1 RESIDU BAHAN AKTIF ASAP OBAT NYAMUK BAKAR YANG

ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
RESIDU BAHAN AKTIF ASAP OBAT NYAMUK BAKAR YANG TERBUAT DARI DAUN
LEGUNDI (Vitex trifolia L.) PADA ORGAN PARU-PARU MENCIT
1
Wahjuni, S., 1Suirta, I W. dan 1Trismariadhari-Pratiwi, K.
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran
([email protected])
1
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang analisis residu bahan aktif asap obat nyamuk bakar yang terbuat
dari daun legundi (Vitex trifolia L.) pada organ paru-paru mencit dengan kromatografi gasspektroskopi
massa (KG-SM). Obat nyamuk yang terbuat dari daun legundi (Vitex trifolia L.) dibakar, asapnya dipaparkan
pada mencit jantan (Mus muculus) selama 20 hari (pemaparan akut). Mencit yang telah terpapar asap obat
nyamuk legundi (Vitex trifolia L.) dibius dengan kapas yang telah dibasahi dengan larutan klorofom,
selanjutnya mencit dibedah dibagian perut secara melintang untuk diambil organ paru-parunya. Organ
paru-paru mencit dimaserasi dengan etanol 96% selama 1x24 jam. Kemudian ekstrak organ paru-paru
mencit dianalisis dengan KG-SM.
Hasil KG-SM asap obat nyamuk bakar legundi (Vitex trifolia L.) teridentifikasi 15 senyawa,
diantaranya: methenamine; 2-metoksi-4-vinilfenol; 2, 6-dimetoksifenol; asam 4-hidroksi-3-metoksibenzoat;
2-metoksi-4-(1-propenil) fenol-E; 5-tert-butilprogalol; 1, 3, 7, 7-tetrametilbisiklo heptan-2-on; 2, 3, 5, 6tetrafloroanisol; dietil ptalat; 2, 6-dimetoksi-4-(2-propenil)fenol; N-N-dimetil
metanasulfonamida; 4-hidroksi-3-nitrokumarin; citenamide; 1-metil-antrakuinon; danhexametilsiklo
trisiloksan. Hasil analisis organ paru-paru mencit dengan KG-SM ditemukan satu senyawa yang merupakan
residu asap obat nyamuk bakar legundi (Vitex trifolia L.) yaitu senyawa heksametilsiklotrisiloksan.
Kata kunci : Vitex trifolia L., Mus musculus, Kromatografi gas-spektroskopi massa (KG-SM)
ABSTRACT
Research of analysis of active ingredient residues of mosquito coil smoke made of leaves legundi
(Vitex trifolia L.) in the lungs of mice by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS) was carried out.
Mosquito coil made from the leaves legundi (Vitex trifolia L.) was burned and the smoke is exposed to male
mice (Mus muculus) for 20 days (acute exposure). Mice that had been exposed to mosquito coil smoke
legundi (Vitex trifolia L.) anesthetized with cotton that has been moistened with chlorofom solution, then
mice were dissected and their abdominal organs was taken transversely to the lungs. Lungs of mice was
macerated with ethanol 96% for 1x24 hours. Then extracted lungs of mice were analyzed by GC-MS.
A number of 15 compounds from legundi (Vitex trifolia L.) mosquito coil smoke were identified
using GC-MS, including: methenamine; 2-methoxy-4-vinylphenol; 2, 6-dimethoxyphenol; 4-hydroxy-3methoxy-benzoic acid; 2-methoxy-4-(1-propenyl) phenol-E; 5-tert-butylpyrogallol, 1, 3, 7, 7-tetra
methylbicycloheptan-2-one, 2, 3, 5, 6-tetrafluoroanisol; diethyl pthalate, 2, 6 - dimethoxy-4-(2-propenyl)
phenol; N-N-dimethyl methanesulfonamide; 4-hydroxy-3-nitrocoumarin; citenamide; 1methyl-anthraquinone; and hexamethyilcyclotrisiloxane. Lungs of mice analyzed using GC-MS found a
compound of hexamethyilcyclotrisiloxane which was similar to compound observed in legundi (Vitex trifolia
L.) mosquito coil smoke.
