Seleksi bakteri probiotik dari saluran pencernaan untuk
advertisement
SELEKSI BAKTERI PROBIOTIK DARI SALURAN PENCERNAAN UNTUK MENINGKATKAN KINERJA PERTUMBUHAN IKAN JELAWAT Leptobarbus hoeveni Blkr SABARIAH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 SELEKSI BAKTERI PROBIOTIK DARI SALURAN PENCERNAAN UNTUK MENINGKATKAN KINERJA PERTUMBUHAN IKAN JELAWAT Leptobarbus hoeveni Blkr SABARIAH Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010 Judul Tesis : Seleksi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan untuk Meningkatkan Kinerja Pertumbuhan Ikan Jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr Nama : Sabariah NIM : C151070151 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Dedi Jusadi Ketua Dr. Widanarni Anggota Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Akuakuktur Prof. Dr. Enang Harris Tanggal Ujian: 29 Maret 2010 Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS. Tanggal Lulus: Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Nu Bambang Priyo Utomo ABSTRACT SABARIAH. Probiotic Selection from Gut to Increased Growth Performance of Jelawat Fish Leptobarbus hoeveni Blkr. Under supervision of DEDI JUSADI and WIDANARNI. The effect of probiotics isolated from jelawat fish gut Leptobarbus hoeveni supplemented into the diet on enzym activities, growth performance of jelawat fish and digestibility was investigated. A triplicate experiment was conducted using 6-7 g jelawat fish. Each fish was fed on the diet supplemented with either probiotics produce amylase (U4), produce lypase (S1), produce protease (U12), produce protease, lypase and amylase (U7) or control (no supplementation of probiotics). Regardless of the strain, the application of probiotics significantly increased the bacteria population in the fish gut, thereby digestibility and protein retention, food conversion ratio and growth of fish significantly improved. On the other hand, fish fed on the diet supplemented with U4 probiotics had the best growth performance. Therefore, U4 is the best probiotics isolated from the jelawat fish gut to use as a supplementary diet for jelawat fish. Keywords: Probiotics, growth performance, Leptobarbus hoeveni Blkr digestibility, jelawat fish, RINGKASAN SABARIAH. Seleksi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan untuk Meningkatkan Kecernaan Pakan dan Pertumbuhan Ikan Jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr. Dibimbing oleh DEDI JUSADI dan WIDANARNI. Kualitas pakan sangat menentukan laju pertumbuhan ikan. Pakan yang dikonsumsi oleh ikan tidak semuanya dapat dicerna namun ada yang dikeluarkan dalam bentuk limbah berupa feses dan sisa metabolisme lain seperti urin dan amoniak. Besarnya pakan yang dikeluarkan menjadi feses tergantung dari kesesuaian komponen pakan dengan kemampuan enzimatik di saluran pencernaan ikan atau daya cerna. Pakan yang berkualitas selain dihasilkan dari sumber bahan pakan juga dapat dihasilkan dengan penambahan enzim dalam pakan. Peningkatan enzim pencernaan dengan memanfaatkan bakteri saluran pencernaan pada ikan telah banyak dilaporkan. Adanya informasi tentang peranan bakteri dalam saluran pencernaan yang memiliki kemampuan enzimatis atau mampu menyumbangkan enzim kecernaan sehingga membantu proses penyerapan makanan. Berdasarkan informasi tersebut dibuat suatu rancangan penelitian untuk menyeleksi bakteri dari saluran pencernaan ikan jelawat sebagai probiotik untuk meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan jelawat. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro meliputi isolasi bakteri kandidat probiotik, seleksi bakteri kandidat probiotik yang terdiri dari 1) uji aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik, 2) uji pertumbuhan bakteri, 3) uji ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu, 4) uji penempelan, 5) uji aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen. Uji in vivo meliputi: 1) Uji patogenitas bakteri kandidat probiotik serta 2) uji pakan percobaan pada kinerja pertmbuhan. 3) Uji daya cerna pakan dan uji aktivitas enzim saluran pencernaan. Penelitian kinerja pertumbuhan menggunakan Rancangan Acak Lengkap dengan 5 perlakuan dan 3 ulangan. Pakan yang diujikan terdiri dari A) pakan komersial yang tidak ditambahkan probiotik, B) pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease (isolat U12), C) pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil lipase (isolat S1), dan D) pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil amilase (isolat U4), E) pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease, lipase dan amilase (U7). Dari uji in vitro didapatkan beberapa isolat yang mampu menghidrolisis substrat. Adanya kemampuan menghidrolisis protease, lipase dan amilase ini menunjukkan bahwa makromolekul yang menjadi sumber karbon mampu dimanfaatkan oleh bakteri probiotik tersebut. Bakteri kandidat probiotik ini juga mampu menempel pada substrat yang ditunjukkan dengan tingginya populasi bakteri yang menempel per mm2 serta memiliki ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu. Sedangkan hasil uji in vivo berupa uji patagenitas menunjukkan bahwa kandidat probiotik yang diujikan tidak bersifat patogen, sehingga diharapkan mampu bertahan pada saluran pencernaan. Bakteri probiotik yang terpilih yaitu U12, S1, U4 dan U7 karena memenuhi persyaratan untuk dijadikan sebagai probiotik. Pemberian pakan yang ditambahkan bakteri probiotik yang memiliki aktivitas enzim memberikan pengaruh yang nyata (P<0,05) terhadap kinerja pertumbuhan ikan jelawat. Hasil terbaik pertumbuhan ikan jelawat ditunjukkan oleh perlakuan U4 yaitu pemberian pakan yang ditambah isolat yang memiliki aktivitas enzim amilase tertinggi. Kecernaan yang tinggi menyebabkan protein dan energi nutrien pakan yang dapat diserap ikan akan lebih tinggi sehingga energi akan lebih banyak tersimpan untuk pertumbuhan. Perlakuan U4 juga menunjukkan hasil konversi pakan yang paling baik dibandingkan lainnya. Enzim amilase lebih efektif pada ikan jelawat untuk mencerna pakan. Penambahan probiotik pada pakan komersial terhadap ikan uji juga memberikan pengaruh yang nyata pada populasi bakteri di saluran pencernaan ikan uji dibandingkan kontrol. Hal ini memacu peningkatan aktivitas enzim endogenous yang diproduksi oleh bakteri dalam saluran pencernaan. Enzim amilase yang disekresikan oleh isolat U4 mampu meningkatkan kinerja pertumbuhan ikan jelawat. Kelangsungan hidup ikan uji memberikan hasil yang tidak berbeda nyata antar perlakuan. Hal ini mungkin diakibatkan oleh kuantitas serta kualitas pakan yang diberikan cukup untuk mempertahankan kebutuhan pokok ikan serta lingkungan yang terjaga dengan baik selama pemeliharaan. Kata kunci : probiotik, kinerja pertumbuhan, Leptobarbus hoeveni Blkr kecernaan, ikan jelawat, © Hak Cipta Milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya Tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Seleksi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan untuk Meningkatkan Kecernaan Pakan dan Pertumbuhan Ikan Jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr. adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Maret 2010 Sabariah C151070151 PRAKATA Puji yukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini adalah probiotik dengan judul Seleksi Bakteri Probiotik dari Saluran Pencernaan untuk Meningkatkan Kecernaan Pakan dan Pertumbuhan Ikan Jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Dedi Jusadi dan Dr. Widanarni selaku pembimbing, serta Dr. Bambang Priyo Utomo selaku dosen penguji yang telah banyak membantu serta memberikan saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Ranta. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua, suami dan putra tersayang Dimas Sakti Maulana, Dino Prasetyo dan Darnas Seto Mulyo serta kakak dan abang atas doa, cinta dan kasih sayang, pengertian serta dorongan yang selalu diberikan. Terima kasih juga disampaikan kepada teman-teman AKU (Mulyati, Suryati, Mulyasari, Suryansyah, Dominggas, Ratnawati, Dian Retnosari, Denny S, Tita N, Swastika Dita, Indra L, Alias R, Deisi H, Didik A, Limin S, Ellen S, Ujang D, Darmi, Mirna F, Dasu R, Afrizal H, Adang S, Purnamawati, ibu Yulintin, ibu Indira, ibu Ayu, mbak Hesti, Pak Otik, pak Gufron, Pak Andi dan teman-teman AKU lainnya (S2 dan S3 angkatan 2007, 2008 dan 2009). Terima kasih kepada teman-teman di SUPM Negeri Pontianak. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada semua pihak yang telah membantu, baik secara langsung maupun tidak langsung. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan, untuk itu saran dan kritik yang bermanfaat akan penulis terima dengan lapang dada. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Amin. Bogor, Maret 2010 Sabariah RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Teluk Pakedai (Kalimantan Barat) pada tanggal 10 Juni 1975 dari Ayah H. Ambo' Dallek (Almarhum) dan Ibu Hj. Rahmah. Penulis merupakan putra ke lima dari tujuh bersaudara. Pada tahun 1994 penulis lulus dari SUPM Negeri Pontianak dan diterima sebagai tenaga honorer pada SUPM Negeri Bone Sulawesi Selatan. Pada tahun 1999 melanjutkan studi S1 di Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Univ. Muhammadiyah Pontianak dan lulus pada tahun 2003. Tahun 2003 diterima menjadi PNS menjadi guru di SUPM Negeri Pontianak. Pada tahun 2007 penulis melanjutkan studi pada Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana IPB. i DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................. iii DAFTAR GAMBAR ............................................................................ iv DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................... v PENDAHULUAN Latar Belakang ……………………………………................. 1 Perumusan Masalah ………………………………................. 2 Tujuan dan Manfaat Penelitian ……………………................. 3 TINJAUAN PUSTAKA Lingkungan Hidup dan Kebiasaan Makan Ikan Jelawat ........... 4 Pencernaan Ikan Jelawat....………………………………......... 5 Jenis-jenis Probiotik .................................................................. 7 Mekanisme Kerja Bakteri Probiotik .......................................... 9 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................... 11 Tahapan Penelitian....................................................................... 11 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Kandidat Probiotik ................ 11 Seleksi Bakteri ........................................................................ 12 Pengujian Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik.... 12 Penentuan Fase Pertumbuhan Bakteri ................................ 12 Uji Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu .............................................................................. 13 Uji Penempelan ................................................................... 13 Uji Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen ........ 14 Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik pada Ikan Jelawat.. 14 Pakan Percobaan pada Ikan Jelawat.......................................... 15 Uji Pertumbuhan pada Ikan Jelawat........................................... 16 Uji Daya Cerna Pakan............................................................... 18 Uji Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan ……………………. 19 ii Analisis Data ............................................................................. 19 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil .............................................................................................. 20 Isolasi dan Pemurnian Bakteri Kandidat Probiotik ................. 20 Seleksi Bakteri ....................................................................... 20 Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik.................... 20 Fase Pertumbuhan Bakteri ................................................ 21 Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu .............................................................................. 23 Penempelan Bakteri ........................................................... 24 Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen .............. 24 Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik pada Ikan Jelawat .. 25 Pertumbuhan Ikan Jelawat....................................................... 