View/Open - Repository | UNHAS

Optimasi Produksi Enzim Lipase dari Bakteri Sumber Air Panas Tamalantik, Mamasa
Sulawesi Barat
Stephanie Tunggala a), Hasnah Natsir b), Nunuk Hariani Soekamto b)
a)
b)
Program Studi Kimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin, Makassar 90245
Jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin, Jl. Perintis Kemerdekaan Km 10 Tamalanrea,
Makassar, Indonesia 90245.
*E-mail : [email protected]
Abstract
Lipase (EC 3.1.1.3) is one of class hydrolase enzymes that can hydrolyze triglycerides into fatty acids and
glycerol. This research determine the optimum conditions of lipase production from Bacillus isolates sp.TM_2a.2
which isolated from hot spring Tamalantik, Mamasa, West Celebes with Various of substrat concentration (olive oil)
is 0.2%, 0.4%, 0, 6%, 0.8% and 1%. The activity of lipase production was tested by titrimetric method. The results
show that the lipase produced optimum at substrat concentration of 0,8% for 36 hours, with activity of 0,3230 U/mL
and specific activity of 0,8296 U/mg. Optimum condition lipase reached at pH 7 and temperature at 40 oC with
activity of 0,2584 U/mg.
Keywords: Bacillus sp, Olive Oil, Lipase.
PENDAHULUAN
Saat ini pemanfaatan enzim dalam bidang
bioteknologi dan industri semakin meningkat, olehnya
itu pengkajian enzim perlu dilakukan untuk dapat
digunakan dalam bidang tersebut. Sifat enzim yang
sangat spesifik dibandingkan dengan katalis anorganik
menyebabkan enzim banyak digunakan dalam
berbagai proses industri. Selain itu, enzim bisa
bekerja sangat efisien, aman, mudah dikontrol, dapat
didegradasi secara biologis, menurunkan biaya
produksi dan dapat menggantikan bahan kimia yang
berbahaya, sehingga enzim dijadikan sebagai salah
satu alternatif untuk menggantikan proses kimiawi
dalam bidang industri (Lin dkk.,1998;Falch, 1991).
Proses industri memerlukan enzim yang
tahan terhadap lingkungan ekstrim dan stabil pada
suhu tinggi. Enzim tersebut dapat diisolasi dari
mikroorganisme termofil yang dapat ditemukan dan
diisolasi dari lokasi daerah geotermal baik di darat
maupun di laut (Muharni, 2009). Seiring
berkembangnya
dunia
perindustrian
dan
bertambahnya aplikasi enzim di berbagai bidang,
maka permintaan produksi enzim juga semakin
meningkat. Menurut data Euromonitor International,
Company Report, January 2009 dalam Riwayati dkk
(2012), jumlah produksi enzim dunia terus naik sejak
tahun 2002. Eropa menghasilkan sekitar 60% dari total
enzim yang sebagian besar adalah enzim hidrolitik
seperti protease, karbohidrase (amilase dan selulase)
dan lipase.
Salah satu enzim yang banyak diaplikasikan
dalam
perindustrian adalah lipase. Lipase (EC
3.1.1.3)
adalah
enzim
yang
menghidrolisis
triasilgliserol menjadi asam lemak bebas dan gliserol.
Aktivitas lipase yang tinggi dalam reaksi hidrolisis,
kimia sintesis dan reaksi esterifikasi membuat lipase
banyak dimanfaatkan dalam perindustrian seperti
industri makanan dan minuman, deterjen, farmasi,
agrokimia, industri farmasi, industri kosmetik, parfum,
dan sintesis bahan organik (Murni dkk., 2011).
Tingginya permintaan terhadap enzim
membuat banyak peneliti mulai mengeksplorasi bakteri
termofil dari lingkungan ekstrim seperti daerah
geotermal. Indonesia memiliki banyak wilayah
geotermal yang belum diteliti potensinya dalam
menghasilkan enzim. Salah satunya adalah sumber air
panas yang ada pada desa Tamalantik, Mamasa
Sulawesi Barat. Sumber air panas ini termasuk salah
satu sumber air panas alami yang mungkin masih
belum terkontaminasi oleh jenis bakteri lain karena
belum dikembangkan menjadi tempat permandian
untuk keperluan wisata. Maka dari itu dilakukan
eksplorasi bakteri termofil dan optimasi produksi enzim
lipase dari sumber air panas tersebut.