Keyword : Vitex trifolia L., Mus musculus, gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS)
PENDAHULUAN
Iklim tropis di Indonesia menyebabkan
suburnya perkembangbiakan nyamuk. Hal ini
menyebabkan Indonesia menjadi salah satu pasar
potensial dalam memasarkan produk pembunuh
nyamuk atau obat nyamuk, khususnya obat
nyamuk bakar. Hampir setiap rumah tangga
memanfaatkan obat nyamuk untuk mengatasi
gangguan nyamuk. Pemakaian terbanyak terutama
pada musim pancaroba, yang di tengarai banyak
berkembang nyamuk penyebab demam berdarah
dan malaria.
1
http://www.scientificunsrat.org/
ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
Obat nyamuk mempunyai bahan aktif
bermacam-macam, yaitu dichlorvos, propoxur,
pyrethroid, diethyltoluamide dan transflutrin, serta
bahan kombinasinya (Intisari, 2007). Bahan aktif
yang masuk ke dalam tubuh secara inhalasi dalam
waktu yang lama, selain akan menyebabkan
gangguan pada paru-paru seperti iritasi juga akan
menyebabkan hati tidak mampu untuk melakukan
detoksifikasi secara sempurna (Iswara, 2009).
Asap yang menguap dari pembakaran obat
nyamuk
yang
dijual
dipasaran
ternyata
mengandung zat karsinogen (pemicu kanker).
Paparan melalui pernafasan sangat berbahaya
karena partikel-partikel bahan aktif dapat dengan
cepat diserap oleh paru-paru menuju peredaran
darah. Sehingga dapat menyebabkan kerusakan
serius pada hidung, tenggorokan dan jaringan
paru-paru apabila terhirup dengan jumlah yang
cukup dan dalam waktu yang lama (Iswara, 2009).
Liu, Weili et al. (2003) dari University of
Medicine and Dentistry of New Jersey, USA dalam
jurnal
Environmental
Health
Perspectives
menyatakan bahwa asap pembakaran obat
nyamuk dapat melepaskan zat penyebab kanker
paru. Selain itu dalam studi yang dilakukan para
ahli dari Institute of Medicine, Chung Shan Medical
University, Taichung, Taiwan, menunjukkan bahwa
sekitar 50 persen kematian karena kanker paruparu di Taiwan tidak terkait kebiasaan merokok,
tetapi bersumber pada obat nyamuk bakar (Senior,
2009).
Banyaknya penelitian tentang efek obat
nyamuk bakar bagi pernapasan, cenderung
membuat penggunaan bahan-bahan kimia beralih
ke penggunaan bahan-bahan alami seperti
penggunaan obat nyamuk bakar yang terbuat dari
daun legundi (Vitex trifolia L.) yang telah banyak
beredar dalam bentuk siap pakai. Obat nyamuk
bakar yang terbuat dari daun legundi (Vitex trifolia
L.) terbukti ampuh digunakan untuk mengusir
nyamuk. Berdasarkan penelitian yang telah
dilakukan, kandungan minyak atsiri yang terdapat
pada daun legundi (Vitex trifolia L.) berefek sebagai
larvasida dan dapat menghambat perkembangan
larva Aedes aegypti (Swastika, 2007). Walaupun
obat nyamuk bakar dari daun legundi (Vitex trifolia
L.) sudah lama digunakan dan bersifat alami,
kemungkinan terjadinya efek samping yang
merugikan perlu diperhatikan terutama pada
penggunaan lama dan terus-menerus. Oleh karena
itu, peneliti ingin mengetahui bagaimana pengaruh
asap obat nyamuk bakar dari daun legundi
terhadap paru-paru dengan melihat ada tidaknya
residu senyawa aktif asap obat nyamuk pada paru-
paru. Namun mengingat penelitian ini tidak dapat
dilakukan pada manusia, maka penelitian ini
dilakukan pada hewan coba yaitu mencit (Mus
musculus) galur balb/C mice karena memiliki
gambaran histopatologis paru-paru yang mirip
manusia (Indriastuti, 2010).