26 Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan ...................................... 27 Pembahasan ………………………………………………......... 28 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan .................................................................................. 32 Saran ........................................................................................... 32 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 33 LAMPIRAN ............................................................................................... 38 iii DAFTAR TABEL Halaman 1. Hasil analisa proksimat pakan komersil yang digunakan.................... 15 2. Laju pertumbuhan harian (LPH ), jumlah konsumsi pakan (JKP), ekonversi pakan (FCR), retensi protein (RP), kecernaan pakan (KP) dan kelangsungan hidup (SR) pada ikan jelawa................................. 26 Log populasi bakteri (PB), aktivitas enzim protease (AEP), aktivitas enzim lipase (AEL) dan aktivitas enzim amilase (AEA) pada ikan jelawat ................................................................................ 28 3. iv DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Skema tata letak akuarium ...................................................................... 16 2. Hasil aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik .................................. 20 3. Diameter hidrolisis enzim oleh isolat proteolitik, lipolitik dan amilolitik. 21 4. Kurva nilai kerapatan optik (Optical Density) .......................................... 22 5. Selisih log (cfu/ml) jumlah bakteri pada pH 2.5 dengan pH normal ....... 23 6. Selisih log (cfu/ml) jumlah bakteri pada pH 7.5 dengan pH normal ...... 23 7. Hasil uji penempelan isolat bakteri pada lempeng baja .......................... 24 8. Aktivitas antagonistik isolat kandidat probiotik terhadap A. hydrophila.. 25 9. Perubahan bobot rata-rata individu ikan jelawat (g) perlakuan kontrol (tanpa probiotik), U12 (protease), S1 (lipase), U4 (amilase) dan U7 (protease, lipase dan amilase) ............................................................ 26 v DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Uji hidrolisis kasein, lemak dan pati .................................................... 38 2. Prosedur penambahan bakteri kandidat probiotik pada pakan komersil yang digunakan……………………………………............... 39 3. Hasil analisa proksimat pakan penelitian (% bobot kering) ................ 39 4. Prosedur analisis nilai kecernaan pakan (Takeuchi. 1988).................... 40 5. Prosedur memperoleh ekstrak enzim usus ikan jelawat ...................... 41 6. Uji aktivitas enzim amilase, protease dan lipase …………………….. 42 7. Nilai kerapatan Optik (Optical density) ….. 44 8. Hasil pengujian ketahanan isolat mikrab amilolitik, proteolitik dan lipolitik terhadap asam lambung dan garam empedu ........................... 45 9. Hasil uji penempelan isolat bakteri amilolitik, proteolitik dan lipolitik pada lempeng baja ................................................................................. 46 10. Aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen …………………….. 46 11. Perhitungan laju konsumsi pakan, laju pertumbuhan harian, efisiensi pakan, kelangsungan hidup dan kecernaan pakan ikan jelawat................................................................................................... 47 12. Perhitungan retensi protein ................................................................... 48 13. Analisis ragam laju konsumsi harian ikan jelawat selama pemeliharaan ........................................................................................ 49 14. Analisis ragam dan uji Duncan laju pertumbuhan harian ikan jelawat selama pemeliharaan ................................................................ 49 15. Analisis ragam dan uji Duncan retensi protein (%) ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 50 16. Analisis ragam dan uji Duncan konversi pakan (%) ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 50 17. Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan protein (%) ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 51 18. Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan total (%) ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 51 19. Perhitungan populasi bakteri, aktivitas enzim protease, lipase dan amilase.................................................................................................... 52 vi 20. Analisis ragam dan uji Duncan populasi bakteri probioik pada ikan jelawat diakhir pemeliharaan ......................................................... 53 21. Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim protease ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 53 22. Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim lipase ikan jelawat selama pemeliharaan ........................................................................... 54 23. Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim amilase ikan jelawat selama pemeliharaan ............................................................................ 54 PENDAHULUAN Latar Belakang Ikan jelawat Leptobarbus hoeveni Blkr adalah jenis ikan air tawar lokal yang digemari oleh masyarakat Riau, Jambi, Sumatera Selatan, Kalimantan Tengah dan Kalimantan Barat (Said 1999). Namun kemungkinan diduga karena kecernaan pakan ikan jelawat rendah, sehingga pertumbuhan ikan jelawat menjadi lambat. Hasil penelitian Truong et al. (2003) dengan lama pemeliharan 60 hari pada fase fingerling dari berat 1,39 g dan panjang 5,10 cm menghasilkan berat 2,54 g dan panjang rata-rata 6,26 cm. Salah satu yang dapat dilakukan untuk meningkatkan pertumbuhan adalah dengan meningkatkan kecernaan pakan melalui penambahan bakteri probiotik. Macey dan Coyne (2005) mengemukakan bahwa probiotik yang mempunyai pengaruh positif bagi inangnya mempunyai beberapa kriteria, antara lain tidak bersifat patogen; sebaiknya merupakan mikroflora normal usus agar lebih mudah menyesuaikan diri dengan lingkungan usus; toleran terhadap asam lambung dan garam empedu; memiliki kemampuan untuk menempel dan mengkoloni sel usus; dan memiliki pengaruh yang menguntungkan terhadap kesehatan. Produk probiotik diharapkan mempunyai sel hidup yang besar yakni berkisar antara 107 sampai 109 cfu/ml. Berdasarkan hasil penelitian Murni (2004) penambahan bakteri probiotik Bacillus sp. dalam pakan buatan mampu meningkatkan laju pertumbuhan ikan gurami, karena aktivitas enzim pencernaan meningkat, yaitu aktivitas enzim protease meningkat dari 0,55 menjadi 0,86 unit/menit/ml dan aktivitas enzim amilase meningkat dari 663,7 menjadi 851,8 unit/menit/ml. Menurut Fardiaz (1992) sebagian dari Bacillus sp. mempunyai sifat proteolitik yang dapat mensekresikan enzim protease, sebagian mempunyai sifat lipolitik yang dapat mensekresikan enzim lipase dan bersifat amilolitik yang dapat mensekresikan enzim amilase. Keberadaan enzim-enzim ini dapat membantu meningkatkan daya cerna ikan, sehingga penggunaan pakan lebih efesien. 2 Beberapa jenis bakteri yang terdapat dalam saluran pencernaan hewan memiliki peran penting dalam rangka meningkatkan pemanfaatan pakan, kesehatan ikan, dan perbaikan mutu lingkungan dan mikroorganisme (Kesarcodi-Watson et al. 2008). Selain itu, beberapa bakteri flora pada saluran pencernaan memainkan peran yang cukup penting dan menghasilkan beberapa jenis enzim dalam saluran pencernaan yang kemungkinan turut berperan dalam metabolisme inang. Karena itu perlu pengkajian bakteri yang terdapat dalam saluran pencernaan ikan jelawat untuk mengetahui potensi enzimnya dalam memacu pertumbuhan ikan jelawat. Perumusan Masalah Ikan jelawat dikelompokkan dalam ikan pemakan tumbuhan (herbivora). Hasil identifikasi pakan di dalam saluran pencernaannya, pakan yang ditemukan adalah biji-bijian, buah-buahan dan tumbuhan air (Balitkanwar 1996). Jenis pakan ini mempunyai kandungan serat yang tinggi, sehingga sulit dicerna dan menyebabkan pertumbuhan ikan jelawat lambat. Penambahan bakteri probiotik dalam pakan buatan akan mempengaruhi kinerja atau aktivitas enzim pencernaan, sehingga proses pencernaan dan penyerapan nutrien pakan oleh tubuh ikan akan lebih baik, yang pada akhirnya pertumbuhan ikan jelawat menjadi lebih cepat. Namun tidak setiap probiotik sesuai untuk semua spesies ikan, hal ini berhubungan dengan aktivitas enzim yang bervariasi. Secara alami aktivitas enzim pencernaan pada ikan berhubungan dengan jenis ikannya. Helver (2002) dan Krogdahl et al. (2005) menyatakan bahwa pada ikan herbivora aktivitas enzim amilase lebih tinggi daripada aktivitas enzim protease dan lipase. Demikian juga aktivitas enzim protease dan lipase ikan omnivora dan karnivora lebih tinggi daripada enzim amilase. Pada ikan jelawat diharapkan probiotik yang diberikan dapat meningkatkan aktivitas enzim sesuai dengan kebutuhannya. Oleh karena itu perlu penelitian bakteri probiotik yang sesuai dan dapat meningkatkan aktivitas enzim percernaan untuk dicampur dalam pakan buatan ikan jelawat, sehingga dapat memberikan pertumbuhan yang maksimal. 3 Tujuan dan Manfaat Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh bakteri dari saluran pencernaan ikan jelawat yang dapat meningkatkan aktivitas enzim pencernaan yang menghasilkan kecernaan pakan tinggi sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan ikan jelawat. Manfaat dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi jenis-jenis bakteri probiotik dari saluran pencernaan yang mampu digunakan sebagai probiotik pada budidaya ikan jelawat. 4 TINJAUAN PUSTAKA Lingkungan Hidup dan Kebiasaan Makan Ikan Jelawat Menurut Said (1999) ikan jelawat merupakan ikan asli perairan umum yang penyebarannya hampir di seluruh Sumatera, Kalimantan, sebagian Jawa dan Sulawesi Utara. Sunarno (1989), mengatakan bahwa ikan jelawat tersebar di perairan-perairan sungai dan daerah genangan atau rawa di Kalimantan dan Sumatera serta kawasan Asia Tenggara dan lainnya seperti Malaysia, Thailand, Vietnam, dan Kamboja. Selanjutnya Asyari dan Gaffar (1993) menyatakan bahwa ikan jelawat banyak di temui di sungai-sungai dan daerah genangan kawasan tengah hingga hilir, bahkan di bagian muara sungai, dan pada saat air menyusut benih ikan jelawat beruaya ke arah bagian hulu sungai. Said (1999) menambahkan bahwa habitat yang di sukai ikan jelawat adalah anak-anak sungai yang berlubuk dan berhutan di bagian pinggirnya. Ikan jelawat memerlukan kondisi fisika dan kimia air yang optimal. Pada umumnya ikan jelawat hidup di perairan yang bersuhu 25–27oC, oksigen terlarut 4–9 ppm dan pH air 6,3–7,5 (Arifin et al. 1992). Namun untuk hidup normal dan tumbuh baik, ikan ini memerlukan suhu 26–28,5oC (Ondara dan Sunarno 1987a), oksigen terlarut 5–7 ppm (Arifin et al. 1992) dan pH air 7,0– 7,5 (Ondara dan Sunarno 1987b). Walaupun diperlukan pH air yang relatif normal untuk hidup dan tumbuh baik, ikan jelawat juga ditemukan hidup pada perairan yang sedikit asam (Arifin et al. 1992). Ikan jelawat yang berukuran besar bersifat omnivora yang cenderung herbivora (Sunarno 1991). Hasil pemeriksaan usus ikan jelawat pada beberapa perairan yang dilakukan oleh Said (1999), menunjukkan bahwa makanan ikan jelawat terdiri dari biji-bijian, buah-buahan dan tumbuhan air. Ikan jelawat yang di pelihara dalam kolam dapat memakan singkong, daun singkong, daun pepaya, ampas dan bungkil kelapa, cincangan daging ikan, ikan rucah, usus ayam dan pakan buatan berbentuk pelet (Sunarno dan Reksalegora 1982). Berdasarkan bentuk mulutnya, ikan jelawat lebih menyukai makanan yang melayang dengan cara menyambar makanan, tetapi ikan jelawat dapat memakan makanan yang berada di dasar perairan. Hasil penelitian Soenarno 5 dan Reksolegora (1982) menyatakan bahwa ikan jelawat yang diberi pakan berbentuk pelet cenderung tumbuh lebih cepat dari pada yang diberi pakan berbentuk gumpalan. Ikan jelawat yang berukuran fingerling dapat mencapai berat 0,6-0,9 kg/ekor selama delapan bulan, lama pemeliharaan ikan konsumsi 4-6 bulan dengan ukuran benih pada saat penebaran antara 12-15 cm. Sedangkan lama pemeliharaan untuk mencapai induk ± 12 bulan (Sunarno 1989). Pencernaan Ikan Jelawat Pencernaan merupakan suatu proses yang berlangsung terus-menerus. Pada umumnya pencernaan makanan adalah proses hidrolisa protein menjadi asam amino atau polipeptida sederhana dan karbohidrat menjadi gula sederhana serta dari lipid menjadi gliserol dan asam lemak (Mohanta et al. 2007). Produksi sari makanan dan hidrolisa nutrien makro pada sistem pencernaan ikan dimungkinkan dengan adanya enzim pencernaan, seperti protease, amilase, karbohidrase dan lipase serta asam lambung. KesarcodiWatson et al. (2008) menyatakan bahwa dalam saluran pencernaan ikan, makanan dicerna dan kemudian diserap melalui dinding usus dan masuk ke dalam sistem peredaran darah. Enzim merupakan katalisator biologis yang dihasilkan oleh sel makhluk hidup untuk membantu proses biokimia. Fungsi katalisator menurut Winarno (1991) adalah untuk mempercepat reaksi kimia dengan membebaskan energi pengaktifan. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Aslamyah (2006) mengatakan bahwa enzim pencernaan yang dihasilkan oleh lambung ikan aktif pada pH 2–4. Kehadiran enzim dalam saluran pencernaan sangat mempengaruhi daya cerna ikan terhadap makanan. Selain enzim dalam saluran pencernaan, kecernaan pakan juga dapat dibantu oleh adanya bakteri dalam usus. Bakteri penghasil enzim akan membantu ikan mencerna pakan dengan bantuan enzim yang dihasilkan oleh bakteri tersebut yaitu protease, lipase dan amilase. Pakan dicerna secara optimal dengan bantuan enzim dalam pakan dan saluran pencernaan ikan, 6 sehingga energi yang dihasilkan dapat digunakan untuk memacu pertumbuhan ikan (Wirawati 2002). Daya cerna ikan terhadap suatu jenis makanan bergantung kepada faktor fisik dan kimia makanan, jenis makanan, umur ikan, sifat fisik dan kimia air serta jumlah enzim pencernaan pada sistem gastrointestinal (Aslamyah 2006). Enzim protease, lipase dan amilase mempengaruhi pencernaan makanan di usus (Murni 2004). Proteolitik merupakan enzim yang berperan dalam hidrolisis protein. Menurut Mohanta et al. (2007) enzim yang paling banyak berperan dalam hidrolisis karbohidrat yaitu amilase seperti yang ditunjukkan oleh ikan mas. Proses kerja enzim dalam pencernaan ikan hampir semuanya sama. Enzim amilase dan lipase tidak hanya terdapat pada ikan herbivora saja, tetapi juga pada ikan karnivora. Keberadaan enzim-enzim pencernaan berhubungan dengan makanan. Helver (2002) menyatakan bahwa pada ikan herbivora aktivitas enzim amilase lebih tinggi daripada protease dan lipase, demikian halnya ikan omnivora dan karnivora aktivitas enzim protease dan lipase lebih tinggi daripada enzim amilase. Daya cerna ikan terhadap suatu makanan bervariasi dari spesies satu ke spesies yang lain. Secara umum daya cerna untuk protein berkisar antara 70 – 90 % dan untuk karbohidrat bervariasi dari 5–15 % untuk tepung selulosa dan glukosa 1 %. Menurut Mohanta et al. (2007) daya cerna ikan terhadap karbohidrat sangat rendah dan tergantung pada spesies ikannya. Keberadaan enzim dalam makanan akan meningkatkan daya cerna ikan terhadap bahan makanan. Helver (2002) menyatakan bahwa enzim eksogenik (berasal dari makanan) sangat berarti bagi pertumbuhan larva atau benih ikan yang mekanisme sekresinya belum berkembang. Menurut Gatesoupe (1999) di dalam saluran pencernaan ikan terdapat bakteri yang menghasilkan enzim pencernaan yang dapat merombak nutrien makro yang masuk melalui pakan untuk kebutuhan bakteri itu sendiri dan memudahkan makanan diserap oleh ikan. 7 Menurut Murni (2004) enzim berperan dalam mengubah laju reaksi, sehingga kecepatan reaksi yang diperlihatkan dapat dijadikan ukuran keaktifan enzim. Affandi et al. (1992) menyatakan bahwa aktivitas enzim dapat dinyatakan antara lain dalam bentuk unit enzim. Aktivitas enzim bergantung pada konsentrasi enzim dan substrat, suhu, pH dan inhibitor. Enzim pencernaan yang disekresikan ke dalam rongga saluran pencernaan berasal dari mukosa lambung, pankreas dan mukosa usus. Enzim-enzim ini berperan sebagai katalisator dalam hidrolis protein, lemak dan karbohidrat menjadi bahan-bahan yang sederhana. Mukosa lambung menghasilkan enzim protease dengan suatu aktivitas proteolitik optimalnya pada pH rendah. Cairan pankreatik kaya akan tripsin, yaitu suatu protease yang aktivitas optimalnya sedikit di bawah pH biasa, disamping itu juga mengandung amilase, maltase dan lipase (Murni 2004). Penelitian Truong et al. (2003) menunjukkan bahwa kecernaan bahan kering, protein, lemak, karbohidrat dan energi pada ikan jelawat 48 g masingmasing sebesar 70,15%; 85,79%; 95,18%; 58,59% dan 76,21%. Law (1986) yang melakukan pengamatan kecernaan pakan ikan jelawat pada berbagai faktor memberikan informasi bahwa kecernaan nutrien, terutama karbohidrat, mempunyai korelasi positif dengan ukuran ikan. Selanjutnya dikatakan bahwa sebagian besar nutrien tepung ikan dapat dicerna oleh ikan jelawat, dan bungkil kelapa lebih mudah dicerna daripada kacang kedele dan jagung. Materi pakan yang telah dicerna selanjutnya akan diserap oleh tubuh. Adanya penyerapan materi ini akan merubah komposisi tubuh ikan yang dapat menunjukkan adanya pertumbuhan. Menurut Gatesoupe (1999) bahwa faktor yang mempengaruhi komposisi tubuh ikan adalah ukuran, umur, jenis pakan dan tingkat kehidupan tertentu. Jenis-jenis Probiotik Kesarcodi-Watson et al. (2008) menyatakan bahwa probiotik merupakan makanan tambahan dalam bentuk mikrob hidup, yang memberi pengaruh menguntungkan bagi inang dengan meningkatkan keseimbangan mikrob dalam saluran pencernaan. 8 Menurut Gatesoupe (1999) pada hewan akuatik, tidak hanya saluran pencernaan yang penting, tetapi juga air yang menjadi habitatnya. Pendapat di atas didukung oleh Kesarcodi-Watson et al. (2008) bahwa pada hewan akuatik selain saluran pencernaan, air disekeliling organisme tersebut juga memegang peranan penting. Oleh karena itu probiotik untuk hewan akuatik adalah agen mikrob hidup yang memberikan pengaruh menguntungkan pada inang dengan memodifikasi komunitas mikrob atau berasosiasi dengan inang, menjamin perbaikan dalam penggunaan pakan atau memperbaiki nilai nutrisinya, memperbaiki respon inang terhadap penyakit atau memperbaiki kualitas lingkungannya. Pemanfaatan beberapa bakteri yang berada dalam wadah budidaya dan tubuh organisme akuatik seperti ikan dan udang sebagai probiotik telah dilakukan dan mampu menunjukkan pengaruh positif terhadap pertumbuhan dan kesehatan melalui peningkatan keseimbangan bakteri dalam tubuh (Nikoskelainen et al. 2003; Villamil et al. 2003; Vine et al. 2004). Beberapa jenis bakteri yang mampu berperan sebagai probiotik pada organisme akuatik yaitu V. alginolyticus, V. harveyi, Pseudomonas sp. Nitrobacter sp. untuk udang, Nitrosomonas sp. dan Bacillus sp. untuk kepiting, V. pelagis, Bacillus toyoi,. Lactobacillus plantarum, L. helveticus dan Streptococcus lactis untuk ikan turbot, Alteromonas sp. untuk Oyster, Rodobacter sp. Vibrio sp. untuk scalop (Gatesoupe 1999)). Bakteri yang dominan terdapat pada air tawar antara lain Aeromonas sp. Plesiomonas, Clostridium sp. Penelitian dengan kultur Lactobacillus sp. 0,2% dan Bacillus subtilis 0,1% yang masing-masing ditambahkan ke dalam pakan menunjukkan adanya peningkatan bobot dan efisiensi pakan pada ikan Rainbow trout. Kultur Bacillus subtilis dalam pakan ayam membantu meningkatkan jumlah Lactobacillus sp. di dinding usus yang pada gilirannya dapat menekan mikroorganisme yang tidak diinginkan seperti E. coli (Balca´zar et al. 2006). Nur dan Fatah (2000) melaporkan bahwa pengkayaan rotifer dengan bakteri probiotik Bacillus sp. pada pakan larva udang menunjukkan tidak ada perbedaan nyata terhadap penambahan panjang larva udang yang diberi probiotik, tetapi memberikan respon pakan yang cukup baik. Rengpipat et al. 9 (2003) mengemukakan bahwa penambahan probiotik Bacillus sp. melalui naupli Artemia memberikan pengaruh nyata dan signifikan terhadap perkembangan larva udang windu. Percobaan serupa telah dibuktikan oleh Hariyati et al. (1998) dengan mengaplikasikan bakteri probiotik melalui media pemeliharaan, yang menunjukkan bahwa penggunaan jasad renik (probion) dapat difungsikan langsung sebagai makanan. Gatesoupe (1999) melaporkan bahwa probiotik merupakan sumber vitamin dan asam amino esensial bagi larva. Selanjutnya Gullian et al. (2004) menyatakan bahwa manfaat probiotik adalah meningkatkan resistensi terhadap infeksi penyakit, meningkatkan laju pertumbuhan, memperbaiki konversi pakan, memperbaiki sistem pencernaan, penyerapan makanan yang lebih baik dan melengkapi nutrien esensial. Mekanisme Kerja Bakteri Probiotik Menurut Verschuere et al. (2000) mekanisme kerja bakteri probiotik dapat dibagi menjadi beberapa cara, yaitu (1) produksi senyawa inhibitor; (2) kompetisi terhadap senyawa kimia atau sumber energi (nutrisi); (3) kompetisi terhadap tempat pelekatan; (4) peningkatan respon imun (kekebalan); (5) perbaikan kualitas air; (6) interaksi dengan fitoplankton. Substansi antibakterial telah dihasilkan oleh beberapa bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan budidaya air tawar terhadap beberapa strain patogen antara lain A. hydrophila (Sugita et al. 1996). Probiotik untuk akuakultur umumnya hanya diseleksi berdasarkan kemampuannya menghasilkan senyawa antibakteri, walaupun demikian pelekatan pada mukosa usus juga penting agar mereka tetap berada pada usus inang. Kompetisi terhadap tempat pelekatan terjadi antara kandidat probiotik (API-AP5) yang diisolasi dari ikan badut (Amphiprion percula L) terhadap bakteri patogen A. hydrophila dan V. Alginolyticus. Kandidat probiotik tersebut mempunyai kemampuan untuk melekat pada mukosa usus ikan dan berkompetisi dengan bakteri patogen, sehingga dengan penambahan bakteri probiotik akan mengurangi pelekatan bakteri patogen (Vine et al. 2004). Perbaikan kualitas air dengan penggunaan bakteri probiotik seperti Bacillus sp. dan Nitrobacter sp. telah dilaporkan Gatesoupe (1999), yaitu 10 dengan meningkatnya perombakan bahan organik dalam wadah pemeliharaan ikan. Interaksi bakteri probiotik-fitoplankton secara tidak langsung dapat meningkatan pertumbuhan dan kelangsungan hidup organisme budidaya. Hasil penelitian Douillet dan Langdon (1994) menunjukkan bahwa penambahan bakteri galur CA2 (belum diketahui spesiesnya) ke dalam kultur alga dapat meningkatkan nilai nutrisi dari alga tersebut dan selanjutnya dapat meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup larva kerang. 11 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai dengan tahap isolasi dan seleksi bakteri kandidat probiotik yang dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB, dengan menggunakan ikan jelawat yang berasal dari Unit Pembenihan Ikan Sentral Anjongan Kalimantan Barat. Tahap isolasi dan seleksi bakteri kandidat probiotik ini dilakukan mulai bulan Desember 2008 sampai Februari 2009. Tahap selanjutnya yaitu percobaan pemeliharaan ikan jelawat yang dilakukan di Laboratorium Lapangan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB dari bulan April sampai Juni 2009. Tahapan Penelitian Isolasi dan Pemurnian Bakteri Kandidat Probiotik Bakteri diisolasi dari saluran pencernaan (usus) 10 ekor ikan jelawat berukuran 15 g/ekor yang dipelihara di Laboratorium Lapangan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Usus ditimbang dan diukur panjangnya, kemudian digerus dan setiap 1 g diencerkan dengan 9 ml larutan fisiologis (NaCl 0,85%) steril. Pengenceran berseri dilakukan dari 10-2 sampai 10-10 dengan cara mengambil 0,1 ml dari tempat penggerusan dan dimasukkan pada eppendorf sebagai pengenceran pertama, selanjutnya dari eppendorf pertama diambil sebanyak 0,1 ml untuk pengenceran kedua dan seterusnya hingga pengenceran terakhir yaitu pengenceran ke sepuluh. Inokulum yang dikultur dengan metode cawan sebar pada media TSA adalah pengenceran ke sembilan dan ke sepuluh. Kultur ini kemudian diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam agar bakteri tumbuh. Isolat yang digunakan adalah isolat yang tumbuh secara terpisah. Isolat diambil dengan jarum ose yang digoreskan di media TSA pada cawan petri, kemudian diinkubasi pada suhu 29oC selama 24 jam. Dari media TSA pada cawan petri, isolat dimurnikan lagi pada media TSA di agar miring pada 12 tabung reaksi. Metode purifikasi dilakukan berulang-ulang dengan teknik dan media yang sama sampai didapatkan koloni bakteri tunggal dan seragam. Seleksi Bakteri Percobaan ini bertujuan untuk menemukan bakteri yang berpotensi tinggi untuk dipilih sebagai probiotik. Seleksi bakteri dilakukan melalui tahapan 1) pengujian aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik; 2) fase pertumbuhan bakteri; 3) ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu; 4) uji penempelan dan 5) pengujian aktivitas antagonistik dengan bakteri patogen. Pengujian Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik Pengujian ini bertujuan untuk mengukur besarnya kemampuan aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik dari masing masing isolat yang diuji melalui uji hidrolisis kasein, lemak dan pati (Lampiran 1). Hidrolisis protein ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling isolat yang ditumbuhkan pada media agar dengan penambahan kasein. Hasil hidrolisis lemak ditandai dengan adanya warna kehijauan pada isolat yang ditumbuhkan pada media agar dengan penambahan lemak (minyak zaitun) dan hidrolisis pati (amilum) ditandai dengan perubahan warna zona isolat menjadi kuning cerah pada media agar dengan penambahan pati. Penentuan Fase Pertumbuhan Bakteri Pencapaian fase ekponensial bakteri dapat ditentukan dengan fase pertumbuhan bakteri. Persiapan kultur dilakukan dengan cara menginokulasikan 0,1 ml isolat bakteri ke dalam 10 ml media kultur cair dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 29°C. Sediaan ini disebut kultur segar yang kemudian diambil 1 ml dan diinokulasikan ke dalam media kultur steril 100 ml dan diinkubasi kembali pada suhu 29°C. Pertumbuhan bakteri diamati setiap 2 jam dengan mengukur nilai kerapatan atau optical density (OD) dengan menggunakan alat spektrofotometer, dengan panjang gelombang 620 nm (Hadioetomo 1990). 