Laporan Isolasi DNA Halus

BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi
DNA dari berbagai sumber. Sumber untuk isolasi DNA sangat
beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dari organisme hidup
atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi
seluruh darah, rambut, sperma, tulang, kuku, jaringan, noda
darah, air liur, bukal (pipi) kapas, sel epitel, urin.
Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA tergantung
pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai
metode yang digunakan ada beberapa kesamaan di antara mereka.
Secara umum, mereka bertujuan untuk menyajikan DNA
terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya.
Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang
digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik. Para
ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti
pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau
untuk tujuan diagnostik. Dalam obat aplikasi yang terakhir
adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu
memulihkan DNA untuk identifikasi individu (bagi pemerkosa
misalnya, pencuri kecil, kecelakaan, atau korban perang),
penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan.
1.2 Tujuan
 Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR.
 Untuk mengetahui uji kualitas DNA.
 Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR.
 Untuk mengetahui manfaat PCR.
1
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR
a. Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi
analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti
maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas.
(Anonymous B, 2012)
b. Isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan
DNA dari komponen sel lainnya.
c. PCR adalah metode perbanyakan DNA secara enzimatik
sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis
/ penelitian.
(Anonymous A, 2012)
d. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang
berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah target DNA untai ganda.
(Handoyo, 2000)
e. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode
enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro.
2.2 Uji Kualitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal elektroforesis,
pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose. Campur bahan
untuk membuat 0,8 %, yaitu 0,32 mg agarose dan 40 ml buffer
2
TBE dalam erlenmeyer. Kemudian larutan gel dihomogenkan
dengan cara dipanaskan dalam microwave hingga larutan gel
benar-benar homogen. Setelah tidak terlalu panas, larutan gel
dituangkan pada cetakan dan didiamkan sampai memadat. Gel
yang sudah memadat dipindah ke dalam mesin elektroforesis.
Kemudian tuangkan buffer TBE ke dalam mesin elektroforesis
hingga seluruh bagian gel terendam. DNA hasil amplifikasi (5 μl)
dicampur dengan loading dye (1 μl) dengan cara pipeting,
kemudian dimasukkan ke dalam sumuran/wells. Proses dilakukan
selama 20 menit dengan tegangan listrik 100 V. Setelah proses
elektroforesis selesai dilakukan, hasil elektroforesis direndam
dalam larutan Ethidium Bromide selama ± 15 menit. Gel yang
telah direndam dalam Ethidium Bromide diamati dengan UV
transluminator dan didokumentasikan. Jika muncul pita berarti
DNA hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk
PCR.
(Heneine, W., R. F. Khabbaz. 1992)
2.3 Komponen dan Tahapan PCR
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR
adalah template DNA; sepasang primer, yaitu suatu
oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang
komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida
(MgCl2) dan enzim polimerase DNA.
a. DNA template adalah DNA untai ganda yang membawa
urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan
basa ini disebut juga urutan target (target sequence).
b. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang
terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat
berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari
dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun,
pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus
3
termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah
denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat
tinggi (± 95°C). Salah satu enzim DNA polimerase yang
umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal
dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
c. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri atas dua
macam, yaitu enzim alami (native) yang diisolasi dari sel
bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang
disintesis di dalam sel bakteri E. coli.
d. Deoxyribonucleoside Triphosphate (dNTPs) merupakan
material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA baru
dalam proses PCR.
e. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan untuk reaksi
PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH 8,3 50 mM KCl dan
1,5mM MgCl2.
(Wongsosupantio, 1992)
2.4 Manfaat PCR
a. Digunakan untuk membuat fragmen pelacak yang dibuat
secara in vitro menggunakan teknik PCR.
b. Untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in
vitro.
c. Untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target
tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang
berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan
bantuan enzim dan oligonukleotida.
d. Digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan
kuantitasi molekul mRNA.
4
e. Pada kedokteran forensik, digunakan untuk diagnosis genetika
dan mikrobiologis serta manipulasi dan rekayasa gen. Selain
itu juga dapat digunakan untuk menganalisis penyakit,
Duchenne’s muscular dystrophy, hemofilia A, untuk
mendeteksi
limfoma
T
pada
manusia,
Human
immunodeficiency virus (HIV), virus hepatitis B, dan
retinoblastoma serta untuk membuat DNA mutan dengan situs
mutasi yang spesifik.teknik ini banyak digunakan baik untuk
penelitian maupun diagnosa klinik karena cukup spesifik,
efesien dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi.
(Puspita, 2010)
5
BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
 Alat : - Mortar & Pestle
: untuk menghaluskan bahan.
- Tip
:
- Gelas Ukur
: untuk mengukur bahan.
- Tabung Eppendorf : untuk tempat/wadah bahan.
- Tissue
: untuk membersihkan alat-alat.
- Gunting
:
- Plastik Pembungkus;
- Mikropipet
: untuk mengambil larutan yg
ukurannya µ liter/ 1000 µ.
- Spatula
: Mengaduk dan mengambil bahan
- Erlenmeyer
: untuk menampung larutan/bahan.
- Microwave
homogen.
: untuk memanaskan bahan agar
- Spektrofotometer : untuk mengukur nilai absorbansi.
