ISBN :978-602-73159-0-7 SEMINAR NASIONAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA VII “Penguatan Profesi Bidang Kimia dan Pendidikan Kimia Melalui Riset dan Evaluasi” Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan P.MIPA FKIP UNS Surakarta, 18 April 2015 MAKALAH PENDAMPING BIOKIMIA ISBN : 978-602-73159-0-7 UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN SENYAWA TETRAHIDROHEKSAGAMAVUNON-5(THHGV-5) Putri Kharisma Novita Sari1,*, Ritmaleni2, dan Sardjiman2 1Bagian 2Bagian Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,Indonesia Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Indonesia email: [email protected] ABSTRAK Heksagamavunon-5 (HGV-5) merupakan salah satu senyawa analog kurkumin. HGV-5 memiliki aktivitas sebagai antioksidan sama halnya dengan kurkumin. Senyawa analog kurkumin telah banyak disintesis untuk mendapatkan aktivitas biologis yang lebih poten. Salah satunya sintesis THHGV-5 dari senyawa HGV-5 melalui reaksi hidrogenasi. Hidrogenasi HGV-5 menjadi THHGV-5 diprediksi dapat meningkatkan aktivitas biologisnya. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari efek antioksidan THHGV-5 dibandingkan dengan HGV-5 secara in vitro. Penelitian dilakukan dengan metode uji daya tangkap radikal DPPH serta daya reduksi terhadap ion feri secara spektroskopi dengan pembanding Vitamin E. Data absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan persen (%) aktivitas antioksidan pada metode DPPH dan data persen (%) FRAP pada metode reduksi ion feri. Kedua data tersebut selanjutnya digunakan untuk mendapatkan nilai IC50. Hasil penelitian menunjukkan bahwa THHGV-5 konsentrasi rendah sudah mampu memberikan aktivitas penangkapan radikal DPPH dan mampu mereduksi ion feri (5 mM). Besarnya aktivitas antioksidan yang diberikan berkorelasi positif dengan meningkatnya konsentrasi senyawa, semakin tinggi konsentrasi, semakin besar aktivitas yang diberikan. THHGV-5 mempunyai efikasi dan potensi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan vitamin E dengan nilai IC50 THHGV-5 sebesar 68,95 µM, HGV-5 sebesar 150,44 µM dan Vitamin E sebesar 226,80 µM pada metode DPPH, serta nilai IC50 THHGV-5 sebesar 11,67 µM, HGV-5 sebesar 17,66 µM dan Vitamin E sebesar 35,21 µM pada metode ion feri. Kata Kunci: tetrahidroheksagamavunon-5, antioksidan, DPPH, ion feri. antioksidan memiliki banyak fungsi bagi PENDAHULUAN Saat ini pencarian obat baru yang berkhasiat sebagi antioksidan banyak dilakukan. Hal ini dikarenakan senyawa tubuh, terhadap spesies diantaranya kerusakan oksigen melindungi yang reaktif, tubuh disebabkan menghambat ISBN :978-602-73159-0-7 terjadinya penyakit menghambat degeneratif peroksidase lipid serta Bahan: pada Farmasi UGM), THHGV-5 (Fakultas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (Aldrich, USA), dan vitamin E makanan [8]. Salah satu senyawa diketahui HGV-5, memiliki aktivitas yang telah (Aldrich, USA), metanol absolut p.a (Merck, antioksidan Germany), o-fenantrolin (Merck, Germany), adalah kurkumin [7]. Kurkumin merupakan FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, akuades. salah satu senyawa metabolit sekunder Alat: Neraca analitik kepekaan 0,0001 yang terkandung dalam Curcuma longa L. gram [2]. Switzerland), Namun