DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli - ANSN

,.
Risafah Pertemuan
Ilmiah P~elilian
dan Pengembangan
Teknologi
ISOlop dan RadiaSl; 2(XJ()
DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli ENTEROHEMORAGIK
(EHEK) DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Dadang Sudrnjat, Maria Lina R, dan F. Suhadi
I
~.~
Teknol~otop danRadiasi,
BATAN,Jakarta
ABSTRAK
DETEKSI CEPAT BAKTERI &cherichia coli ENTEROHEMORAGIK (EHEK) DENGAN
.METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION). Telah dilakukan uji Reaksi polimerisasi berantai
(PCR) untuk mendeteksiadanyabakteri Escherichiacoli enterohemoragikOI57:H7. DNA dari sel bakteri
dengan metode CTAB-fenol-kloroform clan diendapkandenganisopropanol.Untuk menguji sensitivitas dari
reaksi amplifikasi PCR, dibuat seri pengencerandari larutan DNA E.coli O157:H7 antara I ~ -I
pg/~I.
Pasanganoligonukleotida primer yang digunakanuntuk reaksi amplifikasi adalahshiga like toxin 1-forward
(SLTI-F) & shiga like toxin 1- reverse (SLTI-R) yang diperolehdari gen Shiga-Like-Toxin.Hasil penelitian
menunjukkanbahwaDNA E.coli padakonsentrasi1ng/~1masihbisa dideteksimenggunakanprimer SLn-F &
SLn -R denganfragmenDNA padaposisi 140bp.
ABSTRACT
RAPill DETECTION OF &cherichia coli ENTEROHEMORRAGIC (EHEC) BACTERIA BY
PCR (POLYMERASE L'HAIN RE4CTION) METHODs. A PolymeraseChain Reaction(PCR) assays for
detect presenceof enterohemmoragicEscherichiacoli O157:H7 was calTiedout. DNA was extmcted from
bacterial cells \\ith CTAB-phenol-chlorotonnand precipitated \\ith isopropallol.To test sensitivity of PCR
amplified reaction,serialdilutions of E.coli DNA solutionwere preparedbetween I Ilg-l ngllll. A single pair
oligonucleotide primer SLll-F & SLn-R derived from Shiga-like-Toxin genes was used in amplification
method.The results shows that I ngllll of E.coli DNA could be detectedusing the primers SLll-F & SLTI-R
with the position of 140 bp DNA fragment.
PENDAHULUAN
Escherichia coli enterohemoragik (EHEK) adalah
salah satu bakteri usus patogen yang dapat menyebabkan
diare hemoragik colitis (HC), hemolitic-uremic syndrome
(HUS) (1). Menurut Meng daD Doyle (2), EHEK
0157:H7 menyebabkan diare berdarall dan HUS.
Mengingat masih rendahnya tingkat sanitasi
lingkungan di negara berkembang, penyakit diare yang
disebabkan oleh bakteri E.coli patogen menjadi masalah
penting apabila terjadi wabah. Makanan yang
terkontaminasi
bakteri E.coli
khususnya EHEK
menyebabkan diare yang disertai pendaraltan, karena
toksin SL T (Shiga like toxin) yang dihasilkannya.
Penyakit ini biasanya dikaitkan dengan daging sapi daD
susu yang terkontaminasi. Infeksi ini dapat dicegah
dengan mengidentifikasi sumbernya antara lain nlakanan
yang terkontaminasi (2).
Selama ini ada beberapa metode konvensional
yang digunakan untuk menentukan adanya E.coli 0157:7
enterohemoragik dari sampel lnakanan antara lain
metode biakan (kultur), uji biokimiawi, daD uji serologis
(2). Cara-cara tersebut mempunyai kelelnahan dan
keterbatasan, selain memerlukan waktu lama juga tidak
spesifik. Cara biakan yaitu dengan mengisolasi bakteri
dalam media selektif seperti yang dikembangkan oleh
Doyle daD Schoeni (3). Metode ini tidak sensitif kerena
sampel harus mengandung !03 -104 sel/graln, selain itu
juga memerlukan waktu lama dan lnahal karena harus
dilakukan uji tallap selanjutnya meliputi uji biokilnia,
serologis, daD verotoksisitas. Metode serologis dengan
teknik ELISA sangat cepat dan sensitif serta praktis
penggunaanyadalam klinik. Cara ini didasarkanpada
reaksi antara antibodi monoklonal spesifik E. coli
dengan antigen E.coli O157:H7 (4). Dengan cara ini
dapat dideteksi 1,5 seUgram.Kelemahan cara ELISA
adalahkurangspesifikkarenaakanterjadi reaksisilang
dengan antibodi dari bakteri lain sepeti E.hermanii.
