini adalah mekanisme penting lain untuk mengemas struktur DNA yang panjang ke dalam sebuah sel. Banyak protein lain berhubungan dengan DNA serta penting untuk struktur dan fungsinya. Proses replikasi DNA dimulai dengan pemisahan double-stranded DNA helix (heliks DNA helai-ganda), diawali dengan berbagai tahapan oleh aksi enzim. Saat DNA asli membuka menjadi template strand, DNA polymerase mengkatalisasi sintesis strand (helaian) duplikat baru, yang membentuk ulang suatu heliks ganda dengan tiap-tiap strand asli (ini disebut replikasi). Sehingga, tiap molekul turunan mengandung salah satu strand dari orangtuanya. Diperkirakan bahwa molekul DNA asli yang didapatkan pada zigot yang sudah difertilisasi harus digandakan sebanyak kira-kira 1015 kali sepanjang masa hidup manusia. Kecepatan dan ketepatan sangatlah penting. Dengan menggabungkan presisi dan sistem koreksi, kesalahan-kesalahan yang mempengaruhi fungsi protein gen sangatlah jarang. *20 asam amino dalam protein* Homeobox adalah suatu rangkaian DNA, yang dipertahankan sepanjang evolusi, yang megkode suatu rangkaian yang terdiri dari 60 asam amino, disebut homeodomain. Produk protein homeodomain berfungsi sebagai faktor transkripsi dengan cara berikatan dengan DNA. Homeobox mempengaruhi fungsi jaringan spesifik yang penting untuk pertumbuhan dang perkembangan embrio. Genom Manusia Genom dari tiap spesies terdiri dari serangkaian DNA pada semua kromosom. Ada 3,2 milyar pasangan basa pada tiap haploid genom manusia; pada double-stranded helix DNA, ada 6 milyar nukleotida, dan terdapat sekitar 30.000-35.000 gen, unit fungsional terkecil dari informasi yang diturunkan. Gen bertanggungjawab atas hanya sekitar 2% DNA manusia. Walaupun sekilas terlihat amat rumit, namun seluruh bahasa genetik ditulis hanya dengan 4 huruf: A, C, G, dan T (U pada RNA). Terlebih lagi, bahasa tersebut terbatas pada hanya 3-letters words, kodon. Pada akhirnya, seluruh pesan genetik terfragmentasi menjadi 23 pasang kromosom. Dengan 4 nukleotida, dan 3 kelompok bacaan, ada 64 kombinasi yang mungkin. Semua organisme hidup menggunakan kode 7 ini. Genom berubah hanya karena kombinasi baru yang diturunkan dari orangtua atau karena mutasi. *kode genetik mRNA* Struktur dan Fungsi Gen Susunan linear dari banyak gen membentuk suatu kromosom. Suatu gen tersusun dari sebuah segmen DNA yang mengandung exon-exon (kodon pengkode) yang dipisahkan oleh intron (kodon non-coding). Pola intron-exon cenderung dipertahankan selama evolusi. Gen alfa- dan beta-globin dipercaya muncul 500 juta tahu yang lalu, dengan intron pada lokasi yang sama dengan saat ini. Exon Segmen gen yang mengandung produk mRNA yang mengkode protein spesifik. Intron Segmen gen yang tidak terdapat di RNA matur,sehingga tidak mengkode protein. Kodon Suatu rangkaian 3 basa pada RNA atau DNA yang mengkode asam amino spesifik; kodon triplet. Dengan beberapa pengecualian, dipercaya bahwa satu gen yields hanya satu protein. Bagaimanapun, melalui suatu mekanisme yang disebut alternative splicing, 30.000-35.000 gen manusia dapat memproduksi lebih dari 100.000 protein. Seperti yang telah disebutkan di atas, intron tidak ditranslasikan menjadi produk protein. Hanya rangkaian DNA pada exon yang ditranskripsikan menjadi mRNA lalu ditranslasikan menjadi protein. Bagaimanapun, variasi (alternative splicing) dapat menciptakan protein yang berhubungan. *gambar* Gen juga termasuk rangkaian pengapit yang penting untuk transkripsi gen. Area yang akan menginisiasi aksi DNA (misalnya pengikatan DNA dengan kompleks hormonereseptor) disebut regio enhancer. Area dimana transkripsi dimulai disebut regio promoter. Hanya sedikit rangkaian nukleotida yang relative pendek yang merupakan promoter, misalnya rangkaian T-A-T-A-A, atau TATA box, dan rangkaian C-C-A-A-T, atau CAT box. Situs promoter (tempat berikatan untuk RNA polymerase dan beberapa kofaktor)biasanya dekat dengan awal regio pengkode pada gen. Situs enhancer lebih besar daripada 8 promoter dan dapat berlokasi dimana saja, bahkan di tempat yang jauh dari gen, namun biasanya terletak di ujung. Pada ujung 3, suatu rangkaian pengkode biasanya tersedia untuk ekor polyadenin (poly-A) yang umum bagi kebanyakan molekul mRNA (messenger RNA) Situs enhancer mengikat protein-protein (protein regulator) yang bertindak sebagai sinyal untuk meregulasi ekspresi gen dengan cara meningkatkan atau menekan terjadinya pengikatan RNA polimerase di regio promoter. Ini adalah salah satu cara untuk menciptakan fungsi seluler yang unik. Misalnya, suatu jaringan target hormon dapat merespon suatu hormon karena hormon tersebut memiliki reseptor protein spesifik yang bila berikatan dengan hormon akan berikatan dengan situs DNA enhancer. Protein spesifik (disebut faktor transkripsi) berikatan dengan situs enhancer dan mengaktivasi transkripsi. Regulasi transkripsi gen biasanya melibatkan rangkaian DNA pada regio upstream dari sebuah gen 3 kodon (UAG, UAA, UGA) disebut kodon stop, karena kodon-kodon tersebut secara spesifik menghentikan translasi RNA menjadi protein (seperti titik pada akhir suatu kalimat). Sebaliknya, open reading frame adalah suatu rangkaian panjang pasanganpasangan basa di antara 2 kodon stop; sehingga suatu open reading frame mengkode rangkaian asam amino dari produk protein. Menemukan dan mengidentifikasi open reading frame merupakan langkah penting dalam analisis rangkaian DNA karena rangkaian panjang seperti itu biasanya hanya ditemukan pada gen yang aktif. Ekspresi gen terdiri dari tahap-tahap berikut: transkripsi DNA menjadi RNA, pengolahan RNA untuk memproduksi mRNA fungsional dengan splicing out (menyatukan) intron, translasi mRNA pada ribososm menjadi rantai peptida, dan pemrosesan protein struktural menjadi bentuk fungsional. Transkripsi Transkripsi adalah sintesis mRNA strand-tunggal dari suatu gen (DNA strandganda). Rangkaian asam amino protein dikodekan pada DNA oleh kodon; satu asam amino dikode oleh tiap kodon, suatu triplet yang terdiri dari 3 basa asam nukleat. RNA polimerasi membentuk mRNA dengan membaca strand DNA (strand antisense) yang melengkapi RNA; sehingga RNA merupakan duplikat dari strand DNA lain (strand sense), yang juga disebut strand komplementer molekul DNA (ingat, perbedaan yang penting yaitu timin pada DNA digantikan oleh urasil, dan ribosa menggantikan deoksiribosa pada RNA). 