kurkumin dalam masih pemanfaatannya, memiliki beberapa (Mettler air mikropipet. kurkumin Spektrofotometer (Thermo vortex menyebabkan AB204-S, UV/VIS (Spectronic 10 GenesysTM, USA), kuvet, kelemahan, diantaranya sukar larut dalam sehingga Toledo Scientific, China), memiliki bioavailabilitas yang rendah dan Jalannya Penelitian membutuhkan dosis yang besar dalam Penelitian dilakukan dengan metode uji aplikasinya [5,3]. Beberapa peneliti telah daya tangkap radikal DPPH [4] serta daya berhasil reduksi mensintesis modifikasi struktur senyawa kurkumin hasil untuk memperbaiki kelemahan tersebut. terhadap ion feri [1] secara spektroskopi dengan pembanding Vitamin E. Heksagamavunon-5 (HGV-5) Uji antioksidan metode daya tangkap merupakan salah satu senyawa analog radikal DPPH kurkumin yang telah berhasil disintesis oleh Pembuatan Sardjiman dan terbukti memiliki aktivitas Kontrol sebagai antioksidan sama halnya dengan Dibuat larutan THHGV-5 seri kadar 5, 10, kurkumin [6]. Senyawa analog lain telah 50, 75, dan 100 µM Dibuat seri kadar banyak larutan HGV-5 sebesar 10, 50, 75, 100, dan disintesis untuk mendapatkan Larutan Senyawa Uji dan aktivitas biologis yang lebih poten. Salah 150 µM. satunya sintesis THHGV-5 dari senyawa Dibuat larutan vitamin E seri kadar 100, HGV-5 melalui reaksi hidrogenasi [10]. 150, 200, 250, dan 300 µM. Hidrogenasi Dibuat larutan DPPH kadar 0,4 mM. HGV-5 menjadi THHGV-5 diprediksi dapat meningkatkan aktivitas Menentukan Waktu Operasi (OT) biologisnya, khususnya aktivitas sebagai Diambil 500 µL larutan senyawa uji salah antioksidan. satu kadar ditambahkan dengan 1,0 mL Penelitian ini bertujuan untuk larutan DPPH 0,4 mM kemudian mempelajari efek antioksidan THHGV-5 ditambahkan dibandingkan dengan HGV-5 secara in volume tepat 5,0 mL. Campuran kemudian vitro. divortex dan dibaca absorbansinya dengan metanol absolut sampai menggunakan spektrofotometer pada 517 nm selama 1 jam untuk mendapatkan kurva absorbansi yang stabil. Daerah yang stabil METODE PENELITIAN ditetapkan sebagai OT. ISBN :978-602-73159-0-7 Menentukan Panjang Gelombang ( ) dicampur homogen (divorteks), Maksimal absorbansinya Diukur berdasarkan panjang gelombang spektrofotometer pada λ 510 nm selama 1 maksimal DPPH. 1,0 mL larutan DPPH 0,4 jam untuk mendapatkan kurva absorbansi mM itambahkan metanol absolut sampai yang stabil. Daerah yang stabil ditetapkan volume tepat 5,0 mL kemudian dibaca sebagai OT. absorbansinya Menentukan dengan menggunakan dengan dibaca panjang menggunakan gelombang (λ) spektrofotometer dengan rentang panjang maksimum gelombang 400-600 nm. Diambil 1,0 mL larutan FeSO4.7H2O 1200 Pengukuran Absorbansi Larutan Uji dan µM ditambahkan 0,5 mL 1,10-fenantrolin Kontrol 0,05%, ditambahkan 1 mL metanol absolut Diambil 500 µL larutan sampel (THHGV-5, dicampur HGV-5, absorbansinya dan Vitamin E), ditambahkan homogen (divorteks), dengan discan menggunakan dengan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM spektrofotometer dengan rentang panjang kemudian ditambahkan metanol absolut gelombang 480-580 nm. sampai volume tepat 5,0 mL. Campuran Pengukuran absorbansi larutan uji dan kemudian kontrol divortex absorbansinya dengan spektrofotometer dan dibaca menggunakan pada dan OT maksimum. Dilakukan tiga kali replikasi. Diambil 1,0 mL larutan uji (HGV-5, THHGV5, vitamin E) pada beberapa seri konsentrasi, ditambahkan 0,5 mL 1,10fenantrolin 0,05%, ditambahkan 1 mL Uji antioksidan metode daya reduksi FeCl3 .6H2 O 1200 µM dicampur homogen terhadap ion feri (divorteks), dibaca absorbansinya dengan Penyiapan Larutan Uji menggunakan spektrofotometer terhadap Dibuat larutan THHGV-5 seri kadar 5, 10, blanko pada daerah OT dan λ maksimum. 