MATERI DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah obat nyamuk bakar yang terbuat dari daun
legundi (Vitex trifolia L.) dalam bentuk limas-limas
berukuran tinggi sekitar 10 sentimeter, yang
merupakan hasil produksi masyarakat di Desa
Sanur Kauh, Kecamatan Denpasar Selatan, Provinsi
Bali. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol
96% (p.a), kloroform dan formalin 10%.
Hewan Percobaan
Hewan uji yang digunakan adalah mencit
putih (Mus muculus) yang berjenis kelamin jantan
galur balb/C mice sebanyak 12 ekor, normal dan
sehat. Mencit ini diperoleh dari UPT. Laboratorium
Analitik Universitas Udayana, Bukit-Jimbaran, Bali.
Peralatan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini
antara lain kandang mencit, neraca analitik, botol
plastik, kertas saring, botol kaca, kapas, selop
tangan, masker, gunting dan pinset serta alat
kromatografi gasspektroskopi massa (KG-SM).
Identifikasi kromatografi gas-spektroskopi massa
(KGSM) dilakukan di Puslabfor Bareskrim Polri
Laboratorium Forensik cabang Denpasar-Bali dan
pemeriksaan
histopatologi
dilakukan
di
Laboratorium
Patologi
Veteriner
Fakultas
Kedokteran Hewan Univesitas Udayana.
Penyiapan Hewan Coba
Sebelum pengujian, mencit (Mus musculus)
dikondisikan dalam suasana laboratorium terlebih
dahulu selama 1 minggu, dengan tujuan agar
mencit coba (Mus musculus) dapat menyesuaikan
diri dengan lingkungannya, sambil dilakukan
kontrol kesehatan, berat badan dan penyeragaman
makanan yang diberikan (Departemen Kesehatan
RI, 1979).
Pelaksanaan Pemaparan Akut
Sebanyak 12 ekor mencit (Mus musculus)
dibagi menjadi 2 kelompok, masing-masing
kelompok terdiri dari 6 ekor. Pada penelitian ini
ditentukan 2 perlakuan terhadap hewan coba yaitu
perlakuan kontrol (tanpa pemaparan asap) dan
perlakuan pemaparan akut yakni pemaparan asap
7 jam per hari selama 20 hari (OECD, 1981). Selama
2
http://www.scientificunsrat.org/
ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
perlakuan pemaparan akut dilakukan pengamatan
fisik yakni dengan mengamati perubahan berat
badan mencit dan perubahan nafsu makan mencit.
Setelah diberi perlakuan pemaparan akut selama
20 hari, selanjutnya tiap mencit dibius dengan
kapas yang telah dibasahi larutan kloroform
secukupnya. Mencit dibedah pada bagian perut
secara melintang, untuk diambil organ paruparunya. Masing-masing pelakuan dibagi menjadi 2
kelompok yakni ; Sebanyak 3 organ paru-paru pada
perlakuan kontrol dan perlakuan pemaparan akut
diekstraksi dengan etanol 96% (p.a) untuk
pemeriksaan KG-SM. Sebanyak 3 organ paru-paru
pada perlakuan kontrol dan perlakuan pemaparan
akut diawetkan dengan formalin 10% untuk
pemeriksaan histopatologi organ paru-paru
mencit.
Pemeriksaan histopatologi
Hasil pemeriksaan histopatologi organ paruparu mencit kontrol yang diperoleh dari
Laboratorium
Patologi
Veteriner
Fakultas
Kedokteran
Hewan
Universitas
Udayana
menunjukkan bahwa organ paru-paru mencit
kontrol mengalami nekrosis, proliperasi makrofag
alveolel, kongesti dan pendarahan. Berikut adalah
gambaran histopatologi organ paru-paru mencit
kontrol. Nekrosis ditunjukkan oleh lingkaran
berwarna merah, proliperasi makrofag alveolel
berupa bintikbintik hitam oleh lingakaran
berwarna kuning, kongesti oleh lingkaran berwarna
putih dan pendarahan oleh lingkaran berwarna
hitam (Gambar 2).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan perubahan berat badan mencit
dilakukan dengan cara membandingkan berat
badan mencit sebelum dan setelah menerima
perlakuan (Gambar 1).