BAHAN DAN METODE
2.1. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang akan digunakan dalam
penelitian ini adalah air dan sedimen dari sumber air
panas, yeast ekstrak, bakto agar, NaCl, bakto pepton,
minyak zaitun (olive oil), KH2PO4, MgSO4.7H2O,
CaCl2, Rhodamin B, akuades, alkohol 70%, spiritus,
aluminium foil, kertas pH universal, buffer sitrat, bufer
fosfat (NaH2PO4 dan Na2HPO4), reagen Lowry A
(asam fosfo-tungstat-fosfo-molybdat (folin) dan
akuades), Lowry B (Na2CO3 2%, NaOH 0,1 N, CuSO4
1%, Na-K-tartrat 2%), BSA (Bovine Serum Albumin),
fenolftalein 1% , NaOH 0,03 N, dan aseton.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini
adalah neraca analitik (Ohaus), magnetic stirrer (Model
04802-02), autoclave (Model 8000-DSE Napco),
inkubator (Memmert), oven (Memmert), shaker
inkubator (Barnstead-Eclass), mikropipet 100-1000 µL
(Finnipipette Campus), Spektronik 20D+, sentrifuge
(Sentrifuse Universal 320 R Hettich Zentrifugen),
hotplate, cawan petri, jarum ose, lampu spiritus, kaca
preparat, erlenmeyer, dan alat-alat gelas lain yang
umum digunakan di laboratorium
Tahapan pada penelitian ini terdiri dari isolasi
dan pemurnian bakteri penghasil lipase, karakterisasi
morfologi bakteri penghasil lipase, optimasi produksi
enzim lipase, produksi enzim lipase, uji aktivitas enzim
lipase, pengukuran kadar protein enzim, dan penentuan
karakteristik sifat biokimia enzim lipase.
2.2. Isolasi Dan Pemurnian Bakteri Penghasil
Lipase
Sampel air dimasukan dalam media
pengayaan (yeast ekstrak 0,5%, NaCl 1%, bakto pepton
1%) dengan perbandingan 1 : 2 lalu kocok selama 24
jam dengan menggunakan shaker. Setelah itu sebar
diatas permukaan media padat sebanyak 200 µL dan
diratakan dengan menggunakan batang pengaduk
berbentuk L, lalu diinkubasi pada suhu 40 oC selama
beberapa hari. Isolat yang tumbuh dengan baik
dimurnikan dengan menggores kuadran beberapa kali,
lalu diinkubasi kembali pada suhu 40 oC. Setelah isolat
murni diperoleh, gores kuadran pada media padat
seleksi bakteri penghasil lipase (media substrat) dan
diinkubasi selama 2 hari pada suhu 40 oC. Indikasi
bahwa bakteri dapat mendegradasi minyak zaitun
ditunjukkan melalui isolat yang tumbuh dengan baik
dan terbentuknya kompleks warna orange sekitar
koloni.
2.3. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil
Lipase
Isolat bakteri penghasil lipase yang telah
dimurnikan pada media substrat dikarakterisasi
morfologinya dengan melakukan beberapa pengamatan
pada morfologi isolat. Pengamatan yang dilakukan
meliputi pengamatan secara mikroskopis, makroskopis,
dan uji biokimia sederhana.
2.4. Optimasi Produksi Enzim Lipase
Optimasi produksi enzim lipase dari bakteri
terpilih dilakukan dengan menentukan konsentrasi
substrat optimum sebagai induser untuk mengetahui
berapa persen optimum substrat yang diberikan agar
bakteri mampu menghasilkan enzim secara maksimum.
Inokulum aktif dari bakteri yang telah dikocok 18 – 24
jam sebanyak 10% dimasukkan dalam erlenmeyer yang
masing-masing telah berisi media produksi atau media
fementasi dengan konsentrasi substrat yang bervariasi
yaitu 0,2% ; 0,4%, ; 0,6% ; 0,8% ; 1,0%, kemudian
dikocok kembali dengan shaker inkubator pada kondisi:
suhu 40 oC, 180 rpm, selama 1-3 hari. Setiap 12 jam
dilakukan sampling untuk mengetahui waktu
fermentasi optimum. Sampel yang diambil setiap hari
dianalisis pertumbuhannya dengan mengukur optical
density (OD). Setelah optical density (OD) diukur, hasil
sampling kemudian disentrifuse untuk pemisahan filtrat
dan sel. Filtrat yang diperoleh merupakan enzim
ekstrak kasar. Selanjutnya uji aktivitas enzim lipase
ekstrak kasar tiap variasi konsentrasi substrat untuk
mengetahui pada konsentrasi substrat berapa enzim
menunjukan aktivitas tertinggi.
2.5. Produksi Enzim Lipase
Setelah diketahui pada variasi konsentrasi
substrat mana yang menunjukkan aktivitas tertinggi
untuk enzim lipase serta waktu optimum aktivitas
tertinggi enzim, maka dilakukan produksi enzim dalam
jumlah (volume) besar sekitar 500 mL pada kondisi
dimana enzim menunjukkan aktivitas tertinggi. Hasil
produksi enzim kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 4000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 oC
untuk pemisahan filtrat dan sel. Filtrat yang diperoleh
dianalisa kadar proteinnya dengan metode Lowry dan
diuji aktivitas enzim lipase ekstrak kasarnya dengan
menggunakan metode titrimetri.