9 Komplementaritas molekuler adalah konsep yang sulit sekaligus mudah dimengerti. Aspek yang mudah dari konsep ini adalah bahwa satu hal mirip dengan yang lain. Bagian yang sulit adalah kebutuhan untuk memahami dan memvisualisasikan bahwa molekul komplementer tidak identik dengan template nya, namun lebih seperti tempat di mana template masuk, dan molekul komplementer keluar. Sehingga, strand-strand dari heliks ganda tidaklah identik. Tiap strand DNA memiliki struktur komplementer, sedikit banyak, satu template positif dan satu template negatif, masing-masing saling menetapkan satu sama lain. Tiap strand bertindak sebagai template untuk DNA komplementernya (pada proses replikasi) atau untuk RNA komplementernya (pada proses transkripsi). Sheingga, mRNA disintesis dari template negatif (strand antisense) agar memiliki struktur yang sama dengan template positif (strand sense). Ilmuwan biologi molekuler harus berpikir dalam 3 dimensi! Transkripsi dimulai pada upstream start site, dimana kedua strand dari heliksganda berpisah. Proses ini berlanjut secara downstream, mengkopi salah satu strand hingga mencapai kodon spesifik yang memberi pesan untuk berhenti. Sintesis RNA berlanjut dengan penambahan suatu rantai panjang adenin, yaitu ekor poli-A; ini adalah regio tak-tertranslasi yang dipercaya menstabilisasi RNA dengan mencegah degradasi. Setelah transkripsi gen, RNA berpindah ke sitoplasma dimana regio intron dipotong, dan exon bergabung (RNA splicing) untuk memproduksi suatu molekul RNA yang utuh dan matur. Awal dan akhir tiap exon dan intron memiliki rangkaian yang bila dikopi ke RNA dapat memerintah enzim untuk menghilangkan bagian yang menghalangi. Hampir semua intron diawali dengan GU dan diakhiri dengan AG (GT dan AG pada intron DNA). Intron memiliki panjang bervariasi; satu intron dapat berukuran lebih panjang dari produk akhir RNA. Molekul RNA matur memiliki tambahan pada salah satu ujungnya (capping, dengan penambahan nukleotida termodifikasi, 7-metil guanosin) untuk melindungi terhadap ribonuklease (RNase) dan pada ujung yang lain, sebuah ekor poliadenin (ekor poli-A) ditambahkan (selain penambahan faktor stabilisasi). Kedua ujung tersebut tidak ditranslasi pada ribosom. *gambar* *gambar* Faktor Transkripsi Faktor transkripsi adalah protein yang berikatan dengan elemen regulator pada RNA (enhancer dan promoter), sehingga mempengaruhi ekspresi gen. Reseptor hormon 10 steroid adalah faktor transkripsi. Transkripsi gen dan mRNA dapat distimulasi atau diinhibisi melalui interaksi langsung dengan DNA. Faktor transkripsi dapat lebih jauh berinteraksi dengan faktor-faktor lain (koaktivator dan korepresor, juga disebut protein adapter) untuk memproduksi efek-efek kooperatif. Aktivitas protein-protein tersebutt juga dapat dipengaruhi oleh fosforilasi yang dipicu oleh sinyal dari reseptor di permukaan sel (sering kali growth factor). Konsep yang penting adalah untuk melihat hasil akhir aktivitas hormonal dan ekspresi gen sebagai refleksi dari konteks seluler, yaitu sifat dan dan aktivitas faktor transkripsi seperti yang dipengaruhi oleh protein adapter intrasel spesifik. Hal ini menjelaskan bagaimana agen-agen yang mirip (dan faktor transkripsi yang mirip, misal reseptor estrogen) dapat memiliki aksi yang berbeda di jaringan yang berbeda Translasi mRNA berpindah dari kromosom tempatnya disintesis ke ribosom di sitoplasma, dimana ia memimpin penyusunan asam amino menjadi protein (translasi). Tiap sel memiliki proteome yang khas namun dinamis dan selalu berubah. Proteome adalah kumpulan protein yang unik untuk sel tersebut. Asam amino dibawa ke dalam proses translasi melalui molekul tRNA (travel RNA) spesifik. Rangkaian spesifik 3 basa pada salah satu akhir dari tRNA bersifat komplementer terhadap kodon yang mengkode asam amino spesifik. Ikatan pada area ini dengan kodon mRNA menempatkan asam amino spesifik di ujung yang lain ke susunan protein yang tepat. Asam amino ditempatkan satu per satu ketika molekul tRNA membaca template RNA, dimulai dari ujung asam amino dan berakhir pada ujung karboksi. Proses ini dimulai pada triplet AUG pertama dan terus berlanjut hingga mencapai kodon stop (UAA, UAG, atau UGA), dimana mRNA gugur dari ribosom dan berdegenerasi. Rangkaian linear spesifik dari asam amino dispesifikkan dengan pengkodean genetik; pada gilirannya, rangkaian ini menentukan bentuk 3dimensional protein, struktur berlipat yang penting untuk fungsi. *gambar* Ekspresi akhir dari suatu gen mungkin tidak berakhir dengan proses translasi. Pemrosesan protein lebih jauh (post translasional) terjadi, misalnya glikosilasi (gonadotropin) atau cleavage proteolitik (konversi pro-opiomelanocortin menjadi ACTH). hal-hal tersebut disebut modifikasi epigenetik. Mekanisme yang memproduksi protein dari gen mirip di seluruh dunia biologis. Hal ini berarti pengetahuan penting tentang fungsi manusia bisa didapatkan dengan 11 mempelajari organisme sederhana, dan mikroba dapat dibuat untuk memproduksi protein manusia. Mutasi Banyak gen yang memiliki berbagai bentuk, disebut alel. Perubahan pada rangkaian DNA yang menyebabkan perubahan yang merugikan pada stuktur atau fungsi