Teknik RFLP - E-learning UPN JATIM

by:
Makhziah, Ir.MP.
GENETIC ENGINEERING,
WHAT IS ?
Domba Dolly
Produk Rekayasa Genetika
REKAYASA GENETIK / DNA REKOMBINAN
Pembentukan kombinasi materi genetik
yang baru dengan cara penyisipan
molekul DNA (gen) ke dalam suatu vektor
sehingga memungkinkannya untuk
terintegrasi dan mengalami perbanyakan
di dalam suatu sel organisme lain yang
berperan sebagai sel inang
TEKNIK REKAYASA GENETIK (DNA REKOMBINAN)
Tahun
Peristiwa
1917
Karl Ereky pertama kali menyatakan istilah bioteknologi
1943
Antibiotik penisilin diproduksi besar-besaran dalam skala industri
1944
Avery, MacLeod dan McCarty membuktikan bahwa DNA merupakan materi genetik.
1953
Watson dan Crick menemukan struktur DNA
1961-1966
Keseluruhan kode genetik dapat diketahui
1970
Isolasi pertama kali enzim endonuklease restriksi
1972
Khorana dan rekan-rekannya dapat mensintesis keseluruhan gen yang mengkode tRNA
1973
Boyer dan Cohen mengembangkan teknologi DNA rekombinan
1975
Kohler dan Milstein mendeskripsikan produksi antibodi monoklonal
1976
Pertama kali dikeluarkan pedoman untuk penelitian dalam bidang DNA rekombinan
1976
Pengembangan teknik untuk mengetahui sekuen DNA
1978
Perusahaan Genentech memproduksi insulin manusia pada sel bakteri Escherichia coli
1980
Badan pengadilan Amerika Serikat menetapkan peraturan dalam kasus Diamond VS Chakrabarty
yang melakukan manipulasi mikroorganisme yang dipatenkan.
1981
Pertama kalinya alat otomatis untuk sintesis DNA dijual secara komersial
1981
Pertama kalinya kit diagnostik yang dibuat dari antibodi monoklonal digunakan secara luas di AS
1982
Pertama kalinya vaksin hewan diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan di Eropa
1983
Ti plasmid yang telah direkayasa digunakan untuk transformasi pada tanaman
1988
Badan paten AS mengumkan bahwa tikus yang direkayasa secara genetis peka terhadap kanker
1988
Metode polymerase chain reaction (PCR) pertama kali dipublikasikan
1990
ASmengijinkan digunakannya sel tubuh manusia untuk kegiatan penelitian mengenai terapi gen.
Sejarah Perkembangan Rekayasa Genetik
o1750: B.C. Sumerians Brew Beer
o1944: DNA confirmed as genetic material
o1967: First protein synthesized by automation
o1973: First recombinant DNA experiment by Cohen & Boyer
o1973: Voluntary moratorium on certain cloning experiments
o 1974: Recombinant DNA Advisory Committee founded at
NIH
o1976: NIH Guidelines established
o 1980: Boyer Cohen patent issued (shared equally between
Boyer, UCSF, Cohen, and Stanford)
o 1982: 1st animal vaccine made by DNA recombinant
technology
o1985: DNA Finger printing by Alec Jeffreys
1987: First authorized field test of a GMO-Frostban, Adv.
Genetic Sciences
1988: PCR developed by K. Mullis
1990: 1st Gene Therapy Trials in U.S.
1994: Flavr Savr Tamato- Calgene
1995: 1st DNA sequences of free-living organism completed
1996: Human Genome Project under way
1997: Dolly-First cloned mammal
2000: Human Genome sequence is complete 3 billion bases, 2
yrs ahead of schedule
2001: Copy Cat, Cloning pets for profit.
2002: First Human Clone?
2003: Dolly is put down, Final version of Human DNA
Sequence published.
PRODUK HASIL TRANSFORMASI GENETIK
(TRANSGENIK)
Tanaman tembakau
transgenik yang dapat
berpendar karena disisipi
gen kunang-kunang
Deteksi ranjau darat
PRODUK KOMERSIAL TANAMAN TRANSGENIK
1. Golden Rice
 Mengandung provitamin A (betakaroten)
dalam jumlah tinggi.
 Gen berasal dari tumbuhan narsis
(Narcissus), jagung, dan bakteri Erwinia
disisipkan pada kromosom padi.
2. Jagung Bt & kapas Bt
 Tahan terhadap hama ulat Lepidoptera.
 Gen toksin Bt berasal dari bakteri Bacillus
thuringiensis ditransfer ke dalam tanaman
3. Tanaman tembakau tahan cuaca dingin
Gen untuk mengatur pertahanan pada cuaca dingin dari
tanaman Arabidopsis thaliana dan sianobakter (Anacyctis
nidulans) .