Brucella sp dan beberapabakteri enterik lainnya. Untuk
itu perlu dikembangkancara deteksi yang cepat dan
sensitif antara lain dengan teknik PCR (Polymerase
Chain Reaction) berlabel isotop32p.Metode PCR dapat
mendeteksisecaratepat genyang menyanditoksin SLT
(.S'higa-Like-Toxin)
dari bakteri E.coli O157:H7 yang
terdapatdalammakanan,susurnaupunrasespenderita(5.
6).
Tujuanpenelitianini adalallmengembangkan
cara
deteksi bakteri E.coli patogen (EHEK) dalam sampel
makananyang terkontaminasiberdasarkanteknik diatas.
Pada tal1ap awal akan dilakukan ekstrnksi DNA dari
beberapa isolat E.coli enterohemoragik. DNA basil
isolasi diencerkan pada beberapa konsentrasi dan
selanjutnyadilakukan proses amplifikasi DNA dengan
PCRmenggunakan
oligonukleotidaprimer yang spesifik.
Deteksibasil amplifikasi dilakukandenganelektroforesis
gel agarose.
BAHAN DAN METODE
Bahan. Isolat bakteriE.co/i EHEK yang digunakan
dalam penelitian ini adalah strain E.coli OI57:H7 basil
75
Risalah Pertemuan
Ilmiah Pene!J1ian dan Pengembangan
r eknologi
IsOIOp dan Radiasi, l{xx}
isolasi dari daging ayam yaitu isolat dengan no kode 719,
741, 743, 745, HCW, dan HC1-lyang diperolch dari
Balitvet, Bogor. Sebagai pembanding digunakan strain
standar E. coli 0157:H7 Adelaidc. Isolat-isolat tcrscbut
ditwnbullkan dalmn media Mac.Coltkey Agar (DIFCO).
Untuk keperluan isolasi DNA, bakteri ditwnbultkan
dalam media Luria-Bertani (LB) dan diinkubasi pacta
suhu 37° C selmna 211ari.
lsolasi DNA.
Isolasi DNA bakteri E.coli
O:157:H7 dilakukan dengan menggunakan metode
Ausubel (6). Kultur bakteri yang telah tumbuh dalam
media LB selama 2 hari , diambil sebanyak 15 mi. Pallen
sel dilakukan dengan cara sentrifugasi pacta 7000 rpm
selama 10 menit. Pelet sel disuspensikan dalmn 5,6 ml
larut:w bufer 0,0 I M Tris -EDT A pH 8 (TE), tambahkan
larutanlO% sodium dodec;:vlsulfate (SDS) scbanyak 300
f.l.1,clan 30 f.l.llarutan proteinase K (20 mg/ml). Campuran
diinkubasi selama 1 jam pada SullU37°C dalam inkubator
goyang. Tamballkall I mllarutan NaCI 5 M kocok secara
sempuma. Kemudian ditambal1kaIl 800 I1llarutan CT AB,
selanjutnya campuran diinkubasi selama 20 menit pada
suhu 65°C.
Ekstraksi
DNA
dilakukan
dengan
menambahkan volume
SalTh1 larutan kloroform/
isoamilalkohol (24: I). C1mpuran disentrifugasi selama
10 mcnit pacta 10.000 rpm smnpai terbentuk 2 rase.
Pindahkan rase air kedalmll tabung barn kemudian
tmllbaltkan volwne sarna larutan fenol/klorofonn/isoal1ul alkohol dan disentrifugasi kcmbali selama 15 menit
pacta 10.000 rpm. Fase atas yang terbcntuk dipindaltkan
dalam tabung barn kemudian ditmnbal1kc1ll0,6 VOIWllC
larutan isopropanol dingin Imtuk mengendapkan DNA.
Endapan DNA dipisal1kaIl dengml cara sentrifugasi pacta
12.000 rpm selalna 15 menit, kemudian dicuci dengan
larutan 70% etllc1llo1 dingin. Pelet DNA murni
dikeringkan dalmll desikator vakwn untuk selanjutnya
dilarutkan dalmll larutan bufer TE. Konsentrasi DNA
diukur dengan alat spektrofotometer pacta panjang
gelombang 260 Oln daD 280 Oln. Konsentrasi DNA hasil
isolasi kemudian dibuat pengenceran dengan larutan TE
sampc1i I pg/ml untltk pcngujian amplifikasi DNA.