- Mesin PCR
elektroforesis.
:untuk
visualisasi
hasil
&
- Oven
bahan tsb.
:untuk menginkubasi ekstrak dari
6
- Mesin Vortex
: untuk menghomogenkan.
- Timbangan Analitik : untuk menimbang
- Stirer
: untuk mengaduk bahan.
- PH Meter
:mengetahui kadar keasaman
- Mesin Elektroforesis:mengetahui hasil rantai DNA
- Mesin Centrifuge : untuk memisahkan larutan yang
beda massa.
- Autoclave
:
- Mesin UV Transluminator : untuk mengamati gel
agarose.
- Lemari Es
: untuk menginkubasi larutan DNA.
 Bahan : - Daun tomat : untuk bahan isolasi DNA.
- Buffer Ekstraksi CTAB : untuk lisis membrane sel dan
merusak dinding sel yang belum pecah.
- Nitrogen Cair : untuk mempermudah penggerusan
(merusak sel tanpa merusak DNA).
- PVP (Polyvinilpirolidone) : untuk melindungi DNA
agar tetap utuh/tidak rusak.
- CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) / enzim
proteinase : untuk menghilangkan kontaminasi protein.
- Buffer Pencuci : untuk mencuci endapan pellet /
menghilangkan kontaminasi dan supernatan.
7
- Buffer TE : untuk meresuspensi endapan DNA.
- RNAse : untuk menghilangkan kontaminasi RNA.
-β
Mercaptoethanol :
kontaminasi polisakarida.
untuk
menghilangkan
- Isopropanol : untuk presipitasi (menggumpalkan
kembali DNA).
- DNA Ladder :
- Agarosa : untuk menguji kualitas DNA.
- Buffer Elektroforesis (TAE/TBE) :
- Loading Dye : untuk memberi warna pada DNA .
- Ethidium Bromida : untuk memberi tanda adanya
DNA dengan cara menyisipkan pada basa nitrogen.
- "PROMEGA " PCR Reaction Kit : untuk proses PCR.
- Primer Mikrosatelit SSR :
3.2 Langkah Kerja
+ Buffer ekstraksi
(CTAB) 1 ml
Daun tomat 0,1 gr
+ N2 cair & PVP
t = -1980C , gerus
+ 500 ml CHISAM
Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101
Ambil supernatan
8
Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101
Ambil supernatan
+ Isopropanol 1x volume
Inkubasi freezer 30’
Sentifuge
Buffer Pencuci 2x (500 ml)
Resuspensi TE Buffer 200 ml
RNAse 1 ml
Inkubasi 370C 30’
Simpan freezer
9
3.3 Analisa Perlakuan
Hal yang pertama dalam melakukan praktikum isolasi DNA
adalah menyiapkan alat dan bahan yang digunakan. Kemudian
melakukan pembufferan ekstraksi CTAB sebanyak 1 ml
berfungsi untuk melisis membrane serta menimbang sampel
yaitu daun tomat sebesar 01 gram dan ditambahkan PVP 1%
agar tidak merusak DNA dan N2 cair dengan suhu -1920C agar
memudahkan saat pengerusan bersama daun sirkaya. setelah itu
dilakukan penambahan pada B- mercaptoetanol 5 ul dan
diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 650C. Kemudian
ditambahkan chisam sebanyak 500 ul dan ditambahkan 10.000
Rpm selama 10 menit. Setelah itu diambil supernatannya dan
ditambahkan chisam lagi sebanyak 1xvolume supernatan.
Setelah dilakukan perlakuan diatas, maka perlakuan
selanjutnya adalah ditambahkan isopropanol 0,45 x volume
supernatan dan diinvertkan dan diinkubasi ke dalam lemari es
selama 30 menit untuk melihat hasil dari ada atau tidaknya
DNA dalam daun sirkaya tersebut. Setelah itu, disentrifuge
kembali sebesar 10.000 Rpm dan dibuang isopropanol
kemudian didapatkan DNA pellet. Lalu DNA pellet tersebut
dicuci dengan buffer pencuci 200 ul sebanyak 2x serta RNASe
1 ul kemudian diresuspensi dengan plution buffer 20-50 ul dan
akhirnya disimpan ke dalam elektroforesis.
10
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Gambar Hasil Elektroforesis
4.2 Analisa Hasil Elektroforesis
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
4.2 Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
Anonymous A, 2012. http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/
2010/01/isolasi-dna.html
Anonymous B, 2012. http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011
/04/isolasi-dna.html
Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan
Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction. Pusat Studi
Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas Vol 9 No 1. Surabaya.
Heneine, W., R. F. Khabbaz, R. B. Lal, and J. E. Kaplan. 1992.
Sensitive and specific polymerase chain reaction assays for
diagnosis of human T-cell lymphotropic virus type 1
(HTLV-I) and HTLV-II infections in HTLV-I/II-seropositive
individuals. J. Clin. Microbiol. 30: 1605-1607.
Puspita.2010.
Manfaat
PCR.Http://puspitt.multiply.com/
journal/item/14/ISOLASI-DNA.
Diakses
pada
24
November 2012
Wongsosupantio.1992. Elektroforesis Gel Protein. Pusat Antar
Universitas. UGM.Yogyakarta.p.1-4, 12-13.
12