Gambar 2
Gambar 2. Gambaran histopatologi organ
paru-paru mencit kontrol perbesaran 200x.
Gambar 1
Grafik pertambahan berat badan
mencit sebelum dan sesudah perlakuan
Grafik pertambahan berat badan di atas
menunjukkan rata-rata perubahan berat badan
mencit. Semua mencit kontrol dan mencit
perlakuan mengalami peningkatan berat badan,
namun ada perbedaan berat badan antara mencit
kontrol dengan mencit perlakuan sebesar 2 gram
yakni rata-rata pertambahan berat badan mencit
kontrol sebesar 7,5 gram dan rata-rata
pertambahan berat badan mencit perlakuan
sebesar 5,5 gram. Hal ini menunjukkan bahwa
mencit perlakuan mengalami peningkatan berat
badan yang lebih rendah dibandingkan dengan
mencit kontrol.
Pemeriksaan histopatologi organ paru-paru
mencit perlakuan
Hasil pemeriksaan histopatologi organ paruparu mencit perlakuan yang diperoleh dari
Laboratorium
Patologi
Veteriner
Fakultas
Kedokteran
Hewan
Universitas
Udayana
menunjukkan bahwa sel paru-paru mencit
perlakuan mengalami hal yang sama dengan
mencit kontrol dimana terdapat nekrosis,
proliperasi makrofag alveolel, kongesti dan
pendarahan. Nekrosis ditunjukkan oleh lingkaran
berwarna biru, proliperasi makrofag alveolel
berupa bintik-bintik hitam oleh lingakaran
berwarna kuning, kongesti oleh lingkaran berwarna
putih dan pendarahan oleh lingkaran berwarna
hitam (Gambar 3).
Berdasarkan hasil pemeriksaan histopatologi
organ paru-paru mencit, baik kontrol dan
perlakuan sama-sama menunjukkan adanya
nekrosis, proliperasi makrofag alveolel, kongesti
3
http://www.scientificunsrat.org/
ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
dan pendarahan. Namun nekrosis, proliperasi
makrofag alveolel, kongesti dan pendarahan lebih
banyak terjadi pada organ paru-paru mencit
perlakuan pemaparan akut yang disebabkan
adanya pengaruh pemaparan asap obat nyamuk
bakar yang terbuat dari daun legundi (Vitex trifolia
L.). Nekrosis merupakan kematian sel yang
disebabkan oleh kerusakan sel secara akut
(Isnaeni, 2010). Mencit kontrol adalah
mencit yang tidak menerima paparan asap obat
nyamuk apapun sehingga seharusnya tidak
terdapat nekrosis pada sel paru-parunya.
Identifikasi asap obat nyamuk bakar dari
daun legundi (Vitex trifolia L)
Berdasarkan pendekatan database pada
library sistem C:\Database\NISTO2.L dan C:\
Database\wiley7n.l senyawa tersebut diantara nya
diduga seperti yang tertera pada Tabel 1.
Tabel 1.
Hasil analisis KG-SM asap obat nyamuk bakar dari
daun legundi (Vitex trifolia L.)
Sampel
Asap obat
nyamuk
bakar
dari daun
legundi
(Vitex
trifolia L.)
Gambar 3.
Gambaran histopatologis organ paru-paru mencit
perlakuan pemaparan akut perbesaran 200x.
Menurut Ressang (1984) nekrosis pada paru bisa
juga disebabkan oleh pengaruh langsung agen yang
bersifat toksik seperti zat kimia maupun toksin
kuman, atau karena kekurangan faktor-faktor yang
sangat diperlukan sel seperti oksigen dan zat-zat
makanan. Selain nekrosis, sel paru-paru mencit
kontrol dan mencit perlakuan juga mengalami
proliperasi makrofag alveolel. Proliperasi makrofag
alveolel ini sesungguhnya memang ada pada paruparu normal dan bersifat tidak berbahaya, oleh
karena adanya respon berlebih maka makrofag
alveolel ini memperbanyak diri. Proliperasi
merupakan fase sel saat mengalami pengulangan
siklus tanpa hambatan (Isnaeni, 2010).