Ampliflkasi DNA. Amplifikasi DNA dengan
teknik PCR dari E.coli EHEK menggunakml metode
Garmon et at. (7). Rcaksi PCR dikerjakc1ll dcngan total
volwne campuran yang mengandung 2 ug DNA target
(10 111);10 InM tris-HCI (pH 8,3); 50 InM KCI; 2 InM
MgCI2, lnasing-masing 0,2 111MdATP, dCfP, dGTP,
dTTP., daD 2,5 Unit cnzim Taq DNA polimerase (Perkin
Elmer Cetus). Primer yang digunakan adalah pasangan
oligonukleotida SLTI-F (5'-ACACTGGATGATCfCAGTGG-3') clan SLTI-R (5'CTGAATCCCCCTCCATTATG-3') yang diperoleh daTi sekucns spesifik EHEK
sebanyak 2 InM. Pennukaan campuran reaksi dilapisi
dengan mineral oil. Reaksi PCR dilakukan dengan alat
DNA Themlal Cycler (Perkin Elmer) menggunakan 40
siklus, yang tiap siklus terdiri dari : (I) Dcnaturasi pada
suhu 94°C selarna I OlCnit, (2) Annealing pacta suhu 60°C
selama I menit, (3) Extension pada SullU72°C sclalna 2
menit. Sesudall amplifikasi campuran disentrifugasi
12.0000 rpm.
Analisis Amplifikasi DNA.
Hasil mnplifikasi
DNA
E.coli
EHEK
dianalisis
mcnggunakan
elektroforesis gel agarose. Lempeng gel agarose dibuat
76
dengan menggunakan 1% (b/v) agarose yang dilarutkan
dengan larutan biller 0,09 M Tris-Borate-0,2mM EDT A
(TBE). Sejumlah 20 ~l larutan DNA dimasukkan
kedalam sumuran yang terdapat dalam lempeng agarose.
Sebagai gel loading bufer dipakai larutan yang terdiri
daTi 50% gliserol daD 0.025% brornfenolblue. Marker
DNA yang digunakan adalall 4> 174 Hae III (BRL).
Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan tegangan
listrik 100 volt selama 60 memt. Selanjutnya lempeng
agar diwamai dengan ethidium bromide. Pengambilan
gambar dilakukan dengan kamera Polaroid MP-4,
dibawah
penyinaran
sinar
ultraviolet
diatas
Transilluminator.
BASIL DAN PEMBAHASAN
Konsentrasi DNA E.coli EHEK basil isolasi dari
7 isolat dapat di1ibat pactaTabel 1.
Hasil rata-rata dari 3 kali percobaan isolasi DNA,
mempunyai konsentrasi berkisar antara 577,00 ~glml 1039,5 ~glInl denganrasio A26o/A28o = 1,76 -1,83.
Nilai perbandingan basil pembacaan pactapanjang
gelombang A2rd A28o adalah untuk mengetahui tingkat
kemurnian DNA. Menurut Maniatis (9) nilai rasio yang
paling baik antara 1,8 -2,0.
Secara umum tingkat
kemurnian DNA E. coli EHEK
basil isolasi dalarn
penelitian ini cukup baik. Hasil ini juga sesuai dari
gambaran pola elektrogran1 genornik DNA E.coli
EHEK pacta basil analisis dengan elektroforesis gel
agarose yang memperlibatkan 1 pita DNA (Gambar 1).