protein disebut mutasi. Substitusi adalah perubahan pada satu basa asam nukleat. Substitusi pada kodon bisa menyebabkan inkorporasi asam amino yang salah menjadi protein, memicu perubahan atau hilangnya fungsi. Insersi atau delesi asam amino dapat disebabkan oleh splicing RNA yang improper. Karena redundansi yang besar pada kode genetik (banyak kodon triplet yang mengkode asam amino yang sama, dan hanya ada 20 asam amino), tidak semua substitusi menghasilkan efek. Contoh klinis dari substitusi basa tunggal (mutasi titik) adalah mutasi sabit, di mana timin menggantikan adenine pada gen beta-globin. Bila regio DNA yang homolog mengalami kesalahan barisan, crossover bisa terjadi, menyebabkan delesi dan insersi (adisi). Mutasi nonsense adalah substitusi satu basa sehingga diproduksi kodon stop, memotong produk protein. Delesi dan insersi dapat melibatkan satu basa saja, hingga seluruh exon, atau gen maupun beberapa gen. Rekombinasi atau pertukaran materi genetik biasanya terjadi pada meiosis. Perubahan hanya pada perbatasan regio pengkode dan non-pengkode pun dapat memicu mRNA yang abnormal. Abnormalitas Kromosomal Abnormalitas Numerik Abnormalitas numeric biasanya karena nondisjunction, suatu kegagalan berpisah saat anafase, baik pada mitosis maupun meiosis. Aneuploid adalah jumlah kromosom yang bukan kelipatan jumlah haploid, misalnya monosomi (45,X Sindrom turner) atau trisomi (trisomi 13 Sindrom Patau, trisomi 18 Sindrom Edwards, trisomi 21 Sindrom Down, 47,XXY Sindrom Klinefelter). Mosaikisme mengindikasikan adanya satu atau lebih sel dengan karyotipe berbeda, biasanya muncul karena nondisjunction pada mitosis awal (kegagalan 2 kromosom berpasangan untuk berpisah). Poliploid, kelipatan dari jumlah haploid kromosom, adalah penyebab signifikan dari keguguran spontan Abnormalitas Struktural 12 Abnormalitas struktural biasanya disebabkan oleh kerusakan kromosom karena radiasi, obat, atau virus. Abnormalitas yang dihasilkan bergantung pada penyusunan kembali bagian-bagian yang rusak. Sehingga, pada translokasi ada pertukaran material di antara 2 atau lebih kromosom nonhomolog. Translokasi yang seimbang berhubungan dengan tidak adanya materi genetik yang bertambah atau berkurang, dan individu semacam itu adalah carrier translokasi. Defek Gen-Tunggal Defek gen-tunggal disebabkan oleh mutasi pada gen spesifik. Mutasi tersebut ditransmisikan sesuai hokum pewarisan Mendel: autosom dominan, autosom resesif, Xlinked resesif, dan X-linked dominan yang jarang. Selain itu, kelainan gen-tunggal dapat ditransmisikan oleh pewarisan gen mitokondrial, imprinting (hasil cetakan) maternal atau paternal, disomi (mewarisi kedua pasang kromosom dari satu orangtua), dan pengulangan eksesif (suatu fenomena dimana terjadi pengulangan 3 pasangan basa yang lebih dari biasanya). Autosom Dominan Transmisi tidak berhubungan dengan jenis kelamin individu, serta berperngaruh pada anak homozigot dan heterozigot (hanya perlu 1 alel abnormal). Dengan 2 orangtua heterozigot, tiap anak berisiko 75% terkena. Dengan 1 orangtua heterozigot, tiap anak berisiko 50% terkena. Efeknya sangat bervariasi. Contoh kelainan autosom dominan adalah Huntington disease, neurofibromatosis, dan Sindrom Marfan. Efek dari gen dominan abnormal dipengaruhi oleh penetrance, yaitu derajat ekspresi gen dominan. Penetrance komplet, berkebalikan dengan penetrance inkomplet, bermakna bahwa gen selalu diekspresikan dan selalu memproduksi fenotip yang dapat dikenali. Autosom Resesif Kondisi ini hanya diekspresikan secara fenotip pada homozigot (semua alel harus abnormal). Pada ornagtua heterozigot, tiap anak berisiko 25% untuk terkena dan 50% risiko menjadi carrier. Contoh penyakit autosom resesif adalah fibrosis sistik, penyakit sel sabit, dan hyperplasia adrenal karena defisiensi 21-hidroksilase. 13 Imprinting Genomik Imprinting genetik mengindikasikan pengaruh menetap pada fungsi genom karena kontribusi orangtua laki-laki dan perempuan. Misalnya, perkembangan plasenta sebagian besar dikontrol oleh gen yang diturunkan secara paternal. Sehingga, mola hidatidosa memiliki karyotipe normal, namun semua kromosomnya diturunkan dari pihak ayah. Struktur plasenta tidak didapatkan pada teratoma ovarium, suatu tumor yang hanya memiliki kromosom yang diturunkan secara maternal. Percobaan pada alam dan percobaan pada binatang mengindikasikan bahwa kontribusi maternal terhadap genom lebih penting untuk perkembangan embrio. Pada kondisi autosom resesif tertentu, ekspresi, keparahan, dan usia onset dipengaruhi oleh jenis kelamin orangtua yang mewariskan gen atau kromosom mutan. 4. Teknik dalam Biologi Molekuler Enzim yang memecah ikatan fosfodiester dan memotong molekul DNA menjadi fragmen-fragmen adalah endonuklease; suatu enzim restriksi (endonuklease restriksi) hanya memotong pada tempat yang memiliki rangkaian asam nukleat spesifik. Enzim restriksi ditemukan pada bakteri dimana enzim tersebut membentuk mekanisme pertahanan untuk memotong (lalu menginaktivasi) DNA asing (dari virus yang menginvasi) yang diperkenalkan ke sel bakteri. Sebagai bagian dari mekanisme protektif tersebut, bakteri juga memiliki metilase yang memetilasi situs pengenalan pada DNA native, mengarahkan aksi enzim restriksi ke DNA asing yang belum termetilasi. Bakteri yang berbeda memiliki enzim restriksi yang berbeda-beda dengan sasaran aksi yang spesifik. Enzim restriksi memotong DNA menjadi bagian-bagian (fragmen restriksi), mulai dari banyak fragmen kecil hingga beberapa fragmen besar, tergantung jumlah nukleotida pada rangkaian pengenal. Mereka dinamai sesuai dengan organisme dan strain asalnya. Kombinasi fragmen-fragmen restriksi, gabungan 2 potongan DNA, membentuk DNA rekombinan. DNA polimerase adalah enzim yang membawa satu