BAB III

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 2 bulan, yaitu mulai pada minggu
keempat bulan Februari sampai minggu keempat bulan April 2009. Penelitian
dilaksanakan di Laboratorium Biologi, Jurusan Biologi,
FMIPA, Universitas
Haluoleo.
B. Subjek penelitian
Subjek penelitian ini adalah isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1 hasil skrining
bakteri
penghasil
kitinase
dari
tempat
pemeliharaan
udang
(tambak),
penampungan udang, limbah pengolahan udang dan tempat pembuangan limbah
padat udang yang terdapat dibeberapa daerah industri perikanan di Sulawesi
Selatan dan Sulawesi Tenggara, yang dikarakterisasi sifat biokimianya dengan
menggunakan berbagai uji biokimia yaitu uji fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis
pati, uji methyl red, uji Voges-Proskauer , uji oksidase, uji katalase, uji indol, uji
sitrat, uji pencairan gelatin, uji urease, uji H2S, uji selulose dan uji protease.
C. Alat dan bahan yang digunakan
1.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu terdiri dari peralatan gelas
dan bukan gelas serta peralatan instrumen.
a. Peralatan gelas dan bukan gelas
Peralatan gelas terdiri dari tabung reaksi (pyrex), cawan petri (pyrex),
gelas
ukur
100
mL
dan
50
mL,
gelas
kimia
(pyrex)
500
mL,
Erlenmeyer (pyrex) 250 mL, pipet volume (pyrex) 5 mL dan 10 mL,
pipet tetes, tabung Durham, pembakar bunsen, alat penanam bakteri (jarum ose)
ujung bulat dan ujung runcing.
Peralatan bukan gelas terdiri dari karet pengisap (filler), pengaduk
magnetik, pipet mikro, rak tabung reaksi dan botol semprot.
b. Peralatan instrumen
Peralatan instrumen terdiri dari autoklaf, neraca analitik (precisa 205 A),
inkubator, mikroskop cahaya, pemanas (thermolyne), refrigerator, entkas.
2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah pepton, dekstrosa,
kalium fosfat, ammonium dihidrogen fosfat, dikalium fosfat natrium klorida,
natrium sitrat, magnesium sulfat, agar, brom timol biru (BTB) tripton, kalsium
klorida, glukosa, laktosa, sukrosa, kalium dihidrogen fosfat, fenol merah, triple
sugar iron agar (TSIA), gelatin, ekstrak ragi, susu skim, karboksimetilselulosa
51
(CMC), kalium nitrat, trypticase soy agar (TSA), metil merah, etanol 70% dan
etanol 95 %, -naftol, hidrogen peroksida, asam sulfat pekat, larutan iodin, kalium
hidroksida, manitol, maltosa, pati, dimetil-p-fenilendiamin oksalat, safranin,
larutan lugol iodin, Simmon sitrat agar, kalium nitrit 0,5% , asam sulfanilat,
α-naftilamin, p-dimetilaminobenzaldehida, butanol, asam klorida pekat dan
aquades.
..............................
52
D. Prosedur penelitian
Secara umum, metode penelitian ini digambarkan dalam skema berikut :
a. Pewarnaan Gram
Kaca penutup dan kaca objek
-dibersihkan dengan alkohol 70%
-dilewatkan di atas nyala lampu spirtus
Isolat bakteri (1 ose)
-diletakkan diatas kaca objek seluas ± 1 cm2
-dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus
-
diteteskan zat warna dasar (kristal violet) (2 tetes)
-didiamkan selama 1 menit
-dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan
-ditetesi dengan larutan lugol iodin dan
-diamkan 1 menit
-dicuci dengan alkohol 95% (2 tetes)
-didiamkan selama ± 30 detik
-dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan
-diberi larutan safranin (2 tetes)
-didiamkan selama 2 menit
-dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan
-diamati dengan mikroskop
bakteri gram positif berwarna biru keunguan
sedangkan gram negatif berwarna merah
53
b. Uji sifat biokimia isolat
Sterilisasi alat yang akan digunakan
-sterilisasi dengan menggunakan metode panas
lembab (autoklaf) pada suhu 121oC selama
15 menit
-dikeringkan dengan menggunakan oven pada
suhu 80oC selama 15 menit
Pembuatan media uji mikroba
Pembuatan reagen uji
- disterilisasi dengan
metode panas lembab (autoklaf)
pada suhu 121oC selama 15 menit
media uji mikroba steril
reagen uji
Inokulasi isolat bakteri kitinolitik
pada tiap-tiap media uji
Inkubasi pada suhu dan waktu
sesuai tiap-tiap uji biokimia
Karakterisasi isolat bakteri dengan berbagai uji biokimia, yaitu :
- uji fermentasi karbohidrat - uji hidrolisis pati
-uji methyl red
- uji Voges-Proskauer
- uji oksidase
- uji katalase
- uji indol
- uji sitrat
- uji pencairan gelatin
- uji urease
- uji H2S
- uji selulase
- uji protease
- uji nitrat
54
D. Identifikasi isolat
Isolat diidentifikasi berdasarkan pewarnaan gram untuk mengetahui
bentuk sel bakteri dan sifat gram (gram negatif/gram positif) dan uji karakterisasi
sifat biokimia isolat.
a. Pewarnaan Gram
Kaca penutup dan kaca obyek dibersihkan dengan alkohol hingga bebas
lemak, kemudian dilewatkan di atas nyala lampu spritus. Diambil secara aseptik
sebanyak satu ose isolat bakteri dan diletakkan pada kaca obyek seluas ± 1 cm2
kemudian dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus. Diteteskan zat warna
dasar (kristal violet) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu
dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan, kemudian ditetesi dengan larutan
lugol iodin dan diamkan selama 1 menit. Setelah kering, dicuci dengan larutan
peluntur/pemucat (alkohol 95%) sebayak 2 tetes dan didiamkan selama ± 30 detik.
Selanjutnya dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah kering diberi
larutan zat warna pembanding/penutup (safranin) sebanyak 2 tetes dan didiamkan
selama 2 menit dan dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah itu
diamati dengan mikroskop, bakteri gram positif tampak berwarna biru keunguan
sedangkan gram negatif berwarna merah (Lay, 1994).
55
b. Uji sifat biokimia isolat