2.6. Uji Aktivitas Enzim Lipase
Pengukuran aktivitas enzim ekstrak kasar
dilakukan dengan metode titrimetri. Campuran 2
mL substrat (minyak zaitun), 4 mL buffer fosfat pH 7,
dan 2 mL ekstrak kasar enzim lipase diinkubasi pada
suhu 40ºC selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan
10 mL larutan aseton:alkohol (1:1) (inaktif
enzim). Selanjutnya campuran dititrasi dengan
NaOH 0.03 N dengan indikator fenolftalein 1%.
Aktivitas enzim lipase ditunjukkan dengan
perubahan warna saat titrasi dari tidak berwarna
menjadi berwarna merah muda. Perlakuan untuk
kontrol dilakukan sama seperti perlakukan untuk uji
aktivitas enzim dimana enzim digantikan oleh
akuades. Aktivitas lipase dapat dihitung
dengan cara sebagai berikut
(Paskevicius
2001) :
Aktivitas lipase (u/mL) =
(A−B) x N NaOH x 1000
VE x 60
Keterangan :
A
= Volume (mL) NaOH untuk titrasi sampel
B
= Volume (mL) NaOH untuk titrasi blanko
1000 = Konversi dari mmol ke µmol
60
= Waktu inkubasi (1 jam = 60 menit)
VE
= Volume enzim
2.7. Pengukuran Kadar Protein
Sebanyak 1 mL larutan sampel (enzim lipase),
1 mL larutan standar, dan 1 mL akuades sebagai blanko
dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi,
kemudian ditambah 2,75 mL reagen lowry B lalu
campuran dihomogenkan dan didiamkan selama 10-15
menit, kemudian ditambahkan 0,25 mL reagen lowry
A, lalu didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit.
Absorbannya diukur pada panjang gelombang
maksimum 690 nm.
2.8. Karakterisasi Enzim Lipase dari Bakteri
(Natsir, 2010b)
Ekstrak kasar enzim lipase dikarakterisasi
dengan cara : campuran
(enzim : substrat : buffer)
diinkubasi pada berbagai variasi kondisi, seperti pH
dan suhu. Tahapan kerja karakterisasi seperti berikut:
a. Penentuan suhu optimum
Campuran 1,0 mL enzim, 1,0 mL substrat dan
1,0 mL buffer fosfat 0,1 M pH 7,0 diinkubasi selama
60 menit pada kisaran suhu 30oC, 37oC, 40oC, 45oC,
50oC, 55oC, dan 60oC kemudian dilakukan pengujian
aktivitas lipase pada setiap perubahan suhu sehingga
diperoleh aktivitas lipase optimum pada suhu tertentu.
b. Penentuan pH optimum
Campuran 1,0 mL enzim, 1,0 mL substrat dan
1,0 mL bufer sitrat fosfat 0,1 M pada berbagai kisaran
pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; dan 8,0 dicampur dan diinkubasi
selama 60 menit pada suhu optimum (yang telah
dicapai pada perlakuan penentuan suhu optimum)
kemudian dilakukan pengujian aktivitas enzim lipase
pada setiap perubahan pH sehingga diperoleh aktivitas
lipase optimum pada pH tertentu.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Lipase dari Sumber
Air Panas
Isolat bakteri yang berpotensi menghasilkan
enzim lipase adalah isolat yang mampu tumbuh dengan
baik pada media substrat yang mengandung lipid
(minyak zaitun). Hal ini juga dibuktikan dengan
terbentuknya kompleks berwarna orange di sekitar
koloni bakteri yang medianya mengandung Rhodamin
B (Gambar 3). Hal ini disebabkan karena reaksi
Rhodamin B dengan asam lemak membentuk senyawa
kompleks berwarna orange dan berpendar di bawah
radiasi sinar UV (Dahliaty dkk, 2012).
Data
pertumbuhan bakteri pada Tabel 4 menunjukkan semua
isolat mampu tumbuh dengan baik pada media yang
mengandung substrat (minyak zaitun). Namun, isolat
bakteri TM_2a.2 terpilih sebagai isolat yang
pertumbuhannya sangat banyak dan isolat inilah yang
dipilih untuk diidentifikasi.
