Untitled

KARAKTERISASI ENZIM HIDROLASE BAKTERI DARI
MATA AIR SODA PARBUBU, TAPANULI UTARA
SRI ASIH
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
KARAKTERISASI ENZIM HIDROLASE BAKTERI DARI
MATA AIR SODA PARBUBU, TAPANULI UTARA
SRI ASIH
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
ABSTRAK
SRI ASIH. Karakterisasi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda Parbubu,
Tapanuli Utara. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan RASTI SARASWATI.
Tapanuli Utara memiliki sumber mata air soda yang potensial sebagai
sumber keanekaragaman biota Indonesia, salah satunya adalah bakteri hidrolitik.
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi bakteri dari mata air soda Parbubu dan
menguji aktivitas enzim hidrolasenya, yaitu lipase, protease, dan selulase serta
mengkarakterisasi enzim hidrolase terbaik pada kondisi suhu dan pH tertentu.
Isolasi bakteri dari mata air soda Parbubu menggunakan metode cawan tuang
menghasilkan 23 isolat bakteri. Uji semikualitatif enzim hidrolase menggunakan
metode indeks hidrolitik enzim pada media menunjukkan bahwa isolat bakteri P9
memiliki aktivitas enzim lipase tertinggi. Waktu panen enzim lipase bakteri P9
berdasarkan kurva tumbuh dan kurva produksi enzim, yaitu pada jam ketujuh
inkubasi. Aktivitas enzim lipase ditentukan dengan metode titrimetri
menunjukkan bahwa fraksi enzim dengan pengendapan (60-80)% ammonium
sulfat memiliki aktivitas tertinggi, yaitu sebesar 3.5245 U/mL atau 5.992 kali
dibandingkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Enzim lipase memiliki aktivitas
optimum pada pH 7, yaitu sebesar 5.9593 U/mL dan pada suhu 90ºC dengan
aktivitas sebesar 4.9019 U/mL.
ABSTRACT
SRI ASIH. Characterization of Enzymes from Bacteria Hidrolase Parbubu Soda
Springs, North Tapanuli. Under the direction of I MADE A RTIKA and RASTI
SARASWATI.
North Tapanuli has a soda fountain as a source of potential biotic diversity of
Indonesia, one of which is the hydrolytic bacteria. The purpose of this study was
to isolate bacteria from the soda fountain and test Parbubu hidrolasenya enzyme
activities, ie lipase, protease, and cellulase enzyme hidrolase and characterize the
best in certain conditions of temperature and pH. Isolation of bacteria from the
soda fountain Parbubu using pour plate method produced 23 isolates of bacteria.
Test semikualitatif hidrolase enzyme using hydrolytic enzymes in media index
showed that the bacterial isolates P9 has the highest lipase activity. Harvest time
P9 bacterial lipase based on the growth curve and enzyme production curves, ie
on the seventh hour of incubation. Lipase activity determined with titrimetric
method shows that the fraction of the enzyme by precipitation (60-80)% of
ammonium sulfate has the highest activity, that is equal to 3.5245 U / mL or 5992
times the activity of crude extract. Lipase enzyme has optimum activity at pH 7, at
5.9593 U / mL and at a temperature of 90 º C with the activity of 4.9019 U / mL.
Judul Skripsi
Nama
NIM
: Karakterisasi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda
Parbubu, Tapanuli Utara
: Sri Asih
: G84062071
Disetujui,
Komisi Pembimbing
Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc.
Ketua
Dr. Rasti Saraswati
Anggota
Diketahui
Ketua Departemen Biokimia
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT, yang telah
melimpahkan karunia-Nya, sholawat serta salam semoga tercurahkan kepada
Rasulullah Muhammad SAW beserta keluarga dan orang-orang yang berjuang
menegakkan ajaran agama-Nya. Penelitian yang dilakukan berjudul Karakterisasi
Potensi Enzim Hidrolase Bakteri dari Mata Air Soda Parbubu, Tapanuli Utara.
Karya ilmiah ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan di
Laboratorium Mikrobiolgi dan Kesehatan Tanah, Balai Penelitian Tanah, Bogor
pada bulan Maret sampai dengan Juli 2010.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyusunan karya ilmah ini. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan terutama kepada Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc. Selaku
pembimbing dan Dr. Rasti Saraswati selaku pembimbing sekaligus mendanai
penelitian ini. Ungkapan terima kasih yang tak terhingga penulis ucapkan kepada
orang tua dan keluarga atas segala doa, dukungan, dan kasih sayang yang telah
diberikan. Terima kasih penulis sampaikan pula kepada teman-teman Al Iffah, Al
Hurriyyah, ISC, dan Biokimia 43 atas motivasi dan dukungannya.
Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari berbagai
pihak sebagai bahan masukan di kemudian hari. Semoga karya tulis ini dapat
berguna bagi penulis sendiri maupun semua pihak yang membutuhkannya demi
perkembangan dan kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi.
Bogor, Februari 2011
Sri Asih
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Malang pada tanggal 25 Desember 1989 dari bapak
Tukiran dan ibu Lisiati. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara.
Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Gondanglegi Kabupaten
Malang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur
Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada program mayor minor. Penulis
memilih Mayor Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan
Minor Teknologi Pangan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten mata kuliah
Pendidikan Agama Islam pada tahun ajaran 2007/2008, 2008/2009, dan
2009/2010, serta pernah menjadi asisten mata kuliah Biokimia Umum pada tahun
ajaran 2009/2010. Penulis juga pernah aktif dalam organisasi kemahasiswaan,
yaitu sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa Forum for Scientifict Studies
(FORCES) pada tahun 2006-2008, anggota Ikatan Keluarga Muslim TPB (IKMT)
pada tahun 2006-2007, dan pengurus LDK Al Hurriyyah IPB pada tahun 20062010. Penulis pernah mendapatkan dana Program Kreativitas Mahasiswa bidang
Kewirausahaan (PKMK) dari DIKTI pada tahun 2009. Pada periode bulan Juli
sampai Agustus tahun 2009 penulis melakukan Praktik Lapangan di Laboratorium
Mikrobiologi, bagian Quality Control PT. Frissian Flag Indonesia dan menulis
karya ilmiah berjudul Pengendalian Mutu Susu Bubuk Formula dari Bakteri
Salmonella spp.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ vii
PENDAHULUAN ............................................................................................... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Mata Air Soda Parbubu...................................................................................
Enzim Hidrolase .............................................................................................
Kurva Pertumbuhan Bakteri ..........................................................................
Aktivitas Enzim .............................................................................................
2
2
4
5
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan ............................................................................................... 5
Metode ........................................................................................................... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi bakteri dari Mata Air Soda Parbubu.................................................... 8
Aktivitas Enzim Hidrolase secara Semikuantitatif ........................................ 8
Waktu Optimum Produksi Enzim Lipase ....................................................... 9
Aktivitas Enzim Lipase................................................................................... 10
Karakterisasi Enzim Lipase ............................................................................ 12
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ......................................................................................................... 13
Saran ............................................................................................................... 13
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 13
LAMPIRAN ......................................................................................................... 16
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Sumber mata air soda Parbubu ........................................................................ 2
2 Struktur enzim selulase .................................................................................... 3
3 Struktur enzim protease ................................................................................... 3
4 Struktur enzim lipase ....................................................................................... 4
5 Pola pertumbuhan bakteri ................................................................................ 5
6 Hasil uji semikuantitatif selulase pada isolat P10............................................ 8
7 Hasil uji semikuantitatif protease pada isolat P9 ............................................. 9
8
Hasil uji semikuantitatif lipase pada (a) isolat P3, (b) isolat P9, dan (c)
isolat P23.......................................................................................................... 9
9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas lipase bakteri P9 ........................................ 10
10 Reaksi hidrolisis enzimatis spesifik pada minyak zaitun............................... 11
11 Aktivitas lipase pada beberapa fraksi enzim.................................................... 12
12 Penentuan pH optimum ................................................................................... 12
13 Penentuan suhu optimum................................................................................. 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Bagan alir penelitian Sumber mata air soda Parbubu ........................................ 17
2 Isolasi bakteri dari sumber mata air soda Parbubu ............................................ 18
3 Uji potensi enzim hidrolase bakteri ................................................................... 19
4 Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri lipolitik................................................ 20
5 Uji aktivitas enzim lipase dengan metode titrimetrik (Paskevicius 2001)......... 21
6 Karakterisasi enzim hidrolitik (Sari 2008)......................................................... 22
7 Isolat bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara ................................ 23
8 Perhitungan Aktivitas Lipase............................................................................. 26
9 Hasil uji kuantitatif aktivitas lipase pada ekstrak kasar lipase........................... 27
10 Aktivitas lipase pada fraksi lipase dengan pengendapan ammonium sulfat.... 28
11 Aktivitas lipase pada suhu 37°C dan berbagai pH........................................... 29
12 Aktivitas lipase pada pH 7 dan berbagai suhu................................................. 30
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan salah satu negara
dengan sumber biodiversitas dunia karena
memiliki 42 ekosistem daratan alami dan
lima ekosistem lautan. Keragaman ekosistem
tersebut membuat Indonesia menjadi tempat
yang sangat potensial untuk eksplorasi
berbagai jenis organisme. Salah satu bidang
yang belum mendapat perhatian serius adalah
keanekaragaman hayati mikrob. Pendekatan
yang
mungkin
dilakukan
adalah
mengeksplorasi
sebanyak-banyaknya
mikroorganisme.
Pulau Sumatera merupakan pulau
dengan dominasi batuan vulkanik, berupa
batuan beku, piroklastik, dan breksi vulkanik.
Dominasi batuan ini menjadi salah satu
penyebab terdapatnya sumber panas bumi di
Pulau Sumatera (Hasan et al. 2006).
Morfologi Pulau Sumatera, terutama daerah
Tapanuli Utara, sebagai daerah vulkanik ini
mengakibatkan adanya berbagai macam
sumber mata air tanah yang berasal dari
daerah dataran rendah. Mata air tanah yang
muncul antara lain mata air panas dan mata
air soda. Mata air soda terdapat pada sumber
mata air soda Parbubu. Mata air soda dengan
kondisi lingkungan yang ekstrim ini
menjadikannya tempat yang potensial untuk
mengeksplorasi berbagai jenis mikrob.
Kondisi lingkungan yang beraneka ragam
pada daerah vulkanik tersebut menyebabkan
terdapat beragam mikroorganisme yang
mampu tumbuh pada kondisi ekstrim seperti
suhu, pH, dan konsentrasi garam yang tinggi
(Madigan & Mars 1997).
Sumber mata air soda yang memiliki
kandungan karbonat tinggi ini menjadi
pelengkap
keanekaragaman
biota.
