KONSTRUKSI GEN STILBENA SINTASE PADA

PENDAHULUAN
Bioteknologi merupakan suatu bidang
ilmu dalam biologi terapan yang melibatkan
penggunaan organisme hidup dan bioproses
untuk menciptakan suatu produk demi
kepentingan manusia. Bioteknologi modern,
atau sering disebut juga rekayasa genetika,
telah berkembang sangat pesat dalam dua
dasawarsa terakhir ini. Teknik rekayasa
genetika telah banyak diaplikasikan dalam
berbagai bidang, misalnya penelitian, medis,
rekayasa genetika hewan, dan rekayasa
genetika tanaman (Smith 2004).
Rekayasa genetika tanaman adalah suatu
teknik untuk memindahkan gen spesies asing
ke dalam suatu sel tanaman, yang diikuti
dengan regenerasi dari sel-sel tanaman
tersebut sehingga menjadi tanaman lengkap.
Teknik ini telah diterapkan pada berbagai
tanaman pangan dan nonpangan. Rekayasa
genetika sebenarnya merupakan kelanjutan
dari pemuliaan tanaman yang telah dilakukan
oleh petani secara tradisional. Rekayasa
genetika memungkinkan pemindahan satu
atau beberapa gen yang dikehendaki dari satu
tanaman ke tanaman lainnya yang tidak
mungkin terjadi dalam pemuliaan tanaman
secara tradisional.
Prinsip rekayasa genetika sama dengan
pemuliaan tanaman, yaitu memperbaiki sifatsifat tanaman dengan menambahkan sifat-sifat
ketahanan terhadap gangguan hama maupun
lingkungan yang kurang menguntungkan.
Proses rekayasa genetika telah berhasil
mengembangkan berbagai spesies tanaman
baru dengan ketahanan terhadap organisme
pengganggu, seperti serangga, penyakit, dan
gulma yang sangat merugikan tanaman
(Winarno & Agustinah 2007). Contoh
tanaman yang telah berhasil direkayasa adalah
jagung, kapas, kedelai, tomat, dan kelapa
sawit.
Kelapa sawit merupakan salah satu
komoditas perkebunan yang sangat penting di
Indonesia dan produksinya meningkat setiap
tahun. Salah satu kendala yang cukup berarti
dalam usaha peningkatan produksi kelapa
sawit adalah penyakit busuk pangkal batang
yang disebabkan oleh cendawan Ganoderma
sp. Penyakit ini dapat merusak sangat banyak
tanaman kelapa sawit dalam suatu area (PPKS
2009). Pengendalian terhadap penyakit ini
telah dilakukan baik secara mekanis, kimiawi,
maupun hayati (Lubis 1992), namun belum
ada yang dapat dianggap efektif sehingga
perlu dilakukan pengendalian yang tepat.
Pengendalian yang paling tepat dilakukan
untuk masalah Ganoderma pada tanaman
kelapa sawit adalah melalui pemuliaan
tanaman dengan rekayasa genetika, yaitu
untuk menemukan gen yang dapat membuat
kelapa sawit tahan terhadap Ganoderma. Gen
tersebut dapat berasal dari spesies kelapa
sawit sendiri maupun dari spesies lain. Gen
stilbena sintase (STS) yang berasal dari
anggur (Vitis vinifera) merupakan gen
penghasil senyawa yang berfungsi sebagai
anti jamur (SIB 2007), sehingga dapat
dilakukan upaya penyisipian gen STS ke
dalam kelapa sawit agar dapat meningkatkan
ketahanan terhadap Ganoderma.
Upaya konstruksi gen STS agar dapat
disisipkan ke dalam kelapa sawit sebelumnya
sudah pernah dilakukan dengan menggunakan
metode pengklonan biasa dengan prosedur
yang cukup rumit dan waktu yang cukup
lama. Konstruksi gen pada penelitian ini
menggunakan teknologi Gateway. Teknologi
Gateway adalah suatu metode kloning
universal yang berdasarkan rekombinasi situs
spesifik pada bakteriofag lambda (Landy
1989). Teknologi Gateway memungkinkan
pemindahan secara cepat dan efisien sekuen
DNA ke dalam beberapa vektor untuk
dilakukan analisis fungsional dan ekspresi
protein (Hartley at al. 2000).