Gambar 1. Koloni Bakteri Berwarna Orange pada
Media Rhodamin B
Identifikasi Bakteri
Isolat bakteri penghasil lipase yang terpilih
yaitu TM_2a.2 diidentifikasi berdasarkan pengamatan
makroskopis, mikroskopis, dan uji biokimia sederhana
yang bertujuan untuk pencirian dan identifikasi
mikroorganisme seperti pada Tabel 5. Hasil
pengamatan makroskopis bakteri murni TM_2a.2
menunjukkan bahwa bakteri TM_2a.2 memiliki koloni
yang bulat, tepian berombak, pertumbuhannya
menyebar dan
bentuk permukaannya cembung,
sedangkan secara mikroskopis, bakteri TM_2a.2
menunjukkan kalau bakteri ini merupakan bakteri gram
positif karena bakteri tersebut berwarna biru keunguan
setelah ditetesi larutan lugol.
Bakteri TM_2a.2
merupakan bakteri yang berbentuk basil dan memiliki
spora yang membuat bakteri ini dapat tahan pada
lingkungan yang ekstrim seperti suhu yang tinggi. Hal
ini diamati pada mikroskop dengan pembesaran 1000x.
Uji biokimia sederhana terdiri atas uji TSIA
(Triple Sugar Iron), uji SCA (Simmons Citrate Agar),
Uji MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer) dan uji
gula yang meliputi uji glukosa, uji laktosa, uji sukrosa,
dan uji manitol. Uji TSIA untuk bakteri TM_2a.2
menunjukkan hasil positif. Adanya perubahan warna
pada media dari warna merah kecoklatan menjadi
warna kuning menunjukkan kalau isolat bakteri
merupakan bakteri yang memproduksi asam pada
lingkungan aerob. Gas hidrogen sulfida (H2S) tidak
terbentuk karena bekas goresan tidak berwarna
kehitaman dan tidak terbentuk rongga pada bagian
bawah media agar. Hal ini menunjukkan kalau isolat
bakteri TM_2a.2 bukanlah bakteri anaerob karena tidak
menghasilkan gas H2S yang merupakan hasil
metabolisme bakteri anaerob. Selanjutnya hasil uji
SCA menunjukkan kalau bakteri TM_2a.2 tidak
Tabel 1. Identifikasi dan Uji Biokimia Sederhana
Uji Morfologi
Hasil Uji
Makroskopis
Mikroskopis
Uji Gula – Gula :
 Glukosa
 Laktosa
 Sukrosa
 Manitol
SIM :
 Indol
 Motil
Uji Metil Merah
Uji Voges Proskauer
Uji Sitrat
Uji Hidrogen Sulfida
Uji Urea
Uji TSIA
Pertumbuhan
menyebar,
Koloni
bulat,
Tepian
berombak, permukaan
cembung
Basil Gram Positif,
Ada Spora pada sel
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Hasil uji biokimia untuk pengujian MR-VP
adalah negatif. Hasil uji negatif untuk uji MR ditandai
dengan berubahnya warna media yang semulanya
merah menjadi kuning. Hal ini menunjukkan tidak
terjadi fermentasi asam campuran pada media sehingga
dapat dinyatakan isolat bakteri TM_2a.2 tidak termasuk
jenis bakteri yang menempati saluran pencernaan.
Bakteri ini tidak mampu menggunakan fermentasi
butanadiol melalui uji VP ditandai dengan tidak
berubahnya warna kaldu karbohidrat menjadi merah.
Berdasarkan hasil karakteristik morfologi dan
biokimia sederhana dari isolat bakteri penghasil lipase
asal Sumber Air Panas Tamantik, Mamasa Sulawesi
Barat diketahui bahwa isolat menunjukkan ciri – ciri
yang mengarahkan pada genus Bacillus sp. Oleh karena
itu bakteri tersebut dinyatakan sebagai isolat Bacillus
sp.TM_2a.2.
Optimasi Produksi Enzim Lipase
Optimasi produksi enzim lipase dilakukan dengan
menggunakan variasi konsentrasi substrat (minyak
zaitun) pada media produksi yaitu 0,2%, 0,4%, 0,6%,
0,8% dan 1%. Minyak zaitun merupakan substrat yang
banyak digunakan oleh peneliti sebelumnya karena
menghasilkan lipase yang memiliki aktivitas tinggi
dibandingkan substrat lainnya (Kurnia, 2010). Menurut
Martharina (2010), penentuan waktu inkubasi optimum
dilakukan untuk memperoleh waktu yang tepat disaat
aktivitas enzim berada paling tinggi sehingga dapat
dilakukan pemanenan enzim dengan hasil terbaik.
Data pengamatan optical density (OD) bakteri
pada tiap variasi konsentrasi substrat diperoleh dengan
mengukur pertumbuhan bakteri setiap 12 jam
menggunakan spektrofotometri UV/VIS pada panjang
gelombang 660 nm. Data hasil penelitian pada
berbagai konsentrasi substrat dapat dilihat
pada Gambar 4.