Pacta percobaan deteksi DNA E.coli EHEK
dengan reaksi PCR digunakan konsentrasi DNA dari
Imsil pengenceran sebesar 10 ngl~
dengan bantuan
pasangan primer SLTI-F dan SLTI-R, menunjukkan
reaksi positif untuk semua isolat yang diuji yaitu isolat
719, 741, 743, 745, HCW 157 , HCI, dan strain 0
157:H7 Adelaide dengan produk amplifIkasi terletak
pacta posisi 140 bp pacta lempeng elektroforesis gel
agarose (Gambar 2). Pita DNA produk PCR pacta isolat
719 kurang terlibat nyata, sedangkan padac isolat 741,
745, dan strain O157:H7 Adelaide pita DNA terlilmt
jelas. Hasil amplifikasi DNA E.coli EHEK dengan
konsentrasi 1 nglul dengan menggunakan pasangan
primer SLTIR dan SL TIF, masih memberikan basil
positif, untuk 6 isolat yang diuji, kecuali untuk isolat
719 sudah tidak menunjukkan adanya amplifikasi DNA
(tidak terdeteksi). Hasil percobaan yang dilakukan oleh
Garmon et at. (8) menggunakan pasangan primer yang
sarna untuk amplifikasi DNA E.coli 0157:H7 yang
diisolasi dari daging sapi menunjukkan basil positif
dengan fragmen PCR terletak pacta posisi 600 bp pacta
lempeng elektroforesis agarose. Perbedaan posisi produk
PCR dengan penelitian ini kemungkinan disebabkan
adanya perbedaan lokasi sekwens sasaran dalam gen
Shiga Toxin untuk primer SLTI.
Posisi fragmen DNA produk PCR pada penelitian
ini sesuai dengan percobaan penelitian yang dilakukan
Polard dkk (10) menggunakan primer yang diperoleh
dari gen SLTI yaitu pacta posisi 140 bp. Sensitivitas dari
percobaan tersebut adalah 20 pgl~l. Sensitivitas pada
penelitian ini lebih rendah yaitu sekitar 1 ngl~l.
9.
Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelilian
Perbedaan sensirivitas PCR ini kemungkinan juga
disebabkan oleh perbedaanbanyaknya kopi sekwens
DNA spesifik yang terdapatsecaraalami dalam DNA
isolat bakteri. Selain itu sensitivitas PCR juga
dipengarulliolehadanyakontanlinandalamprosesisolasi
DNA sampel, dan juga kondisi reaksi PCR seperti
banyaknyasiklus yang digunakan(9).
Penggunaanpasanganprimer SLTI-F dan SLTI-R
mempunyaiprospekhila digunakandalmn deteksi dini
E.coli O157:H7 enterohemoragik untllk galur lokal
(Indonesia) karena mempunyaispesifisitasyang cukup
tinggi.
KESIMPULAN
I. Amplifikasi DNA dari 7 isolat E.coli O157:H7
dengan teknik PCR, semua isolat menunjukkan reaksi
positif dengan menggunakc'lDpasangan primer SLTIF daD SL T I-R dengan produk PCR terletak pada
posisi 140 bp. Sensitifitas dari pasangan primer ini
adalah dapat mengamplifikasi DNA E.coli O157:H7
dengan konsentrasi 1 ngiul.
2. Waktu deteksi lebih cepat hila dibandingkan dengan
metode konvensional yaitu 13jam.
dan Pengembangan
Teknologi
lsalop dan Radias~ ,,(XX)
4. PADHYE, N.V., and DOYLE, M.P., Rapid
procedure for detecting enterohemomgic
E.\'cherichia coli 0157:H7 in food. Appl.
Environ.Microbiol
~ (1991)2693-2698.
5.
BRIAN, M.J., FROSOLONO,M., MURA Y, H.E.,
MIRANDA, A., LOPEZ, E.L., GOMEZ, HF.,
and
CLEARLY, T.G., Polymerase chain
reaction for diagnosis of enterohemoragic
Escherichiacoli infection and hemolytic uremic
syndrome.J. Clin. Microbio/. JQ (1992) 18011806.
6. BEGUM., STROCBINE,N.A., SOWERS,E.G., and
JACKSON., M.P., Evaluation of techniquefor
identification of shiga like toxin producing
Escherichia coli by using polymerase chain
reactionanddigoxigenin-labelIedprobes.J. Clin.
Microbiol.ll (1993)3153-3156.
7. AUSUBEL, F.M., R.BRENT, R.E. KINGSTON,
0,0. MOORE, J.G. SEOMAN, J.A., and K.
STRUHL. Current protocols in molecular
biology, p.2.4.1.-2.4.2. John Wiley & Sons,
Inc., New York (1987).
8. GANNON, P.J., KING, R.K., KIM, J.Y, and
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang
sebesar-besamya kepada Ny. Suheni Sulaeman, Ny.
Almaida, daD Sdri. Rika Heryani yang telah banyak
membantu dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
DOYLE, M.P., E.~cherichiacoli O157:H7 and its
significancein foods. Int. J. Food.Microbiol. n
(1991)289-302.