13 Uji Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu Untuk bertahan dalam lambung dan saluran pencernaan yang ber-pH rendah diuji dengan ketahanan asam lambung dan garam empedu. Metode ini mengacu pada Ngatirah et al. (2000) yaitu dengan menginokulasikan 1 ml isolat bakteri ke dalam satu seri tabung yang berisi 9 ml larutan media steril dengan pH 2,5 (diatur dengan penambahan HCL) dan pH 7,5 (diatur dengan penambahan NaOH) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 29°C. Selanjutnya sel bakteri yang tumbuh dihitung dengan metode hitungan cawan setiap 2, 4, 6 dan 8 jam. Ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu ditentukan oleh selisih jumlah koloni antara kontrol (pH 7,0) dan perlakuan (pH 2,5 dan pH 7,5). Semakin kecil selisihnya maka semakin tahan terhadap asam larnbung dan garam empedu. Uji Penempelan Uji ini mengacu pada metode berdasarkan Dewanti dan Wong (1993) yang menggunakan lempeng baja. Terlebih dahulu lempeng baja disterilkan dengan cara direndam dalam larutan deterjen yang dipanaskan sampai mencapai suhu 40-45°C selama 24 jam, kemudian lempeng baja dibilas dengan air panas 40-50°C sampai bersih lalu dikeringanginkan, selanjutnya diautoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit. Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan lempeng baja di dalam erlenmeyer 1 L dengan posisi berdiri. Erlenmeyer sebelumnya telah diisi dengan 250 ml TSB steril dan telah diinokulasi 1 ml kultur segar bakteri. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil dan ditempatkan dalam shaker selama 24 jam pada suhu 29°C. Setelah 24 jam lempeng baja dibilas dengan larutan buffer fosfat (BF). Kemudian permukaan lempeng diseka secara merata dengan menggunakan swab. Swab dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml BF dan divortex selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan pengenceran serial dan dihitung populasi bakteri dengan metode hitungan cawan. Jumlah bakteri yang tumbuh pada media dalam erlenmeyer juga dihitung dengan cara mengambil 1 ml cairan dari media tumbuh dan 14 diencerkan dengan 9 ml buffer fosfat. Selanjutnya dilakukan penghitungan populasi bakteri yang tumbuh dengan metode hitung cawan. Bakteri yang mampu membentuk biofilm dengan baik akan mampu menempel pada substrat yaitu usus. Uji Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen Bakteri hasil isolasi diuji kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila dengan metode Kirby-Bauer (Lay, 1994). Biakan cair bakteri kandidat probiotik dan bakteri A. hydrophila yang diinkubasi pada suhu 29OC dan berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki konsentrasi yang sama (107 cfu/ml). Bakteri A. hydrophila dalam media cair diambil sebanyak 0,1 ml, lalu disebarkan dengan batang penyebar pada media TSA pada cawan petri. Selanjutnya masing-masing bakteri kandidat probiotik diambil dan dimasukkan dalam eppendorf dan kertas cakram (diameter 6 mm) direndam dalam eppendorf berisi suspensi bakteri kandidat probiotik tersebut selama beberapa saat. Kertas cakram kemudian diambil dengan menggunakan pinset steril dan ditempatkan pada cawan petri yang telah disebari bakteri A. hydrophila. Setiap cawan petri ditempatkan 3 kertas cakram yang berasal dari satu bakteri kandidat probiotik dan ditambah dengan satu kertas cakram yang telah direndam dengan larutan fisiologis sebagai kontrol. Masing-masing isolat bakteri kandidat probiotik diuji daya hambatnya dengan bakteri A. hydrophila yang digunakan dengan tiga kali ulangan. Isolat yang menghasilkan zona bening berarti menunjukkan kemampuan menghambat bakteri A. hydrophila. Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik pada Ikan Jelawat Uji patogenisitas dilakukan untuk melihat apakah bakteri yang diberikan bersifat patogen atau tidak terhadap ikan jelawat. Uji ini dilakukan dengan cara menyuntikkan bakteri kandidat probiotik secara intramuskular dengan konsentrasi 107 cfu/ml. Ikan dipelihara selama 7 hari dan diamati setiap hari. Pada akhir pemeliharaan tingkat kelangsungan hidup ikan jelawat dihitung dan dibandingkan dengan kontrol yakni ikan yang disuntik dengan 15 larutan fisiologis. Kandidat probiotik yang akan digunakan adalah bakteri yang tidak bersifat patogen yakni bakteri yang tidak menyebabkan ikan jelawat sakit dan mati pada saat uji patogenisitas ini. Pakan Percobaan pada Ikan Jelawat Pakan yang digunakan yaitu pakan komersial (Tabel 1) dan ditambahkan kandidat probiotik. Sebelum dicampurkan ke dalam pakan dilakukan kultur cair yang ditempatkan dalam shaker dengan suhu 29°C dengan kecepatan 180 rpm dan dilakukan pemanenan sesuai waktu pencapaian fase eksponensial. Hasil kultur bakteri yang didapat dipindahkan ke dalam tabung ulir dan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Hasil endapan bakteri probiotik inilah yang dicampurkan ke dalam pakan (Lampiran 2). Probiotik sebanyak 10 g/kg (Wang 2007) ditambahkan ke dalam pakan dengan cara disemprotkan secara merata menggunakan spuit dengan menambahkan 2% kuning telur. Kemudian pakan dianalisa proksimat kembali dengan hasil seperti terlihat pada Lampiran 3. Tabel 1 Hasil analisa proksimat pakan komersil yang digunakan Komposisi Kandungan (%) Protein Lemak Serat kasar Kadar Abu Kadar Air 36,96 3,50 1,37 11,67 7,80 Pakan yang diberikan pada percobaan ini terdiri dari 1. Pakan komersial yang tidak ditambahkan probiotik. 2. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease (isolat U12). 3. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil lipase (isolat S1). 4. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil amilase (isolat U4). 5. Pakan komersial yang ditambah isolat terbaik penghasil protease, lipase dan amilase (U7). 16 Selanjutnya pakan ini diberikan pada ikan jelawat selama percobaan pemeliharaan untuk selanjutnya dilakukan uji pertumbuhan, uji daya cerna dan uji aktivitas enzim saluran pencernaan. Uji Pertumbuhan pada Ikan Jelawat Pemeliharaan ikan dilakukan pada wadah akuarium yang berukuran 50 x 50 x 40 cm sebanyak 15 buah. Sisi bagian luar akuarium ditutup dengan plastik hitam untuk memberikan rasa aman ikan dari gangguan luar. Sebelum digunakan, semua peralatan diberi desinfektan dengan kaporit. Akuarium diisi air yang berasal dari tandon dengan ketinggian 70%. Air dari tandon disaring terlebih dahulu dan diaerasi tinggi. Air disterilkan selama 3 hari dan pada hari ke empat ikan dimasukkan ke dalam akuarium. 1 2 C2 6 3 A2 7 E2 11 8 D1 12 A3 4 B1 9 B3 13 C1 5 E1 10 C3 14 E3 B2 D3 15 D2 A1 Keterangan : A : Kontrol D : Amilase B : Protease E : Gabungan (Protease, lipase dan amilase) C : Lipase Gambar 1 Skema tata letak akuarium. Ikan jelawat dengan bobot rata-rata 5,69 ± 0,04 g ditebar dengan kepadatan 10 ekor per wadah. Pemeliharaan ikan dilakukan selama 60 hari dan diberi pakan satiation sebanyak tiga kali sehari, yaitu pukul 07.00, 12.00 dan 17.00. Penggantian air dilakukan setiap hari sebanyak 10% dan penyiponan dilakukan setiap pagi hari untuk membersihkan sisa pakan dan feses. Jumlah pakan yang diberikan selama pemeliharaan ditimbang dan dicatat untuk menghitung konversi pakan dan Untuk mengetahui laju pertumbuhan ikan dilakukan sampling setiap 10 hari sekali. Untuk menghitung retensi protein, tubuh ikan jelawat pada akhir penelitian dianalisa proksimat. Pengukuran 17 kualitas air dilakukan pada awal, tengah dan akhir pemeliharaan meliputi pH (6,94-7,42), suhu (29-310C), dissolve oksigen (DO) (4,1-5,65 mg/l) dan amoniak (0,017-0,107 mg/l). Pada uji pertumbuhan ini dianalisis beberapa parameter yaitu : 1. Laju Pertumbuhan Harian Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus yang dikemukakan oleh Huisman (1976) : α = ⎡ ⎢ ⎣ Wt Wo t ⎤ − 1 ⎥ × 100 ⎦ Keterangan: α = Wt = W0 = t = 2. Jumlah Konsumsi Pakan % Laju pertumbuhan harian (%) Bobot akhir (g) Bobot awal (g) Waktu Jumlah konsumsi pakan merupakan jumlah pakan yang dikonsumsi oleh ikan selama pemeliharaan. Jumlah konsumsi pakan dapat dihitung dengan cara menimbang jumlah pakan yang dikonsumsi ikan setiap harinya selama masa pemeliharaan. 3. Konversi Pakan Konversi pakan dihitung menggunakan rumus yang dikemukakan NRC (1983) FCR = F ((Wt + D ) − Wo ) Keterangan : FCR F Wt Wo D 4. Retensi Protein = = = = = Konversi pakan Bobot pakan yang diberikan selama percobaan (g) Bobot ikan pada akhir penelitian (g) Bobot ikan pada awal penelitian (g) Jumlah bobot ikan yang mati selama penelitian (g) Retensi protein dihitung dengan rumus yang dikemukakan oleh Takeuchi (1988): RP = Keterangan : Pu × 100 % Pe RP = Retensi protein Pu = Bobot protein yang disimpan dalam tubuh (g) Pe = Bobot protein yang dikonsumsi oleh ikan (g) 18 5. Kelangsungan Hidup Perhitungan kelangsungan hidup berdasarkan rumus (Effendi, 2002). SR = Nt × 100 % No Keterangan : SR Nt (ekor) No = Kelangsungan hidup ikan (%) = Jumlah ikan yang hidup pada akhir penelitian = Jumlah ikan yang hidup pada awal penelitian (ekor) 6. Populasi Bakteri Probiotik Pengamatan populasi bakteri dalam saluran pencernaan ikan dilakukan pada akhir penelitian. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan kontrol secara deskriptif. Uji Daya Cerna Pakan Pengujian daya cerna pakan dilakukan secara terpisah dari uji pertumbuhan. Pakan yang akan digunakan dihaluskan menjadi serbuk dan ditambahkan 0,6 % Cr2O3 sebagai indikator kecernaan dan CMC sebesar 20 g/kg pakan sebagai perekat (Watanabe 1988). Selanjutnya pakan serbuk dibuat pelet lagi dan dikeringkan. Pakan diberikan pada ikan selama seminggu dan pada hari ketujuh dilakukan pengumpulan feses ikan dengan cara menyipon akuarium dengan selang kecil dan ditampung dalam ember. Selanjutnya disaring dan feses yang terkumpul ditempatkan pada botol film untuk selanjutnya dianalisa. Feses yang terkumpul dikeringkan dalam oven bersuhu 110°C selama 4-6 jam. Selanjutnya dilakukan analisa kandungan Cr2O3 terhadap feses yang sudah dikeringkan (Lampiran 4). Nilai kecernaan dihitung berdasarkan Takeuchi (1988) : Kecernaan protein (%) = 1-(a'/a )/(b'/b) x 100 Kecernaan Total (%) = 1-(a'/a ) x 100 Keterangan : a = % Cr2O3 dalam pakan a" = % Cr2O3 dalam feses b' = % protein dalam feses b = % protein dalam pakan 19 Uji Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan Uji aktivitas enzim dilakukan pada saluran pencernaan ikan di akhir penelitian. Hal ini dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya pengaruh dari penambahan probiotik pada pakan yang diberikan dibandingkan kontrol. Ikan diambil sebanyak 2 ekor dari setiap akuarium kemudian dibedah untuk diambil saluran pencernaannya. Preparasi ekstrak enzim saluran pencernaan ikan ini dilakukan pada suhu 4°C (Lampiran 5). Saluran pencernaan ikan kemudian dicuci dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas penghisap. Selanjutnya usus ditimbang dan dihomogenkan dengan menambahkan larutan buffer 10 ml. Setelah homogen lalu disentrifuse selama 20 menit pada 1200 rpm untuk mendapatkan supernatan yang akan digunakan pada pengujian selanjutnya yaitu aktivitas enzim (Lampiran 6). Analisis Data Penelitian ini dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) yang terdiri dari empat perlakuan dan tiga ulangan. Data yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan analisis sidik ragam pada tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat pengaruh antar perlakuan terhadap masing-masing peubah yang diamati (Mattjik dan Sumertajaya 2000). 