1.5
OD BAKTERI
menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya ditandai
dengan tidak adanya perubahan warna menjadi biru
pada media SCA artinya hasil yang diperoleh untuk uji
sitrat adalah negatif. Hasil uji motilitas dengan media
SIM memperlihatkan hasil negatif untuk uji motil dan
indol. Hal ini menunjukkan bakteri tidak memiliki alat
gerak dan tidak menghasilkan enzim triptofanase yang
mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari
triptofan sebagai sumber karbon.
0,2%
1
0,4%
0.5
0,6%
0
0,8%
0 12 24 36 48 60 72
1,0%
WAKTU FERMENTASI (JAM)
Gambar 2. Optical density (OD) bakteri setiap 12
jam dengan variasi substrat yang
berbeda
Pertumbuhan bakteri pada jam ke 12-24,
waktu fermentasi masih berada dalam fase adaptasi
pada konsentrasi substrat 0,2%; 0,8%; 1%, sedangkan
pada konsentrasi substrat 0,4% fase adaptasi terjadi
pada waktu fermentasi jam ke
12-36. Berbeda pada
konsentrasi 0,6%, fase adaptasi tidak terlihat,
kemungkinan fase adaptasi telah terjadi pada jam ke 012 atau pada saat bakteri berada pada media inokulum.
Selanjutnya pada jam ke 24-48 bakteri mengalami fase
eksponensial untuk konsentrasi 0,2%; 0,6% dan 0,8%,
sedangkan untuk konsentrasi substrat 0,4% dan 1% fase
eksponensial berada pada jam ke 24-60.
Pada waktu fermentasi jam ke 48-60 dengan
konsentrasi substrat 0,2%; 0,6% dan 0,8%, bakteri
mengalami fase stasioner, sedangkan untuk konsentrasi
substrat 0,4% dan 1% fase stasioner berada pada jam ke
60-72. Pada waktu fermentasi jam ke 60-72 dengan
AKTIVITAS ENZIM
(U/mL)
Aktivitas Enzim Lipase
Ekstrak kasar lipase (crude enzim) diproduksi
secara ekstraseluler dan diukur dengan metode
titrimetri. Ekstrak kasar diperoleh dari hasil pemisahan
sel bakteri dengan metode sentrifugasi pada kecepatan
4000 rpm selama 20 menit dengan suhu 4 ºC. Proses
tersebut digunakan untuk menghindari proses
denaturasi protein. Pengujian aktivitas ekstrak kasar
lipase dilakukan dengan menggunakan minyak
zaitun sebagai substrat, buffer fosfat pH 7, dan
suhu inkubasi 40 o C selama 1 jam. Hasil yang
diperoleh untuk data aktivitas enzim lipase pada variasi
konsentrasi substrat dapat dilihat pada Gambar 5.
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0,2%
0,4%
0,6%
0 122436486072
WAKTU FERMENTASI (JAM)
Gambar
0,8%
1%
3. Aktivitas enzim dengan variasi
konsentrasi substrat serta waktu
produksi optimum enzim lipase dari
bakteri Bacillus sp.TM_2a.2
Data
hasil
penelitian
(Gambar
5)
menunjukkan bahwa aktivitas enzim terbesar berada
pada konsentrasi substrat 0,8% dengan waktu
fermentasi 36 jam pada fase eksponensial atau fase log.
Hasil pengujian aktivitas enzim lipase pada penelitian
ini menunjukkan adanya peningkatan aktivitas dengan
bertambahnya konsentrasi substrat, tetapi setelah
aktivitas optimum tercapai, terjadi penurunan aktivitas.
Nilai aktivitas enzim pada waktu fermentasi optimum
yaitu jam ke-36 dari variasi substrat 0,2%, 0,4%,
0,6%, 0,8% dan 1% berturut – turut adalah 0.096
U/mL, 0.242 U/mL, 0.274 U/mL, 0,3230 U/mL dan
0.306 U/mL. Dengan aktivitas enzim optimum berada
pada konsentrasi substrat 0,8% yaitu 0,3230 U/mL dan
menurun pada konsentrasi substrat 1% yaitu 0.30685
U/mL. Menurut Kurnia (2010), hal ini dikarenakan
pada konsentrasi minyak zaitun yang optimum, enzim
berada pada keadaan yang jenuh, sehingga bila
konsentrasi minyak zaitun ditingkatkan, akan terjadi
penurunan aktivitas yang disebabkan terjadinya inhibisi
oleh minyak zaitun. Dalam hal ini minyak zaitun
bersifat represor. Data aktivitas tertinggi tiap substrat
dapat dilihat pada Gambar 6.
Aktivitas Enzim
(U/mL)
Konsentrasi substrat 0,2% dan 0,8% bakteri
mengalami fase kematian. Hal ini disebabkan karena
sumber nutrisi bakteri pada media sudah memasuki
fase habis, sedangkan untuk konsentrasi substrat 0,4%
dan 1% pada jam ke-72 belum memasuki fase
kematian.