Penelitian ini bertujuan mengonstruksi gen
STS pada vektor ekspresi dengan metode
yang lebih cepat dan terarah, yaitu metode
Gateway. Gen STS yang telah tersisipkan
dalam
vektor
ekspresi
selanjutnya
ditransformasikan ke dalam Agrobacterium
tumefaciens. Hipotesis penelitian ini adalah
gen STS yang telah dikonstruksi pada vektor
ekspresi dengan metode Gateway bisa
disisipkan
ke
dalam
Agrobacterium
tumefaciens agar dapat diekspresikan pada
tanaman. Hasil penelitian ini diharapkan dapat
menghasilkan Agrobacterium tumefaciens
yang memiliki gen STS, serta memberikan
informasi mengenai metode Gateway sebagai
teknologi rekombinasi gen yang cepat dan
mudah.
TINJAUAN PUSTAKA
Stilbena Sintase
Stilbena sintase merupakan suatu protein
yang memiliki panjang sekuen 392 asam
amino yang berperan dalam proses
pembentukan suatu senyawa yang disebut
resveratrol. Protein ini berfungsi sebagai
2
katalis reaksi sintesis substrat malonil KoA
dan p-koumaroil KoA (Rolfs & Kindl 1984)
menjadi
3,5,4’-trihidroksistilbena
atau
resveratrol. Stilbena sintase terdapat secara
spesifik pada daun, terekspresi di jaringan
palisade dan parenkim. Stilbena sintase bukan
merupakan bagian permanen dari suatu
tanaman, protein ini terinduksi pada saat
beberapa kondisi tertentu seperti saat stres,
terpapar sinar ultraviolet (UV), atau saat
kehadiran patogen seperti Botrytis cinerea
(Schubert et al. 1997).
Resveratrol merupakan suatu senyawa
fitoaleksin polifenolik. Senyawa ini termasuk
dalam golongan stilbenoid, yaitu derivat
stilbena, yang diproduksi dalam beberapa
tanaman dengan bantuan enzim stilbena
sintase untuk melindungi tanaman tersebut
dari infeksi jamur (Breuil et al. 1999).
Anggur, kacang, dan beberapa spesies
tanaman lainnya memiliki kandungan
resveratrol yang terakumulasi di daun
mencapai 400 µg/g berat segar. Konsentrasi
sebesar itu menunjukkan korelasi dengan
resistensi tanaman tersebut terhadap jamur
(Sbaghi et al. 1995). Tanaman seperti
tembakau, tomat, dan alfalfa yang sebelumnya
rentan menunjukkan peningkatan resistensi
terhadap jamur patogen setelah disisipkan gen
stilbena sintase (Hain et al. 1993).
Pengklonan & Metode Pengklonan
Gateway
Klon adalah sekumpulan individu atau
bahan identik yang diperbanyak dari individu
atau bahan yang sama, sedangkan pengklonan
adalah proses perbanyakan bahan tersebut
sehingga menghasilkan bahan yang identik
dengan bahan asalnya (Triastuti 2007).
Pengklonan gen, atau dapat disebut juga
kloning gen dan teknologi DNA rekombinan,
merujuk pada suatu proses yaitu pemindahan
fragmen DNA yang diinginkan dari satu
organisme ke dalam suatu vektor, misalnya
plasmid. Fragmen DNA dan vektor yang telah
bergabung disebut molekul DNA rekombinan.
DNA rekombinan tersebut kemudian dapat
diperbanyak dalam suatu sel inang (HGP
2009).
Tahap awal yang umum dilakukan dalam
pengklonan gen adalah isolasi fragmen DNA
dan vektor, misalnya dari bakteri, dan setelah
diisolasi fragmen DNA dan vektor dipotong
dengan enzim restriksi yang sama. Tahap
selanjutnya adalah menggabungkan fragmen
DNA dengan vektor yang dibantu oleh enzim
ligase, sehingga disebut juga tahap ligasi,
menghasilkan molekul DNA rekombinan.