nukleotida tunggal ke molekul DNA. DNA polimerase dapat membentuk DNA hanya bila ada template DNA; DNA yang disintesis akan bersifat komplementer terhadap template tersebut. RNA polimerase dapat membuat RNA juga hanya jika ada template DNA. 14 Deoksiribonuklease (DNAase) dapat menghilangkan nukleotida. Dengan menggabungkan treatment DNAase dengan aksi DNA polimerase, nukleotida radiolabeled dapat dikenalkan pada molekul DNA, menghasilkan DNA probe. Suatu DNA probe dapat dibandingkan dengan antibody yang digunakan dalam imuno assay. Antibodi tersebut spesifik dan mengenali hormon yang berlawanan. DNA probe secara spesifik mendeteksi rangkaian DNA. Reverse transciptase adalah DNA polimerase yang dependen RNA. Disebut reverse transcriptase karena arus informasinya dari RNA ke DNA, kebalikan dari arus yang biasanya. Enzi mini memungkinkan penggandaan molekul RNA apapun menjadi DNA single-strand; DNA semacam itu disebut DNA komplementer karena ia adalah cerminan dari mRNA. DNA probe komplementer terbatas hanya membaca exon (ingat bahwa intron excised dari RNA), sehingga probe-probe tersebut hanya membaca area yang besar. DNA dan RNA adalah molekul bermuatan, sehingga akan berpindah dalam medan listrik. Fragmen dapat dianalisis dengan gel (agarose atau polyacrylamide) elektroforesis, fragmen terbesar paling lambat berpindah. By convention, gel tersebut dibaca dari atas ke bawah, dengan fragmen terkecil berada di bawah. Analisis Southern Blot DNA awalnya didenaturasi untuk memisahkan kedua strand, dicerna oleh enzim restriksi untuk memproduksi fragmen-fragmen lebih kecil yang dimasukkan ke gel elektroforesis. Metode Southern blot, dinamakan sesuai penemunya E.M Southern, menentukan ukuran fragmen. Fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis. Gel elektroforesis ditempatkan di kertas saring tebal yang ujungnya direndam di larutan tinggi-garam. Membran khusus (nitroselulosa) ditempatkan di atas gel, dan di atasnya diberi setumpuk handuk kertas yang diberi beban. Larutan garam naik ke kertas saring; larutan tersebut naik melalui aksi kapiler melewati gel, membawa DNA bersamanya. DNA dibawa ke membrane nitroselulosa dimana ia berikatan. Larutan garam tetap bergerak dan diserap handuk kertas. Membran nitroselulosa lalu membentuk replika pola elektroforesis asli. DNA difiksasi ke membrane dengan pembakaran temperature-tinggi atau dengan sinar UV. Probe (bagian kecil DNA) yang telah dilabeli spesifik lalu dapat dihibridisasi. Hibridisasi adalah a specific probe anneals to its complementary sequence (suatu penguatan spesifik terhadap rangkaian komplementernya). Fragmen-fragmen dengan 15 rangkain ini akhirnya diidentifikasi dengan autoradiografi. Probe fluoresens dapat dimanfaatkan setelah aktivasi dnegan sinar laser, memungkinkan pemeriksaan kualitatif dan kuantitatif dengan komputer. Northern blotting merujuk pada pemrosesan RNA, disebut Northern karena RNA adalah kebalikan dari DNA. RNA yang telah diekstrak dipisahkan dengan elektroforesis dan ditransfer ke membrane selulosa seperti pada Southern blotting untuk hibridisasi dengan DNA komplementer. Northern blotting digunakan misalnya untuk menentukan apakah stimulasi hormon dari protein spesifik di suatu jaringan dimediasi oleh mRNA. Elektroforesis untuk memisahkan protein disebut Western blotting, dan antibodi digunakan untuk proses identifikasi hibridisasi. Seperti Northern blotting, Western blotting menguji ekspresi gen, bukan hanya keberadaan suatu gen. Istilah Northern (utara) dan Western (barat) menunjukkan kelucuan yang disengaja (hal yang jarang dalam sains) sebagai respon terhadap Southern blotting. Hibridisasi tanpa elektroforesis dengan menempatkan setetes ekstrak sel langsung di kertas saring disebut dot atau slot blotting. Hibridisasi Saar 2 strand komplementer DNA ber-reasosiasi, prosesnya disebut hibridisasi. Hibridisasi membuat area spesifik DNA dapat dipelajari menggunakan radiolabeled DNA probe yang spesifik (suatu rangkaian komplementer). Membran nitroselulosa yang diproduksi setelah Southern blotting pada awalnya diberi perlakuan untuk memblok binding site nonspesifik. Membran tersebut lalu dihibridisasi dengan probe yang telah dilabeli. Lokasi probe lalu diidentifikasi dengan autoradiografi (untuk radiolabeled probes) atau dengan metode kolorimetri. Rangkaian probe menentukan rangkaian pada tempat ikatan. Kapanpun 2 produk bersifat komplementer, hibridisasi akan terjadi, Sehingga, DNA komplementer dapat dihibridisasi menjadi template mRNA nya. Hibridisasi in situ adalah teknik di mana probe DNA atau RNA yang telah dilabeli ditempatkan langsung pada slide jaringan atau sel. Sepotong DNA yang telah diklon dan dilabeli dengan marker fluoresens dapat digunakan; metode ini disebut FISH (fluorescence in situ hybridization). Regio yang berhubungan dengan DNA yang telah diklon akan bersinar di bawah iluminasi fluoresens kecuali regio tersebut telah dihapuskan dari salah satu kromosom. Beberapa sindrom mikrodelesi telah ditemukan dengan teknik FISH, misalnya Sindrom Prader-WIlli. 16 Teknologi Microarray Chip Metode ini mendeteksi ekspresi gen, menguji ribuan gen secara simultan. DNA klon komplementer dihibridisasi dengan DNA komplementer berlabel yang disiapkan dari jaringan. Jika jaringan tersebut mengekspresikan sebuah gen, sinyal berlabel dapat dengan mudah diamati. Produksi kepingan gen spesifik memunginkan teknik ini untuk mencari mutasi dan polimorfisme. Microarray gene chip adalah serangkaian display fisik dari DNA yang dapat secara simultan mengidentifikasi ribuan produk mRNA unik pada sampel heterogen. Proses yang sangat otomatis ini dapat menunjukkan perbedaan ekspresi gen sebagai respon dari berbagai stimulus atau kondisi. Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR adalalah teknik amplifikasi (relatif cepat) fragmen kecil atau area dari DNA menjadi cukup besar untuk dapat dianalisis dengan metode elektroforesis dan blotting. Teknik ini menghasilkan sejumlah besar kopian rangkaian DNA spesifik tanpa harus melakukan kloning. Rangkaian DNA yang akan diamplifikasi harus diketahui. Marker spesifik (sekuens pendek yang disintesis dari DNA yang berkoresponden dengan tiap ujung rangkaian yang akan diamati) dipilih dan akan delineate regio DNA yang akan diamplifikasi. Rangkaian ini disebut “primer”. Sampel DNA, primer, dan sisa nukleotida tunggal bebasnya diinkubasi dengan DNA polimerase. Tahap pertama termasuk pemisahan DNA ke strand-strand tunggalnya melalui denaturasi dengan panas (92 C); lalu temperatur diturunan (40 C), menyebabkan primer menempel ke regio komplementernya pada DNA. Temperatur lalu dinaikan menjdi 62 C, dan DNA polimerase kemudia mensintesis strand baru yang diawali dan diakhiri di primer, membentuk DNA double-strand baru. Mengulangi siklus tersebut berulang kali (dengan mengganti-ganti temperature reaksi) akan mengamplifikasi jumlah DNA yang tersedia untuk diamati (lebih dari 1 juta kali); peningkatannya terjadi secara eksponensial. Sehingga, DNA dapat dianalisis dari satu sel saja, dan gen dapat divisualisasikan melalui blotting tanpa probe berlabel. Karena proses ini memerlukan pemanasan dan pendinginan bergantian, DNA polimerase yang resisten panas adalah suatu keuntungan. Masalah ini terpecahkan dengan penemuan DNA polimerase (Taq polimerase) pada mikroorganisme (Thermus aquaticus) yang termofil (mikroba air panas) dan ditemukan pada mata air panas 17 Mushroom Pool di Taman Nasional Yellowstone. Polimerase temperatur-tinggi ini memungkinkan otomatisasi proses di atas. Teknik PCR telah memungkinkan dilakukannya studi terhadap jumlah DNA yang sangat kecil dari jaringan atau cairan tubuh apapun. Sindrom Down dapat didiagnosis dari beberapa sel fetal yang diambil dari darah ibu. Hal yang khususnya menakjubkan adalah amplifikasi sejumlah kecil DNA terdegradasi dari spesies yang telah punah dan jarang yang diawetkan di museum. DNA dari fosil telah berhasil diamplifikasi dan dirangkai (misalnya dari tanaman magnolia berusia 18 juta tahun). Metode ini juga memungkinkan indentifikasi gen melalui ekspresi mRNA nya. RNA adalah template untuk amplifikasi dengan awalnya mengubahnya menjadi DNA komplementer. PCR digunakan untuk mendeteksi mikroba, menyediakan hasil dalam jangka waktu jam, bahkan pada keberadaan obat-obatan antimikroba. Metode ini bisa mendeteksi bakteri yang tidak bisa diisolasi melalui teknik kultur. Kloning DNA Kloning berarti mengisolasi gen dan mengkopinya. DNA library adalah kumpulan molekul DNA yang didapatkan dari metode cloning. DNA library komplementer adalah counterpart (lawan) DNA dari mRNA yang diisolasi dari sel atau jaringan tertentu. DNA komplementer telah diproduksi untuk lebih dari 70% gen manusia dan tikus. Dimulai dengan mRNA, pencarian gen yang diinginkan dapat difokuskan (alih-alih mencari di semluruh genom). Library semacam itu dibuat dengan menggunakan reverse transcriptase. Molekul DNA lalu dapat dimasukkan ke vektor yang sesuai (dijelaskan di bawah ini) dan replika molekul akan dapat diproduksi. Menggunakan probe, dapat dipilih DNA komplementer yang sesuai dengan gen yang diinginkan (ingat bahwa DNA komplementer hanya mengandung exon). Kloning DNA adalah produksi banyak kopian identik dari fragmen DNA spesifik. Kloning juga dapat dilakukan menggunakan PCR. Seperti yang disebutkan di atas, kloning DNA komplementer berfokus pada counterpart DNA dari mRNA; cloning DNA genom, menggunakan restriction endonuclease, mengkopi DNA pada gen. Kloning juga dapat digunakan untuk membuat kopian multipel dari probe atau fragmen DNA yang tidak diketahui. Jika rangkaian asam amino tidak diketahui, prosesnya dapat dilakukan secara berkebalikan. Setelah produk protein spesifik diketahui, dapat diproduksi antibodi terhadap 18 protein tersebut. Saat DNA komplementer dimasukkan ke vektor tertentu, produksi protein dapat diidentifikasi menggunakan antibodi; sehingga fragmen DNA akan dapat diisolaso. Vektor adalah suatu entitas dimana DNA asing dapat dimasukkan. Vektor dan DNA asing dimasukkan ke sel host; sel host memproduksi baik vektor maupun DNA asing. Vektor pertama adalah plasmid bakteri, suatu molekul DNA sirkuler (minikromosom) yang terdapat di sitoplasma bersama dengan DNA kromosomal bakteri. Perlu diperhatikan bahwa plasmid membawa gen yang mengkode resistensi terhadap antibiotic. Hal ini memungkinkan sel bakteri yang mengandung plasmid untuk dipilih oleh treatment antibiotikyang tepat. Vektor plasmid juga telah dikembangkan sehingga memungkinkan pemilihan melalui warna. Berbagai strain bakteri telah dikembangkan, masing-masing untuk kegunaan spesifik. Disrupsi DNA plasmid dengan enzim restriksi, diikuti inkorporasi DNA asing dengan DNA ligase, memproduksi molekul DNA plasmid (DNA rekombinan yang mengandung DNA asing) yang dapat direplikasi. Vektor plasmid dapat memasukkan fragmen DNA asing hingga seukuran 10 kb. Pencernaan fragmen DNA dengan enzim restriksi melepaskan fragmen DNA yang diinginkan, yang lalu dapat dipulihkan kembali melalui elektroforesis. Vektor yang lain adalah bakteriofag (atau phage), yaitu virus yang menginfeksi dan bereplikasi dalam bakteri. Bakteriofag dapat menggabungkan DNA yang lebih besar, hingga 20 kb. Kloning DNA dengan vektor bakteriofag memiliki dasar yang sama dengan vektor plasmid. Fragmen yang lebih besar dari DNA asing dikloning menggunakan vektor kosmid, yang secara artificial memproduksi kombinasi phage dan vektor plasmid. Fragmen yang sangat besar, hingga 1000 kb, dapat diklon menggunakan kromosom artificial yeast. Metode ini dapat digunakan pada gen utuh. Langkah-langkah dasar kloning 1. Memilih sumber DNA: baik DNA genomik ataupun DNA komplementer. 