PRODUKSI BIOPLASTIK POLI-β

PRODUKSI BIOPLASTIK POLI-β-HIDROKSIBUTIRAT OLEH BAKTERI
AMILOLITIK YANG DIISOLASI DARI TEPUNG SAGU BASAH MENGGUNAKAN
BERBAGAI MACAM SUBSTRAT PATI
Nur Arfa Yanti
Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Haluoleo
e-mail : [email protected]
ABSTRAK
Dua isolat bakteri amilolitik yang diisolasi dari tepung sagu basah diuji kemampuannya
memproduksi bahan baku bioplastik poli-β-hidroksibutirat (PHB) dari berbagai macam substrat
pati yaitu pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong sebagai sumber karbon. Kedua
isolat bakteri amilolitik diidentifikasi berdasarkan karakteristik morfologi, kultural dan
biokimianya. Produksi PHB dilakukan menggunakan media sintetik (media Ramsay) dengan
berbagai macam pati sebagai sumber karbon. Ekstraksi PHB dilakukan menggunakan metode nhexan-aceton-dietil eter. Kadar PHB dideterminasi menggunakan spektrofotometer UV pada
panjang gelombang 235 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri amilolitik
diidentifikasi sebagai anggota genus Bacillus yaitu Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5.
Produksi PHB dari Bacillus sp. PSA10 pada berbagai macam pati (pati sagu, pati singkong, pati
garut dan pati ganyong) berkisar antara 21-56 % (g PHB/g berat kering sel) sedangkan Bacillus
sp. PPK5 berkisar antara 11-24 % (g PHB/g berat kering sel). Produksi PHB tertinggi oleh kedua
isolat bakteri amilolitik diperoleh dari substrat pati sagu yaitu Bacillus sp. PSA10 sebanyak
56,49 % sedangkan Bacillus sp. PPK5 sebanyak 24,07 %. Dengan demikian, pati sagu
merupakan substrat pati yang potensial digunakan sebagai sumber karbon murah untuk produksi
PHB terutama oleh Bacillus sp. PSA10.
Kata kunci : Bioplastik, PHB, Bakteri amilolitik, substrat pati, pati sagu
Pendahuluan
Poli-β-hidroksibutirat (PHB) adalah polimer yang diakumulasi secara intraselular oleh
mikrobia sebagai granula cadangan karbon dan energi (Anderson & Dawes, 1990). Polimer ini
bersifat termostabil, dapat didegradasi secara biologis (biodegradable) dan memiliki sifat yang
hampir sama dengan plastik sintetik yaitu polipropilen (Chen, 2003) sehingga berpotensi sebagai
pengganti plastik sintetik yang sulit didegradasi (undegradable) (Anderson & Dawes, 1990).
Kendala utama dalam pengembangan bioplastik dari PHB adalah harganya yang jauh
lebih mahal dibandingkan plastik sintetik karena biaya produksi yang tinggi. Sebagai
perbandingan produk Biopol (nama dagang bioplastik) seharga US 16 dolar/kg padahal harga
plastik polipropilen kurang lebih US 1 dolar/kg (Lee, 1996). Salah satu upaya yang dapat
dilakukan untuk menurunkan biaya produksi PHB adalah penggunaan sumber karbon murah
(Kim, 2000) karena biaya produksi PHB yang tertinggi berasal dari substrat yaitu 40 % dari total
biaya produksi (Lee, 1996).
Pati merupakan salah satu sumber karbon alternatif untuk produksi PHB yang digunakan
sebagai pengganti glukosa karena harganya relatif lebih murah (Kim, 2000; Halami, 2008;
Ramadas et al., 2009). Kendala penggunaan pati sebagai substrat untuk produksi PHB adalah pati
harus dihidrolisis terlebih dahulu menjadi glukosa sehingga dibutuhkan bakteri yang memiliki
enzim penghidrolisis pati (amilolitik). Pemanfaatan bakteri yang memiliki kemampuan ganda
yaitu bersifat amilolitik sekaligus mampu mengakumulasi PHB merupakan solusi tepat untuk
memproduksi PHB dengan substrat yang komponen utamanya pati.
Beberapa jenis pati yang dapat ditemukan di Indonesia seperti pati sagu, pati singkong,
pati ganyong dan pati garut berpotensi digunakan sebagai substrat alternatif untuk produksi PHB.