Molekul DNA rekombinan kemudian
ditransformasikan ke bakteri. Transformasi
adalah proses memasukkan DNA asing (DNA
rekombinan) ke dalam sel inang. Sel inang
yang
telah
mengalami
transformasi
(mengandung DNA rekombinan) kemudian
diseleksi berdasarkan gen penanda yang
dibawa oleh plasmid. Gen penanda, atau
selectable marker, biasanya berupa gen yang
tahan terhadap suatu antibiotik. Sel inang
yang
telah
diseleksi
selanjutnya
ditransformasi ke sel target. Tahap terakhir
adalah meneliti gen yang diklon, yaitu dengan
mendapatkan informasi mengenai lokasi gen,
cara gen ditranskripsi, hasil translasi yang
dikode oleh gen, dan struktur gen (Brown
1991).
Metode pengklonan Gateway, yang
ditemukan dan dikembangkan oleh Invitrogen
sejak akhir tahun 1990-an, adalah suatu
metode
biologi
molekular
yang
memungkinkan peneliti untuk memindahkan
fragmen DNA dari suatu plasmid ke plasmid
lain secara efisien dengan menggunakan suatu
set sekuen rekombinasi yang disebut situs “att
Gateway”, dan dua mix enzim yang disebut
enzim BP klonase dan LR klonase. B
merupakan singkatan dari bacterial dan P
(phage), sedangkan L (left) dan R (right).
Metode ini dapat secara efektif menggantikan
fungsi dari enzim restriksi endonuklease dan
ligase pada metode pengklonan biasa (Hartley
et al. 2000).
Metode pengklonan Gateway sebenarnya
memanfaatkan reaksi rekombinasi situs
spesifik yang memungkinkan bakteriofag
lambda untuk berintegrasi ke dalam
kromosom bakteri atau sebaliknya. Protokol
Gambar 1 Reaksi BP dalam metode Gateway
(Kolpack & Loschelder 2008).
3
Gateway sangat bergantung pada reaksi BP
dan LR klonase. Reaksi BP (Gambar 1)
dikatalisis oleh mix enzim BP klonase yang
terdiri atas enzim integrase fage (Int) dan
protein IHF (Integration Host Factor). Enzim
BP klonase memindahkan suatu fragmen
DNA yang diinginkan, misalnya produk PCR,
yang diapit oleh dua situs bacterial
attachment (attB) ke dalam vektor donor
(pDONR) yang membawa dua situs phage
attachment (attP). Rekombinasi terjadi antara
situs attB dan attP yang cocok, selanjutnya
fragmen DNA disisipkan ke dalam vektor
donor, menghasilkan suatu klon entri
(pENTR) yang diapit oleh dua situs left
attachment (attL). Klon entri juga dapat
dirakit oleh restriksi dan ligasi fragmen DNA
dalam vektor yang mana situs pengklonan
jamaknya diapit oleh situs attL (Karimi et al.
2007).
Klon entri merupakan substrat kunci
dalam reaksi LR (Gambar 2) yang dikatalisis
oleh mix enzim LR klonase yang terdiri atas
enzim integrase (Int), exsisionase fage (Xis),
dan protein IHF. Enzim LR klonase
memindahkan fragmen DNA yang diinginkan
yang diapit oleh dua situs attL (di dalam klon
entri) ke dalam vektor destinasi (pDEST)
yang membawa dua situs right attachment
(attR). Rekombinasi terjadi antara situs attL
dan attR yang cocok, selanjutnya fragmen
DNA disisipkan ke dalam klon ekspresi
(pEXPR) dan diapit lagi oleh situs attB
(Karimi et al. 2007).