15, 20 dan 25 µM. Dilakukan tiga kali replikasi. Larutan blanko Dibuat larutan HGV-5 seri kadar: 5, 10, 25, terdiri dari 1,0 mL metanol absolut, 1,10- 40 dan 50 µM. fenantrolin 0,05%, 1 mL FeCl3 .6H2 O 1200 Dibuat larutan vitamin E seri kadar: 5, 10, µM dan dicampur homogen. 50, 75, dan 100 µM. Analisis Hasil Dibuat larutan o-fenantrolin 0,05% Data yang diperoleh dari uji kuantitatif Dibuat larutanFeCl3 .6H2 O1200 µM. aktivitas antioksidan dengan metode DPPH Dibuat larutanFeSO4.7H2O 1200 µM. adalah persen (%) penangkapan radikal Menentukan waktu operasi (OT) bebas Diambil 1,0 mL larutan uji salah satu kadar, aktivitas ditambahkan digunakan rumus : 0,5 mL 1,10-fenantrolin 0,05%, ditambahkan 1 mL FeCl3 .6H2 O 1200 µM. DPPH. Besarnya penangkapan % Aktivitas= - persen radikal (%) bebas ×100% ISBN :978-602-73159-0-7 Konsentrasi dalam sistem vs data (%) penangkapan radikal DPPH tersebut kemudian di analisis dengan regresi linier kuantitatif metode yang diperoleh aktivitas daya dari antioksidan reduksi ion uji feri adalah Reducing Antioxidant Power). Kemudian persen membandingkan (%) nilai Konsentrasi dalam sistem vs data (%) FRAP FRAP regresi linier untuk menentukan nilai IC50 . dengan absorbansi sebagai nilai FRAP (Ferric dihitung nilai FRAP senyawa ×100% nilai FRAP FeSO4 1200µM FRAP tersebut kemudian di analisis dengan untuk menentukan nilai IC50 . Data % FRAP= dengan senyawa HASIL DAN PEMBAHASAN Uji daya tangkap radikal DPPH Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan yang poten, akan memudarkan warna DPPH secara maksimal, dibuktikan dengan nilai FRAP FeSO4 1200 µM yang dianggap sebagai nilai 100% FRAP. dengan rendahnya absorbansi DPPH yang terukur. Pengukuran absorbansai dilakukan pada DPPH yakni 514,5 nm dan pada senyawa yakni HGV-5 selama 25 menit, THHGV-5 selama 26 menit, dan vitamin E selama 20 menit. Hasil penelitian yang diperoleh saat operating time, untuk mendapatkan menunjukkan data persen (%) aktivitas hasil pengukuran yang stabil. Operating antioksidan seperti pada tabel 1. time yang diperoleh adalah berbeda tiap Tabel 1. Daya tangkap HGV-5, THHGV-5, dan Vitamin E terhadap DPPH ISBN :978-602-73159-0-7 Kadar THHGV-5 Absorbansi (n=3) 5 % Antioksidan-SD Persamaan Regresi Linier y = 0,717x + 0,583 R² = 0,992 IC50 = 68,95µM 0,678 2,96±0,41 0,646 7,49±0,38 50 0,438 37,33±0,97 75 0,293 58,09±0,58 100 0,216 69,12±0,65 10 Kadar HGV-5 % Antioksidan-SD Absorbansi (n=3) 10 0,683 2,20±0,66 50 0,587 15,89±0,22 75 0,540 22,67±1,12 100 0,468 32,98±0,86 150 Kadar 0,347 50,31±1,79 THHGV-7 Persamaan regresi linier y = 0,343x - 1,663 R² = 0,998 IC50 =150,44µM HGV-7 Absorbansi (n=3) % Antioksidan-SD Absorbansi (n=3) % Antioksidan -SD 100 0,654 8,27±0,40 0,606 15,05±0,74 150 0,656 8,04±0,72 0,605 15,10±0,49 200 0,652 8,60±0,57 0,595 16,50±0,21 250 0,653 