4. Tanaman kedelai kaya asam oleat dan tahan herbisida
 Mengandung asam oleat tinggi dan tahan terhadap
herbisida glifosat.
 Gen resisten herbisida dari bakteri Agrobacterium galur
CP4 dimasukkan ke kedelai dan juga digunakan
teknologi molekular untuk meningkatkan pembentukan
asam oleat.
5. Tanaman tomat tahan lama tidak busuk
 Gen khusus antisenescens ditransfer ke tomat untuk
menghambat enzim poligalakturonase (enzim yang
mempercepat kerusakan dinding sel tomat. Bisa
menggunakan gen dari bakteri E. coli, atau dengan
memodifikasi gen yang telah dimiliknya secara alami.
6. Ubi jalar tahan virus
 Gen dari selubung virus tertentu ditransfer ke ubi
jalar dan dibantu dengan teknologi peredaman
gen
7. Tanaman kanola kaya asam laurat dan vitamin E
 Gen FatB dari Umbellularia californica ditransfer ke
dalam tanaman kanola untuk meningkatkan
kandungan asam laurat.
8. Pepaya tahan terhadap virus tertentu (Papaya ringspot virus
(PRSV).
 Gen yang menyandikan selubung virus PRSV
ditransfer ke dalam tanaman pepaya.
9. Melon tidak cepat busuk
 Gen baru dari bakteriofag T3 diambil untuk
mengurangi pembentukan hormon etilen (hormon
yang berperan dalam pematangan buah)
10. Gandum tahan terhadap penyakit hawar (Fusarium)
 Gen penyandi enzim kitinase (pemecah dinding sel
cendawan) yang berasal dari barley ditransfer ke
tanaman gandum.
11. Bit gula tahan terhadap herbisida glifosat dan glufosinat.
 Gen berasal dari bakteri Agrobacterium galur CP4
dan cendawan Streptomyces viridochromogenes
ditransfer ke dalam tanaman bit gula.
12. Buah plum tahan terhadap infeksi virus cacar plum pox virus
 Gen selubung virus cacar prem ditransfer ke
tanaman plum
Produk Hormon Insulin
INSULIN DARI HASIL SEKRESI
BAKTERI
CENTRAL DOGMA
STRUKTUR DNA
STRUKTUR RNA
PERANGKAT REKAYASA GENETIK
 Ligase Enzyme
A. VEKTOR
Pembawa fragmen DNA target utk
dimasukkan kedlm bakteri agar dpt
memperbanyak diri (replikasi)
Central component dlm kloning gen
Macam Vektor
:
1. Plasmid
umum dipakai
2. Fage
3. Cosmid
4. Yeast Artificial Cromosome (YAC)
Plasmid pBR322 paling sering dipakai krn :
Panjang fragmen relatif kecil (4363bp) shg DNA
vector & DNA rekombinan dpt dimurnikan.
Membawa 2 gen ketahanan antibiotik yaitu :
a.Gen ketahanan Ampicilin (Amp R)
b.Gen ketahanan Tetraciclin (Tetr R)
Dapat mengcopy diri yg besar yaitu 1000-3000
per sel (relaxed plasmid)
PLASMID
pBR 322
PHAGE
COSMID
YEAST ARTIFICIAL CROMOSOME
(Yac)
B. ENSIM RESTRIKSI
Ensim yg memotong DNA menjadi fragmen2 DNA
Tipe ensim restriksi :
type I, type II dan type III dipakai dlm Rekayasa Genetik (RG)
krn punya situs pemotongan yg spesifik
Restriksi Endonuklease (RE)
Type RE :
Berujung Rata (Blunt End)
Memotong ditengah sekuen rekoknisi (pengenalan) shg menghasilkan ujung rata
5’-N-N-G-G-C-C-N-N-3’
HaeIII
5’-N-N-G-G
C-C-N-N-3’
3’-N-N-C-C-G-G-N-N-5’
3’-N-N-C-C
G-G-N-N-5’
Berujung tidak Rata ( Cohesif End)
Memotong tidak tepat ditengah sekuen shg menghasilkan ujung yg tdk rata
efisien utk RG krn ikatannya kuat
5’-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N
3’-N-N-C-T-T-A-A-C-N-N
EcoRI
5’N-N-G- A-A-T-T-C-N-N-3’
3’N-N-C-T-T-A-A
G-N-N-5’
*Situs pengenalan ensim restriksi adalah daerah simetri
PALINDROM
yaitu : bila kedua utas dibaca dari arah berlawanan akan memberikan nukleotida yg
sama
C. ENSIM LIGASE
Ensim yg menyambung dua ujung DNA melalui ikatan kovalen
antara ujung 3’OH utas yg satu dg 5’ P utas yg lain
LIGASI (Penyambungan)