Hasil rekombinasi dapat diseleksi dengan
kombinasi seleksi positif (resisten terhadap
antibiotik) dan seleksi negatif (gen sitotoksik
ccdB). Gen sitotoksik ccdB (Control of Cell
Death B) terdapat pada vektor donor dan
vektor destinasi. Saat rekombinasi pada reaksi
Gambar 2 Reaksi LR dalam metode Gateway
(Kolpack & Loschelder 2008).
BP terjadi, gen ccdB akan bertukar dengan
fragmen DNA yang diinginkan sehingga
vektor yang tidak disisipi DNA tersebut akan
mati karena gen ccdB. Begitu juga pada reaksi
LR, fragmen DNA yang telah diapit oleh situs
attL akan bertukar dengan gen ccdB yang
telah diapit oleh situs attR pada vektor
destinasi (Bernard & Couturier 1992).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
merupakan salah satu teknik yang digunakan
secara luas dalam bidang biologi molekular
dan dikembangkan pertama kali oleh Kary
Mullis pada tahun 1984. Teknik ini disebut
polymerase chain reaction karena mengacu
pada enzim DNA polimerase yang digunakan
untuk mengamplifikasi (replikasi berulang
kali) suatu DNA secara in vitro. Instrumen
PCR dapat mereplikasi molekul DNA yang
asli dengan bantuan enzim DNA polimerase
sehingga jumlahnya menjadi dua kali lipat.
Molekul-molekul DNA tersebut kemudian
direplikasi lagi pada replikasi “siklus” kedua,
sehingga jumlahnya menjadi empat kali lipat.
DNA direplikasi lagi pada siklus ketiga dan
seterusnya, proses ini yang disebut “reaksi
berantai” (chain reaction) dimana DNA
cetakan diamplifikasi secara eksponensial.
Proses PCR memungkinkan amplifikasi satu
utas DNA menjadi beberapa juta kopi melalui
beberapa siklus, sehingga dapat digunakan
dalam manipulasi genetik atau penggunaan
yang lain (Kennedy & Oswald 2011).
Proses
PCR
membutuhkan
empat
komponen utama agar dapat berjalan, yaitu (1)
DNA cetakan, adalah fragmen DNA yang
akan diamplifikasi, (2) oligonukleotida
primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida
pendek (15-25 basa nukleotida) yang
digunakan untuk mengawali sintesis rantai
DNA, (3) deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP,
dTTP, dan (4) enzim DNA polimerase, yaitu
enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis
rantai DNA. Komponen lain yang juga
penting adalah senyawa buffer (Yuwono
2006).
PCR pada prinsipnya adalah menggunakan
perbedaan temperatur untuk tiga tahap reaksi
(Gambar 3), yaitu denaturasi (denaturation),
penempelan (annealing), dan pemanjangan
(extension). Suhu yang tinggi, biasanya 94-95
o
C,
digunakan
untuk
mendenaturasi
(memisahkan) utas ganda DNA cetakan. Suhu
kemudian diturunkan untuk menempelkan
4
primer
kepada
sekuen
basa
yang
komplementer pada utas cetakan, suhu
annealing tersebut berbeda-beda bergantung
pada primer yang digunakan. Suhu annealing
memegang peranan penting untuk memastikan
tingkat spesifitas reaksi, biasanya semakin
tinggi suhu annealing maka reaksi akan
semakin spesifik. Suhu annealing yang
digunakan umumnya 55 oC. Akhirnya, untuk
sintesis DNA yang efisien, suhu diatur agar
optimal untuk aktivitas DNA polimerase,
yaitu sekitar 72 oC. Ketiga siklus tahap reaksi
tersebut biasanya dilalui berulang kali untuk
mendapatkan hasil amplifikasi DNA yang
baik (biasanya sekitar 25-40 siklus) atau agar
hasilnya dapat dilihat secara langsung melalui
elektroforesis gel agarosa (McPherson &
Moller 2006).
Keberhasilan PCR sangat bergantung pada
penggunaan primer yang didesain dengan
benar. Sepasang primer yang didesain dengan
benar dapat mengamplifikasi suatu fragmen
DNA yang cocok dengan daerah target dari
molekul DNA tersebut. Primer didesain agar
tepat komplementer dengan DNA cetakan.