Pemanfaatan pati sebagai substrat untuk produksi PHB diharapkan mampu menurunkan biaya
produksi PHB sekaligus memberikan nilai tambah bagi pati-pati tersebut. Oleh karena itu, pada
penelitian ini dikaji kemampuan bakteri amilolitik indigenous dalam memproduksi PHB
menggunakan beberapa jenis pati sebagai substratnya.
METODE, ALAT DAN BAHAN
Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah strain Bacillus sp. PSA10 dan
Bacillus sp. PPK5 yang diisolasi dari tepung sagu basah. Pati yang digunakan sebagai substrat
untuk produksi PHB adalah pati sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong. Bahan kimia
yang digunakan meliputi seperangkat bahan untuk karakterisasi bakteri, seperangkat bahan untuk
ekstraksi PHB yang meliputi, N-hexana, dietil eter, aseton, etanol, sodium hipoklorit, asam sulfat
pekat dan bahan kimia untuk media Ramsay yaitu (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 HPO 4 . 7H 2 O, KH 2 PO 4 ,
MgSO 4. 7H 2 O, Ferrous Amonium Citrate,
CaCl 2 .2H 2 O. Alat-alat yang digunakan dalam
penelitian ini meliputi laminar air-flow, autoklaf, spektrofotometer UV, mikroskop, inkubator
shaker, sentrifuse, oven dan water bath.
Karakterisasi dan Identifikasi bakteri Amilolitik
Isolat bakteri diidentifikasi berdasarkan karakteristik fenotipik meliputi karakteristik
morfologi, kultural dan biokimia. Karakter morfologi yang dideterminasi meliputi bentuk sel,
reaksi Gram, pembentukan endospora dan motilitas. Karakter kultural meliputi morfologi koloni,
pertumbuhan pada pH, suhu dan keberadaan NaCl. Karakter biokimia meliputi produksi katalase,
pertumbuhan anaerobik, reduksi nitrat, hidrolisis pati, hidrolisis gelatin, tween 80, uji Methyl Red
and Voges-Proskauer, penggunaan sitrat dan fermentasi berbagai macam gula.
Produksi PHB dan Analisis Kuantitatif PHB
Produksi PHB dilakukan dengan menumbuhkan isolat bakteri
pada medium minimal
Ramsay (Ramsay et al., 1990) dengan menggunakan sumber karbon berbagai jenis pati yaitu pati
sagu, pati singkong, pati garut dan pati ganyong sebanyak 1 % (b/v). Kultur diinkubasi pada
penggojog dengan kecepatan 125 rpm, pada suhu 30oC selama 72 jam (Yanti dkk., 2009a). Sel
bakteri dipanen dengan sentrifugasi kultur cair pada kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. PHB
diekstraksi dari massa sel (pelet) yang dipecah menggunakan larutan sodium hipoklorit 5%
selama 24 jam. Ekstraksi PHB dilakukan menggunakan metode n-hexan-aceton-dietil eter
(Senior dkk., 1972). Kadar PHB dideterminasi menggunakan spektrofotometer UV pada panjang
gelombang 235 nm dengan pelarut asam sulfat pekat.
Hasil dan Pembahasan
Identifikasi Bakteri Amilolitik Indigenous
Identifikasi bakteri amilolitik indigenous dilakukan berdasarkan karakter fenotipik yang
meliputi karakter morfologi, kultural dan biokimia. Karakter fenotipik dari kedua isolat bakteri
amilolitik dan karakter genus Bacillus yang digunakan sebagai acuan disajikan pada Tabel 1.
Hasil penelitian pada Tabel 1 menunjukkan bahwa kedua isolat bakteri mempunyai sel berbentuk
batang, Gram positif, membentuk spora, katalase positif dan motil. Karakter-karakter ini sesuai
dengan karakter kunci dari genus Bacillus (Holt et al., 1994; Apun et al., 2000; Yanti et al.,
2009b). Dengan demikian, kedua isolat bakteri amilolitik indigenous merupakan anggota genus
Bacillus.