Keragaman mikrob yang terdapat pada
sumber mata air soda sangat menarik untuk
dikaji karena mikrob, terutama bakteri
mampu bertahan hidup pada kondisi air yang
mengandung karbonat.
Potensi yang dimiliki oleh mata air soda
Parbubu
ini
belum
dikaji,
bahkan
pemanfaatannya hanya sebagai pemandian
saja. Oleh karena itu, diperlukan kajian yang
lebih mendalam terhadap potensi yang
dimiliki oleh mata air soda ini agar dapat
dimanfaatkan secara tepat. Untuk dapat
memanfaatkan potensi yang tersimpan
tersebut diperlukan upaya-upaya untuk
mengeksplorasi kekayaan mikrob yang
terdapat di dalamnya. Upaya untuk
mendapatkan mikrob, terutama bakteri yang
terdapat di mata air soda tersebut dilakukan
dengan cara mengisolasi, memurnikan, dan
mengidentifikasi potensi enzimatik yang
dimiliki isolat, serta optimasi potensi bakteri.
Analisis ini menjadi sangat penting untuk
mengetahui besarnya potensi yang dimiliki
oleh bakteri dalam air soda.
Keistimewaan isolat bakteri ini adalah
dapat hidup pada kondisi lingkungan dengan
kadar
karbonat
yang
tinggi,
yang
mengakibatkan air menjadi sadah dan
turunnya pH air menjadi asam (DITA 2003).
Kesadahan air yang tinggi dan pH yang
relatif rendah dapat menghambat organisme
untuk hidup. Kondisi ekstrim air soda ini
memungkinkan hidupnya bakteri yang
memiliki ketahanan yang tinggi pula pada
kondisi ekstrim yang dibutuhkan saat proses
industri.
Pengkajian terhadap potensi enzimatik
bakteri
ini
juga
diperlukan
untuk
memanfaatkan bakteri sebagai pabrik
biologis. Bakteri yang dapat tumbuh pada
lingkungan ekstrim dapat menghasilkan
metabolit, salah satunya enzim, yang
memiliki ketahanan terhadap kondisi ekstrim
pula. Enzim-enzim yang mampu bertahan
dan aktif pada kondisi ekstrim sangat
diperlukan dalam dunia industri berbasis
enzim. Penggunaan enzim yang mampu
bertahan pada suhu tinggi dalam bidang
bioteknologi dapat menurunkan biaya operasi
dan meningkatkan kecepatan reaksi
Enzim yang diujikan aktivitasnya antara
lain protease, lipase, dan selulase. Pemilihan
ketiga jenis enzim dimaksudkan untuk
mendegradasi makromolekul utama yang
terdapat banyak di alam, sehingga cakupan
aplikasi enzim yang diproduksi bakteri ini
dapat lebih luas. Aplikasi penggunaan enzim
dalam industri selanjutnya disesuaikan
dengan potensi mikrob yang diperoleh saat
analisis.
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi
bakteri dari mata air soda Parbubu dan
menguji aktivitas enzim hidrolasenya, yaitu
lipase, protease, dan selulase serta
mengkarakterisasi enzim hidrolase terbaik
pada kondisi suhu dan pH tertentu.
Penelitian
ini
diharapkan
dapat
memberikan informasi tentang potensi
enzimatik dari isolat-isolat bakteri asal mata
air
soda
Parbubu
sehingga
dapat
dimanfaatkan secara luas pada bidang-bidang
yang sesuai. Selain itu diharapkan dapat
memberikan informasi tentang kondisi
keasaman dan suhu optimum yang diperlukan
enzim lipase dari salah satu isolat dalam
mendegradasi substrat.
TINJAUAN PUSTAKA
Mata Air Soda Parbubu
Air soda merupakan sejenis air yang
dikarbonasikan dan dibuat bersifat efervesen
dengan penambahan gas karbon dioksida di
bawah tekanan. Nama air soda berasal dari
garam
natrium
yang
dikandungnya.
Kandungan
senyawa
garam
natrium
hidroksida ini menambah kualitas yang
berbeda bagi sejumlah minuman beralkohol
dan tanpa alkohol. Berbeda dengan minuman
bersoda tersebut, terdapat mata air soda yang
berasal dari alam tanpa penambahan zat
apapun.
Berdasarkan penelitian geologi dan
hidrologi yang dilakukan oleh Situmorang
(2006), terdapat dua sumber mata air soda di
daerah Tarutung, yaitu sumber air soda
Parbubu dan sumber air soda Pintu Bosi.
Mata air soda yang saat ini dimanfaatkan
sebagai pemandian air soda merupakan salah
satu objek wisata di Tarutung (Gambar 1).
Mata air soda yang dikenal masyarakat luas
berlokasi di desa Parbubu, Kecamatan
Tarutung, Kabupaten Tapanuli Utara,
Provinsi Sumatera Utara (Ruhiman 2009).
Mata air ini berada di areal persawahan.
Sumber mata air ini dipercaya masyarakat
dapat menyembuhkan penyakit karena
adanya kandungan H2CO3 yang dapat
berfungsi sebagai antiseptik. Selain itu, bila
dirasakan dengan lidah, rasa air ini lebih
asam dibandingkan air biasa. Debit airnya
sangat banyak dan terus menerus berganti.
Ciri morfologi lembah dan perbukitan
memanjang sebagai hasil kegiatan tektonik
aktif. Retakan-retakan yang terbentuk di
sepanjang lembah ini juga menjadi jalan bagi
keluarnya air panas. Mata air panas
Sipoholon dekat Tarutung yang terukur
bersuhu 63,8ºC menjadi tempat wisata yang
ramai. Air panas Sipoholon keluar dari celahcelah batuan dan menembus tuf Toba.
Endapan travertin yang terbentuk akibat air
panas menerobos tuf Toba menghasilkan
endapan dengan pola-pola yang menarik,
berupa bentukan stalaktit dan stalagmit, serta
teras-teras endapan travertin (Ruhiman 2009).
Di bagian tenggara dijumpai mata air
dengan gelembung-gelembung udara dengan
rasa sedikit asam sehingga penduduk
menamakannya air soda di Parbubu. Suhu air
secara umum relatif hangat, yaitu 31,5ºC.
Tetapi karena suhu udara terukur adalah
30.7ºC, maka air soda Parbubu terasa dingin
ketika disentuh (Ruhiman 2009).
Gambar 1 Mata air soda Parbubu.
Enzim Hidrolase
Enzim adalah biomolekul berupa
protein yang berfungsi sebagai katalis
(senyawa yang mempercepat proses reaksi
tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi
kimia organik. Sebagian besar enzim bekerja
secara khas, yang artinya setiap jenis enzim
hanya dapat bekerja pada satu macam
senyawa atau reaksi kimia yang dikatalis
maupun substrat yang terlibat dalam reaksi.
Berdasarkan reaksi yang dikatalis, enzim
dikelompokkan menjadi enam golongan,
yaitu oksireduktase, transferase, hidrolase,
liase, isomerase, dan ligase.
Enzim hidrolase merupakan enzim yang
berperan
dalam
reaksi
hidrolisis
makromolekul yang melibatkan molekul air.
Enzim hidrolase dikelompokkan kembali
berdasrkan substrat yang terlibat, yaitu enzim
selulase, protease, dan lipase.
Enzim Selulase (EC 3.2)
Selulase merupakan enzim ekstraseluler
yang terdiri atas kompleks endo-β-1,4glikonase
(CMCase,
Cx
selulase
endonuklease, atau carboxymethyl cellulase),
kompleks ekso- β-1,4-glikonase (aviselase,
selobiohidrolase, C1 selulase), dan β-1,4glikonase atau selobiase (Crueger 1984).
Selulase mampu menghidrolisis selulosa
menjadi gula sederhana atau glukosa dengan
memutuskan ikatan glikosidik β-1,4 dalam
selulosa, selodekstrin, selobiosa, dan turunan
selulosa lainnya (Kulp 1975). Struktur enzim
selulase dapat dilihat pada Gambar 2.
Selulosa adalah polimer glukosa dengan
ikatan β-1,4-glikosidik (Subba 1995).
Selulosa sebagai substansi organik yang
paling banyak dijumpai di alam, merupakan
suatu homoglikan berantai lurus yang
terbentuk dari glukosa yang saling
berhubungan
dengan
ikatan
β-1→4
glukosida. Komposisi selulosa berkisar antara
40-50% dari komposisi total penyusun
dinding sel tumbuhan (Koolman 2001).
Gambar 2 Struktur enzim selulase.
Dalam rantai selulosa unit anhidroglukosa
memakai konfigurasi kursi dengan grup
hidroksil dalam posisi aksial (Choulghlan
1985). Serat selulosa membentuk lignin pada
kayu yang berfungsi sebagai pelindung
selulosa
terhadap
serangan
enzim
perombakselulosa (Hardjoko et al. 1989).
Adanya fibril yang dibentuk oleh mikrofibril
menyebabkan selulosa bersifat tidak larut.
Aktivitas enzim selulase meliputi tiga
tipe utama, yaitu endoglukanase atau 1,4-βD-glukan-4-glukanohidrolase (EC 3.2.1.4),
eksonuklease,
meliputi
1,4-β-D-glukan
glukanohidrolase (juga dikenal sebagai
selodekstrin) (3.2.1.74) dan 1,4-β-D-glukan
selobiohidrolase (EC 3.2.1.91), dan βglukosida glukorohidrolase (EC 3.2.1.21)
(Syam 2008). Endonuklease memotong
secara acak pada situs internal amorf pada
rantai selulosa polisakarida menghasilkan
oligosakarida dengan panjang yang berbedabeda dan akhirnya membentuk ujung rantai
baru. Eksoglukanase
berperan
dalam
mengatur proses reduksi atau tanpa reduksi
dari ujung rantai selulosa polisakarida,
membebaskan glukosa (glukanohidrolase)
atau selobiosa (selobiohidrolase) sebagai
produk utamanya. Eksoglukanase juga dapat
berperan pada selulosa mikrokristalin,
menyambung rantai selulosa dari struktur
mikrokristalin. Glukosidase menghidrolisis
selodekstrin dapat larut dan selobiosa
menjadi glukosa. Selulase dapat dikenali dari
glikosida
hidrolase
lain
berdasarkan
kemampuannya untuk menghidrolisis ikatan
β-1,4-glikosidik antara residu glukosil (Syam
2008).
mikrob, serta memiliki peranan penting
dalam metabolisme sel dan keteraturan proses
dalam sel (Ward 1985).
Menurut Winarno (1987), protease
memiliki dua pengertian, yaitu proteinase
dan
peptidase.