Syarat-syarat desain primer yang baik secara
ringkas adalah: (1) Panjang primer,
memegang peranan penting karena suhu
annealing bergantung kepada panjang primer.
Panjang primer yang ideal berkisar antara 1830 basa; (2) Komposisi primer, komposisi
basa primer sebaiknya sekitar 45-60% terdiri
atas G+C; (3) Primer sebaiknya tidak
memiliki struktur sekunder; (4) Primer yang
ideal tidak mengandung sekuen yang saling
komplementer satu sama lain; (5) Sekuen
palindrom harus dihindari; (6) Suhu melting
(Tm) primer yang optimum berkisar antara 5258 oC, dapat dihitung dengan rumus Tm =
2(A+T) + 4(G+C); dan (7) Posisi produk,
Gambar 3 Tahapan reaksi PCR.
lokasi primer bisa di dekat ujung 5’, ujung 3’,
atau dimana saja selama tidak melebihi
panjang yang ditetapkan. Posisi ujung 3’ telah
diketahui dapat menghindari mispriming atau
kesalahan peng-awal-an (Donepudi 2011).
Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis
adalah suatu teknik
pemisahan molekul selular berdasarkan
ukurannya, dengan menggunakan medan
listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul,
misalnya
DNA
yang
bermuatan negatif. Molekul yang bermuatan
negatif jika dilewatkan melalui suatu medium,
misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus
listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya, maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul
tersebut bergantung pada rasio muatan
terhadap massanya, serta bergantung juga
pada bentuk molekulnya (Yuwono 2005).
Teknik elektroforesis dapat digunakan
untuk analisis DNA, RNA, maupun protein.
Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk
menganalisis fragmen-fragmen DNA hasil
pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen
molekul DNA yang telah dipotong-potong
dapat ditentukan ukurannya dengan cara
membuat gel agarosa, yaitu suatu bahan semipadat berupa polisakarida yang diekstraksi
dari rumput laut atau alga yang ditemukan di
California dan Asia bagian timur (Rothman
2011).
Gel
agarosa
dibuat
dengan
melarutkannya dalam suatu buffer, dan
dicetak sehingga membentuk sumur-sumur
saat kondisinya masih panas (cair). Larutan
buffer yang dapat digunakan misalnya trisasetat-EDTA (TAE) dan tris-borat-EDTA
(TBE). Teknik elektroforesis DNA juga
memerlukan loading buffer selain larutan
yang
berfungsi
buffer
elektroforesis,
meningkatkan densitas sampel sehingga
fragmen sampel tersebut berada di dasar
sumur gel dan tidak menyebar (Sambrook &
Russell 2001).
Elektroforesis pada dasarnya adalah proses
penyaringan. Fragmen DNA yang semakin
besar akan semakin mudah terjerat oleh
matriks gel, sehingga migrasinya akan
semakin lambat. Kepadatan matriks dapat
diatur dengan meningkatkan konsentrasi
agarosa
(kepadatan
meningkat)
atau
sebaliknya. Standar konsentrasi gel agarosa
1% dapat memisahkan DNA yang memiliki
panjang antara 0.2-30 Kb (Rothman 2011).
Pengamatan hasil elektroforesis dapat
dilakukan secara visual dengan menambahkan
etidium bromida (EtBr) pada gel. EtBr akan
menyisip ke dalam DNA sehingga dapat
berpendar jika dipaparkan sinar UV. Citra
berupa pita-pita pada gel akan tampak jika gel
disinari dengan sinar UV dari bawah. Pita-pita
tersebut adalah molekul-molekul DNA yang
bergerak
sepanjang
gel
setelah
dielektroforesis (Yuwono 2005).
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens merupakan
bakteri golongan Gram negatif yang memiliki
sifat aerob dan mampu hidup dengan baik
sebagai saprofit maupun parasit. A.
tumefaciens berbentuk batang, berukuran 0.610 µm sampai 1.5-3.0 µm dalam bentuk
tunggal atau berpasangan (Gambar 6). Bakteri
ini mudah bergerak (motil), tidak berspora,
tidak memiliki pigmen, dan tumbuh optimal
pada suhu 25-28 oC (Biotek UnUd 2008).