Beberapa anggota genus Bacillus dilaporkan memiliki kemampuan memproduksi PHB
dari berbagai macam substrat (Yilmaz et al., 2005; Valappil et al., 2007). PHB yang dihasilkan
oleh bakteri Gram positif seperti Bacillus sangat berpotensi digunakan sebagai bahan baku untuk
peralatan medis (Valappil et al., 2007). Menurut Valappil et al. (2007), penggunaan bakteri Gram
positif sebagai penghasil PHB untuk keperluan medis memiliki kelebihan dibandingkan dengan
bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif mempunyai lipopolisakarida (LPS) pada dinding
selnya yang dapat menyebabkan reaksi imunogenik sementara bakteri Gram positif tidak
mempunyai LPS. Dengan demikian, isolat PSA10 dan isolat PPK5 yang merupakan bakteri Gram
positif sangat berpotensi dimanfaatkan sebagai penghasil PHB untuk keperluan medis.
Tabel 1. Karakteristik Fenotipik Isolat bakteri amilolitik indigenous dan genus Bacillus
Karakter
Morfologi
Bentuk sel
Ukuran sel (µm)
Motilitas
Endospora
Reaksi Gram
Kultural
Bentuk koloni
Tumbuh pada Nutrient Broth pH 5,0-7,0
Tumbuh dengan adanya NaCl 2,0-5,0 %
Tumbuh pada suhu 50oC
Biokimia
Katalase
Reduksi Nitrat
Methyl red
Voges-proskauer
Hidrolisis Kasein
Hidrolisis Gelatin
Hidrolisis Tween 80
Hidrolisis Pati
Akumulasi PHB
Pembentukan asam dari :
Glukose, Sukrosa, Maltosa
Dextrosa, Xylosa, Mannitol,
Galactosa, L-Arabinosa
Produksi Gas dari glukosa
PSA10
PPK5
Bacillus
Batang
1,5 x 5-10
Batang
0,8 x 3-4
+
+
Positif
+
+
Positif
Batang
0,5 x 1,2 (kecil)
2,5 -10 (besar)
+
+
Positif
Sirkuler
+
+
+
Sirkuler
+
+
+
Variable
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+/+/+/+
+/+/-
+
+
+
+
+
+/-
-
-
+/-
+ reaksi positif atau ada pertumbuhan; - reaksi negatif atau tidak ada pertumbuhan
Produksi PHB dari berbagai Substrat Pati
Sumber karbon merupakan salah satu komponen yang paling penting dalam media
produksi PHB, karena komponen sel mikrobia sebagian besar terdiri atas unsur-unsur karbon.
Karbohidrat merupakan sumber karbon yang paling banyak digunakan dalam suatu proses
fermentasi dan salah satunya adalah pati.
Pemanfaatan pati sebagai substrat yang harganya relatif murah untuk memproduksi PHB
merupakan salah satu upaya untuk mengembangkan PHB sebagai bahan baku bioplastik. Pati
berpotensi digunakan sebagai substrat untuk memproduksi PHB karena memiliki karena pati
mengandung kadar karbon (C) tinggi namun kadar nitrogen (N) dan fosfat (P) rendah. Menurut
Anderson & Dawes (1990) secara umum, PHB akan disintesis dan diakumulasi oleh sel bakteri
pada substrat yang mengandung kadar C tinggi sedangkan sumber N dan P terbatas. Oleh karena
itu, pada penelitian ini dikaji kemampuan dua isolat bakteri amilolitik indigenous dalam
memproduksi PHB menggunakan beberapa jenis pati yang banyak terdapat di Indonesia seperti
pati sagu, singkong, garut dan ganyong.
Produksi PHB oleh kedua isolat bakteri (Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5) pada
4 macam substrat pati ditampilkan pada Gambar 1. Kadar PHB yang diproduksi oleh Bacillus sp.
PSA10 pada empat jenis pati dari yang terendah hingga tertinggi berturut-turut adalah sebagai
berikut : pati singkong 21,48 %, pati ganyong 27,65 %, pati garut 36,92 % dan pati sagu 56,39 %.
Kadar PHB yang diproduksi oleh Bacillus sp. PPK5 pada empat jenis pati dari yang terendah
hingga tertinggi berturut-turut adalah sebagai berikut : pati singkong 11,20 %, pati ganyong
16.28%, pati garut 18,45 % dan pati sagu 24,07 %. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
produksi PHB tertinggi oleh kedua bakteri amilolitik diperoleh pada media yang menggunakan
substrat pati sagu
sedangkan yang terendah diperoleh dari media pati singkong. Hal ini
mengindikasikan bahwa pati sagu merupakan substrat pati yang paling berpotensi digunakan
sebagai substrat untuk memproduksi PHB oleh kedua bakteri amilolitik indigenous.