0.20
0.00
0.0
0.5
1.0
1.5
Konsentrasi Substrat (%)
Gambar 4. Aktivitas enzim lipase tiap variasi
konsentrasi substrat
Pengaruh konsentrasi substrat terhadap
produksi enzim lipase juga dilakukan oleh beberapa
peneliti sebelumnya. Hasil penelitian Kurnia (2010)
menunjukkan A. niger ITBCC L51 dan L74 mencapai
aktivitas lipase maksimumnya pada
konsentrasi
minyak zaitun 2% dengan aktivitas berturut-turut
0,1465 µmol/ml.menit dan 0,1050 µmol/ml.menit,
sedangkan A. niger ITBCC L161 dan L76 memperoleh
aktivitas lipase maksimumnya pada konsentrasi
minyak
zaitun
berturut-turut
1,5%
(0,1852
µmol/ml.menit) dan 2,5% (0,2420 µmol/ml.menit).
Pratiwi dkk (2013) juga memproduksi enzim lipase dari
Pseudomonas aeruginosa dengan variasi konsentrasi
substrat 2%, 4%, 6%, 8% dan 1%. Substrat yang
digunakan untuk penelitian ini adalah minyak jagung.
Dari hasil penelitian tersebut diketahui bahwa aktivitas
enzim tertinggi ditunjukkan oleh konsentrasi substrat
8% yaitu sebesar 478,5026 µmol/mL/menit. Perbedaan
konsentrasi substrat optimum untuk produksi enzim
lipase berbeda – beda karena adanya perbedaan
mikroba yang digunakan serta kondisi yang berbeda –
beda pula.
Pengukuran Kadar Protein Enzim Lipase
Pengukuran kadar protein dalam enzim
ditentukan dengan menggunakan metode Lowry dan
larutan standar BSA (Bovine Serum Albumin) dengan
variasi konsentrasi standar yang diukur pada panjang
gelombang maksimum 690 nm sehingga diperoleh
kurva standar (Lampiran 11). Dari kurva standar ini
kemudian dibuat persamaan garis lurus
untuk
menghitung kadar protein lipase. Gambar 7
menunjukkan hasil pengukuran kadar protein enzim
diukur pada konsentrasi substrat 0,8% (memiliki
aktivitas tertinggi). Hasil pengukuran menunjukkan
kadar protein tertinggi pada jam ke-60 sebesar 0.5170
mg/mL, aktivitas tertinggi pada jam ke-36 sebesar
0.3230 U/mL sehingga dapat diketahui aktivitas
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0
12
24
36 48 60 72
waktu fermentasi (jam)
Kadar Protein
Aktivitas Spesifik Enzim
Gambar 5. Kadar protein lipase dari bakteri
Bacillus sp.TM_2a.2 selama waktu
fermentasi dan aktivitas Spesifik enzim
Pada jam ke-36 menunjukkan kadar protein
rendah
tetapi
aktivitas
spesifiknya
tinggi
mngindikasikan bahwa enzim lipase yang diproduksi
relatif murni, sedangkan pada jam ke-60 kadar protein
tinggi namun aktivitas spesifik rendah menunjukkan
bahwa tidak semua protein yang diproduksi
teridentifikasi sebagai protein enzim lipase. Hal ini
menegaskan bahwa kadar protein tertinggi tidak mutlak
memiliki aktivitas lipase yang tinggi.
Karakterisasi Enzim Lipase
Karakterisasi lipase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim ekstrak kasar pada berbagai rentang pH
dan suhu. Enzim yang dikarakterisasi adalah enzim
lipase yang memiliki aktivitas tertinggi yaitu pada
konsentrasi substrat 0,8% dengan waktu produksi
optimum 36 jam. Karakterisasi enzim dilakukan pada
rentang suhu 30-60 oC dan pH 4-8.
Penentuan Suhu Optimum
Data hasil penelitian yang diperoleh (Gambar
8) menunjukkan ekstrak kasar lipase pada suhu 30 oC
dan 37 oC memiliki aktivitas berturut-turut sebesar
0.0484 U/mL dan 0.0646 U/mL. Pada suhu 40 oC
aktivitasnya meningkat menjadi 0,2584 U/mL dan pada
suhu 45 oC, 50 oC, 55 oC dan 60 oC menunjukkan
penurunan berturut - turut 0.1453 U/mL, 0.0484 U/mL,
0.0323 U/mL, dan
0.0162 U/mL.
Hal ini
menunjukkan bahwa lipase dari bakteri ini memiliki
aktivitas tertinggi pada suhu 40 oC. Menurut Kosim
dan Putra (2010), peningkatan suhu sampai dengan
suhu optimum menyebabkan aktivitas enzim
meningkat. Hal ini disebabkan karena suhu yang tinggi
akan meningkatkan energi kinetik, sehingga menambah
intensitas tumbukan antara substrat dan enzim. Pada
suhu optimum, tumbukan antara enzim dan substrat
sangat efektif yang menyebabkan pembentukan
kompleks enzim-substrat makin mudah sehingga dapat
meningkatkan aktivitas enzim. Setelah suhu optimum,
aktivitas enzim menurun. Hal ini disebabkan karena
enzim mengalami denaturasi yang menyebabkan
struktur lipatan enzim terbuka pada bagian
permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah.