8,42±0,69 0,562 21,13±0,49 300 0,648 9,12±0,16 0,549 23,05±0,08 Berdasarkan data tersebut, THHGV-5 dan THHGV-5 memiliki aktivitas antioksidan HGV-5 konsentrasi rendah sudah mampu (menangkap radikal DPPH) yang lebih baik memberikan aktivitas penangkapan radikal dari HGV-5 dikarenakan tidak DPPH (5 dan 10 mM). Besarnya aktivitas ikatan antioksidan berkorelasi menjadikannya lebih reaktif. THHGV-5 juga positif dengan meningkatnya konsentrasi memiliki jumlah gugus hidroksi yang lebih senyawa, konsentrasi, banyak disertai dengan subtituen berupa semakin besar aktivitas yang diberikan. gugus pendorong elektron yakni dua gugus THHGV-5 mempunyai efikasi dan potensi metoksi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan meningatkatnya densitas elektron pada vitamin E dengan nilai IC50 THHGV-5 gugus sebesar 68,95 µM, HGV-5 sebesar 150,44 memberikan aktivitas yang lebih baik dari µM dan Vitamin E sebesar 226,80 µM vitamin E [11]. (p<0,05). Uji daya resuksi ion feri yang diberikan semakin tinggi rangkap yang hidroksi Senyawa IC50 THHGV-5, HGV-5, VITAMIN E 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 226.80 150.44 konjugasi adanya yang menyebabkan sehingga yang memiliki mampu aktivitas antioksidan yang poten, akan membentuk senyawa kompleks dengan intensitas warna merah yang kuat, dibuktikan dengan 68.95 tingginya absorbansi senyawa kompleks yang terukur. Hal ini dikarenakan semakin THHGV-5 HGV-5 Vitamin E banyak terbentuknya ion fero yang berhasil direduksi oleh senyawa uji dan membentuk kompleks dengan ortofenantrolin. ISBN :978-602-73159-0-7 Pengukuran absorbansai dilakukan pada kompleks fero-fenantrolin yakni 509 nm dan pada saat operating time yakni Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan data persen (%) aktivitas antioksidan seperti pada tabel 2. 1 jam dengan tujuan untuk mendapatkan hasil pengukuran yang stabil. Tabel 2. Daya reduksi HGV-5, THHGV-5, dan Vitamin E terhadap ion feri. THHGV-5 Kadar 5 FRAP (n=3) 0,259 10 HGV-5 Kadar 18,71±1,44 5 FRAP (n=3) 0,285 0,427 30,85±0,38 10 0,375 27,12±2,90 15 0,524 37,89±2,49 25 0,594 42,89±0,55 20 0,607 43,88±5,48 40 0,727 52,53±0,65 % FRAP±SD 63,87±0,56 25 0,884 Persamaan Regresi Linier y = 2,067x + 8,037 R² = 0,952 IC50 = 20,30µM THHGV-7 Kadar FRAP % FRAP±SD (n=3) 17,37±0,33 100 0,240 % FRAP±SD 20,59±0,75 64,47±2,86 50 0,892 Persamaan Regresi Linier y = 0,934x + 17,22 R² = 0,990 IC50 = 35,10µM HGV-7 Kadar FRAP % FRAP±SD (n=3) 16,11±1,97 100 0,223 200 0,267 19,27±0,68 200 0,217 15,66±1,05 400 0,440 31,79±9,87 400 0,215 15,53±0,51 600 0,609 44,03±1,67 600 0,227 16,40±0,55 800 0,690 49,86±1,04 800 0,242 17,49±1,01 1000 0,689 49,78±0,95 1000 0,250 18,06±0,75 Kadar Kadar 100 FRAP (n=3) 0,235 200 THC7 Vitamin E 17,37±1,21 100 FRAP (n=3) 0,247 0,278 19,27±0,36 150 0,258 18,67±0,11 400 0,424 31,79±4,62 200 0,496 35,84±0,19 600 0,513 44,03±3,67 250 0,693 50,10±0,27 800 0,725 49,86±2,15 1000 0,775 49,78±2,73 300 0,844 60,96±0,48 Persamaan Regresi Linier y = 0,463x + 14,44 R² = 0,996 IC50 = 76,80µM % FRAP±SD % FRAP±SD 17,85±0,64 ISBN :978-602-73159-0-7 Data yang diperoleh mendukung data hasil dan daya reduksi terhadap ion feri yang lebih metode DPPH, yakni pada konsentrasi rendah baik dari HGV-5 dan vitamin E. THHGV-5 dan HGV-5 sudah