Uji fermentasi karbohidrat
Langkah-langkah yang digunakan dalam uji fermentasi karbohidrat adalah
menyiapkan kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan
manitol masing-masing 1%. Kaldu karbohidrat yang mengandung BTB (brom
timol biru) sebagai indikator pH dan ditambahkan pepton sebagai sumber
nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi
tabung Durham. Kemudian diinokulasi dengan biakan bakteri. Setelah itu
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30oC selama 24 jam. Selanjutnya
fermentasi karbohidrat diperiksa dengan melihat pembentukan asam (warna
kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham (Lay, 1994).

Uji methyl red
Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red adalah disiapkan
kaldu MR-VP, lalu dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dan
diinokulasikan biakan bakteri ke dalam kaldu MR-VP, diinkubasi pada suhu 37oC
selama 48 jam atau pada suhu 30oC selama 72 jam. Hari berikutnya ditambahkan
reagen metil merah 5 tetes, jika kaldu berwarna merah setelah penambahan reagen
metil merah maka menunjukan hasil uji positif, dan jika warna kaldu berwarna
kuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).
56

Uji Voges Proskauer
Kaldu MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
diinokulasi bakteri pada kaldu MR-VP, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC
selama 24 jam. Setelah itu ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes
larutan α-naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji positif jika kaldu berwarna
merah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah
penambahan reagen (Lay, 1994).

Uji oksidase
Biakan ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA), diinkubasi selama
pada suhu 30oC selama 24 jam, kemudian ditambahkan reagen uji oksidase
(campuran 1:1 larutan -naftol 1% dan 1% larutan
dimetil-p-fenilendiamin
oksalat) pada koloni bakteri dan didiamkan selama 30 menit. Uji positif jika
warna koloni berubah menjadi hitam (Lay, 1994).