2. Membuat fragmen DNA menggunakan restriction endonuclease. 3. Memasukkan fragmen ke dalam vektor. 4. Memperkenalkan vektor ke bakteri. 5. Mengumpulkan DNA klon untuk membuat library. 6. Mengecek library untuk menemukan rangkaian yang diinginkan. Metode yang bisa dilakukan termasuk penggunaan probe nukleotida komplementer untuk fragmen yang 19 menghibridisasi, deteksi protein spesifik yang diproduksi menggunakan antibodi terhadap protein tersebut, atau dengan memeriksa fungsi protein. Model Binatang Knockout Model binatang untuk fungsi gen menggunakan metode “knocking out” (mengeluarkan) gen tertentu. Pada demonstrasi yang berteusterang namun penting, dapat ditentukan apakah suatu gen dan proteinnya penting bagi kehidupan, atau bagi suatu fungsi (misalnya kehamilan). 5. Identifikasi Gen Untuk mengklon seluruh gen yang produk proteinnya diketahui, dibuat suatu library DNA komplementer. Fragmen DNA spesifik diidentifikasi dengan menghubungkannya pada protein. Saat telah teridentifikasi, seluruh gen dapat dipilah menggunakan DNA komplementer tersebut, menunjukkan intron dan exon nya. Strategi lain adalah dengan mensintesis suatu probe oligonukleotida, mendasarkan rangkaiannya pada rangkaian asam amino yang telah diketahui pada produk protein (dari rangkaian peptidanya, rangkaian DNA yang mengkode protein tersebut dapat diprediksikan. Metode ini dapat digunakan pada potongan peptide yang relatif kecil. Semakin banyak gen yang diklon, frekuensi kodon untuk asam amino tertentu dapat diketahui. DNA komplementer dapat diklon tanpa membuat library dengan menggunakan PCR untuk mengamplifikasi DNA komplementer yang dibuat dari mRNA oleh reverse transcriptase. Rangkaian genom yang saling tumpang tindih dapat diklon, menggunakan sepotong DNA dari masing-masing produknya, untuk menyusuri suatu kromosom secara sistematik untuk mencari suatu gen; ini disebut chromosome walking. Seluruh proses sequencing (pencarian rangkaian) dapat dilakukan oleh komputer, bahkan pencarian open reading frames juga bisa dilakukan oleh komputer. Begitu rangkaian fragmen DNA telah teridentifikasi, komputer dapat menggunakan database DNA dan protein untuk memprediksi rangkaian, recognition site, translasi protein, dan homologi dengn rangkaian-rangkaian yang telah diketahui. Ilmuwan kemudian dapat memilih ukuran fragmen restriksi untuk kloning. Begitu suatu gen telah dianalisis, gen tersebut harus dibandingkan dengan gen pada disease state. Jika mutasinya berukuran besar, maka dapat dideteksi dengan Southern blotting. Gangguan minor membutuhkan 20 perbandingan rangkaian DNA, yang dapat dilakukan menggunakan amplifikasi rantai polimerase untuk memproduksi rangkaian gen spesifik dalam jumlah yang bisa diamati. Suatu gen yang produk proteinnya tidak diketahui dapat dilokalisir menjadi suatu kromosom spesifik dengan studi yang melibatkan penyusunan kembali kromosom dan analisis linkage. Penyakit-penyakit spesifik berhubungan dengan perubahan karyotipe. Sehingga, kromosom spesifik dapat ditargetkan untuk lokalisasi gen. Analisis linkage memanfaatkan polimorfisme ukuran panjang fragmen restriksi. Polimorfisme DNA Southern blotting mengungkapkan pola spesifik dari band yang merefleksikan variasi panjang fragmen DNA yang diproduksi oleh aksi enzim restriksi. Suatu situs spesifik dapat menunjukkan mutasi dengan adanya pola yang berbeda (panjang fragmen DNA yang berbeda pada Southern blotting dikarenakan perbedaan rangkaian). Perbedaan-perbedaan dalam rangkaian DNA ini disebut polimorfisme panjang fragmen restriksi (polimorfisme nukleotida-tunggal), atau secara sederhana disebut polimorfisme, biasanya merupakan variasi yang benign. Berikut ini merupakan variasi yang umum; genom manusia memiliki sekitar 10 juta polimorfisme, dan lebih dari 3 juta telah teridentifikasi. Suatu polimorfisme bisa bentindak sebagai marker genetik untuk gen yang penting secara medis. Polimorfisme diatur oleh Hukum Pewarisan Sifat Mendel, dan bila kebetulan polimorfisme teridentifikasi pada pasien dengan penyakit tertentu, transmisi penyakit tiu dapat dipelajari. Polimorfisme, yang berhubungan dengan penyakit secara kebetulan, dapat digunakan untuk mempelajari penurunan penyakit tersebut jika gennya tidak diketahui. Polimorfisme bertindak seperti bendera yang menandari area spesifik pada kromosom. Metode studi ini membutuhkan DNA dari minimal 1 individu yang terkena dan sejumlah DNA anggota keluarganya untuk melacak adanya polimorfisme, baik dengan Southern blotting (untuk rangkaian yang panjang) atau dengan PCR (terbaik untuk rangkaian pendek). Korelasi marker genetik (polimorfisme) dan fenotip juga melibatkan haplotype (mirip dengan polimorfisme namun rangkaian nukleotidanya lebih panjang, bahkan kumpulan beberapa polimorfisme). Minisatelit adalah bentuk dari polimorfisme. Gen berkumpul di area acak di sepanjang kromosom yang dipisahkan oleh rangkaian panjang DNA non-pengkode. Minisatelit adalah area non-pengkode dari DNA yang berulang dalam jumlah yang bervariasi, jumlah yang bervariasi tersebut disebut tandem repeat sequence (rangkaian 21 tandem berulang), terdistribusi di sepanjang kromosom manusia. Area-area tersebut dapat diikuti oleh probe DNA, menyediakan suatu fingerprint bagi individu spesifik. Keunikan ini diaplikasikan pada kedokteran forensik. Mikrosatelit, seperti namanya, lebih kecil daripada minisatelit. Biasanya mikrosatelit mengandung repetisi dari hanya 2 nukleotida. Polimorfisme DNA saat ini berjumlah ribuan dan memungkinkan pemetaan genetik dengan presisi yang bagus. Proyek Genom Manusia Seluruh gen manusia secara kolektif