mampu mereduksi ion feri menjadi ion fero (5 dan 10 mM). Besarnya kemampuan mereduksi berkorelasi positif dengan meningkatnya konsentrasi senyawa, semakin tinggi konsentrasi, semakin UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih diucapkan kepada Penelitian Hibah Multidisiplin DIKTI 2012-2014 yang telah mendanai penelitian ini. besar kemampuan yang diberikan. Dari nilai IC50 yang dimiliki masing-masing senyawa, THHGV- DAFTAR RUJUKAN 5 mempunyai efikasi dan potensi paling tinggi dibandingkan HGV-5 dan vitamin E yakni [1] Benzie, I.F.F., and Strain J.J., 1996, The dengan nilai IC50 THHGV-5 sebesar 20,37 µM, ferric reducing ability of plasma as a HGV-5 sebesar 35,12 µM dan Vitamin E measure of “antioxidant power” The FRAP sebesar 76,85 µM pada metode ion feri assay, Analitycal Biochemitical, 239, 70-76. (p<0,05). [2] Goel, A., Kunnumakkara A.B., Aggarwal B.B., 2008, Curcumin as "Curecumin": from IC50 THHGV-5, HGV-5, VITAMIN E 100.00 50.00 kitchen to clinic, Biochem Pharmacol, 75, 76.85 787-809. [3] Jurenka, 35.12 20.37 J.S., Properties 0.00 2009, of Anti-inflammatory Curcumin, a Major Constituentof Curcuma longa: A Review of THHGV-5 THHGV-5 HGV-5 Vitamin E memiliki dan Preclinical kemampuan and Clinical Research, Alternative Med. Review, 14 (2), 141-153. HGV-5 [4] Molyneux, P., 2004, The Use of Stable Free rangkap Radikal Diphenilpicrylhydrazyl (DPPH) for konjugasi yang menyebabkan efek resonansi Estimating Antioxidant Activity, J. Sci. karbonil berkurang dan menjadikannya lebih Technol., 26 (2), 211-219. mereduksi yang dikarenakan tidak lebih baik adanya dari ikatan nonpolar, sehingga kelimpahan elektron di [5] Ravindranath, V., & Chandrasekhara, N., gugus fenolik meningkat dan menyebabkan 1982, Metabolism of Curcumin studies with meningkatnya [3H] Curcumin, Toxicology, 22, 337-344. pula kemungkinan untuk mendonorkan elektronnya [9]. [6] Sardjiman, 2000, Syntesis of Some New Series KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, diperoleh kesimpulan bahwa THHGV5 memiliki daya tangkap terhadap radikal DPPH of Antioxidative, Antibacterial Curcumin Analouge, Antiinflammatory, Activities, Qualitative Structure-Activity Relationship, Disertation, Gadjah Mada University, Yogyakarta. ISBN :978-602-73159-0-7 [7] Sharma, O.P., 1976, Antioxidant activity of curcumin and related compounds, Biochem Pharmacol, 25,1811-1812. kecambah Radikal Dari Biji Bebas Universitas Beberapa Tanaman Familia Gadjah Mada, Yogyakarta. [11]Wibowo, [8] Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap [10]Farmasi H., 2013, Sintesis Tetrahidroheksagamavunon-5 dari Starting Material Heksangamavunon-5 dengan Katalis Paladium Karbon melalui Reaksi Papilionaceae, Jurnal Farmasi Indonesia, 2 Hidrogenasi, (2), 53-61 Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Skripsi, Faklutas Farmasi [9] Utama, D.G.A., 2012, Uji Daya Tangkap [12]Wuryantoko, J., Supardjan, A.M., 1997, Radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil dan Daya Daya Reduksi Kurkumin dan Turunannya Reduksi (4-alkil-kurkumin) terhadap Ion Feri yang Tetrahidropentagamavunon-1 Skripsi, Faklutas Senyawa (THPGV-1), diuji dengan Metode Ortho-fenantrolin Kompleks, Majalah Farmasi Indonesia, 8 (4), 171-178. TANYA JAWAB PENANYA : -