Uji katalase
Biakan ditumbuhkan pada media NA dengan cara ditotolkan dan
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC kemudian ditambahkan reagen H2O2
3 %. Uji positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara pada biakan dan
disekitarnya (Lay, 1994).
57

Uji indol
Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL,
diinkubasi
selama
24
jam
pada
suhu
35oC,
kemudian
ditambahkan
beberapa tetes reagen Kovacs. Jika terbentuk warna merah dipermukaan medium
menunjukkan hasil uji positif (Waluyo, 2008).

Uji sitrat
Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulum
yang tipis, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 48 jam. Jika terjadi
perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan uji positif (Lay, 1994).

Uji pencairan gelatin
Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yang
akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasi
pada suhu 350C selama 24 jam. Jika media gelatin mencair, maka langkah
selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Diamati pencairan
gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika
tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 350C. Uji
negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).
58

Uji hidrogen sulfida ( H2S)
Inokulasi biakan pada tabung reaksi yang telah berisi media TSIA 7 mL
dengan cara menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru diinokulasi
pada bagian slant TSIA. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati
pertumbuhannya pada bagian Butt dan Slant (Lay, 1994).

Uji urease
Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme,
kemudian diinkubasi pad suhu 350C selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warna
dari kuning
menjadi merah keunguan
maka menunjukkan uji positif
(Hadioetomo, 1985).

Uji selulase
Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC
(karboksimetilselulase) pada cawan Petri dengan melubangi agar pada cawan
dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a),
kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkan
dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro
sebelum dipipet lalu diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak
100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak
terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona
bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).
59
O
O
O
O
O
(a)
( b)
Gambar 19. (a) Bentuk lubang dan (b) bentuk goresan pada media uji.

Uji protease
Inokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim pada
cawan Petri dengan membagi media menjadi 4 bagian dengan menggunakan
spidol pada bagian luar cawan petri, kemudian digoreskan inokulum pada 4
bagian media tersebut (Gambar 19.b). Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada
inkubator dengan suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona
bening di sekitar daerah goresan (Akhdiya, 2003).

Uji hidrolisis pati
Biakan diinokulasi pada media NA yang mengandung pati, dengan cara
melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5
lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan
kemudian diencerkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan
menggunakan pipet mikro sebelum dipipet dan diinokulasi pada lubang yang
terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada
inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan
dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih,
2007).
60

Uji reduksi nitrat
Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada kaldu
nitrat
dalam tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham,
kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 jam. Setelah masa inkubasi,
diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media biakan.
Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan
α-naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan
warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak
menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk Zn untuk melihat reduksi
nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah
warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit
dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004).
E. Desain penelitian
Tabel 6. Desain penelitian hasil perlakuan pada pewarnaan Gram
terhadap isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1.
No
Reagen yang diberikan
Warna isolat
SSA2.B4.1
1
Kristal violet
2
Larutan lugol
3
Larutan pemucat (Alkohol 95%)
4
Safranin
SSD2A7
Kesimpulan
61
Tabel 7. Desain penelitian hasil uji sifat biokimia isolat
SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1.
No
Nama isolat
Jenis uji
Hasil
uji
Keterangan
1
2
3
4
5
1.
SSD2A7.1.
1. Fermentasi karbodidrat
a. Fermentasi glukosa
b. Fermentasi manitol
c. Fermentasi laktosa
d. Fermentasi sukrosa
2. Uji indol
3. Uji Methyl red
4. Uji Voges Proskauer
5. Uji sitrat
6. Uji urease
7. Uji Hidrogen sulfida
8. Uji katalase
9. Uji selulase
10. Uji protease
11. Uji hidrolisis pati
12. Uji pencairan gelatin
13. Uji oksidase
14. Uji nitrat
62
No
Nama isolat
Jenis uji
Hasil
uji
Keterangan
1
2
3
4
5
1. Fermentasi karbodidrat
a. Fermentasi glukosa
b. Fermentasi manitol
c. Fermentasi laktosa
d. Fermentasi sukrosa
2.
SSA2B4.1.
2. Uji indol
3. Uji Methyl red
4. Uji Voges Proskauer
5. Uji sitrat
6. Uji urease
7. Uji Hidrogen sulfida
8. Uji katalase
9. Uji selulase
10. Uji protease
11. Uji hidrolisis pati
12. Uji pencairan gelatin
13. Uji oksidase
14. Uji nitrat
63