disebut genom. Dimulai pada 1990, tujuan dari Proyek Genom Manusia Internasional adalah untuk merangkai 3,2 milyar pasangan basa dari genom manusia, suatu tujuan yang tercapai dalam bentuk draft pada 2001 dan mencapai 99% rangkaian yang sebenarnya pada 2003, lebih dari dua tahun lebih awal dari yangh dijadwalkan, 50 tahun setelah publikasi Watson dan Crick. Jumah gen (30.00035.000) lebih sedikit dari perkiraan sebelumnya. Kurang dari 2% dari genom manusia mengkode protein; sehingga, sisanya adalah sumber yang kaya bagi sejarawan evolusi dan merupakan target untuk memicu perubahan genetik. Jumlah gen pada kromosom spesifik bervariasi; kromosom yang dipengaruhi oleh trisomi, kromosom 13,18,dan 21, memiliki jumlah gen paling sedikit. Rangkaian DNA pada genom manusia dapat di download di: www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human Peta garis keturunan genetik dapat bertindak sebagai dasar untuk menemukan lokasi penyakit dan untuk mengintegrasi sequencing genetik dengan fungsi biologis. Tidak lama lagi, kita akan memiliki CD personal yang berisi blueprint genetik lengkap milik kita sendiri. Departemen Energi AS menjalankan suatu website yang menyediakan informasi dasar dan link ke situs lain menyangkur proyek genom manusia: http://www.ornl.gov Lokasi kromosomal dari gen yang bertanggungjawab terhadap produksi hormon telah dipetakan. Dari rangkaian DNA klon, rangkaian asam amino dapat diprediksi. Tiap produk protein dari suatu gen mewakili diagnosis potensial atau target terapeutik. Dan tentu saja, kelainan yang diturunkan akan menjadi subyek karakterisasi, dan akhirnya terapi gen. Bagaimanapun, bahkan setelah suatu gen telah teridentifikasi dan terpetakan secara genetik, karakterisasi penuhnya masih sulit dan memakan banyak waktu. 22 Pemahaman penuh tentang kelainan yang melibatkan interaksi dari berbagai gen akan menjadi lebih rumit. Namun, kemajuan molekuler tidak dapat dihindari. Di masa depan, kedokteran preventif akan berupa prediksi. Dengan mengetahui konstitusi genetik seseorang, screening yang tepat dan intensif dapat diarahkan ke kondisi predisposisi. Pengetahuan semacam ini juga akan membutuhkan pertimbangan sosial dan politik. Bayangan tentang penghindaran pernikahan dan kehamilan karena perpaduan predisposisi genetik yang buruk tidaklah jauh. Masyarakat telah mengembangkan panduan mengenai penggunaan informasi ini: oleh individu, oleh para pekerja, oleh organisasi kesehatan, dan oleh pemerintah. Kemajuan ilmu harus sejalan dengan pendidikan publik dan professional agar pengetahuan ini dapat diterima dengan baik. Genomik dan Proteomik Genomik mengacu pada seluruh proses yang terlibat pada Proyek Genom Manusia, deskripsi lengkap dari rangkaian genetik, dan lebih jauh lagi mengindikasikan studi ekspresi gen, terutama menggunakan teknik microarray dengan kepingan gen. Bagaimanapun, genomik tidak akan mengungkapkan keseluruhan cerita. Produk protein dari ekspresi gen terganggu pada proses translasi dan juga karena modifikasi posttranslasional seperti glikosilasi, metilasi, dan fosforilasi. Oleh karena itu, cerita lengkapnya membutuhkan proteomik, suatu studi tentang produk akhir yang fungsional secara biologis, yaitu protein sel atau jaringan. Baik genomik maupun proteomik dibutuhkan untuk memahami fisiologi, diagnosis penyakit, dan untuk mendesain obat baru. Identifikasi protein membutuhkan pemisahan protein dengan elektroforesis, pencernaan protein besar menjadi protein yang lebih kecil, pengukuran kandungan asam amino dengan spektrofotometri massa, dan identifikasi spesifik dari protein melalui perbandingan dengan database komputer. Setelah itu, baru profil massa protein dari sel normal dan abnormal dapat dibandingkan. 6. Aplikasi Klinis Tantangan dalam kedokteran modern adalah untuk membuat pemahaman klinis tentang koleksi data yang sangat banyak dari proyek genom. Pemahaman tentang fungsi 23 gen dan protein tidak diragukan lagi akan menjadi sesuatu yang mempercepat kemajuan manusia. Diagnosis molekuler dari kelainan genetik hanya membutuhkan sedikit sampel DNA yang didapatkan dari sel apapun yang berinti, misalnya sel darah putih atau sel epitel. PCR yang dilakukan dengan mesin otomatis memungkinkan diagnosis DNA yang cepat dengan menggunakan materi yang diamplifikasi dari satu sel tunggal. Hal ini adalah keuntungan yang penting dalam analisis genetik prenatal dan dalam penentuan jenis kelamin dan diagnosis preimplantasi. PCR memungkinkan diagnosis DNA dari sel tunggal yang diambil dari embrio yang difertilisasi in vitro. Diagnosis molekuler dibatasi oleh prevalensi perubahan genetik heterogen. Dengan kata lain, banyak kelainan melibatkan mutasi yang berbeda pada orang yang berbeda. Sebaliknya beberapa kelainan (misalnya penyakit sel sabit) selalu melibatkan perubahan yang sama. Pada fibrosis sistik, 70% pasien (dari keturunan Eropa Utara) memiliki delesi 3 basa yang sama, sedangkan 30% sisanya memiliki mutasi yang sangat heterogen. Lebih jauh lagi, diagnosis molekuler ditantang oleh kebutuhan untuk bukan sekedar untuk menemukan perubahan kecil pada gen, namun juga untuk membedakan perubahan penting dengan variasi yang benign (polimorfisme). Metode berdasar-PCR yang cerdas telah dikembangkan untuk screening cepat dan deteksi dari mutasi. Signifikansi dari mutasi yang terdeteksi membutuhkan segregasi mutasi dengan penyakit yang telah diidentifikasi dalam keluarga. Setidaknya satu tipe defisiensi growth hormone diwariskan dalam pola autosom resesif. Kloning DNA growth hormone yang besifat komplementer terhadap mRNA nya memungkinkan dilakukannya lokalisasi gen groeth hormone. Gen growth hormone terletak di suatu cluster yang termasuk juga di dalamnya gen untuk human placental lactogen. Cluster gen ini memiliki