20 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi dan Pemurnian Bakteri Kandidat Probiotik Bakteri yang berhasil diisolasi dari saluran pencernaan ikan jelawat sebanyak 40 isolat. Morfologi koloni isolat tersebut pada media TSA berwarna putih, krem, transparan, kuning dan kuning krem dengan bentuk bundar, tak beraturan, menyebar, membulat dan menyebar tidak rata. Seleksi Bakteri Aktivitas Proteolitik, Lipolitik dan Amilolitik Hasil uji aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik terhadap bakteri kandidat probiotik disajikan pada Gambar 2. Hasil uji aktivitas proteolitik ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni isolat, aktivitas lipolitik ditunjukkan dengan adanya warna hijau di sekeliling koloni isolat dan aktivitas amilolitik ditandai zona kuning bening di daerah isolat yang ditumbuhkan. aktivitas proteolitik amilolitik aktivitas lipolitik aktivitas Gambar 2 Hasil aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik. Hasil uji aktivitas proteolitik, lipolitik dan amilolitik memperlihatkan bahwa hampir semua isolat positif menghidrolisis sumber karbonnya, yang ditandai dengan adanya zona bening dan warna hijau di sekitar koloni. Hal tersebut menunjukkan bahwa makromolekul yang menjadi sumber karbon sudah dimanfaatkan sebagai sumber energi oleh bakteri. Aktivitas proteolitik terbesar diperlihatkan oleh isolat U12 dengan diameter 18 mm, aktivitas lipolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat S1 dengan diameter 17 mm pada 21 koloni yang berwarna hijau terang, aktivitas amilolitik terbesar diperlihatkan oleh isolat U4 dengan diameter 22 mm, sedangkan isolat yang mampu menghasilkan gabungan protease, lipase dan amilase terbesar diperlihatkan oleh isolat U7 (Gambar 3). berdasarkan tahapan Isolat-isolat tersebut selanjutnya diuji lanjut seleksi bakteri probiotik. Adanya kemampuan menghidrolisi protein, lemak dan pati ini menunjukkan bahwa isolat-isolat tersebut mampu memanfaatkan sumber energi yaitu kasein, lemak dan pati yang ditambahkan pada media menjadi sumber karbon. U12 Diameter hidrolisis (mm) 25 U8 U16 20 M9 S1 15 S6 U5 10 U4 5 P10 U7 0 Protease Lipase Amilase U6 U9 Aktivitas Enzim Gambar 3 Diameter hidrolisis enzim oleh isolat proteolitik, lipolitik dan amilolitik. Fase Pertumbuhan Bakteri Pengamatan fase pertumbuhan bakteri dilakukan dengan mengamati perubahan populasi dan nilai kerapatan optik (Optical Density = OD) (Lampiran 7). Hal ini berhubungan dengan panen sel yang tepat untuk memproduksi suatu produk atau senyawa metabolit, antara lain enzim, antibakterial, vitamin, asam organik, asam lemak, asam amino dan peptida. Menurut Irianto (2003) fase exsponensial tercepat merupakan bakteri yang cukup baik digunakan sebagai probiotik. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa isolat U4, U12, S1 dan U7 memiliki fase pertumbuhan tercepat yakni masing-masing mencapai akhir fase eksponensial pada jam ke-12 dan mulai menurun pada jam ke-14 (Gambar 4). 22 U8 U12 1.0 0.5 O ptic al dens ity O p tic al d en s ity 1.5 1.0 0.5 0.0 0 4 8 12 16 20 M9 4 8 O p tic al d en s ity 1.0 0 16 20 2.0 1.5 1.0 1.0 0.5 0.0 24 0 4 8 0 12 16 20 24 2 1.0 0.5 Optic al dens ity O p tic al d en s ity 1.5 1.5 1.0 0.5 1.5 1 0.5 0.0 0.0 0 0 12 16 20 24 4 8 12 16 20 24 U7 1.5 1.0 0.5 0.0 8 12 16 20 24 12 16 20 24 U9 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) 8 2.0 O p tic al d en s ity 1.5 O p tic al d en s ity 2.0 4 4 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) U6 2.0 0 0 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) P eriode peng a ma ta n (ja m) 12 16 20 24 P 10 2.0 8 8 U4 U5 4 4 P eriode peng a ma ta n (ja m) P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) 2.0 12 16 20 24 1.5 P e riode pe ng a m a ta n (ja m) 0 8 S6 0.0 12 4 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) 0.5 0.5 0.0 O p tic al d en s ity 12 16 20 24 S1 2.0 1.5 8 0.5 P e riode peng a m a ta n (ja m ) 2.0 4 1.0 0.0 0 24 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) 0 1.5 O p tic al d en s ity O p tic al d en s ity 1.5 0.0 O p tic al d en s ity 2.0 2.0 2.0 Optic al dens ity U16 0 4 8 12 16 20 24 P eriode pe ng a m a ta n (ja m) 0 4 8 12 16 20 24 P e riode pe ng a m a ta n (ja m ) Gambar 4 Kurva nilai kerapatan Optik (Optical Density). 23 Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu Toleransi terhadap asam merupakan salah satu syarat penting suatu isolat untuk dijadikan kandidat probiotik. Hasil dari pengujian ketahanan asam lambung dan garam empedu masing-masing disajikan pada Gambar 5, Gambar 6 dan Lampiran 8. 2 jam Populasi bakteri (Log cfu/ml) pH 2.5 4 jam 6 jam 8 jam 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 U12 U8 U16 M9 S1 S6 U5 U4 P10 U7 U6 U9 Isolat Gambar 5 Selisih log (cfu/ml) jumlah bakteri pada pH 2.5 dengan pH normal. 2 jam pH 7.5 4 jam 6 jam 8 jam Populasi bakteri (Log cfu/ml) 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 U12 U8 U16 M9 S1 S6 U5 U4 P10 U7 U6 U9 Isolat Gambar 6 Selisih log (cfu/ml) jumlah bakteri pada pH 7,5 dengan pH normal. Hasil pengujian terhadap asam lambung menunjukkan bahwa isolat U12, S1, U4 dan U7 memiliki selisih terkecil yang berarti lebih tahan terhadap pH asam lambung dibandingkan isolat lainnya. Isolat harus tahan terhadap pH asam lambung untuk mampu bertahan hidup dalam saluran pencernaan. Apabila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam maka membran sel dapat mengalami kerusakan dan berakibat pada hilangnya komponen- 24 komponen intraseluler seperti Mg, K dan lemak dari sel tersebut, dan pada akhirnya kerusakan ini dapat mengakibatkan kematian sel. Hasil pengujian terhadap garam empedu menunjukkan bahwa isolat U4 merupakan isolat yang paling mampu beradaptasi karena selisih log populasinya paling kecil diantara semua isolat. Penempelan Bakteri Faktor penempelan atau adherence factor merupakan faktor yang dimiliki oleh bakteri untuk menempel dan membentuk biofilm pada permukaan padat. Ha1 yang mempengaruhi sifat penempelan bakteri pada permukaan padat adalah sifat hidrofobisitas antar sel bakteri, jarak antar sel dan adanya reseptor pada sel inang. Uji penempelan terhadap kandidat probiotik memberikan hasil yang berbeda pada setiap kandidat probiotik seperti ditunjukkan pada Gambar 7 dan Lampiran 9. Untuk kandidat probiotik terpilih (U12, S1, U4 dan U7) menunjukkan adanya kemampuan menempel pada substrat. Isolat U4 memiliki jumlah koloni 2,9 x 108 koloni /mm2 yang artinya isolat ini mampu menempel dengan baik. 8 Jumlah populasi bakteri/mm (x 10 ) 4 3 2.87 2.78 2.64 2 2.49 3 2.21 2.16 2 1.69 1.57 2 1.16 2.32 1.27 1.10 1 1 0 U12 U8 U16 M9 S1 S6 U5 U4 P10 U7 U6 U9 Isolat Bakteri Gambar 7 Hasil uji penempelan isolat bakteri pada lempeng baja. Aktivitas Antagonistik terhadap Bakteri Patogen Hasil uji aktivitas antagonistik membuktikan bahwa isolat bakteri kandidat probiotik rata-rata memiliki daya hambat terhadap bakteri patogen 25 yaitu A. hydrophila dimana aktivitas ini ditandai dengan adanya zona hambat di sekeliling isolat yang ditanam. Hasil pengukuran zona hambat isolat kandidat probiotik disajikan pada Gambar 8 dan Lampiran 10. Zona hambat terbaik dihasilkan oleh isolat bakteri proteolitik yaitu U12 dengan diameter 11 mm, isolat bakteri lipolitik yaitu S1 dengan diameter 12 mm dan isolat amilolitik yaitu isolat U4 dengan diameter 12 mm serta isolat bakteri gabungan proteolitik, lipolitik dan amilolitik yaitu isolat U7 dengan diameter 10 mm. Kandidat probiotik diharapkan mampu menekan atau memiliki aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen dalam saluran pencernaan. Aktivitas antagonistik tersebut dapat terjadi karena kandidat probiotik mampu menghasilkan senyawa antibakteri. Pada penelitian ini aktivitas antagonistik bakteri kandidat probiotik ditujukan untuk bakteri patogen ikan jelawat yaitu A. hydrophila. 14 Diameter zona hambat (mm) 12 12 12 11 10 10 9 8 8 7 7 7 6 7 6 6 4 2 0 U12 U8 U16 M9 S1 S6 U5 U4 P10 U7 U6 U9 Isolat Bakteri Gambar 8 Aktivitas antagonistik isolat kandidat probiotik terhadap A. hydrophila. Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik pada Ikan Jelawat Hasil yang didapat dari uji patogenisitas membuktikan bahwa kandidat probiotik yang terpilih (U12, S1, U4 dan U7) tidak bersifat patogen. Hal ini dibuktikan dari hasil kelangsungan hidup ikan jelawat 100 %. Ikan jelawat yang disuntik dengan isolat bakteri kandidat probiotik mampu bertahan hidup selama masa uji dan kondisi tubuhnya tidak ada perbedaan dengan ikan kontrol atau yang disuntik dengan larutan fisiologis. Dengan hasil ini maka kandidat probiotik dapat diaplikasikan sebagai probiotik melalui penambahan pada pakan yang akan diberikan pada ikan jelawat. 26 Kinerja Pertumbuhan Ikan Jelawat Hasil penelitian menunjukkan adanya pertumbuhan pada ikan jelawat. 35 27,75 27,00 27,43 25,50 26,66 30 25 ikan (g) Perubahan bobot rata-rata individu Perubahan bobot biomassa ikan jelawat setelah 60 hari terlihat pada Gambar 9. 20 Awal 15 Akhir 10 5,69 5,69 5,69 5,66 5,68 5 0 Kontrol U12 S1 U4 U7 Perlakuan Gambar 9 Perubahan bobot rata-rata individu ikan jelawat (g) perlakuan kontrol (tanpa probiotik), U12 (protease), S1 (lipase), U4 (amilase) dan U7 (protease, lipase dan amilase). Hasil uji kinerja pertumbuhan disajikan pada Tabel 2, Lampiran 11 dan 12 yang meliputi beberapa parameter yang dianalisis. Pemberian pakan yang ditambah bakteri kandidat probiotik yang memiliki aktivitas enzim memberikan pengaruh yang nyata (P≤0.05) terhadap pertumbuhan ikan jelawat dibandingkan dengan pertumbuhan ikan jelawat yang diberikan pakan kontrol atau tanpa penambahan probiotik. Tabel 2 Laju pertumbuhan harian (LPH), jumlah konsumsi pakan (JKP), konversi pakan (FCR), retensi protein (RP), kecernaan protein (KP), kecernaan total (KT) dan kelangsungan hidup (SR) pada ikan jelawat Perlakuan Parameter kontrol U12 a S1 c U4 U7 2,68 ± 0,01 2,60 ± 0,03b 413,18 ± 3,66a 419,14 ± 4,68a 418,71 ± 24,55a 1,94 ± 0,09b 1,94 ± 0,02b 1,90 ±0,04b 2,00 ± 0,07b 18,62± 0,04a 18,42 ± 0,76a 18,86 ± 0,59a 22,30±1,18b 20,99 ± 1,24c KP (%) 88,62±0,84a 91,31±0,56b 90,40±0,88b 92,70±0,35c 91,44±0,63b KT (%) a 77,97±0,91 81,42±1,24 b b c 82,57±0,83 82,14±0,45bc SR (%) 100 100 100 100 LPH (%) 2,53 ± 0,02 2,66 ± 0,02 JKP (%) 419,13 ± 3,57a 420,7 ± 21,16a FCR (%) 2,12 ± 0,03a RP (%) 2,63 ± 0,01 81,13±0,71 100 b c Keterangan : Huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan antar perlakuan (p≤0,05). 27 Hasil terbaik laju pertumbuhan ikan jelawat ditunjukkan oleh perlakuan U4 yaitu pemberian pakan yang ditambah isolat yang memiliki aktivitas enzim amilase dan perlakuan U12 yaitu pemberian pakan yang ditambah isolat yang memiliki aktivitas enzim protease. Laju pertumbuhan ikan jelawat pada kedua perlakuan ini relatif sama dan lebih baik dibandingkan perlakuan lainnya. Hal ini juga didukung dengan nilai kecernaan protein yang lebih tinggi (92,70±0,35). Semua perlakuan dengan penambahan probiotik juga menunjukkan hasil konversi pakan yang lebih baik dibandingkan kontrol. Kelangsungan hidup selama pemeliharaan ikan jelawat menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara perlakuan dengan kontrol (Lampiran 13, 14, 15, 16, 17 dan 18). Aktivitas Enzim Saluran Pencernaan Berdasarkan hasil analisis aktivitas enzim pada saluran pencernaan ikan jelawat menunjukkan bahwa aktivitas enzim protease, lipase dan amilase (Lampiran 19) bakteri mampu menghidrolisis protein, lemak dan karbohidrot pada uji in vitro. Sehingga pada saat uji in vivo dengan ditambahkan dalam pakan mampu meningkatkan kecernaan pakan pada ikan jelawat. Tabel 3 menunjukkan terdapat perbedaan yang signifikan antar perlakuan jumlah populasi bakteri pada saluran pencernaan ikan jelawat, yaitu aktivitas enzim protease, aktivitas enzim lipase dan aktivitas enzim amilase. Populasi bakteri disaluran pencernaan ikan jelawat pada akhir penelitian menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antara perlakuan penambahan probiotik dengan kontrol (Lampiran 20, 21, 22 dan 23). Hal ini memicu peningkatan aktivitas enzim endogenous yang diproduksi oleh bakteri dalam saluran pencernaan. Ini membuktikan bahwa populasi bakteri yang lebih tinggi pada saluran pencernaan ikan uji pada perlakuan U12, S1, U4 dan U7 dapat meningkatkan aktivitas enzim protease, lipase dan amilase pada saluran pencernaan ikan jelawat. 