Proteinase
berarti
mengkatalisis reaksi hidrolisis molekul
protein menjadi fragmen-fragmen besar
polipeptida. Peptidase memiliki pengertian
dapat menghidrolisis fragmen-fragmen besar
polipeptida menjadi asam amino. Enzim yang
mampu
mendegradasi
protein
ini
menyebabkan enzim protease termasuk ke
dalam enzim proteolitik.
Protease memegang peranan utama di
dalam banyak fungsi hayati, mulai dari
tingkat sel, organ sampai organisme, yaitu
dalam melangsungkan reaksi metabolisme,
fungsi regulasi, dan reaksi-reaksi yang
menghasilkan sistem berantai (cascade)
untuk menjaga keadaan normal homeostasis,
maupun kondisi patofisiologis abnormal,
serta proses kematian sel secara terencana.
Protease ekstraseluler diperlukan makhluk
hidup untuk menghidrolisis nutrisi protein
menjadi peptida kecil dan asam amino
sehingga dapat diserap dan dimanfaatkan
oleh sel tubuhnya. Protease intraseluler
bertanggung jawab terhadap degradasi
proteolitik secara cepat dan irreversible bagi
protein sel yang fungsinya tidak diperlukan
lagi atau protein abnormal yang tidak
bermanfaat bahkan mengganggu metabolisme
sel (Suhartono 2000). Protease merupakan
salah satu jenis enzim yang banyak
digunakan pada proses industri makanan,
minuman, farmasi, tekstil, kertas, deterjen,
dan penyamakan kulit (Kusumaningtyas et al.
2000).
Enzim Protease (EC 3.4)
Protease (Gambar 3) merupakan
kelompok enzim yang bersifat kompleks,
yang bervariasi dalam spesifisitas substrat,
sisi aktif, dan mekanisme katalitiknya. Enzim
ini dihasilkan secara ekstraseluler dan
intraseluler oleh hewan, tumbuhan, maupun
Gambar 3 Struktur enzim protease.
Menurut
Komisi
Tata
Nama
International Union of Biochemist and
Molecular Biologist, protease termasuk
dalam kelompok III subkelompok IV enzim
(E.C.3.4), yaitu golongan hidrolase pemecah
substrat protein. Terdapat beberapa cara
klasifikasi protease yang digunakan para ahli.
Hartley (1960) (dalam Widyastuti 2000)
mengklasifikasikan protease berdasar sifatsifat kimia sisi aktif enzim, yaitu protease
serin (memiliki asam amino serin pada sisi
aktifnya), protease sulfhidril (memiliki gugus
sulfhidril pada sisi aktifnya), protease metal
(memiliki ion logam pada sisi aktifnya), dan
protease asam (memiliki dua gugus karboksil
pada sisi aktifnya).
Enzim Lipase (EC 3.1)
Enzim yang bekerja dalam hidrolisis
lemak dan minyak dapat dikelompokkan
menjadi dua kelompok besar, yaitu lipase dan
esterase (Winarno 1985). Lipase termasuk
golongan enzim dengan fungsi hidrolase
karena dapat menghidrolisis ikatan ester pada
lemak sehingga terbentuk asam lemak bebas
dan gliserol. Lipase juga termasuk kelompok
enzim esterase, sebab dapat menghidrolisis
ikatan ester. Selain itu, lipase merupakan
enzim yang dapat memutuskan ikatan rantai
panjang asam lemak ester dan memiliki nama
ilmiah triasilgliserol asilhidrolase (Tika et al
2007).
Enzim lipase atau asilgliserol hidrolase
(E.C 3.1.1.3) (Gambar 4) merupakan enzim
yang dapat menghidrolisis rantai panjang
trigliserida. Enzim ini memiliki potensi untuk
digunakan memproduksi asam lemak, yang
merupakan prekursor berbagai industri kimia.
Produksi asam lemak secara industri
menggunakan katalis kimia menghasilkan
efek samping bagi lingkungan. Selain itu,
enzim lipase telah banyak dikenal memiliki
cakupan aplikasi yang amat luas dalam
bidang bioteknologi, seperti biomedikal,
pestisida, pengolahan limbah, industri
makanan, biosensor, deterjen, untuk industri
Gambar 4 Struktur enzim lipase.
kulit dan industri oleokimia (memproduksi
asam lemak dan turunannya) (Macrae AR
1983).
Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pertumbuhan merupakan penambahan
secara teratur semua komponen sel suatu
jasad. Pertumbuhan dapat diartikan sebagai
penambahan jumlah sel. Penambahan jumlah
sel pada jasad bersel banyak (multiseluler)
tidak menghasilkan penambahan jumlah
individunya,
melainkan
terbentuknya
jaringan baru atau peningkatan ukuran suatu
jasad. Penambahan sel pada jasad bersel satu
(uniseluler) berarti penambahan jumlah
individu, seperti pertumbuhan yang terjadi
pada suatu kultur mikrob.
Mikrob jika dimasukkan pada media
baru yang sesuai akan tumbuh dan
memperbanyak diri. Perbanyakan diri
dilakukan melalui pembelahan biner, artinya
satu sel akan membelah diri menjadi dua sel
yang identik. Sel tersebut kemudian masingmasing membelah diri lagi menjadi dua, dan
seterusnya. Pertumbuhan seperti ini termasuk
dalam tipe pertumbuhan eksponensial
(Sokatch 1969). Pada kondisi yang sesuai,
beberapa jenis bakteri dapat membelah
menjadi dua sel baru atau membentuk
generasi baru dalam 15 menit, sedangkan
pada kondisi yang tidak sesuai, diperlukan
waktu hingga 24 jam atau lebih. Waktu yang
diperlukan untuk membelah diri dari satu sel
menjadi dua sel sempurna disebut waktu
regenerasi (Foster et al. 1961).
Kurva pertumbuhan diperoleh melalui
perbandingan jumlah bakteri yang dihitung
pada
waktu-waktu
tertentu
sehingga
menunjukkan pola pertumbuhan bakteri
tersebut. Pola pertumbuhan bakteri pada
umumnya memiliki empat fase pertumbuhan,
yaitu fase permulaan atau adaptasi (fase lag),
fase
pertumbuhan
eksponensial
atau
logaritma (fase log), fase stasioner, dan fase
kematian.
Fase pertumbuhan awal atau fase lag
merupakan awal pertumbuhan mikrob ketika
bakteri baru menyesuaikan diri dengan
lingkungannya. Fase ini ditandai dengan
perubahan
komposisi
kimiawi
sel,
penambahan ukuran, substansi seluler, dan
waktu generasinya relatif panjang. Fase
selanjutnya adalah fase pertumbuhan
eksponensial atau fase log yang merupakan
fase pertumbuhan sel paling cepat dan paling
aktif. Pada fase ini, metabolisme sel paling
aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan
jumlah konstan hingga nutrien habis. Fase log
sangat dipengaruhi oleh suhu dan komposisi
media
pertumbuhan.
Fase
optimum
pertumbuhan bakteri ini memungkinkan
dalam mempelajari enzim dan komponen
bakteri lainnya, termasuk metabolit primer
(Rahman et al.1992).
Setelah nutrisi pada media pertumbuhan
sudah habis, pertumbuhan sel mulai
terhambat, kecepatan pembelahan sel
berkurang, dan jumlah sel yang mati mulai
bertambah, serta mulai dihasilkannya
metabolit sekunder. Pada fase ini, jumlah sel
hidup konstan seperti tidak terjadi
pertumbuhan, sehingga disebut sebagai fase
stasioner. Berikutnya, nutrisi dari media
pertumbuhan sudah tidak tersedia lagi dan
terjadi penimbunan hasil metabolisme yang
bersifat
toksik
yang
mengakibatkan
penurunan jumlah populasi bakteri secara
drastis. Fase ini disebut sebagai fase
kematian. Namun, pada fase ini tetap terdapat
sel yang dapat bertahan hidup dengan waktu
generasi yang relatif lama (Rahman et al.
1992).
Gambar 5 Pola pertumbuhan bakteri.
Aktivitas Enzim
Aktivitas enzim didefinisikan sebagai
kecepatan
pengurangan
substrat
atau
kecepatan pembentukan produk pada kondisi
optimum. Satu unit aktivitas enzim
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
menghasilkan satu mikromolekul monomer
setiap menit (Lehninger 1993).
Kondisi yang mempengaruhi aktivitas
enzim antara lain konsentrasi substrat, pH,
dan suhu (Pelczar & Chan 1986). Setiap
enzim berfungsi secara optimal pada pH,
suhu, dan konsentrasi subtrat tertentu.
Keasaman atau pH dapat mempengaruhi
aktivitas enzim karena adanya ion gugus
karboksil dan gugus amino yang mudah
berubah dengan kondisi keasaman yang
berbeda. Temperatur sebagai faktor yang
berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Pada
suatu temperatur optimal, rekasi enzimatis
dapat berlangsung sangat cepat. Namun pada
kondisi di atas temperatur optimum,
kecepatan reaksi menurun tajam karena
enzim yang merupakan protein dapat
terdenaturasi, sedangkan pada kondisi di
bawah temperatur, enzim bereaksi sangat
lambat. Konsentrasi substrat yang terlalu
rendah menyebabkan daerah aktif pada enzim
tidak terikat semua pada substrat (Pelczar &
Chan 1986).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah
mikropipet, tip, autoklaf, laminar air flow
cabinet, cawan petri, jarum ose, gelas ukur,
tabung Eppendorf, oven, spektrofotometer,
termometer, pH meter digital, inkubator,
lemari pendingin, neraca analitik, pengaduk
magnetik, pipet Mohr, lemari pembeku,
sentrifuse, dan berbagai macam peralatan
gelas lainnya.
Bahan-bahan yang digunakan adalah air
soda dari sumber mata air soda ParbubuTapanuli Utara, NaCl 0.85%, media peptone
glucose agar (PGA) (pepton, glukosa, dan
agar), media potato dextrose agar (PDA),
media carboxymethil cellulose (CMC) (CMC,
MgSO4, 7H2O, KNO3, K2HPO4, FeSO4,
7H2O, CaCl2, 2H2O, ekstrak khamir, agaragar bakto, dan glukosa), media susu skim
(susu skim, bakto agar, akuades), media
Tween 80 (Tween, NaCl, CaCl2.H2O, agar,
dan Bromkresol ungu), HCl 0.1N, NaOH 1N,
larutan merah kongo 1%, alkohol 70%, dan
akuades. Bahan yang diperlukan pada uji
kuantitatif yaitu buffer sitrat, buffer fosfat,
buffer borat-borax, larutan ammonium sufat,
larutan alkohol:aseton (1:1), media peptone
glucose yeast extract (PGY) dengan
penginduksi minyak zaitun, larutan NaOH
0.05 N, larutan fenolftalein 1%, dan substrat
enzim hidrolitik.