Pertumbuhan kedua strain bakteri amilolitik pada 4 jenis pati yang dideterminasi dalam
bentuk berat kering sel ditampilkan pada Tabel 2. Hasil penelitian pada Tabel 2 menunjukkan
bahwa berat kering sel Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 tertinggi diperoleh pada pati
singkong berturut-turut yaitu 1,49 g/l dan 1,16 g/l dibandingkan ketiga jenis pati lainnya. Hal ini
mengindikasikan bahwa pertumbuhan kedua strain bakteri amilolitik pada pati singkong paling
baik.
60.00
56.39
Kadar PHB (%)
50.00
36.92
40.00
30.00
24.07
20.00
27.56
21.48
18.45
11.21
10.00
16.28
0.00
Pati Sagu
Pati Singkong
Pati Garut
Pati Ganyong
Substrat Pati
Bacillus sp. PSA10
Bacillus sp. PPK5
Gambar 1. Produksi bioplastik PHB oleh Bacillus sp. PSA10 dan Bacillus sp. PPK5 dari berbagai substrat
pati sebagai sumber karbon
Berat kering sel yang tinggi namun kadar PHB paling rendah dari kedua strain bakteri
amilolitik pada substrat pati singkong (Tabel 2) menunjukkan bahwa pati singkong merupakan
substrat yang lebih baik digunakan untuk pertumbuhan sel bakteri daripada untuk memproduksi
PHB. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya perbedaan komposisi nutrien terutama kadar
protein dari keempat jenis pati. Kadar protein tertinggi terdapat pada pati singkong, yaitu 1,20 %
(BSN, 1996) dibandingkan pati sagu (0,69 %) (Wina et al., 1996), pati ganyong (0,67 %) dan pati
garut (0,50 %) (Perez & Lares, 2005).
Menurut Anderson dan Dawes (1990), PHB akan
diproduksi oleh bakteri pada saat kondisi media pertumbuhan mengalami ketidakseimbangan
kadar substrat yaitu ketika kadar C berlebih sedangkan kadar nutrien lain seperti N, P atau K
terbatas. Pada kondisi pertumbuhan yang tidak seimbang (sumber C berlebih tetapi nutrisi lain
terbatas), aktivitas NADH oksidase dalam siklus Krebs menurun sehingga meningkatkan jumlah
NADH. Peningkatan NADH akan menghambat aktivitas sitrat sintase sehingga asetil-CoA dan
oksaloasetat (OAA) tidak diubah menjadi sitrat dan CoA bebas. Hal ini menyebabkan hilangnya
penghambatan asetil-CoA asetiltransferase (β-Ketotiolase) oleh CoA bebas sehingga terjadi
reaksi kondensasi asetil-CoA menjadi asetoasetil-CoA yang merupakan senyawa awal terjadinya
polimerisasi PHB (Braunegg et al., 1998).
Tabel 2. Berat kering sel, konsentrasi PHB dan kadar PHB yang diperoleh dari 4 macam substrat pati
yang berbeda pada skala erlenmeyer setelah 72 jam inkubasi.
ISOLAT
Pati sagu
1,33
0,74
56.39
1,08
0.26
24,07
Substrat Pati
Pati singkong
Pati garut
1,49
1,30
0,26
0,48
21,48
36,92
1,16
1,03
0.088
0,19
11,21
18,45
BKSa (g/L)
PHBb (g/L)
P/Xc (%)
Bacillus sp. PPK5
BKSa (g/L)
PHBb (g/L)
P/Xc (%)
a
Keterangan : BKS = Berat kering sel
PHBb = Konsentrasi PHB
P/Xc = Kadar PHB (g PHB/g berat kering sel)
Bacillus sp. PSA10
Pati ganyong
1,27
0,35
27,56
0,86
0,097
16,28
Produksi PHB yang paling tinggi pada substrat pati sagu oleh Bacillus sp. PSA10 dan
Bacillus sp. PPK5 dibandingkan ketiga jenis pati lainnya (pati singkong, pati garut dan pati
ganyong) menunjukkan bahwa pati sagu merupakan substrat paling potensial digunakan untuk
memproduksi PHB oleh kedua strain bakteri amilolitik. Hal ini mungkin disebabkan karena
kedua strain bakteri amilolitik diisolasi dari tepung sagu basah sehingga mereka telah beradaptasi
dan mampu menggunakan komponen-komponen pada pati sagu untuk memproduksi PHB.