28 Tabel 3 Log populasi bakteri (PB), aktivitas enzim protease (AEP), aktivitas enzim lipase (AEL) dan aktivitas enzim amilase (AEA) pada ikan jelawat Perlakuan Parameter kontrol U12 a 0,2679 ± 0,2879 ± 0,2755 ± 0,7800 ± 0.02a 0,7500± 0.05a 1,5533 ± 0.04b 0,9533 ± 0.03c 0,2854 ± 0,2867 ± 0,2918 ± 0,2763 ± 8,8664 ± 0,01 AEP (U/menit) 0,2615 ± 0,2737 ± AEL (µmol AL/menit) 0,7300 ± 0,01a AEA (U/menit) 0,2669 ± 0.0014b 0.002b 8,8594 ±0 ,01 b U7 8,8647 ± 0,01b 7,1133 ± 0,43 0,001a U4 8,8753 ± 0,01 PB (Log cfu/g) 0,0006a S1 b 0.0003a 0.001b b 0.0036c 0.002c 0.0015b 0.001d Keterangan : Huruf yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan perbedaan antar perlakuan (p≤0,05). Pembahasan Seleksi bakteri probiotik dari saluran pencernaan ikan jelawat menghasilkan bakteri kandidat probiotik yang mampu menghasilkan enzim sebagai katalisator dalam hidrolisis nutrien pakan ikan yaitu enzim protease (U12), enzim lipase (S1) dan enzim amilase (U4) ataupun ketiga enzim baik protease, lipase dan amilase (U7). Isolat U12 adalah bakteri yang mampu mensekresikan enzim protease yang akan merombak protein menjadi asam amino. Isolat S1 yaitu bakteri yang mampu mensekresikan enzim lipase yang akan mencerna trigliserida dan menghasilkan asam lemak rantai panjang dan gliserol. Sedangkan isolat U4 adalah bakteri yang mampu mensekresikan enzim amilase yang akan mendegradasi pati menjadi maltosa dan glukosa yang kemudian diangkut ke dalam sitoplasma sel dan digunakan sebagai sumber karbon dan energi (Atlas et al. 1984). Syarat lain suatu bakteri dapat dijadikan kandidat probiotik adalah mampu bertahan pada paparan pH asam dan basa dengan selisih populasi yang kecil antara pH normal dengan pH asam dan pH basa. Hal ini sangat penting karena bakteri probiotik harus mampu bertahan pada pH asam lambung dan setelah itu probiotik akan berhadapan dengan garam empedu yang ber pH basa. Bakteri yang mampu bertahan pada pH rendah atau asam dinyatakan bersifat asam atau resisten terhadap asam lambung dan yang berhasil bertahan pada pH basa dinyatakan resisten terhadap garam empedu (Kimono et al. 1999 dan 29 Jacobsen et al. 1999). Keempat bakteri kandidat probiotik yang terpilih ratarata memiliki ketahanan terhadap pH asam dan basa dan tetap hidup sampai akhir pengamatan 8 jam. Hal ini diduga karena isolat diseleksi dari saluran pencernaan yang sudah beradaptasi dengan kondisi asam lambung dan garam empedu pada saluran pencernaan. Peran lainnya yang harus dimiliki suatu bakteri untuk dapat dijadikan kandidat bakteri probiotik yaitu mampu menghasilkan senyawa antibakteri sehingga dapat menghambat perkembangan bakteri patogen pada ikan jelawat dan mampu menjaga keseimbangan bakteri dalam saluran pencernaan. Selain itu, supaya mampu hidup dan bertahan dengan baik pada saluran pencernaan maka kandidat probiotik harus mempunyai kemampuan menempel sehingga mampu mengkolonisasi substrat dengan baik. Apabila tidak mampu mengkolonisasi maka akan terlepas oleh konstraksi usus (Havenaar et al. 1992). Kandidat probiotik yang terpilih memiliki jumlah koloni yang relatif tinggi menempel pada substrat. Penambahan probiotik pada pakan komersial terhadap ikan uji juga memberikan pengaruh yang nyata pada populasi bakteri di saluran pencernaan ikan uji. Hal ini memicu peningkatan aktivitas enzim endogenous yang diproduksi oleh bakteri dalam saluran pencernaan (Ziaei-Nejad et al. 2006). Ini dibuktikan dengan populasi bakteri yang lebih tinggi pada saluran pencernaan ikan uji pada perlakuan U12, S1, U4 dan U7 dibandingkan kontrol. Peningkatan populasi bakteri sejalan dengan aktivitas enzim protease, lipase dan amilase pada saluran pencernaan ikan jelawat. Isolat U4 memiliki nilai laju pertumbuhan, Konsumsi pakan dan FCR yang tidak berbeda nyata dengan isolat U12. Namun nilai kecernaan protein, kecernaan total dan retensi protein pada isolat U4 lebih tinggi dibandingkan dengan isolat U12. Nilai kecernaan total yang tinggi pada isolat U4 menunjukkan bahwa isolat ini mampu menghasilkan enzim-enzim yang dapat membantu ikan untuk mencerna pakan. Pakan yang telah dicerna akan dengan mudah diserap dan digunakan oleh ikan untuk sumber energi dan pertumbuhannya sehingga hanya sedikit sisa pakan yang terbuang dalam bentuk feces. Seperti kita ketahui bahwa feces merupakan limbah yang akan 30 mengotori lingkungan perairan sebagai media budidaya ikan, sehingga semakin sedikit feces yang dihasilkan akan mempertahankan kualitas lingkungan budidaya ikan yang tetap baik. Oleh karena itu penggunaan probiotik ini selain dapat meningkatkan kecernaan ikan juga dapat menjaga kondisi lingkungan perairan yang lebih baik sehingga dapat menjaga kesehatan ikan dan menyebabkan pertumbuhan ikan yang lebih optimal. Menurut Handayani et al. (2000) bahwa bakteri pengurai yang ikut termakan akan membantu proses pencernaan dalam saluran pencernaan udang karena bakteri ini mampu memproduksi enzim protease, amilase serta lipase dan meningkatkan keseimbangan bakteri dalam saluran pencernaan. Kecernaan pakan meningkat dengan adanya penambahan probiotik dalam pakan dibandingkan dengan pakan tanpa penambahan probiotik. Enzim-enzim khusus yang dimiliki oleh bakteri ini sangat membantu dalam pemecahan molekul kompleks menjadi molekul sederhana sehingga akan mempermudah pencernaan lanjutan dan penyerapan oleh saluran pencernaan ikan. Perlakuan U4 memiliki aktivitas enzim protease, lipase dan amilase lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya, namun pada aktivitas enzim protease hasil yang diperoleh tidak menunjukkan berbedaan yang signifikan dengan perlakuan U12. Hal ini membuktikan bahwa ikan jelawat selain dapat mencerna karbohidrat dengan baik, sesuai sifat ikan pada umumnya juga dapat mencerna protein, karena ikan membutuhkan protein untuk pertumbuhannya. Ikan jelawat termasuk ikan yang bersifat pemakan tumbuhan (herbivora). Menurut Krogdahl et al. (2005) ikan herbivora cenderung memiliki aktivitas enzim amilase lebih tinggi daripada aktivitas enzim protease dan lipase. Pada perlakuan U4 dimana aktivitas enzim protease, lipase dan amilase pada saluran pencernaan yang lebih tinggi dibandingkan perlakuan lainnya menunjukkan bahwa aktivitas amilase yang tinggi sesuai dengan sifat ikan jelawat yang herbivora sedangkan aktivitas protease tidak dipengaruhi oleh pola makan ikan jelawat tersebut. Tingginya aktivitas enzim amilase pada saluran pencernaan ikan jelawat didukung oleh tingginya enzim amilase yang disekresikan oleh isolat U4 pada saat uji in vitro. Oleh karena itu enzim amilase lebih efektif pada ikan jelawat dibandingkan enzim protease dan 31 lipase. Tingginya aktivitas enzim amilase ini dipengaruhi oleh jumlah enzim yang dihasilkan oleh bakteri amilase dan substrat yang sesuai, sehingga populasi bakteri tumbuh lebih tinggi dibanding bakteri pada perlakuan yang lain. Dari hasil penelitian ini kelangsungan hidup ikan uji memberikan hasil yang tidak berbeda nyata antar perlakuan. Hal ini mungkin diakibatkan oleh kuantitas serta kualitas pakan yang diberikan cukup untuk mempertahankan kebutuhan pokok ikan serta lingkungan yang terjaga dengan baik selama pemeliharaan. 32 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Dari saluran pencernaan ikan jelawat diperoleh bakteri kandidat probiotik yang mampu mensekresikan enzim protease (U12), lipase (S1), amilase (U4) dan ketiganya (U7). Penambahan probiotik U4 pada pakan mampu meningkatkan kecernaan total, kecernaan protein dan retensi protein dan kinerja pertumbuhan, sehingga probiotik U4 berpotensi untuk dijadikan probiotik pada ikan jelawat. Saran Isolat U4 dapat dijadikan sebagai probiotik yang ditambahkan pada pakan ikan jelawat, namun perlu penelitian lanjutan tentang preparasi probiotik agar sampai ke pembudidaya ikan dengan jumlah inokulum yang stabil atau sesuai dengan yang direkomendasikan. 33 DAFTAR PUSTAKA Affandi R, Syafei DS, Rahardjo MF, Sulistiono. 1992. Fisiologi pencernaan ikan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas. Ilmu Hayati. Institut Pertanian Bogor. Arifin Z, Samuel dan Yosmaniar. 1992. Polikultur ikan jelawat dengan patin di kolam rawa, Kertamulia. Bull. Penel. Perik. Darat Vol. 11 No. 2, 138-145. Aslamyah S. 2006. Penggunaan mikroflora saluran pencernaan sebagai probiotik untuk meningkatkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup ikan Bandeng. [Disertasi]. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Asyari, Gaffar AK. 1993. Pengaruh perbedaan padat tebar dan ransum pakan terhadap pertumbuhan benih ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni). Bull. Penel. Perik. Darat Vol. 12 No. 1, 37-41. Atlas RM, Brown AE, Dobra KW, Miller L. 1984. Experimental Microbiology. Fundamental and Applications. New York: Macmillan Publishing Company. Balca´zar JL, Ignacio DB, Imanol RZ, David C, Daniel V, Jose LM. 2006. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary Microbiology 114 : 173– 186 Balai Penelitian Perikanan Air Tawar. 1996. Penentuan kebutuhan kadar protein pakan untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup benih ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni). Puslitbang Perikanan, Badan Litbang Pertanian: 35-37. Brunt JA, Newaj F, Austin B. 2007. The development of probiotics for the control of multiple bacterial diseases of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases 30; 573–579 Dewanti R. Wong ACL. 1993. Influence of culture conditions on biofilm formation by E.coli 157:H7. Food microbiology 67:456-456 Douillet PA, Langdon CJ. 1994. Use of a probiotic the culture of larvae of the pasific oyster (Crassostrea gigas Thunberg). Aquaculture 119 :25-40. Effendi MI. 2002. Biologi perikanan. Yayasan Pustaka Nusatama, Yogyakarta. 163 hal. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Kerjasama PAU Pangan dan Gizi IPB dengan Penerbit Gramedia Utama. 34 Gatesoupe FJ. 1999. The Use of Probiotics in Aquaculture. Aquaculture 180:147-165. Gullian M, Thompson F, Rodriguez J. 2004. Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus vannamei. Aquaculture 233: 1-14. Hadioetomo RS. 1990. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan I Bogor. Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Handayani R, Kokarkin C, Astuti SM. 2000. Pemanfaatan enzim bakteri remedian pada pemeliharaan larva udang windu. (Laporan Penelitian). Jepara : Balai Budidaya Air Payau. Hariyati, Lante S. and Tsumura S. 1998. Use of By-9 as a Probiotic Agent in the Larva Rearing of Penaeus monodon. In : Advance in Shrimp Biotechnology (Flegel, ed.). The Genetic Engineering, Biotechnology, Thailand Havenaar R, Brink BT, Veld JHJHI. 1992. Selection of strains for probiotic use. In Fuller R. editor. Probiotic The Scientific Basis. Ed. Ke-1. London: Champman and Hall. hlm 209-224. Helver JE. 2002. Fish Nutrition. School of Fisheries University Washington. Seattle. Academia Press, INC. P 798. Huisman EA.1976. Food Conversión Efficiencies Maintenance and Production Level for Carp (Cyprinus carpio L.) and Rainbow trout (Salmo gairdneri R.). Aquaculture 9:259-273. Irianto A. 2003. Probiotik Akuakultur. Gadjah Mada University Press. 125 hal Jacobsen CN, Nelsen VR, Hayford AE, Moller PL, Michaelsen KF, Erregaard AP, Sandstrom B, Tvede M, Jacobsen M, 1999. Screening of probiotic activities of forty-seven strains of Lactobacillus spp. by in vitro techniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans. Applied and Environmental 65:4949-4956. Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan MJ, Gibson L. 2008. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquaculture 274: 1–14 Kimono H, Kurisari J, Tsuji NM, Ohmomo S, Okamoto T, 1999. Lactococci as probiotic strains adhedion to human enterocyte-lke caco-2 cells and tolerance to low pH and bile. Lett. In Applied Microbiology 29:313316. 35 Krogdahl A, Hemre GI, Mommse TP. 2005. Carbohydrates in fish nutrition: digestion and absorption in postlarval stages. Aquaculture Nutrition 11; 103–122 Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Manajemen PT. Raja Grafindo Persada. Macey B.M. dan V.E. Coyne. 