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri dari Mata Air Soda
Parbubu
Sampel air yang diambil langsung dari
mata air soda Parbubu, Tarutung, Tapanuli
Utara diisolasi dengan metode cawan sebar.
Sebanyak 1 mL air soda diambil
menggunakan mikropipet dan dipindah ke
tabung reaksi yang telah berisi 9 mL larutan
garam fisiologis (0.85%) steril (pengenceran
pertama/ 10-1). Pengenceran terus dilakukan
sampai pengenceran keenam atau diperoleh
konsentrasi 10-6). Hasil pengenceran diambil
sebanyak 0.1 mL dan dimasukkan ke dalam
cawan petri, lalu ditambah dengan media
hangat yang belum memadat sebanyak 20
mL. Media yang ditambahkan ada dua
macam, yaitu media peptone glucose agar
(PGA) dan potato dextrose agar (PDA),
sehingga diperoleh koloni yang berbeda.
Selanjutnya cawan digoyang perlahan untuk
homogenisasi, lalu dibiarkan memadat.
Cawan selanjutnya dimasukkan dalam plastik
dalam posisi terbalik dan disimpan dalam
inkubator suhu 37ºC selama dua sampai lima
hari (Nurkanto 2007; Ilyas 2007).
Setelah masa inkubasi, pertumbuhan
bakteri dalam cawan diamati. Bakteri yang
tumbuh dalam cawan tersebut bersifat
heterogen, sehingga dilakukan pemurnian
dengan cara memindahkan masing-masing
bakteri yang tumbuh dengan ciri morfologi
berbeda ke dalam media dalam cawan baru
dan selanjutnya dipindahkan pada agar
miring. Pemindahan dilakukan dengan cara
mengambil sebanyak satu ose biakan dari
cawan lalu dipindahkan ke agar miring
dengan goresan zig-zag dari arah pangkal
agar miring hingga ujung. Pemindahan ini
dilakukan secara aseptik. Isolat yang telah
murni selanjutnya disimpan pada media
penyimpanan dengan suhu 4ºC (Akhdiya
2003).
Uji Potensi Enzim Hidrolase Bakteri
Pengujian
Potensi
Selulolitik.
Pengujian potensi bakteri selulolitik secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi
selulosa. Metode yang digunakan adalah
modifikasi metode Miller (1959) pada
substrat selulosa murni, yaitu carboxy methyl
cellulose (CMC). Media CMC mengandung 1
g CMC, 0.02 g MgSO4, 7H2O, 0.075 g
KNO3, 0.05 g, K2HPO4, 0.002 g
FeSO4,7H2O, 0.004 g CaCl2, 2H2O, 0.2 g
ekstrak ragi, 1.5 g agar-agar bakto, dan 0.1 g
glukosa (Meryandini et al. 2009). Isolat yang
telah murni tersebut selanjutnya diambil
menggunakan lup dan ditotolkan pada media
CMC lalu diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37ºC (Syam 2008). Koloni yang sudah
tumbuh dicuci dengan larutan merah kongo
0.1% selama sepuluh menit dan dibilas
menggunakan NaCl 1%. Selanjutnya diukur
diameter koloni dan zona bening yang
dihasilkan oleh isolat. Aktivitas selulolitik
ditentukan berdasar indeks selulolitik (IS)
yang diperoleh dari perbandingan diameter
zona bening dan diameter koloni (Nurkanto
2007).
Pengujian
Potensi
Proteolitik.
Pengujian potensi bakteri proteolitik secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi protein.
Metode
pengujian
yang
dilakukan
berdasarkan metode Durham et al. (1987).
Isolat yang telah murni ditotol pada medium
agar susu skim. Agar susu skim dibuat
dengan mencampurkan 100 mL susu skim
pasteurisasi dicampur dalam kondisi hangat
dengan larutan lain yang berisi 7.5 g bakto
agar yang dilarutkan dalam 200 mL akuades
dan telah diautoklaf selama 15 menit pada
suhu 121ºC. Campuran tersebut lalu
dimasukkan dalam cawan dan dibiarkan
memadat (Amri 2004). Isolat yang telah
ditotolkan diinkubasi pada suhu 37ºC selama
48 jam. Setelah masa inkubasi, diukur
diameter koloni dan zona beningnya.
Aktivitas proteolitik ditentukan berdasar
indeks proteolitik (IP) yang diperoleh dari
perbandingan diameter zona bening dan
diameter koloni (Akhdiya 2003).
Pengujian Potensi Lipolitik. Pengujian
potensi bakteri lipolitik secara kualitatif
dilakukan dengan menguji aktivitas bakteri
dalam mendegradasi lipid. Pengujian
dilakukan menurut Sensitive Plate Assay
(Kouker & Jaeger 1987 dalam Tika dkk
2007). Koloni yang tumbuh pada media
diinokulasikan sebagai spot kecil pada media
Tween 80 agar (Gilbert et al.1991). Tween 80
atau disebut juga polisorbat 80 merupakan
surfaktan nonionik dan emulsifier yang
berasal dari sorbitan polietoksilat dan asam
oleat , dan sering digunakan dalam makanan.
Polisorbat 80 adalah cairan, kuning kental
larut dalam air. Tween 80 mengandung
Tween 80, NaCl 5 g, CaCl2.H2O 0.1 g, agar
20 g, dan Bromkresol ungu 25 mg.
Selanjutnya medium uji diinkubasi pada 37ºC
selama 48 jam. Aktivitas lipolitik ditentukan
berdasar zona yang terbentuk pada perubahan
warna media dari kuning menjadi ungu.
Penentuan Waktu Optimum Produksi
Enzim Lipase
Pengujian
selanjutnya
dilakukan
terhadap enzim yang dihasilkan oleh bakteri
dengan aktivitas tertinggi berdasarkan uji
aktivitas enzim secara semi kuantitatif. Pada
penelitian ini, digunakan enzim lipase
dihasilkan oleh isolat bakteri dengan aktivitas
tertinggi. Penentuan waktu optimum inkubasi
dilakukan dengan mengkaji hubungan antara
kurva pertumbuhan bakteri dan kurva
aktivitas enzim lipasenya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan.
Sebanyak satu lup isolat bakteri terpilih (data
nilai indeks lipolitik terbesar), diinokulasikan
ke dalam 50 mL media PGA sebagai starter
dan diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang.
Setiap jam diambil sebanyak 1 mL larutan
sampel, kemudian dilakukan pengenceran.
Selanjutnya, dilakukan pengukuran jumlah
sel dengan metode turbidimetri melalui
perhitungan
optical
density
(OD)
menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 600 nm sehingga diperoleh kurva
pertumbuhan (Martharina 2009).
Aktivitas Enzim Lipase. Sebanyak satu
lup isolat bakteri terpilih (data nilai indeks
lipolitik terbesar), diinokulasikan ke dalam
50 mL media PGA sebagai starter dan
diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang.
Pada saat bakteri mulai memasuki fase
pertumbuhan eksponensial, yaitu jam
keempat, dilakukan pengambilan sampel
setiap tiga jam sampai akhir fase
pertumbuhan untuk mendapatkan ekstrak
kasar enzim per tiga jam (Maranatha 2008).
Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan
sentrifugasi kultur sel pada 3500 rpm selama
15 menit pada suhu 4°C. Pengukuran
aktivitas enzim ekstrak kasar dilakukan
dengan metode titrimetri. Dicampurkan
sebanyak 2 mL minyak zaitun, 4 mL buffer
sitrat pH 6, dan 1 mL ekstrak kasar enzim
lipase. Campuran dikultivasi pada shaker
dengan suhu 37ºC selama 1 jam. Setelah
dikultivasi, campuran
substrat enzim
diinaktifkan dengan penambahan larutan
aseton:alkohol (1:1) sebanyak 10 mL
kemudian dititrasi dengan NaOH 0.05 N
dengan menambah 2-3 tetes fenolftalein 1%
sebagai indikator. Aktivitas enzim lipase
ditunjukkan dengan perubahan warna saat
titrasi dari tidak berwarna menjadi berwarna
merah muda. Perlakuan untuk kontrol
dilakukan setelah kultivasi selama 1 jam.
Aktivitas
lipase
ditentukan
berdasar
perhitungan volume NaOH terkoreksi, yaitu
volume terpakai sampel dikurangi volume
NaOH terpakai blanko. Volume NaOH
terpakai selanjutnya dikalikan dengan
konsentrasi NaOH dan dibagi dengan bobot
minyak dan masa inkubasi (Paskevicius
2001).
Pengukuran Aktivitas Enzim Lipase
Produksi Enzim Lipase. Produksi
enzim lipase dilakukan dengan cara
mengkultivasi satu isolat bakteri ke dalam 50
mL media PGA sebagai starter dan
diinkubasi selama 20 jam. Selanjutnya
dimasukkan 1% starter, yaitu sebanyak 3 mL
ke dalam 300 mL media cair minyak zaitun
1% dan diinkubasi pada inkubator bergoyang
selama waktu optimum panen berdasar data
pengamatan
sebelumnya.
Setelah
itu
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan
3500 rpm selama 15 menit. Filtrat hasil
sentrifugasi disebut ekstrak kasar enzim.
Semipurifikasi Enzim Lipase Melalui
Pengendapan dengan Ammonium Sulfat.
Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim
lipase dilakukan dengan fraksinasi bertingkat
menggunakan garam ammonium sulfat
dengan tingkat kejenuhan (0-20)%, (2040)%, (40-60)%, dan (60-80)%. Fraksinasi
dengan amonium sulfat dilakukan dengan
cara menambahkan amonium sulfat sedikit
demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim
sambil diaduk. Pengadukan diusahakan
sedemikian rupa sehingga tidak menimbulkan
busa selama kurang lebih 20 menit. Setiap
endapan protein enzim yang didapat
dipisahkan
dari
filtratnya
dengan
menggunakan sentrifugasi pada kecepatan
10.000 rpm selama 15 menit. Pellet yang
dihasilkan selanjutnya dilarutkan dalam
larutan buffer sitrat pH 6 untuk dilakukan
pengujian selanjutnya (Nurhasanah &
Herasari 2008).
Uji Aktivitas Enzim Lipase pada
Berbagai Fraksi. Pengujian aktivitas enzim
lipase dari fraksi-fraksi enzim yang
diproduksi menggunakan metode titrimetri
oleh Paskevicius (2001) seperti yang telah
dilakukan pada pengujian sebelumnya).