unit-unit DNA yang homolog dan rentan mengalami rekombinasi, yang memicu delesi pada satu kromosom dan duplikasi pada kromosom lainnya. Mekanisme yang mirip terjadi pada produk protein lain yang diatur oleh gen-gen dalam cluster, misalnya globin. Produksi protein komersial dari gen yang diklon lalu dimasukkan ke bakteri meningkat dengan cepat. Produksi insulin (yang pertama) dan growth hormone adalah contohnya. Glikosilasi tidak terjadi pada sistem bacterial, sehingga produksi komersial dari glikoprotein rekombinan membutuhkan sel mamalia dalam prosesnya. Hal ini telah dicapai, dan saat ini gonadotropin rekombinan telah tersedia. Gen untuk gonadotropin24 releasing hormone pada lengan pendek kromosom 8 telah berhasil diisolasi dan diklon. Teknologi molekuler penting untuk karakterisasi inhibin, hormon folikular ovarium yang menghambat sekresi FSH. Gen inhibin telah sequenced dan ditemukan bahwa gen tersebut homolog dengan gen untuk hormon antimullerian. Subunit alfa yang umumnya terdapat di gonadotropin, TSH, dan hCG telah dilacak hingga ke gen yang telah diisolasi, sequenced, dan dilokalisir pada kromosom 6. Insersi gen asing ke dalam embrio menghasilkan hewan transgenik. Gen asing yang dimasukkan akan terdapat di berbagai jaringan, dan bila hewan tersebut fertil maka akan diturunkan. Ada banyak aplikasi untuk hewan transgenik. Hewan transgenik menyediakan model binatang untuk penyakit keturunan dan tumor ganas serta menyediakan sarana untuk melakukan eksperimen terapi gen. Perpindahan gen baru atau gen yang terganggu adalah metode penting untuk mempelajari fungsi gen. Tanaman transgenik bahkan dapat dikembangkan untuk dapat memproduksi obat baru, dan pengenalan gen yang resisten serangga mungkin akan menyelesaikan permasalahan kontminasi insektisida. Genom manusia memiliki banyak gen yang berpotensi menyebabkan kanker. Gen lain memiliki kemampuan untuk memblok keganasan. Kanker adalah penyakit genetik dimana tumor dapat dikatakan klonal; semua selnya terkait secara genetik. Onkogen, yang ditemukan pada virus-virus tumor, adalah gen yang mengubah pertumbuhan sel menjadi abnormal dengan mengkode protein yang terlibat dalam transduksi sinyal, terutama transmisi pesan-pesan pengatur pertumbuhan. Ada banyak onkogen dan berbagai jalur aksi, semuanya menyebabkan suatu kondisi proliferative. Mutasi yang mengaktivasi gen-gen tersebut memicu aktivitas protein yang independen terhadap sinyal atau memicu aktivitas pada tempat dan waktu yang salah. Yang perlu digarisbawahi adalah pemicuan pertumbuhan persisten (oleh onkogen yang terganggu). Pada sel normal juga terdapat antionkogen, gen supresi pertumbuhan yang harus diinaktivasi sebelum tumor bisa tumbuh. Kerentanan turunan terhadap kanker juga disebabkan oleh mutasi pada gen supresor tumor. Meskipun aktivasi onkogen adalah efek dominan, mutasi supresor tumor adalah resesif serta dapat dibawa dan ditransmisikan, namun tidak aktif selama berpasangan dengan antionkogen normal. Oleh karena itu, kanker adalah penyakit genetik, namun regulasi pertumbuhan normal melibatkan suatu sistem kompleks yang membutuhkan waktu yang lama untuk overcome. Selama periode tersebut, teknologi DNA rekombinan mungkin telah dapat 25 mencapai diagnosis yang cukup awal untuk dapat disembuhkan. Pengetahuan tentang onkogen spesifik yang terlibat dalam tumor tertentu juga menawarkan kemungkinankemungkinan terapeutik. Misalnya, suatu antimetabolit dapat menempel ke antibodi untuk suatu onkogen dan menargetkan sel-sel kanker. Biologi molekuler mengubah baik diagnosis maupun terapi. DNA virus dan bakteri dapat diidentifikasi. Proses PCR otomatis dapat memproduksi pola elektroforetik yang dapat dibaca secara otomatis. Dengan teknik ini, molekul tunggal dari DNA human papillomavirus dapat dideteksi di antara 10.000 atau lebih sel manusia. Saat ini beberapa ratus tes genetik telah digunakan di klinik. Kesalahan produksi protein endogen dapat dibenahi dengan cara menggantikan mekanisme yang bermasalah. Ada 2 strategi: pengenalan sel asing yang memproduksi protein yang hilang, atau penggantian gen yang cacat (atau lebih tepatnya penambahan DNA komplementer yang telah dibenahi). Sehingga, kelainan gen-tunggal resesif secara potensial amenable to terapi gen, begitu juga dengan penyakit seperti kanker dan infeksi. Terapi gen secara luas didefinisikan sebagai penggunaan mesin seluler pasien sendiri untuk memproduksi agen terapeutik. Suatu gen yang diantarkan ke sel dapat menggantikan gen yang defektif atau hilang atau dapat juga memproduksi protein dengan efek yang diinginkan. Bagaimanapun, bidang ini masih sangatlah baru. Panduan spesifik untuk terapi gen yang telah dikembangkan membutuhkan beberapa tinjauan. Salah satu kelas terapi manusia adalah penggunaan vektor retroviral untuk mentransfer gen marker ke sel manusia yang telah dikultur yang kemudian akan dikembalikan lagi ke pasien. Misalnya, hal ini akan memungkinkan pelacakan limfosit yang menginfiltrasi tumor, hepatosit donor, atau killer T cell yang spesifik untuk HIV. Gen-gen tersebut juga dapat diciptakan untuk menyediakan suatu fungsi pada pasien dengan kelainan turunan gen-tunggal. Kelas lain dari terapi melibatkan transfer dari gen yang mengkode faktor-faktor yang menghancurkan sel tumor, misalnya tumor necrosis factor atau interleukin. Vektor retroviral adalah virus yang telah dibuat sedemikian rupa sehingga tidak akan ada protein viral yang dapat dibuat oleh sel yang terinfeksi vektor tersebut. Sehingga, replikasi dan penyebaran virus dapat dicegah, namun transfer gen ke sel yang sedang bereplikasi bisa tetap terjadi. Metode transfer lain yang sedang dikembangkan termasuk penggunaan vektor adenovirus dan DNA plasmid. 6. Referensi 26 7. Sumber-sumber Online 27