Kongesti adalah peningkatan cairan pada
suatu tempat yang terjadi karena proses pasif yang
disebabkan kegagalan aliran cairan keluar dari
jaringan, misalnya pada kerusakan vena. Jika dilihat
secara visual maka daerah jaringan atau organ
yang mengalami kongesti akan berwarna lebih
merah (ungu) dan secara mikroskopi kapiler-kapiler
dalam jaringan melebar penuh berisi darah.
Terdapat dua mekanisme timbulnya kongesti, yaitu
kenaikan jumlah darah yang mengalir ke daerah
tersebut dan penurunan jumlah darah yang
mengalir dari daerah tersebut. Kongesti dapat
terjadi pada daerah yang mengalami peradangan
(Greaves, 2000).
Waktu
retensi
(menit)
6,74
8,48
Perse
n area
11,71
11,58
9,13
10,67
16,16
3,16
10,72
8,69
11,81
12,27
1,93
3,23
12,33
11,95
12,71
14,02
2,48
4,93
15,21
2,81
16,90
3,39
17,12
18,33
23,97
2,46
11,24
4,29
Senyawa
Methenam.
2-Metoksi-4-vinil
fenol.
2,6-Dimetoksi fenol
Asam 4-hidroksi-3metoksi-benzoat.
2-Metoksi-4-(1propenil)fenol-E.
5-Tert-butil progalol.
1,3,7,7-Tetrametil
bisiklo heptan-2-on.
2,3,5,6-Tetra floro
anisol.
Dietil ptalat.
2, 6-Dimetoksi-4-(2propenil)fenol.
N-N-dimetil
Metanasulfonamida.
4-Hidroksi-3-nitro
kumarin.
Citenamide.
1-Metilantrakuinon.
Hexametilsiklotri
siloksan.
Identifikasi ekstrak organ paru-paru mencit
kontrol dengan alat KG-SM
Berdasarkan pendekatan database pada
library sistem C:\Database\NISTO2.L dan C:\
Database\wiley7n.l senyawa tersebut diantaranya
diduga seperti dicantumkan dalam Tabel 2.
Tabel 2.
Hasil analisis KG-SM organ paruparu mencit kontrol
Sampel
Paruparu
mencit
kontrol.
Waktu
retensi
(menit)
23,44
Persen
area
1,68
25,54
10,79
26,17
87,53
Senyawa
N-benzoyl-1,2,2Trimethoxyethyl
amine.
1,2-Benzene
dicarboxylicacid,
mono(2-etylhexyl)
ester.
Kolesterol.
4
http://www.scientificunsrat.org/
ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
Analisis residu ekstrak organ paru-paru mencit
perlakuan dengan (KG-SM)
Berdasarkan pendekatan database pada
library sistem C:\Database\NISTO2.L dan C:\
Database\wiley7n.l senyawa tersebut diantaranya
diduga seperti yang tercantum pada Tabel 3.
Tabel 5.
Analisis hasil KG-SM organ paruparu mencit
perlakuan
Sampel
Organ
paru-paru
mencit
perlakuan
Waktu
retensi
(menit)
20,03
Persen
area
1,17
20,39
1,96
23,44
2,21
24,93
0,81
25,11
25,55
1,28
5,46
26,19
87,11
Senyawa
Pentadecanoic
acid, 14-methylmethyl ester.
n-Hexadecanoic
acid.
2-(5’-nitro-2’thienyl)pyrimidine
Hexametilsiklotri
siloksan.
Gibberellin.
1,2-Benzene
dicarboxylicacid
mono(2-etylhexyl)
ester.
Kolesterol
Berdasarkan hasil analisis residu organ paruparu mencit dengan alat kromatografi gasspektroskopi massa (KGSM) di atas diketahui
bahwa terdapat residu asap pada organ paru-paru
mencit yakni sebanyak 1 senyawa. Senyawa
tersebut adalah hexametilsiklotrisiloksan dengan
waktu retensi sebesar 24,93 menit.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Simpulan yang dapat diambil dari penelitian
yang telah dilakukan adalah sebagai berikut :
1. Hasil analisis dengan KG-SM menunjukkan
bahwa ditemukan residu bahan aktif pada
organ paru-paru mencit yang terpapar asap
obat nyamuk bakar yang terbuat dari daun
legundi (Vitextrifolia L.).