Sebagian
besar
genus
Agrobacterium
bertanggung jawab terhadap penyakit tumor
pada tanaman dikotil dan beberapa tanaman
monokotil yang disebut penyakit Crown Gall
(McCullen & Binns 2006).
Penyakit tumor Crown Gall adalah
jaringan tanaman yang pertumbuhannya
terdiferensiasi akibat adanya interaksi antar
tanaman yang rentan dengan galur virulen A.
tumefaciens. Galur AGL0 yang digunakan
dalam penelitian ini telah terbukti sebagai
galur yang virulen (Jones et al. 2005).
Karakterisasi molekular dari induksi Crown
Gall ini menunjukkan bahwa Agrobacterium
bisa dipakai untuk mengantarkan materi
genetik ke dalam tanaman (Deacon 2002).
Materi genetik tersebut berupa potongan DNA
yang disebut sebagai T-DNA (DNA transfer).
Bakteri ini dikenal sebagai parasit genetik
karena memindahkan materi genetiknya ke
dalam mekanisme genetik sel inang. Sistem
transfer DNA dari Agrobacterium ke tanaman
dimanfaatkan secara meluas untuk penelitian
biologi molekular dan rekayasa genetika pada
tanaman (Nester 2008).
Pembentukan tumor pada tanaman
melibatkan tiga komponen genetik. Pertama,
gen virulen kromosom (chromosomal
virulence atau chv) yang terdapat pada
kromosom A. tumefaciens. Gen ini berfungsi
dalam pelekatan bakteri pada sel tanaman.
Kedua, sekelompok gen virulen (vir). Gen vir
terdapat dalam plasmid Ti dan berperan dalam
menginduksi transfer dan integrasi T-DNA.
Ketiga, daerah T-DNA yang mengandung gen
penting bagi A. tumefaciens. Daerah ini
dibatasi oleh LB (Left border) dan RB (Right
Border). Proses pembentukan tumor inilah
yang mendasari konsep transformasi genetik
atau penyisipan gen ke dalam tanaman
menggunakan A. tumefaciens (Escobar &
Dandekar 2003).
Gambar 4 Agrobacterium tumefaciens.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam proses
amplifikasi menggunakan kit Platinum dari
Invitrogen adalah gen stilbena sintase (STS),
primer spesifik Gateway STS-For, primer
spesifik Gateway STS-Rev, larutan bufer PCR
10x, MgCl2, dNTPs, Taq polimerase, dan
molecular water (MW). Bahan yang
digunakan dalam elektroforesis yaitu gel
agarosa (Fermentas), larutan bufer Tris-BoratEDTA (TBE) 0.5x, etidium bromida (EtBr) 5
µL/100 mL, loading buffer (bromfenol biru
2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 Kb Plus
DNA Ladder (Invitrogen). Ekstraksi dan
purifikasi gel menggunakan kit dari Invitrogen
(PureLinkTM Quick Gel Extraction). Bahan
yang digunakan dalam proses rekombinasi
adalah kit Gateway® Technology dari
Invitrogen
(vektor
pDONRTM,
vektor
destinasi, enzim BP ClonaseTM, enzim
proteinase K, enzim LR ClonaseTM). Tahap
transformasi ke dalam sel kompeten
menggunakan sel kompeten Escherichia coli
XL1-Blue dan media Luria Agar (LA). Isolasi
DNA plasmid menggunakan kit dari
Fermentas (GeneJETTM Plasmid MiniPrep
Kit).
Tahap transformasi
ke
dalam
Agrobacterium menggunakan sel kompeten A.
tumefaciens galur AGL0 dan media Yeast
Extract Pepton (YEP). Bahan lainnya yang
digunakan adalah primer M13-F, primer M13R, larutan bufer 10x dream Taq, larutan bufer