Dugaan ini sesuai dengan hasil penelitian Du et al. (2004) yang menyatakan bahwa bakteri yang
hidup di lingkungan mengandung sumber C tinggi cenderung mengakumulasi material cadangan
tertentu seperti PHB.
DAFTAR PUSTAKA
Anderson, A.J. & Dawes, E.A. 1990. Occurence, Metabolism, Metabolic Role and Industrial
Uses of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Microbiological Reviews. 54 (4) : 450-472.
Apun, K., Jong, B.C. & Salleh, M.D. 2000. Screening and Isolation of a Cellulolytic and
Amylolitic Bacillus from Sago Pith Waste. Journal of General and Applied Microbiology,
46 : 263-267
Badan Standardisasi Nasional (BSN), 1996. Tapioka. .
Chen, Guo-Qiang. 2003. Microbial Production of Bioplastics-Polyhydroxyalkanoate.
International Conference on Bio-Based Polymers. Riken Institute Tokyo, Japan.
Du, G., Chen, L.X.L. & Yu, J. 2004. High-Efficiency Production of bioplastics from
Biodegradable Organic Solids. Journal of Polymers & The environment 12 (2) : 89-94.
Halami, P.M. 2008. Production of polyhydroxyalkanoate from starch by the native isolate
Bacillus cereus CFR06. World Journal Microbiology & Biotechnology 24 : 805-812.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Stanley, J.T. & Williams, S.T. 1994. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. 9th ed. Lipincot, Williams and wilkins, Baltimore.
Kim, B.S. 2000. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates. Enzyme and
Microbial Technology 27 : 774-777.
Lee, S.Y. 1996. Plastic Bacteria? Progress and Prospect for Polyhydroxyalkanoate Production in
Bacteria. Tibtech 14 : 431-438.
Perez, E. & Lares, M. 2005. Chemical Composition, Mineral Profile, and Functional Properties
of Canna (Canna edulis) and Arrowroot (Maranta spp.) Starches. Plant Food for Human
Nutrition 60 :113-116.
Ramadas, N.V. Singh, S.K., Soccol, C.R. & Pandey, A. 2009. Polyhydroxybutyrate Production
using Agro-industrial Residue as Substrate by Bacillus sphaericus NCIM 5149. Brazilian
Archives of Biology and Technology 52 :17-23.
Ramsay, B.A., Lomaliza, K., Chavarie, C., Dube, B., Bataille, P. & Ramsay, J.A. 1990.
Production of Poly-(ß-Hydroxybutyric-Co- ß-Hydroxyvaleric) Acids. Applied and
Environmental Microbiology 56 (7) : 2093-2098.
Senior, P.J., Beech, G.A., Ritchie, G.A.F. & Dawes, E.A. 1972. The Role of Oxygen Limitation
in the Formation of Poly-β-hydroxybutyrate during Batch and Continuous Culture of
Azotobacter beijerinckii. Biochemistry Journal, 128 : 1193-1201.
Valappil, S.P., Boccaccini, A.R., Bucke, C. & Roy, E.I. 2007c. Polyhydroxyalkanoates in Gram
positive bacteria : insight from the Genera Bacillus and Streptomyces. Antonie van
leuuwenhoek 91 : 1-17.
Wina, E., Evanza, A.J. & Lowry, J.B. 1986. The Composition of Pith from the Sago Palms
Metroxylon sagu and Arenga pinnata. Journal of Science Food Agricultural 37 : 352-358
Yanti, N.A., Sembiring, L. & Margino, S. 2009a. Amylolytic Bacteria Producing The Raw
Material of Bioplastic. Berkala Penelitian Hayati 3C : 95-99.
Yanti, N.A., Sembiring, L. & Margino, S. 2009b. Production of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB)
from sago starch by the native isolate Bacillus megaterium PSA10. Indonesian Journal of
Biotechnology 14 (1) : 1111-1116.
Yilmaz, M., Soran, H. & Beyatli, Y. 2005. Determination of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB)
production by some Bacillus spp. World Journal of Microbiology & Biotechnology 21 :
565-566