Pengujian dilakukan pada kondisi yang sama,
yaitu nilai keasaman dan suhu percobaan.
Karakterisasi Enzim
Aktivitas Terbaik
Lipase
dengan
Fraksi enzim lipase yang memiliki
aktivitas terbaik berdasarkan pengukuran
aktivitas enzim pada variasi pH dan suhu.
Penentuan pH optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas enzim lipase pada
substrat minyak zaitun dalam berbagai pH.
Variasi pH media yang digunakan adalah 3,
5, 7, dan 9 menggunakan buffer sitrat, buffer
fosfat, dan buffer bórax-borat. Pengujian pH
optimum dilakukan pada suhu 37°C.
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas enzim hidrolase pada
berbagai suhu dalam buffer pH optimum dan
diinkubasi 30 menit. Variasi suhu yang
digunakan adalah 30ºC, 50ºC, 70ºC, dan 90ºC
(Sari 2008).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri dari Mata Air Soda
Parbubu
Bakteri
yang
digunakan
dalam
penelitian ini merupakan bakteri yang
diisolasi dari mata air soda Parbubu, Tapanuli
Utara. Berdasarkan hasil isolasi yang
dilakukan, diperoleh 23 isolat bakteri dari
mata air soda Parbubu. Isolat-isolat yang
diperoleh dibedakan berdasarkan ciri
morfologisnya, yaitu warna, bentuk tepian,
ukuran, dan kecembungan. Isolasi bakteri
dilakukan dengan menggunakan sampel air
dari
mata air soda Parbubu, Tarutung,
Tapanuli Utara diisolasi dengan metode
cawan sebar. Media yang digunakan adalah
media peptone glucose agar (PGA) dan
potato dextrose agar (PDA), sehingga
diperoleh koloni yang berbeda (Nurkanto
2007; Ilyas 2007).
Aktivitas Enzim Hidrolase secara
Semikuantitatif
Pengujian potensi bakteri dalam
menghasilkan enzim hidrolase dilakukan
terhadap tiga enzim, yaitu enzim selulase,
protease, dan lipase. Pemilihan tiga jenis
enzim ini dimaksudkan karena enzim ini
merupakan enzim yang dapat mendegradasi
makromolekul utama yang ada di alam, yaitu
selulosa, protein, dan lipid. Pengujian potensi
enzim dilakukan secara semikuantitatif, yaitu
dengan mengukur indeks hidrolitik dari
bakteri. Pengujian ini digunakan sebagai
informasi awal dalam menentukan enzim
yang memiliki aktivitas terbesar dalam
mendegradasi substrat.
Aktivitas
Enzim Selulase secara
Semikuantitatif
Berdasarkan
pengujiian
secara
semikuantitatif terhadap 23 isolat bakteri
Parbubu, sebanyak tiga belas isolat memiliki
aktivitas selulase. Isolat P10 merupakan
isolat bakteri yang memiliki aktivitas selulase
terbaik dengan nilai indeks selulolitik (IS)
sebesar 3,789.
Pengujian enzim selulase secara
semikuantitatif dilakukan menggunakan
modifikasi metode Miller (1959) pada
substrat selulosa murni, yaitu carboxy methyl
cellulose (CMC). Menurut Nurkanto (2007)
pengujian dilakukan dengan mengukur
indeks selulolitik berdasarkan zona bening
yang terlihat disekitar koloni bakteri yang
ditotolkan pada media CMC. Senyawa CMC
merupakan turunan selulosa yang mudah
larut dalam air. Oleh karena itu CMC mudah
dihidrolisis menjadi gula-gula sederhana oleh
enzim selulase dan selanjutnya difermentasi
menjadi etanol oleh bakteri. Hal itu yang
mendasari pemilihan CMC sebagai substrat
untuk pengujian enzim lipase. Pengujian ini
berdasarkan proses enzimatik yang dilakukan
oleh koloni bakteri yang dapat menghasilkan
enzim selulase dan mendegradasi selulosa
menjadi glukosa. Hasil degradasi media oleh
enzim selulase terlihat sebagai zona bening,
sedangkan media agar yang masih
mengandung selulosa terlihat berwarna
merah karna adanya ikatan dengan pewarna
merah kongo.
Koloni bakteri
Zona bening
Gambar 6 Hasil uji semikuantitatif selulase
rpada isolat P10.
Aktivitas
Enzim
Semikuantitatif
Protease
secara
Pengujian
enzim protease secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi protein.
Berdasarkan
pengujiian
secara
semikuantitatif terhadap 23 isolat bakteri
Parbubu, sebanyak lima belas isolat memiliki
aktivitas protease. Isolat yang memiliki
indeks proteolitik terbaik adalah isolat P9
dengan nilai indeks proteolitik (IP) sebesar
2,230. Metode pengujian yang dilakukan
berdasarkan metode Durham et al. (1987),
yaitu pengamatan zona bening yang
dihasilkan dari penguraian protein menjadi
asam amino oleh enzim protease yang
dihasilkan bakteri pada media susu skim.
Aktivitas proteolitik dalam mendegradasi
protein menghasilkan zona bening menurut
yang dilaporkan Akhdiya (2003) disebut
sebagai
indeks proteolitik (IP) yang
diperoleh dari perbandingan diameter zona
bening dan diameter koloni.
Koloni bakteri
tertinggi merupakan enzim lipase. Ketiga
koloni bakteri yang memiliki nilai IL
tertinggi, yaitu P3, P9, dan P23 dipilih koloni
P9 untuk diuji lanjut secara kuantitatif.
Dipilih koloni P9 karena koloni bakteri ini
juga memiliki aktivitas yang tertinggi pada
uji semikuantitatif enzim protease.
Zona bening
Gambar 7 Hasil uji semikuantitatif protease
pada isolat P9.
Aktivitas
Enzim
Lipase
secara
Semikuantitatif
Pengujian
enzim lipase secara
semikuantitatif dilakukan dengan menguji
aktivitas bakteri dalam mendegradasi lipid
menggunakan metode Sensitive Plate Assay
(Kouker & Jaeger 1987 dalam Tika et al.
2007). Aktivitas lipase ditentukan berdasar
zona yang terbentuk pada perubahan warna
media yang mengandung bromkresol ungu
dari kuning menjadi ungu. Bromkresol ungu
merupakan indikator pH dengan rentang pH
5.2 berwarna ungu. Pada pengujian ini,
terdapat perubahan pH dari asam menjadi
basa dengan dihasilkannya asam lemak dan
gliserol dari polimer lipid sehingga dapat
diamati secara semikuantitatif banyaknya
enzim yang dihasilkan oleh sel untuk
mendegradasi polimer lipid. Berdasarkan
pengujiian secara semikuantitatif terhadap 23
isolat bakteri Parbubu, sebanyak dua belas
isolat memiliki aktivitas lipase. Isolat bakteri
yang memiliki indeks lipolitik (IL) besar
adalah isolat P3, P9, dan P23 dengan nilai
indeks lipolitik berturut-turut sebesar 11,640;
10,80; 16,700.
Uji kualitatif tidak selalu menjadi dasar
yang baik untuk melihat aktivitas enzim,
sehingga perlu dilakukan uji lanjutan
terhadap aktivitas proteasenya. Menurut
Ward (1985) tidak selalu terdapat korelasi
yang baik antara daerah jernih di sekitar
koloni pada media padat dengan kemampuan
organisme tersebut. Beberapa faktor yang
diduga
menjadi
penyebab
tidak
terkorelasinya nilai aktivitas hidrolisis secara
kualitatif dengan nilai aktivitas enzim secara
kuantitatif adalah kecepatan pertumbuhan
setiap isolat pada medium padat atau cair dan
jumlah inokulum yang diberikan pada kedua
medium.
Berdasarkan seluruh pengujian terhadap
ketiga enzim hidrolase, aktivitas enzim
a
b
c
Gambar 8 Hasil uji semikuantitatif lipase
wpada (a) isolat P3, (b) isolat P9,
wdan (c) isolat P23.
Tabel 1 Hasil uji aktivitas enzim hidrolase
secara semikuantitatif
Kode
bakteri
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
IS
IP
IL
2
2.579
3.789
1.100
1.200
1.690
3.150
1.760
2.600
1.980
2.200
1.060
1.870
1.178
1.880
1.220
2.230
1.569
1.590
1.240
1.200
1.650
1.140
1.460
1.530
1.180
1.050
1.790
2.140
11,640
6.940
3.500
10.800
2.700
2.800
2.500
3.600
1.700
3.900
16.700
Waktu Optimum Produksi Enzim Lipase
Hasil pembuatan kurva pertumbuhan
dan kurva produksi dapat dilihat pada
Gambar 9. Kurva tersebut menunjukkan
bahwa aktivitas enzim optimum terjadi pada
jam ketujuh yang merupakan fase bagian
awal dari fase pertumbuhan eksponensial atau
fase log. Hal ini berarti isolat bakteri P9 dapat
dilakukan pemanenan enzim lipase pada jam
ketujuh setelah masa kultivasi.
Kurva pertumbuhan
bakteri P9
Kurva produksi
enzim lipase
Gambar 9 Kurva pertumbuhan dan aktivitas lipase isolat bakteri P9.
Pengujian aktivitas enzim untuk
pembuatan kurva pertumbuhan dilakukan
pada titik-titik kurva pertumbuhan. Pada
pengujian ini dilakukan pengukuran aktivitas
enzim setiap tiga titik (jam) diawali pada
awal fase pertumbuhan eksponensial.
Menurut Martharina (2010), penentuan waktu
inkubasi optimum dimaksudkan untuk
memperoleh waktu yang tepat disaat aktivitas
enzim berada paling tinggi sehingga dapat
dilakukan pemanenan enzim dengan hasil
terbaik. Waktu inkubasi optimum ditentukan
berdasarkan kurva pertumbuhan bakteri dan
kurva produksi dari bakteri. Selain itu, kurva
ini
juga
dapat
digunakan
untuk
memperkirakan penggolongan jenis metabolit
dari enzim yang dihasilkan. Berdasarkan
hasil
pengujan,
isolat
bakteri
P9
menghasilkan enzim dengan aktivitas
optimum pada jam ketujuh yang merupakan
awal fase pertumbuhan eksponensial. Hal ini
menunjukkan bahwa isolat bakteri P9
menghasilkan enzim yang merupakan
metabolit primer. Menurut Poedjiadi (1994),
metabolit primer merupakan suatu zat yang
dihasilkan pada fase pertumbuhan karena
digunakan sebagai zat yang menopang
pertumbuhan suatu makhluk hidup.