2.
MENG, J., DOYLE, M.P., ZHAO, T., and ZHAO,
S., Detection and control of Escherichia coli
0157:H7 in foods. Trend in Food .Science &
Technology:! (1994) 179-184.
GOLSTEYN THOMAS, E.J. Rapid and
sensitive method for detection of shiga-like
toxin-producingEsherichia coli in ground beef
using tIle polymerase chain reaction. Applied
and Enviromental Microbiology ~
(1992)
3809-3815.
MANIATIS, T., FRITSCH, E.F., and SAMBROOK,
J., Molecular cloning, Laboratory Manual Book,
3A, 2 nd edition.
Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989).
10. POLLARD, D.R., JOHNSON, W.M., LIOR, H.,
TYLER,
S.D., and
ROZEE, K.R..
Differentiationof shiga toxin and vero cytotoxin
type 1 genes by
polymerase chain reaction.
Journal ofInfectiousDiseases162(1990) 11951199
DOYLE, M.P., and SCHOEN!, J.L., Isolation of
Escherichia coli O157:H7 from retail fresh
meats and poultry. Appl. Environ.Microbiol. .21
(1987)2394-2396.
77
1
Risa/ah Pel1emuan //miah Penelitian dan Pengembangan Tetn%gi /sotop dan RadiaSl; 2{){)()
Tabcl
Hasil allalisis konsentrasi dan nilai kemumian .DNA isolat
E.coli EHEK O157:H7
~~
t
;~
"*
$
6
1
Kb
2Jx J:J,;()
Gambar
78
Pola elektrogram genomik DNA E.coli
EHEK
deng.m elektroforesis gel agarose.
(1). DNA Marker A Hind III, (2). Isolat 719, (3).
Isolat 741, (4) Isolat 743, (5). Isolat 745, (6) Isolat
HCW 157, (7) Isolat HCI-I, (8) Isolat Adelaide 157.
Risalah Peltemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan [elrnologi Isolop dan RadlaS/;",(XX)
M
1
2
3
..
5
M
1 6
7 8
1353,,-
1078._.
871--
.603 --
310
281~
bp 271-
234'194-140 118-
1)1'
140
M~~,¥jg~.L :
M: Marker DNA <I>17-1IJ~le ill (BRL)
1 : Koilirol negntif
2: IF:ol:JI 719
3 : .If;oll1( 7~ 1
4 : Isola! 7113
5 : 1801~11
7.15
6 : rsol~,t fJCW 1.57
7:180111IT1(:.'I-1
8 : Isol~ltAdeJ(ljde 157
79
Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelitian don Pengembangan leknologi lsotop dan RadiaSl; cfX)()
M 1 2 3
..
5
bp
GWllbw' 3. AJnl)JifiknfJi JJNJ\ igoJnt bJ1l<.tl~l'i
E. coli EI-IEK Ol~7:r17 cJl"I)~1lI1
kollsrrlll'nsi
1 ngimJ mrllggllllru<!1/1pnsmlgml pi-imer SLTI-F clan Sl:rl-lt
p~lcJ:ll;'l('kh(1r(11"('si~
gel
RgnrORe.
_Y~_r~Jg~-:
M: Mru'kcr DNA 4I17~ Tille ill (ilRL'
1 : Kollb'ol negatif
2:
Tsolnt719
3 : IAolllt 7~ I
" : If;ol:lt 743
.5 : IRolnt 74.5
6 : IRo!~lt JJ(;W 1.S7
7 : IRoiltl
..fC J -J
8 : Isolrlt Adelaide
1.'57
DISKUSI
BASRIL
SUDRADJAT ISKANDAR
Dari beberapametodeyang disebutkanterdahulu
(kultur. ELISA danPCR). manayang palingekonomis?
1. Untuk mendeteksi DNA E. coli pada konsentrasi
rendall 1 mg/ml, apakah ada cara lain yang lebih
sederhanadan murall ?
2. Kalau ada, apa perbedaan dengan yang diteliti
(metode PCR) ?
DADANG
Metode PCR yang lebih ekonomis. dibandingkan
dengan metode konvensiorull (kurslls. ELISA) k.1rerul
selain cepat. sensitip dan spesefik.
DADANG
1. Tidak ada, hanya dengan metode PCR yang dapat
mendeteksi adanya E. coli, dengan menguji DNA
yang pada konsentrnsi dibawah 1 mg.
2. Tidak ada.
80