2005. Improved growth rate and disease resistance in farmed Haliotis midae through probiotic treatment. Aquaculture 245 : 249– 261 Mattji AA, Sumertajaya M. 2000. Perancangan percobaan dengan aplikasi SAS dan Minitab Jilid I. IPB Press, Bogor. 326 hal. Mohanta KN, SN. Mohanty dan JK. Jena. 2007. Protein-sparing effect of carbohydrate in silver barb, Puntius gonionotus fry. Aquaculture Nutrition 13; 311–317 Murni 2004. Pengaruh penambahan bakteri probiotik Bacillus sp. Dalam pakan buatan terhadap aktivitas enzim pencernaan, efisiensi pakan dan pertumbuhan ikan gurami (Osphronemus gouramy Lac.) [Tesis]. Pascasarjana. IPB. Bogor. 47 halaman. Ngatirah, Harmayanti E, Rahayu ES, Utami T. 2000. Seleksi bakteri asam laktat sebagai agensia probiotik yang berpotensi menurunkan kolesterol. Di dalam : Pemberdayaan industri pangan dalam rangka peningkatan daya saing menghadapi era perdagangan bebas. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Pangan (Volume II); Surabaya,l0-11 Oktober 2000. Surabaya : Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia.hlm 63-70. Nikoskelainen S, Ouwehand AC and Bylund G. 2003. Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus). Fish & Shellfish Immunology IS : 443-452. NRC. 1983. Nutrient Requirements of Domestic Animals. Nutrient Requirements of Warm Water Fishes and Shellfishes. National Research Council, National Academic Press, Washington, DC, 102 pp. Nur A, dan Fatah S. 2000. Aplikasi Probiotik pada Pemeliharaan Larva udang Windu dan Ikan Bandeng. Laporan BBAP. Jepara. Ondara dan MTD. Sunarno. 1987a. Percobaan pendahuluan pembesaran benih ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni) dan ringo (Thynnycthys thynnoides) dalam sangkar jaring terapung di Danau Teluk Jambi. Bulletin Penelitian Perikanan Darat, 1(6): 10-15. 36 Ondara dan MTD. Sunarno. 1987b. Pemijahan ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni) dengan suntikan hormon dalam sangkar jaring terapung di Danau Teluk Jambi. Bulletin Penelitian Perikanan Darat, 1(6): 21-28. Rengpipat S, Aroon T, Arlo WF, Somkiat P, Piamsak M. 2003. Diseases of Aquatic Organisms. Vol. 55: 169–173 Said A. 1999. Budidaya ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni Blkr) di perairan umum. Jurnal Litbang Pertanian. 18 (1). Sugita H, Shibuya K, Shimooka H, Deguchi Y. 1996. Antibacterial abilities of intestinal bacteria in freshwater cultured fish. Aquaculture 145:195203. Sugita H, Kawasaki J, Kumazawa J, Deguchi Y. 1996b. Production of amylase by intestinal bacteria of Japanese coastal animals. Letters in Applied Microbiology 23 : 174-178. Sunarno MTD. 1989. Pengamatan fekunditas ikan jelawat (Leptoberbus hoeveni Blkr). Bull. Penel. Perik. Darat Vol. 8 No. 1, 26-32. Sunarno MTD. dan O. Reksalegora. 1982: Respon ikan jelawat (Leptobarbus hoeveni) terhadap bentuk makanan yang diberikan. Pewarta BPPT, I : 35-36. Sunarno MTD., 1991. Pemeliharaan ikan jelawat Leptoberbus hoeveni) dengan frekuensi pemberian pakan yang berbeda. Bull. Penel. Perik. Darat Vol. 10 No. 2, 76-80. Takeuchi T. 1988. Laboratory work-chemical eveluation of dietary nutriens, p. 179-233. In T. Watanabe (Ed). Fish nutrition and mariculture, RCA textbook, the general aquaculture course. Department of Aquatic Bioscience, Tokyo University of Fisheries. Truong DV, Nguyen MT, Hoang QB, Thi TV, Pham DK, Nguyen THV and Trinh QT, 2003. Artificial propagation of Hoevens slender carp (Leptobarbus hoevenii). Aquaculture of Indigenous Mekong Fish Species Component, MRC Fisheries Programme. Proceedings of the 6th Technical Symposium on Mekong Fisheries. Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Journal Microbiology and Molecular Biology Review. Dec. 64:655-671. Villamil L, Figueras A, Planas M, Novoa B. 2003. Control of Vibrio alginolyticus in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics. Aquaculture 219:43-56. 37 Vine NG, Leukes WD, Kaiser H, Daya S, Baxter J, Hecht T. 2004. Competition for attachement of aquaculture candidate probiotic and pathogenic bacteria on fish intestinal mucus. Fish Diseases 27 : 319326. Wang YB. 2007. Effect of probiotics on growth performance and digestive enzyme activity of the shrimp Penaeus vannamei. Aquaculture 269:259-264. Watanabe T. 1988. Fish Nutrition and Martculttrre. JICA textbook the general aquaculture course. Tokyo: Departement of Aquatic Biosciences, Tokyo University of Fisheries. Winarno FG. 1991. Kimia Pangan dan Gizi. PT. Gramedia. Jakarta. 35 hlm Wirawati CU. 2002. Potensi bakteri asam laktat yang diisolasi dari tempoyak sebagai probiotik [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Ziaei SN .2006. The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture 252, 516524. 38 Lampiran 1 Uji hidrolisis kasein, lemak dan pati. Hidrolisis Kasein 1. Media TSA steril yang telah dicampur susu skim dituang pada cawan petri 2. Inokulasikan bakteri yang akan diuji dengan metode gores pada permukaan agar yang telah memadat, disebarluaskan seluas 0,5 cm 3. Cawan petri tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 29°C selama 2448 jam 4. Hasil hidrolisis kasein diamati, yaitu daerah jernih pada agar, sebaliknya apabila daerah koloni tetap keruh berarti tidak terjadi hidrolisis 5. Ukur diameter wilayah yang dihidrolisis Hidrolisis Lemak 1. Media TSA steril yang telah dicampur dengan minyak zaitun dituang pada cawan steril 2. Inokulasikan bakteri yang akan diuji dengan metode gores pada permukaan agar yang telah memadat 3. Inkubasikan pada inkubator pada suhu 29°C selama 24 -48 jam 4. Amati hasil hidrolisis lemak tersebut, dengan menuangkan CuSO4 jenuh pada permukaan agar cawan, Bakteri yang mampu menghidrolisis lemak, di sekitar pertumbuhan koloninya terdapat warna hijau mengkilat, sedang di daerah lain tidak, 5. Ukur diameter wilayah yang dihidrolisis Hidrolisis Pati 1. Media TSA steril yang telah dicampur dengan kanji dituang pada cawan steril 2. Inokulasikan bakteri yang akan diuji dengan metode gores pada permukaan agar yang telah memadat 3. Inkubasikan pada inkubator pada suhu 29 °C selama 24 - 48 jam 4. Amati hasil hidrolisis pati tersebut, dengan menuangkan reagen Kl pada permukaan agar cawan, Bakteri yang mampu menghidrolisis pati, di sekitar pertumbuhan koloninya terdapat daerah jernih atau terang, sedang di daerah lain terdapat warna biru gelap, 5. Ukur diameter wilayah yang dihidrolisis 39 Lampiran 2 Prosedur penambahan bakteri kandidat probiotik pada pakan komersil yang digunakan. a. Dilakukan analisa proksimat terhadap pakan komersil yang akan digunakan selama penelitian b. Pakan ditimbang, untuk masing-masing, perlakuan c. Produk probiotik disiapkan sesuai dengan perlakuan d. Pencampuran produk probiotik tersebut dilakukan secara merata pada pakan sesuai dengan perlakuan, e. Pakan siap untuk diberikan kepada ikan, Lampiran 3 Hasil analisa Proksimat pakan penelitian (% bobot kering). Perlakuan Kontrol U12 S1 U4 U7 Protein Lemak 36,96 3,50 43,28 4,73 43,53 5,04 41,26 4,94 40,17 5,27 Serat kasar 1,37 2,26 0,93 1,45 1,10 Kadar Abu 11,67 11,05 10,96 10,77 10,76 BETN 38,72 38,68 39,54 41,58 42,70 Kadar Air 7,80 9,63 9,84 9,48 9,84 40 Lampiran 4 Prosedur analisis nilai kecernaan pakan (Takeuchi, 1988). a. Penambahan cromium oksida (Cr2O3) dalam pakan Pakan dalam bentuk tepung dicampur merata dengan Cr2O3 sebanyak 0,5-1% dari jumlah pakan, CMC sebanyak 20 g/kg pakan disiram dengan air panas dan diaduk sampai kental, lalu ditambahkan dalam pakan sambil diaduk sampai merata, Kemudian pakan dicetak menjadi bentuk pellet dan dikeringkan, Pemberian pakan + Cr2O3 dilakukan selama 15 hari dan koleksi feces dimulai pada hari ke 7, b. Prosedur analisis cromium oksida (Cr2O3) Feses ditimbang sebanyak 0,1-0,2 g dalam berat kering dan ditambahkan 5,0 ml larutan asam nitrat (specific gravity 1,42), kemudian dipanaskan perlahan-lahan selama 30 menit sampai volume larutan 1,0 ml, Larutan didinginkan, setelah dingin larutan diaduk untuk menghancurkan feses, kemudian tambahkan 3,0 ml asam perklorit (70%), Selanjutnya larutan didestruksi (untuk menghancurkan logam-logam) dengan cara memanaskan larutan dengan suhu tidak terlalu panas ± 80 O C selama 10 menit sampai kelihatan uap putih dan larutan berganti warna dari hijau menjadi kuning atau orange, Larutan didinginkan dan diencerkan dengan akuades sampai 100 ml, kemudian didiamkan selama beberapa menit pada suhu ruang, Absorbansi larutan diukur pada panjang gelombang 350 nm, Y = 0,2089X + 0,0032 Dimana : Y = Absorbsi X = Cr2O3 mg/100 ml 41 Lampran 5 Prosedur memperoleh ekstrak enzim usus ikan jelawat. Ekstrak enzim diambil dari usus ikan jelawat, Adapun prosedur kerja untuk mendapatkan enzim tersebut adalah sebagai berikut: 1. Semua prosedur penyiapan ekstrak enzim dikerjakan pada suhu 0-4°C dengan tujuan enzim dalam kondisi tidak aktif, 2. Usus diambil secara hati-hati, kemudian dicuci dengan aquades, Selanjutnya dikeringkan dengan kertas pengisap dan kemudian ditimbang bobotnya, 3. Usus sample ditimbang sebanyak 1 g; kemudian dihancurkan sampai halus dan dihomogenkan, Kemudian ditambahkan 10 ml larutan buffer (pH 7), Selanjutnya disentrifus selama 20 menit pada suhu 4°C dart 1200 rpm, Supernatannva diambil sebagai ekstrak enzim kasar, Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas enzim, Sumber : Subhakti (2000) 42 Lampiran 6 Uji aktivitas enzim amilase, protease dan lipase a. Prosedur analisis aktivitas enzim amilase (Bergmeyer dan Grassi, 1983) Perlakuan Blanko (ml) Estándar (ml) Sampel (ml) Soluble starch dalam buffer 1,0 1,0 1,0 sitrat (pH 5,7) - Maltosa estándar 1,0 - Ekstrak enzim 1,0 1,0 - Akuades Dikocok dan diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 32OC selama 30 menit DNS 3,0 3,0 3,0 Panaskan pada suhu 100OC selama 10 menit Diencerkan dengan akuades sampai volume tertentu atau tergantung kepekatan warna Didiamkan selama beberapa menit pada suhu ruang, kemudian ukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm - b. Prosedur analisis aktivitas enzim protease (Bergmeyer dan Grassi, 1983) Perlakuan Blanko (ml) Estándar (ml) Sampel (ml) Buffer borat (0,01 M, pH 8,0) Substrat kasein (20 mg/ml pH 8,0) - HCl (0,05 mg/ml) - Enzim dalam CaCl2 (10 mmol/l) - Tirosin estándar (5 mmol/l) - Akuades Diinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37OC selama 10 menit - TCA (0,1 M) 3,0 3,0 3,0 - Akuades 0,2 - Enzim dalam CaCl2 (10 0,2 0,2 mmol/l) Didiamkan pada suhu 37OC selama 10 menit, selanjutnya sentrifius dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit 1,5 1,5 1,5 - Filtrat 5,0 5,0 5,0 - Na2CO3 (0,4 M) - Folin ciocalteau 1,0 1,0 1,0 O Didiamkan pada suhu 37 C selama 20 menit, kemudian ukur absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm - Aktivitas enzim dihitung dengan humus : U / ml = ODSampel − ODBlanko × Faktor . pengencera n × T 1 OD.S tan dar − ODBlanko 43 Dimana : U = Aktivitas anzim dalam internacional Unit per menit OD = Absorbansi T = Waktu (menit) c. Analisis aktivitas enzim lipase (Tietz dan Friedreck dalam Aslamiah, 2006) - Substrat lipase stabil (minyak zaitun) 1,5 ml ditambah 1 mL Tris-HCl 0,1 M sebagai buffer dengan pH 8,0 Kemudian tambahkan 1,0 mL ekstrak enzim Campuran dihomogenkan dan inkubasi selama 6 jam pada suhu 37OC Reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 ml etil alcohol 95% Titrasi sampel dengan NaOH 0,01 N dengan menggunakan thymophthalein 0,9% (w/v) dalam ethanol sebagai indikator Prosedur yang sama dilakukan juga terhadap blanko Satu unit aktivitas lipase didifinisikan sebagai volume NaOH 0,05 N yang dibutuhkan untuk menetralisir asam lemak yang dilepaskan selama 6 jam inkubasi dengan substrat, setelah dikoreksi dengan blanko, 44 45 Lampiran 8 Isolat Hasil pengujian ketahanan isolat mikrab amilolitik, proteolitik dan lipolitik terhadap asam lambung dan garam empedu. pH 2,5 Periode Pengamatan (jam) 4 6 2 12 11 8 U12 2,21 x 10 1,60 x 10 8,20 x 10 7,10 x 1011 M9 7,10 x 1011 1,42 x 1012 2,10 x 1012 9,30 x 1011 U5 2,94 x 1012 6,00 x 1011 1,25 x 1012 1,05 x 1012 U7 7,80 x 1011 1,96 x 1012 6,50 x 1011 5,60 x 1011 S1 4,30 x 1011 1,01 x 1012 1,36 x 1012 1,44 x 1012 S6 7,00 x 1011 1,27 x 1012 9,50 x 1011 7,60 x 1011 U8 1,32 x 1012 1,00 x 1012 4,70 x 1011 3,10 x 1011 U4 1,06 x 1012 7,60 x 1011 6,40 x 1011 1,27 x 1012 U16 1,13 x 1012 5,50 x 1011 8,30 x 1011 4,00 x 1011 P10 1,85 x 1012 5,50 