Aktivitas Enzim Lipase
Pengukuran aktivitas enzim lipase
dilakukan pada beberapa fraksi enzim lipase,
yaitu fraksi ekstrak kasar enzim (crude
enzyme), fraksi enzim dengan pengendapan
(0-20)%, fraksi (20-40)%, fraksi (40-60)%,
dan fraksi (60-80)% ammonium sulfat.
Pengukuran aktivitas enzim lipase pada fraksi
ekstrak kasar enzim ini menunjukkan bahwa
aktivitas rata-rata enzim hasil pengukuran
duplo adalah 0.5882 U/mL. Hasil pengukuran
terhadap fraksi enzim dengan pengendapan
ammonium sulfat menunjukkan nilai aktivitas
rata-rata enzim hasil pengukuran duplo pada
fraksi (0-20)% adalah 1.3627 U/mL, fraksi
(20-40)% adalah 2.3235 U/mL, fraksi (4060)% adalah 2.4410 U/mL, dan fraksi (6080)% adalah 3.5245 U/mL.
Produksi ekstrak kasar enzim diperoleh
dengan mengkultivasi satu isolat bakteri P9
sebagai isolat terpilih ke dalam media yang
yang mengandung minyak zaitun sebagai
penginduksi. Menurut Rajendran dan
Tangavelu (2007), minyak zaitun merupakan
salah satu minyak nabati terbaik setelah
minyak kacang tanah untuk digunakan
sebagai penginduksi enzim lipase. Selain itu,
minyak zaitun juga telah banyak digunakan
dalam berbagai pengujian enzim lipase.
Media tersebut selanjutnya diinkubasi pada
inkubator bergoyang dengan suhu ruang
selama tujuh jam sesuai dengan hasil
pengamatan waktu produksi optimum enzim.
Inkubasi pada kondisi optimum pertumbuhan
dimaksudkan untuk memperoleh enzim lipase
dalam jumlah cukup besar. Setelah itu
dilakukan pemisahan antara media dengan sel
menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan
3500 rpm selama 15 menit suhu 4°C. Filtrat
hasil sentrifugasi merupakan campuran antara
media dan enzim yang selanjutnya disebut
ekstrak kasar enzim (Paskevicius 2001).
Sedangkan sel yang memiliki massa yang
yang lebih besar tertarik ke pusat sentrifugal
sehingga menjadi pellet yang menempel pada
dinding tabung sentrifus.
Ekstrak kasar enzim selanjutnya diuji
aktivitas lipasenya menggunakan metode
titrimetri. Pengujian menggunakan minyak
zaitun sebagai substrat, buffer sitrat pH 6, dan
fraksi enzim. Campuran dikultivasi pada
inkubator bergoyang dengan suhu 37ºC
selama 1 jam. Minyak zaitun terdiri atas
trigliserida (trioleogliserol). Setiap 2 mL
minyak zaitun memiliki massa 1.7 gram.
Trioleogliserol dengan rumus molekul
(C17H35COO)3C3H5 memiliki berat molekul
884 g/mol, sehingga dalam 2 mL sampel
minyak zaitun terdapat 1.923 mmol
trigliserida. Pada masa inkubasi, minyak
zaitun, (C17 H35 COO)3 C3H5, akan dihidrolisis
oleh
lipase
menjadi
asam
lemak
C17H34COOH
dan
gliserol
berdasarkan reaksi pada Gambar 10. Setelah
diinkubasi,
campuran
substrat
enzim
diinaktifkan dengan penambahan larutan
aseton:alkohol (1:1). Campuran aseton dan
alkohol mendenaturasi struktur enzim yang
merupakan protein dengan mengganggu
rantai ikatan hidrogen intramolekul samping.
Hal ini mengakibatkan rusaknya struktur
sekunder dan tersier dari enzim sehingga
enzim berhenti bekerja. Kemudian campuran
tersebut dititrasi dengan NaOH 0.05 N
dengan sebelumnya menambahkan 2-3 tetes
fenolftalein 1% sebagai indikator. Asam
lemak hasil hidrolisis bereaksi dengan NaOH
menjadi C17H34COONa dan H2O (Wulan et
al. 2007).
Aktivitas enzim lipase ditunjukkan dengan
perubahan warna saat titrasi dari tidak
berwarna menjadi berwarna merah muda
akibat terjadinya perubahan pH pada larutan.
Awal titrasi netralisasi, larutan tidak
menghasilkan warna karena NaOH yang
diteteskan berikatan dengan asam lemak,
sehingga tidak dapat mengubah pH larutan,
akibatnya fenolftalein sebagai indikator pH
tidak memberikan perubahan warna. Warna
merah muda muncul saat NaOH tidak lagi
dapat berikatan dengan asam lemak, sehingga
memberikan sifat basa pada larutan dan
menimbulkan warna merah muda sebagai
indikasi perubahan pH larutan. Banyaknya
NaOH yang dapat berikatan dengan asam
lemak menunjukkan banyaknya asam lemak
yang terdapat dalam larutan sebagai hasil
hidrolisis minyak zaitun. Perlakuan untuk
kontrol dilakukan setelah kultivasi selama 1
jam, yaitu berarti sebelum terjadi reaksi
degradasi lipid oleh lipase. Aktivitas lipase
ditentukan berdasar perhitungan volume
NaOH terkoreksi, yaitu volume terpakai
sampel dikurangi volume NaOH terpakai
blanko. Volume NaOH terpakai selanjutnya
dikalikan dengan konsentrasi NaOH dan
dibagi dengan bobot minyak dan masa
inkubasi (Paskevicius 2001).
Setelah diperoleh ekstrak kasar enzim,
dilanjutkan dengan purifikasi enzim secara
fraksinasi bertingkat menggunakan garam
ammonium
sulfat.
Pengendapan
menggunakan garam ammonium sulfat
merupakan salah satu cara yang mudah untuk
Gambar 10 Reaksi hidrolisis enzimatis spesifik
pada minyak zaitun.
mengendapkan
protein
enzim,
selain
denaturasi oleh panas atau pH, sentrifugasi
diferensial, filtrasi gel, dan elektroforesis
(Martin et al. 1995). Penggunaan ammonium
sulfat disebabkan karena ammonium sulfat
mudah didapatkan, harganya relatif murah,
bersifat menstabilkan enzim (Yurnaliza
2002). Penambahan garam ammonium sulfat
dilakukan secara perlahan dan dilakukan
pengadukan secara terus menerus. Saat
pengadukan,
ammonium
sulfat
akan
berikatan dengan gugus ionik yang berada
pada ujung-ujung protein enzim. Pada
kondisi tertentu, garam ammonium sulfat
berada pada kondisi jenuh dan tidak dapat
terlarut lagi. Pada kondisi ini, molekulmolekul enzim yang telah berikatan dengan
ammonium
sulfat
meningkat
bobot
molekulnya sehingga terendapkan menjadi
pellet ketika disentrifugasi. Ekstrak kasar
enzim dengan penambahan ammonium sulfat
secara bertingkat selanjutnya disebut sebagai
fraksi (0-20)%, fraksi (20-40)%, fraksi (4060)%, dan fraksi (60-80)% ammonium sulfat.
Setelah penambahan garam, dilakukan
pemisahan enzim dengan sentrifugasi 10.000
rpm selama 15 menit pada suhu 4°C.
sentrifuse dilakukan pada suhu 4°C agar
enzim yang merupakan protein tidak rusak
akibat panas yang ditimbulkan oleh
sentrifuse. Enzim yang sudah terendapkan
setelah mengalami sentrifus berda pada pusat
sentrifugal,yaitu
menjadi
pellet
yang
menempel pada dinding tabung sentrifuse,
sedangkan media terpisahkan berupa filtrat.
Pellet yang dihasilkan selanjutnya dilarutkan
dalam larutan buffer sitrat pH 6 untuk
dilakukan pengukuran aktivitas enzim lipase
(Nurhasanah & Herasari 2008).
Aktivitas enzim mengalami peningkatan
seiring dengan tingkat kemurnian enzim.
Hubungan antara fraksi enzim yang
menentukan kemurnian enzim dengan
aktivitas enzim lipase dapat dilihat pada
Gambar 11. Enzim pada fraksi (60-80)%
memiliki aktivitas tertinggi. Hasil ini
memperlihatkan bahwa terjadi kenaikan
Gambar 11 Aktivitas lipase pada beberapa
wfraksi enzim.
Karakterisasi Enzim Lipase
Berdasarkan pengujian aktivitas enzim
lipase, fraksi enzim dengan pemurnian (6080)% ammonium sulfat memiliki aktivitas
terbaik. Fraksi enzim ini selanjutnya
dilakukan karakterisasi enzim pada beberapa
kondisi pH dan suhu untuk menentukan
kondisi pH dan suhu optimum reaksi
enzimatis.
Hasil pengujian aktivitas enzim pada
beberapa kondisi pH (Gambar 12)
menunjukkan bahwa enzim lipase memiliki
aktivitas optimum pada pH 7, yaitu sebesar
5.9593 U/mL. Pengujian aktivitas enzim
lipase pada pH optimum pada beberapa suhu
menunjukkan bahwa aktivitas lipase optimum
pada suhu 90ºC dengan aktivitas sebesar
4.9019 U/mL (Gambar 13).
Penentuan pH optimum dilakukan
dengan mengukur aktivitas enzim lipase pada
substrat minyak zaitun dalam berbagai pH.
Variasi pH media yang digunakan adalah pH
3, 5, 7, dan 9 menggunakan buffer sitrat pH 3
dan 5, buffer fosfat pH 7, serta buffer bóraxborat pH 9. Pengujian pH optimum dilakukan
pada suhu 37°C dengan menggunakan
metode titrimetri.
Gambar 12 menunjukkan bahwa
terdapat variasi aktivitas enzim pada kondisi
keasaman yang berbeda-beda. Hal ini
umumnya terjadi karena adanya perubahan
struktur sekunder dan tersier dari enzim. Pada
pH yang optimum muatan gugus samping
asam amino berada pada keadaan yang sesuai
sehingga enzim sangat efisien dalam
mempercepat reaksi biokimia yang sangat
spesifik. Aktivitas optimum lipase dicapai
pada pH 7. Hal ini disebabkan karena pada
kondisi pH 7 gugus pemberi dan penerima
proton yang penting pada sisi katalitik enzim
berada pada keadaan yang diinginkan
sehingga aktivitas katalitiknya tinggi
(Nurhasanah & Herasari 2008).
Penentuan suhu optimum dilakukan
dengan cara menguji aktivitas enzim lipase
pada beberapa suhu dalam buffer pH 7
sebagai kondisi pH optimum lipase dan
diinkubasi 30 menit. Variasi suhu yang
digunakan adalah 30ºC, 50ºC, 70ºC, dan 90ºC
(Sari 2008).
