Nama: Yasmine Nur Hasna

Nama: Yasmine Nur Hasna
Nim: 135100607111003
Kelas: K
(PCR)
1.
Apa kepanjangan dari PCR? Dan jelaskan pengertiannya!
PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain Reaction atau dalam di
Indonesia disebut reaksi berantai polimerase. PCR adalah suatu teknik atau metode
enzimatis untuk memperbanyak (replikasi) DNA secara eksponensial suatu sekuen
nukleotida tertentu secara in vitro.
Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh
untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti
DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk mendapat potongan DNA,
diperlukan Primer yang berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang akan
digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk menandai ujung
depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Karena DNA
terdiri dari 2 untai pilinan ganda (double strand), maka DNA Primer forward bekerja
pada strand yang satu sementara Primer Reverse bekerja pada untai pilinan yang satunya.
Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu Denaturation, Annealing dan Extension.
1.
Denaturation adalah proses memisahkan dua untai pilinan DNA. Pada tahap ini,
ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-masing
akan menjadi untai tunggal. Biasanya suhu Denaturing berkisar antara 92-98 derajat
celcius.
2.
Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari
pasangannya di untai-untai DNA. Jika pas, maka dia akan melekat. Suhu Annealing
biasanya berkisar antara 48-72 derajat Celcius. Suhu yang biasanya umum dipakai
adalah 50-52 derajat C.
3.
Setelah itu, mesin PCR akan kembali memanaskan 'sup DNA' lagi ke suhu 72
derajat celcius agar Taq polymerase bekerja menggandakan potongan DNA. Pertama
ia, maksudnya si Taq, membaca primer seperti layaknya pesawat terbang lari di
landasan pacu sebelum take off.
(Cara kerja PCR)
2.
Apa saja macam-macam PCR? Dan apa perbedaannya!
a.
Real-Time PCR
Real-Time PCR merupakan suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi
PCR. Teknik ini digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus
kuantifikasi (menghitung) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.
b.
Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen.
c.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction merupakan modifikasi dari PCR,
di mana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Seperti namanya, proses RT-PCR
merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada
proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi
cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase.
d.
PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat
yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Di mana dalam
sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode
ini.
e.
Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda.
3.
Jelaskan prinsip kerja Real Time PCR!
Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen.
Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam
reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau.
4.
Jelaskan prinsip kerja Reverse Transkriptase PCR!
Prinsip kerja Reverse Transcriptase PCR adalah menggunakan sepasang primer, yang
berkomplemen dengan sequens yang jelas dari masing-masing dua untai cDNA. Primer
tersebut kemudian diperpanjang dengan bantuan enzim DNA polymerase dan akan
menghasilkan sebuah untai gandaan pada setiap siklusnya dan seterusnya mengikuti
amplifikasi logaritmik.
5. Jelaskan prinsip kerja ELISA!
Prinsip kerja ELISA adalah dengan melakukan pengukuran sequen internal dalam produk
PCR untuk mendeteksi sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR. ELISA PCR
akan mendeteksi dan membedakan antarabeberapa sasaran dari sequen yang diinginkan.
(Teknik Rekayasa Genetika)
1.
Jelaskan pengertian mengenai DNA sekuensing!
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan basa
nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA,
yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung
instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA
dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah
diketahui.
Dalam melakukan sekuensi DNA diperlukan beberapa komponen, antara lain:
1.
DNA rantai tunggal
2.
Primer
3.
DNA polimerase
4.
dATP, dCTP, dTTP, dan dGTP
Secara lebih terperinci, proses DNA sekuen daapt dijelaskan sebagai berikut:
a. Persiapan
Yaitu menyiapkan salah satu untai fragmen DNA yang dibagi dalam 4 bagian,
kemudian setiap bagian diinkubasi dengan semua bahan yang diperlukan untuk sintesis
untas komplementer (primer, DNA polimerase, dan keempat deoksiribonukleotida
triphospat)
b. Sintesis untai DNA baru
Dimulai pada primer dan berlanjut hingga dideoksiribonukleotida dimasukkan yang
mencegah sintesis lebih lanjut. Dideoksiribonukleotida diselipkan begitu sering secara
random sebagai ganti ekuivalensi normalnya. Pada akhirnya dihasilkan serangkaian untai
radioaktif yang mempunyai panjang yang berbeda-beda.
c. Elektroforesis Gel
Untai DNA baru dalam setiap campuran, reaksi dipisahkan dengan cara
elektroforesis pada gel poliakrilamid yang dapat memisahkan untai-untainya, bahkan
yang hanya mempunyai perbedaan sekecil nukleotida panjangnya.
(Proses DNA sekuensing)
2.
Jelaskan pengertian hibridisasi!
Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida
yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan
suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNA–DNA, DNA–RNA, atau RNA–RNA dapat
terbentuk melalui proses ini. Hibridisasi DNA–DNA terbentuk dalam Southern blotting
sedangkan hibridisasi DNA–RNA terbentuk dalam Northern blotting.
Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu proses denaturasi atau pemisahan
dua rantai asam nukleat yang komplementer dari proses renaturasi atau perpaduan
kembali dua rantai asam nukleat. Proses denaturasi biasanya dilakukan dengan cara
pemanasan DNA untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa
sehingga rantai asam nukleat akan terpisah. Proses ini kemudian diikuti dengan proses
renaturasi dengan cara pendinginan.
(Proses hibridisasi)
3.
Jelaskan prinsip kerja southern blot!
Prinsip kerja dari metode southern blot adalah transfer molekul DNA dari gelelektroforesis ke
membran nilon atau penyaring nitroselulosa. DNA diekstraksidari jaringan (darah, tulang,
dan sebagainya), kemudian dilakukan proses digesti dengan lokasi yang spesifik oleh
enzim restriksi. DNA kemudian didenaturasi secara in situ dan dipindahkan ke membran nilon.
4.
Jelaskan prinsip kerja northern blot!
Prinsip kerja dari metode northern blot sama dengan southern blot, namun menggunakan
kertas DBM dan biasanya mendeteksi RNA. Pada dasarnya adalah kombinasi dari
denaturasi RNA elektroforesis gel, dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan
berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa
dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui
berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam
penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel.
5.
Jelaskan prinsip kerja western blot!
Prinsip kerja western blot adalah mengidentifikasi antibodi spesifik pada suatu protein
dengan berat molekul tertentu
yang telah diseparasi. Pada awalnya berat molekul
protein diseparasi atau dipisahkan dengan menggunakan SDS-PAGE elektroforesis
kemudian ditransfer ke kertas nitrocellulose (NC) untuk melakukan western blot.