Selain itu pada suhu yang terlalu tinggi enzim akan
mengalami perubahan konformasi, sehingga substrat
terhambat memasuki sisi aktif enzim. Hasil penelitian
Kurnia (2010) mendukung hal tersebut.
Aktivitas Enzim
(U/mL)
kadar protein (mg/mL)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
aktivitas Spesifik Lipase
(U/mg)
spesifik tertinggi berada pada jam ke-36 sebesar 0,8296
U/mg. Murni dkk (2011) memperoleh kadar protein
lipase dari Aspergillus niger yang tidak jauh beda
dengan penelitian ini yaitu 0,52 mg/mL, sedangkan
Lestari dkk (2009) memperoleh kadar protein lipase
dari bakteri Azospirillum sp. yang jauh lebih besar yaitu
4,46 mg/mL. Perbedaan hasil kadar protein yang
diperoleh disebabkan karena adanya perbedaan kondisi
produksi enzim dan jenis bakteri yang digunakan.
0.3
0.2
0.1
0
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Suhu (oC)
Gambar 6 Pengaruh Suhu terhadap aktivitas lipase
dari isolat bakteri Bacillus sp. TM_2a.2
pada kondisi pH 7 dengan substrat
minyak zaitun.
Beberapa hasil penelitian sebelumnya tentang
karakterisasi enzim terhadap suhu menunjukkan bahwa
suhu optimum berbeda – beda. Karakterisasi enzim
lipase yang diisolasi dari bakteri hasil skrining dari
tanah tempat pembuangan akhir gunung Tugel
Banyumas memiliki suhu optimum 40 oC
(Zusfahair dkk., 2009). Hasil tersebut sama dengan
suhu optimum yang diperoleh pada penelitian ini.
Pratiwi dkk (2013) juga mengkarakterisasi enzim lipase
dari Pseudomonas aeruginosa memperoleh suhu
optimum 40 oC, sedangkan karakterisasi enzim lipase
dari bakteri Bacillus subtilis yang dilakukan oleh
Yuneta dan Putra (2009) memperoleh suhu optimum 45
o
C. Menurut Zusfahair dkk (2009) Enzim lipase pada
umumnya mempunyai suhu optimum 30-60 oC, dan
ada beberapa lipase yang memiliki suhu optimumnya di
atas atau di bawah rentang suhu tersebut.
Penentuan pH Optimum
Data hasil pengaruh pH terhadap aktivitas
lipase pada penelitian ini (Gambar 9) menunjukkan
aktivitas enzim pada mulanya mengalami peningkatan
seiring bertambahnya nilai pH yang digunakan
sehingga pada saat berada pada pH 7 aktivitas enzim
menunjukkan nilai tertinggi yaitu 0.2584 U/mL.
Aktivitas enzim mulai menurun pada pH 8 dengan nilai
aktivitas sebesar 0.0646 U/mL. Berdasarkan data yang
diperoleh ini dapat diketahui bahwa pH optimum enzim
lipase yang diperoleh pada penelitian ini berada pada
pH 7.
Menurut Putranto dkk (2006) kondisi
lingkungan dimana enzim dapat mengkatalisis substrat
pada pH optimum. pH yang jauh dari kondisi optimum
menyebabkan inaktivasi enzim karena enzim
mengalami kerusakan struktur protein sehingga
aktivitasnya berkurang dan bahkan menjadi tidak aktif.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada Ibu Dr. Hj. Hasnah Natsir,
M.Si dan Ibu Prof. Dr. Nunuk Hariani Soekamto, M.S
atas bimbingan, waktu, bantuan dana serta sumbangsih
pemikiran selama penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Asih S.,2011, Karakterisasi Enzim Hidrolase Bakteri
dari Mata Air Soda Parbubu, Tapanuli
Utara, Skripsi tidak diterbitkan, Departemen
Biokimia Fakultas Matematika Dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.
Dahliaty, A., Susanti, R., Haryani, Y., 2012, Skrining
Bakteri Lipolitik Dari Air Sungai Siak di
Daerah Pelita Pantai Kota Pekanbaru, J.
Ind.Che.Acta, 3(1), 2085-0050.