2. Jenis senyawa aktif yang terdapat pada organ
paru-paru mencit yang terpapar asap obat
nyamuk bakar yang terbuat dari daun legundi
(Vitex trifolia L.) adalah heksametilsiklotri
siloksan.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang
residu bahan aktif asap obat nyamuk bakar yang
terbuat dari daun legundi (Vitex trifolia L.) pada
organ paru-paru mencit dengan waktu paparan
yang lebih lama (paparan kronis) serta perlu
dilakukan penelitian mengenai LC50 obat nyamuk
bakar legundi (Vitex trifolia L.).
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan
terimakasih kepada Prof. Dr. Ir. I. B. Putra
Manuaba, M.Phil atas ijin menggunakan UPT Lab
Analitik Universitas Udayana untuk melakukan
penelitian. Ucapan terimakasih ditujukan juga
kepada Bapak Ir. Rudy R. Taviv, M.Si atas ijin
melakukan analisis GC-MS di Laboratorium
Forensik RI cabang Bali.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Departemen Kesehatan RI, 1979, Materia
Medika III, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta.
2. Greaves, P., 2000, Histopathology of
Preclinical Toxicity Studies Interpretation
and Relevance in Drug Safety Evaluation,
Second Edition, 372-380, Elsevier,
Amsterdam.
3. Gutama, A. P., Juni 2008, Penggunaan
Mencit Dan Tikus Sebagai Hewan Model
Penelitian Nikotin, Skripsi, IPB, Bogor.
4. Indriastuti, R., 2010, Uji Toksisitas Akut
Monocrotophos Dosis Bertingkat Per Oral
Dilihat Dari Gambaran Histopatologis
Paru-Paru
Mencit
Balb/C,
Skripsi,
Universitas Diponegoro, Semarang.
5. Intisari, 2007, Bahan Aktif Obat Nyamuk,
Available at <http://www.depkes.go.id>.
Diakses 08 Oktober 2010.
6. Isnaeni, W., 2006, Fisiologi Hewan,
Kasinius, Yogyakarta.
7. Iswara, A., Maret 2009, Pengaruh
Pemberian Antioksidan Vitamin C Dan E
Terhadap Kualitas Spermatozoa Tikus
Putih
Terpapar
Allethrin,
Skripsi,
Universitas Negeri Semarang, Semarang.
8. Liu, W., Zhang, J., Hashim, H. J., Jalaludin,
J., Hashim, Z., and Goldstein, D. B., 2003,
Mosquito Coil Emissions and Health
Implications, Journal of Environmental
Health Perspectives, vol. 111 (12) : 14541460.
9. OECD Guideline For Testing of Chemicals :
Acute Inhalation Toxicity, 1981, Available
at
<http://google.com/acuteinhalationtoxicity. pdf>. Diakses 7 Oktober
2010.
10. Ressang, A.A., 1984, Buku Pelajaran
Patologis Khusus Veteriner, Edisi II, 53, 54
5
http://www.scientificunsrat.org/
ISSN: 2089-9084
ISM, VOL.1 NO.1, JANUARI-APRIL, HAL.1-6
240, 246, Bali Cattle Disease Investigation
Unit, Denpasar.
11. Senior, 2009, Asap Hio & Obat Nyamuk
Picu
Kanker
Paru,
Available
at
<http://cybermed.cbn. net.id>. Diakses 12
Oktober 2010.
12. Swastika, I Kadek, 2007, Efikasi Minyak
Atsiri Daun Legundi (Vitex Trifolia L.)
Sebagai Larvisida dan Pengaruhnya pada
Perkembangan Larva, Daya Fekunditas
serta Daya Tetas Telur (Aedes aegypti),
Tesis,
Universitas
Gadjah
Mada,
Yogyakarta.
6
http://www.scientificunsrat.org/