Hasil pengujian aktivitas lipase pada
beberapa pH tertera pada Gambar 13. Pada
temperatur kurang dari 50°C enzim cukup
stabil, tetapi hidrolisis substrat minyak zaitun
oleh enzim tidak berjalan secara maksimal.
Dengan meningkatnya temperatur, energi
kinetik molekul-molekul yang bereaksi
bertambah sehingga molekul yang bereaksi
semakin banyak dan produk yang dihasilkan
semakin besar. Enzim terus mengalami
peningkatan aktivitas sampai pada suhu
90°C. Di atas temperatur optimum, aktivitas
enzim menurun tajam hal ini terjadi karena
enzim mengalami denaturasi protein yang
dapat merubah konformasi struktur molekul
sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya.
Pada temperatur tinggi, substrat juga dapat
mengalami perubahan konformasi sehingga
gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam
memasuki sisi aktif enzim (Suhartono 1989).
8
aktifitas lipase U/mL
sebesar 5.992 kali dibandingkan ekstrak kasar
enzim. Aktivitas spesifik enzim dipengaruhi
oleh kadar protein, semakin tinggi aktivitas
spesifik suatu enzim maka semakin tinggi
kemurnian enzim tersebut. Hal ini
menunjukkan terjadinya pemisahan protein
lain yang bukan enzim. Meningkatnya
aktivitas spesifik pada tiap tahap pemurnian
menunjukkan bahwa purifikasi enzim yang
dilakukan cukup baik (Nurhasanah &
Herasari 2008). Enzim dengan tingkat
kemurnian dan aktivitas tertinggi selanjutnya
dilakukan tahap karakterisasi enzim pada
perlakuan pH dan suhu.
5,38725,9593
4,8039
4,7598
6
4
2
0
0
5
pH
10
Gambar 12 Penentuan pH optimum enzim
sssssssssssslipase.
Aktifitas Lipase (U/mL)
Sedangkan pada suhu yang lebih rendah dari
suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah.
Hal ini disebabkan karena rendahnya energi
aktivasi yang tersedia. Energi tersebut
dibutuhkan untuk menciptakan kondisi
tingkat kompleks aktif, baik dari molekul
enzim atau molekul substrat (Nurhasanah &
Herasari 2008).
6
5
4
3
2
1
0
3,9657
0
3,8294
4,4509
4,9019
50
Suhu
Amri E. Aktivitas amilase dan protease yang
dihasilkan oleh isolat aktinomisetes
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Choughlan MP. 1985. The properties of
fungal and bacterial cellulose with
comment on their production and
application. Biotechnology and Genetic
Engineering 3:39-109.
Crueger W, Crueger A, Brock TD, editor.
1984. Biotechnology: A text book of
industrial Microbiology. Sunderland:
Minuaer Associates.
100
Gambar 13 Penentuan suhu optimum
ssssssssssssenzim lipase.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara
memiliki potensi mikrobial. Sebanyak 23
isolat bakteri diperoleh dari mata air soda
tersebut. Isolat tersebut memiliki aktivitas
enzim lipase, protease, dan selulase dengan
enzim lipase sebagai enzim dengan aktivitas
terbaik. Enzim lipase dengan pengendapan
(60-80)% ammonium sulfat memiliki
aktivitas tertinggi dibandingkan fraksi lain,
yaitu sebesar 3.5245 U/mL. Enzim lipase
memiliki aktivitas optimum pada pH netral,
yaitu sebesar 5.9593 U/mL dan pada suhu
90ºC dengan aktivitas sebesar 4.9019 U/mL.
[DITA] Direktori Ikan dan Tanaman Air.
2003. Kesadahan air. Ornamental Fish
Information Service Highlights. .
[terhubung
berkala].
http://ofish.com/direktori.php [22 februari
2010].
Durham DR, Stewart DB, Stellwag EJ. 1987.
Novel alkaline and heat stable serine
proteases from alkalaphilic Bacillus sp.
strain GX6638. J. Bacterial 169:27622768.
Foster EM, Nelson FE, ML Speck, RN
Doetsch, Olson JCJr. 1961. Dairy
Microbiology. New Jersey: Prentice
Hall.
Gilbert EJ, Cornish A, Jones C. 1991.
Purification
and
properties
of
extracellulear lipase from Pseudomonas
aeruginosa EF2. Journal of General
Microbiology 137:2223-2229.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk identifikasi bakteri P9, karakterisasi
enzim lipase pada substrat yang sesuai,
logam-logam inhibitor, nilai Km dan Vm.
Selain itu juga perlu dilakukan pengkajian
lebih lanjut tentang aktivitas dan karakterisasi
enzim protease dan selulase dari isolat-isolat
yang diperoleh dari mata air soda Parbubu
lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Akhdiya A. 2003. Isolasi bakteri penghasil
enzim protease alkalin termostabil.
Buletin Plasma Nutfah 9: 98-102.
Hardjoko S, Indrati NS, T Bantacut. 1989.
Biokonversi: Pemanfaatan Limbah
Industri Pertanian. Bogor:PAU IPB.
Hasan R, Setiadama, Risdianto D, Supardi K.
2007. Geologi daerah panas bumi
Sipoholon-Tarutung,
kabupaten
Tapanuli Utara, Sumatera Utara. Pusat
Sumber Daya Geologi. [terhubung
berkala].
http://www.bgl.esdm.go.id/
[20 Februari 2010].
Ilyas M. 2007.
Isolasi dan identifikasi
mikoflora kapang pada sampel serasah
daun tumbuhan di Kawasan Gunung
Lawu, Surakarta, Jawa
Tengah.
Biodiversitas 8: 105-110.
Koolman J, Rohm K. 2001. Atlas Berwarna
dan
Teks
Biokimia.
Septelia,
penerjemah. Jakarta: Hipokrates.
Kouker G and Jaeger KE. 1987. Specific and
sensitive plate assay for bacterial
lipases. Appl Environ Microbiol 53:
211-213.
Kullp K. 1975. Carbohydrate. Di dalam:
Reed G, editor. Enzyme and Food
Processing. New York: Academic Pr.
Kusumaningtyas E, Tan WS, Zamrod Z,
Eshaghi M, Yusoff K. 2004. Existence
of two forms of L protein of Newcastle
disease virus isolates due to a
compensatory mutation in Domain V.
Arch Virol 149: 1859-1865.
Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia.
Thenawidjaja M, penerjemah; Jakarta:
Erlangga. Terjemahan dari: Principles
of Biochemistry.
Macrae AR. 1983. Extracelullar microbial
lipases. Di dalam Fogarty WM, editor.
Microbial Enzymes and biotecknology.
England: Applied Science Publiser.
Madigan
MT,
Marrs
BL.
Extremophiles. Sci. Am 82-87.
Nurkanto A. 2007. Identifikasi aktinomisetes
tanah hutan pasca kebakaran bukit
Bangkirai Kalimantan Timur dan
potensinya
sebagai
pendegradasi
selulosa dan pelarut fosfat. Biodiversitas
8: 314-319.
Nurhasanah, Herasari D. 2008. Pemurnian
Enzim Lipase dari Bakteri Lokal dan
Aplikasinya dalam Reaksi Esterifikasi.
Prosiding Seminar Nasional Sains dan
Teknologi-II
2008
Universitas
Lampung. hlm 267-277.
Paskevicius A. 2001. Lipase activity of yeast
and yeasts-like fungi functioning under
natural conditions. Institute Of Botany.
[terhubung
berkala].
http://images.katalogas.lt/maleidykla/bi
o4/B-16.pdf [23 April 2010].
Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar
Mikrobiologi.
Volume
ke-1.
Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS,
Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr.
Terjemahan
dari:
Elements
of
Microbiology.
Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia.
Jakarta: UI Press.
1997.
Maranatha. 2008. Aktivitas enzim selulase
isolat asal Indonesia pada berbagai
substat limbah pertanian. [skripsi].
Bogor: Fakultas Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Martharina D. 2010. Karakterisasi bakteri
asam laktat termofilik dari sumber air
panas Gunung Pancar, Bogor [skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Martin DW, Mayes PA, Rodwell VW. 1981.
Harper’s Review of Biochemistry.
California: Lange Medical Publication.
Meryandini A et al. 2009. Isolasi bakteri
selulolitik dan karakterisasi enzimnya.
Makaira Sains 13:33-38.
Miller GL. 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid
Reagent of Determination of Reducing
sugar. Anal Chem 31: 246-248.
Rahman A, Fardiaz S, Rahaju WP, Suliantari,
Nurwitri
CC.
1992.
Teknologi
Fermentasi Susu. Bogor: Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat
Jenderal Pendidikan Tinggi, Institut
PertaniSan Bogor.
Rajendran A, Thangavelu V. 2007.
Optimization of medium compotition
for lipase production by candida rugosa
NCIM 3462 using response surface
methodology.
Canada
Journal
Microbiol53:643-655.
Ruhiman B. 2009. Ekspedisi Geografi
Indonesia Sumatera Utara 2009.
Bandung: Badan Koordinasi Survei dan
Pemetaan Nasional.
Sari
WW. 2008. Karakterisasi selulase
bakteri asal tanah pertanian Jawa
Tengah dan Jawa Barat [skripsi]. Bogor:
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Situmorang T. 2006. Penyelidikan geomagnet
daerah panas bumi Ria-Ria Sipoholon,
Tarutung, Tapanuli Utara, Sumatera
Utara. Pusat Sumber Daya Geologi.
[terhubung
berkala].
http://www.bgl.esdm.go.id/ [20 Februari
2010].
Subba R. 1995. Soil Microorganisms and
Plant Growth,3rd ed. New Hampshire:
Science Publisher.
Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan
Bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB.
Bogor.
Suhartono MT. 2000. Eksplorasi protease
bakteri asal Indonesia untuk aplikasi
industri dan riset bioteknologi. Di
dalam: Suwahyono U, Rachman MA,
Tambunan J, Setyahadi S, Angkoso G,
Wahyudi P, Laily N, Retno WK,
Trismilah, editor. Mikrobiologi, Enzim
dan Bioteknologi. Prosiding Seminar
Nasional
Industri
Enzim
dan
Bioteknologi II. hlm 125 -130.
Syam KA. 2008. Optimasi produksi dan
aktivitas enzim selulse dari mikrob
selulolitik asal rayap [skripsi]. Bogor:
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Tika IN, Redhana IW, Ristiati NP. 2007.
Isolasi enzim lipase termostabil dari
bakteri termofilik isolat air panas
Banyuwedang Kecamatan Gerogak,
Buleleng Bali. Akta Kimia Indonesia 2:
109 – 112.