AKTIVITAS ENZIM
(U/mL)
0.2
0.15
0.1
Falch, E. A., 1991, Industrial Enzymes Developments
in Production and Application, Biotech Adv.,
9, 643 – 658.
0.05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
VARIASI pH
Gambar 7 Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase
dari isolat bakteri Bacillus sp.TM_2a.2
pada kondisi suhu 40 oC dengan
substrat minyak zaitun.
Pengaruh pH terhadap aktivitas lipase telah
dilakukan diantaranya oleh Asih (2011) yang
menunjukkan bahwa enzim lipase memiliki aktivitas
optimum pada pH 7 yaitu sebesar 5,9593 U/mL.
Penelitian yang dilakukan oleh Pratiwi dkk (2013)
memperoleh pH optimum pada 7,5. Menurutnya,
aktivitas enzim mengalami peningkatan hingga pH 7,5
dan menurun secara drastis pada pH 8. Hal ini dapat
disebabkan karena putusnya ikatan hidrogen sehingga
struktur enzim tersebut berubah atau terdenaturasi.
KESIMPULAN
1. Sumber air panas Tamalantik, Mamasa Sulawesi
Barat berpotensi menghasilkan bakteri termofil
yang memiliki aktivitas lipase, dan bakteri
tersebut teridentifikasi sebagai bakteri genus
Bacillus sp. TM_2a.2.
2. Kondisi optimum lipase dari Bacillus sp.
TM_2a.2 diperoleh pada waktu fermentasi 36 jam
dan konsentrasi substrat (minyak zaitun) 0,8%.
3. Lipase dari Bacillus sp. TM_2a.2 bekerja
optimum pada kondisi suhu 40 oC dan pH 7
dengan nilai aktivitas sebesar 0,2584 U/mL.
Kurnia, D.R.D., (2010), Studi Aktivitas Enzim Lipase
dari Aspergillus niger Sebagai Biokatalis
pada Proses Gliserolisis untuk Menghasilkan
Monoasilgliserol, Tesis tidak diterbitkan,
Program Pascasarjana Jurusan Teknik Kimia
Universitas Diponegoro, Semarang.
Lestari, P., Handayani, S.N., Oedjijono., 2009, SifatSifat Biokimiawi Ekstrak Kasar Lipase
Ekstraseluler Dari Bakteri Azospirillum sp.
JG3, Jurnal Molekul, 4(2), 73 – 82.
Lin, L. L., Chyau, C. C., dan Hsu, W. H., 1998,
Production and Properties of a RawStarchDegrading
Amylase
from
Thermophilic and Alkaliphilic Bacillus sp.
TS-23,
Biotechnology
and
Applied
Biochemistry, 28, 61–68.
Martharina, D., 2010, Karakterisasi Bakteri Asam
Laktat Termofilik dari Sumber Air Panas
Gunung Pancar, Bogor, Skripsi tidak
diterbitkan, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Muharni., 2009, Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Penghasil Kitinase dari Sumber Air Panas
Danau Ranau Sumatera Selatan, Jurnal
Penelitian Sains, 09:12-15.
Natsir, H., 2010a, Production and Characterization of
Chitinase Enzymes from Hot Spring in South
Sulawesi, Bacillus licheniforms HSA3-1a,
Indonesian Journal of Chemistry, 10(2), 14119420.
Natsir, H., 2010b, Kajian Enzim Kitinase Termostabil
dari Bakteri Termofil : Produksi, Pemurnian,
Karakterisasi, dan Aplikasi dalam Hidrolisis
Kitin, Disertasi tidak diterbitkan, Jurusan
Kimia FMIPA Universitas Hasanuddin,
Makassar.
Pratiwi, D., Sebayang, F., Jamilah, I., 2013, Produksi
Dan Karakterisasi Enzim Lipase dari
Pseudomonas
aeruginosa
Dengan
Menggunakan Induser Minyak Jagung Serta
Kofaktor Na+ dan Co2+ , Jurnal Saintia Kimia,
1(2).
Putranto, R.A., Santoso, D., Panji, T., Suharyanto., dan
Budiani, A., 2006, Karakterisasi Gen Penyandi
Lipase dari Kapang Rhizopus oryzae dan
Absidia corymbifera, Jurnal Bioteknologi,
74(1), 23-31.
Yuneta, R., Putra, S.R., 2009, Pengaruh Suhu pada
Lipase dari Bakteri Bacillus subtilis,
Prosiding Kimia FMIPA Institut Teknologi
Sepuluh Nopember Surabaya.
Zusfahair., Setyaningtyas, T., Fatoni, A., 2009, Isolasi,
Pemurnian dan Karakterisasi Lipase Bakteri
Hasil Skrining dari Tanah Tempat
Pembuangan Akhir (TPA) Gunung Tugel
Banyumas, Jurnal Natur Indonesia, 12(2):
124-129.