x 1011 5,60 x 1011 5,90 x 1011 U6 1,91 x 1012 7,60 x 1011 4,80 x 1011 4,50 x 1011 U9 6,10 x 1011 5,00 x 1011 1,07 x 1012 4,80 x 1011 Isolat 12 pH 7,5 Periode Pengamatan (jam) 4 6 2 12 12 12 8 U12 1,60 x 10 1,45 x 10 1,25 x 10 2,42 x 1012 M9 1,28 x 1012 4,10 x 1011 8,30 x 1011 1,69 x 1012 U5 8,7 x 1011 1,27 x 1012 1,07 x 1012 1,22 x 1012 U7 1,81 x 1012 6,50 x 1011 5,60 x 1011 1,26 x 1012 S1 2,05 x 1012 1,13 x 1012 6,70 x 1011 8,80 x 1011 S6 9,70 x 1011 1,21 x 1012 6,40 x 1011 1,18 x 1012 U8 2,11 x 1012 1,47 x 1012 4,00 x 1011 3,10 x 1011 U4 1,52 x 1012 1,18 x 1012 1,13 x 1012 7,60 x 1011 U16 1,56 x 1012 8,90 x 1011 1,40 x 1012 5,40 x 1011 P10 1,11 x 1012 5,60 x 1011 1,34 x 1012 6,70 x 1011 U6 7,40 x 1011 1,10 x 1012 3,90 x 1011 3,50 x 1011 U9 1,08 x 1012 5,80 x 1011 6,10 x 1011 1,31 x 1012 46 Lampiran 9 Hasil uji penempelan isolate mikrob amilolitik, proteolitik dan lipolitik pada lempeng stainless steel. Isolat Jumlah koloni yang menempel/mm2 (x 108) U12 M9 U5 U7 S1 S6 U8 U4 U16 P10 U6 U9 2,78 1,57 1,10 2,64 2,49 1,69 1,16 2,87 1,27 2,16 2,21 2,32 Lampran 10 Aktivitas antagonistik terhadap bakteri patogen No. Kode Isolat Diameter zona hambat (mm) 1 2 3 U12 U8 U16 M9 S1 S6 U5 U4 P10 U7 U6 U9 11 7 6 4 5 6 7 8 9 10 11 12 7 12 6 7 12 7 10 8 9 47 Lampiran 11 Perhitungan laju konsumsi pakan, laju pertumbuhan harian, efisiensi pakan, kelangsungan hidup dan kecernaan pakan ikan jelawat. Parameter Bobot ikan awal (g) Rata-rata Standar deviasi Bobot ikan akhir (g) Rata-rata Standar deviasi Pakan ikan Konsumsi pakan (g) Rata-rata Standar deviasi Jumlah ikan mati (jumlah awal 10 ekor/akuarium) Konversi Pakan (FCR) Rata-rata Standar deviasi Laju Pertumbuhan harian (%) (LPH) Rata-rata Standar deviasi Kecernaan Protein (%)(Kp) Rata-rata Standar deviasi Kecernaan Total (%)(Kp) Rata-rata Standar deviasi U 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Perlakuan Kontrol U12 S1 U4 U7 57,3 57,1 56,4 56,93 0,47 258,7 256,4 249,8 254,97 4,62 56,5 56,9 57,3 56,9 0,4 273,2 271,1 278,5 274,27 3,81 57,1 56,5 57 56,87 0,32 272 269,6 268,3 269,97 1,88 56,4 56,7 57,2 56,77 0,4 276,8 275,3 280,5 277,53 2,68 57,1 57,2 57,3 57,2 0,1 271,5 265,7 262,6 266,6 4,52 419,70 422,38 415,31 419,13 3,57 0 0 0 441,24 398,97 421,90 420,7 21,16 0 0 0 413,05 416,91 409,59 413,18 3,66 0 0 0 420,33 423,10 413,98 419,14 4,68 0 0 0 445,56 413,18 397,40 418,71 24,55 0 0 0 2,08 2,12 2,15 2,04 1,86 1,91 1,92 1,96 1,94 1,91 1,94 1,85 2,08 1,98 1,94 2,12 0,03 1,94 0,09 1,94 0,02 1,90 0,04 2,00 0,07 2,54 2,53 2,51 2,53 0,02 87,76 88,65 89,44 88,62 0,84 76,92 78,57 78,42 77,97 0,91 2,66 2,64 2,67 2,66 0,02 90,68 91,48 91,76 91,31 0,56 80,65 80,77 82,86 81,42 1,24 2,64 2,64 2,62 2,63 0,01 89,72 90,08 91,39 90,4 0,88 80,46 81,07 81,87 81,13 0,71 2,69 2,67 2,69 2,68 0,01 92,84 92,3 92,95 92,7 0,35 82,14 82,04 83,52 82,57 0,83 2,63 2,59 2,57 2,6 0,03 92,08 90,82 91,42 91,44 0,63 81,71 82,61 82,09 82,14 0,45 48 Lampiran 12 Perhitungan retensi protein. Parameter Bobot ikan awal (g) Rata-rata Standar deviasi Bobot ikan akhir (g) Rata-rata Standar deviasi Protein ikan Protein tubuh awal (g) Protein tubuh akhir (g) Jumlah protein yang disimpan dalam tubuh Pakan ikan Konsumsi pakan (g) Kadar protein pakan (%) Jumlah Protein pakan yang dikonsumsi ikan (g) Retensi protein (%) Rata-rata Standar deviasi 1 2 3 1 2 3 Perlakuan Kontrol U12 S1 57,30 56,50 57,10 57,10 56,90 56,50 56,40 57,30 57,00 56,93 56,90 56,87 0,47 0,40 0,32 258,70 273,20 272,00 256,40 271,10 269,60 249,80 278,50 268,30 254,97 274,27 269,97 4,62 3,81 1,88 U4 56,40 56,70 57,20 56,77 0,40 276,80 275,30 280,50 277,53 2,68 U7 57,10 57,20 57,30 57,20 0,10 271,50 265,70 262,60 266,60 4,52 1 2 3 1 2 3 1 2 3 7,47 7,45 7,35 36,27 36,56 35,95 28,80 29,11 28,60 7,35 7,39 7,46 38,84 39,26 40,84 31,49 31,87 33,38 7,45 7,36 7,43 42,57 41,11 40,33 35,12 33,75 32,90 7,37 7,42 7,47 47,35 47,23 49,29 39,98 39,81 41,82 7,45 7,46 7,47 42,57 42,88 42,62 35,12 35,42 35,15 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 419,70 422,38 415,31 36,96 36,96 36,96 155,12 156,11 153,50 18,57 18,65 18,63 18,62 0,04 420,33 423,10 413,98 41,78 41,78 41,78 175,61 176,77 172,96 17,93 18,03 19,30 18,42 0,76 413,05 416,91 409,59 43,53 43,53 43,53 179,80 181,48 178,29 19,53 18,60 18,45 18,86 0,59 441,24 398,97 421,90 43,28 43,28 43,28 190,97 172,67 182,60 20,94 23,06 22,90 22,30 1,18 445,56 413,18 397,40 40,17 40,17 40,17 178,98 165,97 159,64 19,62 21,34 22,02 20,99 1,24 49 Lampiran 13 Analisis ragam jumlah konsumsi pakan ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Jumlah db 4 10 14 JK 100,31 2197,16 KT 25,08 219,72 F,hitung 0,11 F. Tabel 5% 3,48 Lampiran 14 Analisis ragam dan uji Duncan laju pertumbuhan harian ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Total db JK KT F,hitung F. Tabel 5% 4 10 14 0,0444 0,0033 0,0111 0,0003 33,27 3,48 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 S1 2,53 2,66 2,63 U4 U7 P 0,05 (P, 10) 2,68 2,60 BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) 2 Beda Dengan 3 4 5 0,13 0,03 0,10 0,05 0,08 3,15 0,02 0,03 3,30 0,15 0,06 3,37 0,07 3,43 0,03 0,04 0,04 0,04 BJND 0,05 a c b c b 50 Lampiran 15 Analisis ragam dan uji Duncan retensi protein (%) ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat db JK KT F,hitung F. Tabel 5% 4 35,5653 8,8913 11,54 3,48 10 7,7021 0,7702 Total 14 43,2674 Perlakuan Rata-rata Kontrol 18,62 18,86 u12 18,42 S1 22,30 U4 20,99 U7 P 0,05 (P, 10) BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) 2 0,20 0,44 3,44 1,31 3,15 1,60 Beda Dengan 3 4 0,24 3,88 2,13 3,30 1,67 3,68 2,57 3,37 1,71 5 2,38 3,43 1,74 BJND 0,05 a a a b c Lampiran 16 Analisis ragam dan uji Duncan konversi pakan ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Jumlah db 4 10 14 Perlakuan Rata-rata Kontrol 2,12 u12 S1 U4 U7 P 0,05 (P, 10) 1,94 1,94 1,90 2,00 BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) JK 0,0868 0,0351 2 KT 0,0217 0,0035 Beda Dengan 3 4 F,hitung 6,18 5 0,18 0,00 0,04 0,10 3,15 0,18 0,04 0,06 3,30 0,22 0,06 3,37 0,12 3,43 0,10 0,11 0,11 0,11 F. Tabel 5% 3,48 BJND 0,05 a b b b b 51 Lampiran 17 Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan protein (%) ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Jumlah db 4 10 14 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 88,62 91,31 JK 27,44 4,64 2 KT 6,86 0,46 F,hitung 14,80 Beda Dengan 3 4 5 2,69 90,40 S1 92,70 U4 91,44 U7 P 0,05 (P, 10) BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) 0,91 2,30 1,26 3,15 0,71 1,78 1,39 1,04 3,30 0,75 4,08 0,13 3,37 0,76 2,82 3,43 0,78 F. Tabel 5% 3,48 BJND 0,05 a b a c b Lampiran 18 Analisis ragam dan uji Duncan kecernaan total (%) ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Jumlah db 4 10 14 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 S1 77,97 81,42 81,13 U4 U7 P 0,05 (P, 10) 82,57 82,14 BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) JK 39,32 7,54 2 KT 9,83 0,75 F.hitung 13,04 Beda Dengan 3 4 5 3,45 0,29 3,16 1,43 0,43 3,15 1,14 1,00 3,30 4,60 0,71 3,37 4,17 3,43 0,91 0,95 0,98 0,99 F. Tabel 5% 3,48 BJND 0,05 a b b c bc 52 Lampiran 19 Perhitungan populasi bakteri, aktivitas enzim protease, lipase dan amilase. Perlakuan Parameter Kontrol U12 S1 U4 U7 Populasi bakteri 1 7,11 x 106 7,58 x 108 7,28 x 108 7,70 x 108 7,53 x 108 probiotik (cfu/g) 2 7,50 x 106 7,20 x 108 7,10 x 108 7,38 x 108 7,27 x 108 3 4,10 x 107 7,01 x 108 7,22 x 108 7,22 x 108 7,15 x 108 7,24 x 106 7,27 x 108 7,20 x 108 7,50 x 108 7,32 x 108 Rata-rata Populasi bakteri 1 6,8520 8,8800 8,8620 8,8870 8,8770 probiotik (Log cfu/g) 2 6,8750 8,8580 8,8510 8,8800 8,8620 3 7,6130 8,8460 8,8590 8,8590 8,8550 7,1133 8,8613 8,8573 8,8753 8,8647 0,4329 0,0172 0,0057 0,0146 0,0112 Rata-rata Standar deviasi 1 0,2616 0,2728 0,2676 0,2846 0,2760 2 0,2620 0,2730 0,2680 0,2917 0,2739 3 0,2608 0,2754 0,2682 0,2875 0,2767 Rata-rata 0,2615 0,2737 0,2679 0,2879 0,2755 Standar deviasi 0,0006 0,0014 0,0003 0,0036 0,0015 1 0,7400 0,8000 0,7900 1,5200 0,9800 2 0,7200 0,7600 0,7000 1,6000 0,9300 3 0,7300 0,7800 0,7600 1,5400 0,9500 0,7300 0,7800 0,7500 1,5533 0,9533 0,0100 0,0200 0,0500 0,0400 0,0300 0,2676 0,2870 0,2870 0,2932 0,2764 Enzim protease Enzim lipase Rata-rata Standar deviasi Enzim amilase 1 2 0,2657 0,2854 0,2854 0,2896 0,2752 3 0,2675 0,2838 0,2876 0,2927 0,2773 Rata-rata 0,2669 0,2854 0,2867 0,2918 0,2763 Standar deviasi 0,0011 0,0016 0,0011 0,0020 0,0011 53 Lampiran 20 Analisis ragam dan uji Duncan populasi bakteri probioik pada ikan jelawat diakhir pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Total Perlakuan db 4 10 14 Rata-rata 7,1133 Kontrol 8,8613 u12 8,8573 S1 8,8753 U4 8,8647 U7 P 0,05 (P, 10) BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) JK 7,3617403 0,3761013 7,7378416 2 1,7480 0,0040 0,0180 0,0107 3,1500 0,3527 KT 1,8404351 0,0376101 F,hitung 48,93 Beda Dengan 3 4 1,7440 0,0140 0,0073 3,3000 0,3695 F. Tabel 5% 3,48 5 1,7620 0,0033 3,3700 0,3773 1,7513 3,4300 0,3840 BJND 0,05 a b b b b Lampiran 21 Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim protease ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat db JK KT F,hitung F. Tabel 5% 4 10 0,001164 0,000035 0,000291 0,000003 83,52 3,48 Total 14 0,001199 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 S1 U4 0,2615 0,2737 0,2679 0,2879 0,2755 U7 P 0,05 (P, 10) BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) 2 Beda Dengan 3 4 0,0123 0,0058 0,0200 0,0065 0,0142 0,0265 0,0124 3,1500 0,0034 0,0076 3,3000 0,0036 0,0018 3,3700 0,0036 5 0,0141 3,4300 0,0037 BJND 0,05 a b c d b 54 Lampiran 22 Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim lipase ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Total db 4 JK 1,4438 KT 0,3610 10 14 0,0099 1,4537 0,0010 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 0,73 S1 U4 U7 P 0,05 (P, 10) 0,78 0,75 1,55 0,95 BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) F.hitung 363,37 Beda Dengan 3 4 2 5 0,05 0,03 0,80 0,60 3,15 0,02 0,77 0,20 3,30 0,82 0,17 3,37 0,22 3,43 0,06 0,06 0,06 0,06 F. Tabel 5% 3,48 BJND 0,05 a a a b c Lampiran 23 Analisis ragam dan uji Duncan aktivitas enzim amilase ikan jelawat selama pemeliharaan. Sumber keragaman Perlakuan Galat Total db 4 10 14 Perlakuan Rata-rata Kontrol u12 S1 U4 U7 P 0,05 (P, 10) 0,2669 0,2854 0,2867 0,2918 0,2763 BJND 0,05 (P, 10) (P,SЎ) JK 0,0011627 0,0000196 0,0011823 2 0,0185 0,0013 0,0052 0,0155 3,1500 KT 0,0002907 0,0000020 Beda Dengan 3 4 F.hitung 148,02 5 0,0197 0,0064 0,0249 0,0104 0,0091 0,0094 3,3000 3,3700 3,4300 0,0025 0,0027 0,0027 0,0028 F. Tabel 5% 3,48 BJND 0,05 a b b c d 55 Lampiran 19 Kualitas air. No Perlakuan 1 2 3 4 5 Kontrol u12 S1 U4 U7 No Perlakuan 1 2 3 4 5 Kontrol u12 S1 U4 U7 No Perlakuan 1 2 3 4 5 Kontrol u12 S1 U4 U7 DO 5,65 5,10 4,89 4,35 4,60 pH 7,42 7,16 7,12 7,06 6,94 Parameter Pengamatan NH3 NO2 0,107 0,408 0,017 0,826 0,021 0,885 0,019 0,225 0,096 0,757 NO3 1,942 1,487 1,429 1,013 0,779 DO 5,17 5,32 4,62 5,65 4,15 pH 7,11 7,37 7,27 7,42 7,10 Parameter Pengamatan NH3 NO2 0,024 0,837 0,036 0,814 0,036 0,871 0,107 0,408 0,085 0,783 NO3 1,441 1,452 1,448 1,942 0,758 pH 7,17 7,10 7,14 7,16 7,21 Parameter Pengamatan NH3 NO2 0,015 0,412 0,021 0,831 0,033 0,825 0,025 0,215 0,062 0,727 NO3 1,946 1,483 1,434 1,035 0,763 DO 5,65 5,53 4,98 4,75 4,10 44 Lampiran 7 Nilai kerapatan Optik (Optical Density) NO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Kode Isolat U12 M9 U5 U7 S1 S6 U8 U4 U16 P10 U6 U9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0,480 0,758 0,956 0,501 0,604 0,739 0,391 0,769 0,656 0,517 0,559 0,468 4 1,089 0,980 1,235 0,829 1,187 0,995 0,779 1,187 1,146 1,124 1,106 0,900 6 1,256 1,228 1,436 1,220 1,325 1,287 1,211 1,433 1,202 1,290 1,298 1,291 8 1,314 1,342 1,519 1,423 1,399 1,347 1,358 1,624 1,329 1,302 1,448 1,478 JUMLAH BAKTERI (jam ke-) 10 12 14 16 1,395 1,426 1,465 1,508 1,424 1,454 1,512 1,617 1,586 1,613 1,648 1,706 1,523 1,566 1,624 1,671 1,480 1,489 1,566 1,580 1,404 1,499 1,546 1,608 1,564 1,591 1,715 1,746 1,696 1,705 1,719 1,725 1,345 1,454 1,487 1,545 1,359 1,390 1,445 1,569 1,494 1,555 1,674 1,688 1,578 1,695 1,799 1,805 18 1,598 1,631 1,750 1,763 1,653 1,659 1,763 1,766 1,585 1,626 1,743 1,857 20 1,698 1,722 1,799 1,787 1,715 1,752 1,845 1,775 1,681 1,681 1,627 1,840 22 1,763 1,751 1,813 1,819 1,757 1,789 1,868 1,799 1,725 1,745 1,619 1,875 24 1,890 1,797 1,749 1,865 1,808 1,825 1,897 1,805 1,746 1,786 1,604 1,900