Ward OP. 1985. Proteolytic enzymes. Di
dalam:
Young
MM,
editor.
Comprehensive Biotechnology: The
principles,Applications,
and
Regulations of Biotechnology in
Industry, Agriculture and Medicine. Vol.
3. Oxford: Pergamon Press.
Widyastuti N, D Astuty. 2000. Optimasi
produksi dan semikarakterisasi protease
dari Bacillus sp. Laporan teknik.
Winarno FG. 1987. Biokimia Pangan.
Jakarta: PT. Gramedia Utama.
Wulan PPDK, Rejoso MT, Hermansyah H.
2007. Reaksi Hidrolisis Minyak Zaitun
Menggunakan Lipase Rhizopus oryzae
yang Diimobilisas Melalui Metode
Adsorpsi.
Depok:
Departemen
Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat
Jenderal Pendidikan Tinggi, Universitas
Indonesia.
Yurnaliza. 2002. Senyawa khitin dan kajian
aktivitas
enzim
mikrobial
pendegradasinya
[tesis].
Medan:
Fakultas
Matematika
Dan
Ilmu
Pengetahuan
Alam,
Universitas
Sumatera Utara.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian Sumber mata air soda Parbubu
Air soda dari sumber mata
air soda Parbubu
Isolat Bakteri
Uji potensi selulolitik
Uji potensi enzim hidrolase
dari isolat bakteri
Uji potensi proteolitik
Uji potensi lipolitik
Penentuan waktu inkubasi
optimum melalui kurva
pertumbuhan
Uji aktivitas enzim hidrolase
terbaik
Karakterisasi enzim dengan
variasi suhu dan pH
Lampiran 2 Isolasi bakteri dari sumber mata air soda Parbubu (Nurkanto 2007;
Ilyas 2007)
Air soda Parbubu
Pengenceran 9 kali
menggunakan larutan NaCl
0.85%
1 mL sampel
Media PGA hangat
Inkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam
Pemurnian bakteri dengan
morfologi yang berbeda
Isolat bakteri
Lampiran 3 Uji potensi enzim hidrolase bakteri
1. Pengujian potensi selulolitik (Meryandini 2007)
Isolat bakteri
Ditotol pada media
CMC padat
Inkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam
Bilas dengan NaCl 1%
Bilas dengan larutan congo
red 1% selama 10 menit
Ukur koloni dan zona
bening
Hitung indeks selulolitik
2. Pengujian potensi proteolitik (Akhdiya 2003)
Isolat bakteri
Ditotol pada media
susu skim padat
Hitung indeks proteolitik
Inkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam
Ukur koloni dan zona
bening
3. Pengujian potensi lipolitik (Kouker & Jaeger 1987)
Isolat bakteri
Ditotol pada media
Tween 80
Hitung indeks lipolitik
Inkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam
Ukur koloni dan zona ungu
Lampiran 4 Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri lipolitik
Isolat bakteri
Inokulasi pada media
starter cair (PGB)
Inkubasi pada
inkubator bergoyang
Pengukuran OD pada
600 nm setiap jam
Pembuatan kurva
pertumbuhan
Inkubasi pada
inkubator bergoyang
selama 6 jam
Inokulasi 1% starter
pada media cair
minyak zaitun 1%
Lampiran 5 Uji aktivitas enzim lipase dengan metode titrimetrik (Paskevicius
2001)
Isolat bakteri
Peremajaan pada media minyak zaitun
Inkubasi 1-3 hari pada suhu ruang
Ditambah 25 mL buffer
sitrat pH 6.0, 50 mM
Sentrifuse selama 15 menit
pada 3500 rpm, suhu 4-5ºC
Supernatan : enzim lipase
Dicampur dengan minyak
zaitun & buffer sitrat
Diinkubasi bergoyang dengan
suhu 37ºC selama 1 jam
Inaktifasi enzim dengan larutan
aseton:alkohol (1:1)
Titrasi dengan NaOH 0.05 N dengan
indikator phenolphtalein 1%
Hitung aktivitas lipolitik bakteri
Lampiran 6 Karakterisasi enzim lipase (Sari 2008)
Ekstrak enzim kasar
(crude enzyme)
Dicampur dengan substrat
minya zaitun
Perlakuan pH (3,5,7,9) dengan penambahan
buffer sitrat, fosfat, dan tris-HCl
Perlakuan suhu dengan inkubasi bergoyang
pada suhu 37ºC, 50ºC, 70ºC, dan 90ºC selama
1 jam
Inaktivasi enzim
Pengukuran aktivitas enzim
hidrolitik
Lampiran 7 Isolat bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara
Kode
Bakteri
P1
Warna
deskripsi
jingga
Mengkilat, sekitar koloni lebih terang, ukuran
cukup besar (2-10 mm), bentuk bergelombang
mirip bunga
P2
Jingga
Mengkilat, sekitar koloni lebih terang, ukuran
cukup besar (2-10 mm), bentuk bergelombang
mirip bunga, terlihat ada serabut
P3
Putih
Bulat, tidak mengkilat, pinggir tipis agak mengkilat,
ukuran kecil (0.5-2mm)
P4
jingga
Mengkilat, sekitar koloni lebih terang, ukuran lebih
besar (0.8-1.8 cm), bentuk memanjang
P5
bening
Mengkilat, bundar, kecil sekali (tidak dapat diukur)
P6
kuning
Menonjol ke permukaan media, bulat, tidak
mengkilat, pinggir halus, diameter 7 mm
P7
Putih
gading
Center menonjol, mengkilat, pinggir halus agak
bergaris, D=1.2 cm
P8
Putih
kekuning
an
P9
Putih
gading
Bulat, mengkilat, ukuran sangat kecil (tidak bisa
diukur)
P10
putih
Mengkilat, sekitar koloni lebih terang, ukuran
cukup besar (2-10 mm), bentuk bergerigi, center
menonjol
Bulat, kecil (D=0.5 cm)
Foto
Lampiran 7 Isolat bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara
P11
kuning
Bulat, mengkilat, kecil (D= 1mm)
P12
Putih
gading
Bulat, mengkilat, ukuran sangat kecil (tidak bisa
diukur)
P13
Putih
kekuning
an
P14
bening
Mengkilat, bundar, kecil sekali (tidak dapat diukur)
P15
Putih
gading
Bulat, mengkilat, ukuran sangat kecil (tidak bisa
diukur)
P16
putih
Mengkilat, bundar, tepian halus, zona sekitar koloni
memudar, D= 1-4 mm
P17
putih
Bulat, pinggir tidak halus, tidak mengkilat, D= 1
mm
P18
Putih
gading
Bulat (seperti mutiara), mengkilat, tepian halus
tanpa zona yang memudar, D= 1mm
P19
Putih
kekuning
an
Bulat, kecil (D=0.5 cm)
Bulat, kecil (D=0.5 cm)
Lampiran 7 Isolat bakteri dari mata air soda Parbubu, Tapanuli Utara
P20
putih
Mengkilat, tepian menonjol, ada zona memudar di
sekitar koloni, D= 2-4 mm
P21
Putih
Bulat, tidak mengkilat, pinggir tipis agak mengkilat,
ukuran kecil (0.5-2mm)
P22
jingga
Mengkilat, sekitar koloni lebih terang, ukuran
cukup besar (2-10 mm), bentuk bergelombang
mirip bunga
P23
Putih
Mengkilat, center menonjol, pinggir menebal, D=
3-4 mm
Lampiran 8 Perhitungan aktivitas lipase
Aktivitas hidrolisis lipase =
(
)
Keterangan:
Satu unit aktivitas lipase adalah banyaknya enzim yang dibutuhkan untuk
menghidrolisis minyak menghasilkan satu µmol produk selama satu jam.
A
: volume NaOH (titran) untuk titrasi sampel (mL)
B
: volume NaOH (titran) untuk titrasi blanko (mL)
N NaOH
: Normalitas NaOH yang digunakan
1000
: faktor konversi dari mmol keµmol
W
: berat minyak (mg)
60
: waktu inkubasi (menit)
Lampiran 9 Hasil uji kuantitatif aktivitas lipase pada ekstrak kasar lipase
Jam keBlanko
4
7
10
13
16
19
22
25
28
Ulangan
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Volume titran
terpakai (mL)
2.00
1.95
2.35
2.25
2.75
2.40
2.30
2.70
2.30
2.25
2.25
2.20
2.40
2.40
2.25
2.30
2.25
2.45
Rata-rata volume
titran terpakai (mL)
Aktivitas lipase
(U/mL)
1.975
0
2.300
0.1354
2.575
0.3229
2.300
0.1354
2.500
0.2187
2.250
0.1146
2.300
0.1354
2.325
0.1458
2.300
0.1354
2.350
0.1562
Lampiran 10 Aktivitas lipase pada fraksi lipase dengan pengendapan ammonium
sulfat
Konsentrasi
(NH4)2SO4
Blanko
0%
(0-20)%
(20-40)%
(40-60)%
(60-80)%
Ulangan
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
Volume titran Rata-rata volume
terpakai (mL) titran terpakai (mL)
2.65
2.55
2.45
2.92
3.15
3.38
3.65
3.94
4.23
4.57
4.92
5.27
4.93
5.04
5.15
5.52
6.145
6.77
Aktivitas
lipase (U/mL)
0
0.5882
1.3627
2.3235
2.4410
3.5245
Lampiran 11 Aktivitas lipase pada suhu 37°C dan berbagai pH
pH
Bufer
3
5
7
9
Ulangan
1
2
1
2
1
2
1
2
Volume titran
blanko (mL)
Terpakai Rata-rata
10.93
10.925
10.92
4.98
4.900
4.82
3.68
3.571
3.46
3.07
3.36
3.65
Volume titran
sampel (mL)
Terpakai Rata-rata
18.61
17.755
16.90
10.42
10.395
10.37
10.65
9.65
8.65
8.55
8.215
7.88
Aktivitas
lipase (U/mL)
4.8039
5.3872
5.9593
4.7598
Lampiran 12 Aktivitas lipase pada pH 7 dan berbagai suhu
Suhu
30°C
50°C
70°C
90°C
Ulangan
1
2
1
2
1
2
1
2
Volume titran
blanko (mL)
Terpakai Rata-rata
3.30
3.375
3.45
3.40
3.42
3.44
3.45
3.41
3.37
3.60
3.60
3.60
Volume titran
sampel (mL)
Terpakai Rata-rata
7.07
7.42
7.77
6.60
7.326
8.05
7.40
7.95
8.60
9.70
8.60
7.60
Aktivitas
lipase (U/mL)
3.9657
3.8294
4.4509
4.9019