4 bahan dan metode

4
ditranskipsi dan produk translasi yang dikode
oleh gen (Nasution 1999).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan suatu reaksi in vitro
untuk menggandakan jumlah molekul DNA
pada target tertentu dengan cara mensintesis
molekul DNA baru yang berkomplemen
dengan molekul DNA target tersebut dengan
bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai
primer dalam suatu thermocycler. Primer yang
berada sebelum daerah target disebut sebagai
primer forward dan primer yang berada
setelah daerah target disebut primer reverse.
Enzim yang digunakan sebagai pencetak
rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai
enzim polimerase (Muladno 2002).
Reaksi PCR pada dasarnya adalah tiruan
dari proses replikasi DNA, yaitu adanya
pembukaan rantai DNA utas ganda,
penempelan primer, dan perpanjangan rantai
DNA baru oleh DNA polimerase dari arah 5’
ke 3’. Tetapi pada teknik PCR tidak
menggunakan enzim ligase dan primer RNA.
Satu siklus pada teknik PCR terdiri atas tiga
tahap, yaitu denaturasi, annealing dan
ekstensi. Denaturasi dilakukan pada suhu 9095oC sehingga terjadi pemisahan utas ganda
DNA menjadi dua utas tunggal DNA yang
menjadi
cetakan
(template)
tempat
penempelan primer dan tempat kerja DNA
polimerase. Selanjutnya pada tahap annealing,
suhu diturunkan untuk penempelan primer
oligonukleotida
pada
sekuens
yang
komplementer pada molekul DNA cetakan.
Suhu annealing tiap sekuens DNA bersifat
spesifik dan merupakan faktor penentu
keberhasilan suatu reaksi PCR. Sedangkan
tahap terakhir adalah ekstensi. Tahap ekstensi
dilakukan pada suhu 72o C. Suhu ini
merupakan suhu optimum untuk kerja enzim
Taq DNA polimerase. Pada tahap ini terjadi
sintesis DNA komplemen dengan DNA
cetakan. Ketiga tahap tersebut dilakukan
berulang kali dalam mesin PCR, pada
umumnya antara 25-40 siklus bergantung dari
jumlah DNA yang diinginkan (Saiki et al.
1989).
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens merupakan
bakteri tanah Gram negatif yang termasuk
famili Rhizobiaceae dan anggota dari genus
Agrobacterium. Pada awal abad 20-an A.
tumefaciens diketahui merupakan penyebab
crown gall diseases yang membentuk
benjolan dalam tanaman dikotil yang
menyerang 90 famili tumbuhan dikotil
sehingga menimbulkan kerugian ekonomi
yang besar. Tumor ini dihasilkan dari proses
transfer, integrasi dan ekspresi dari transfered
DNA (T-DNA) utas tunggal. T-DNA
dihasilkan oleh plasmid Ti yang dipicu oleh
molekul yang dilepaskan sel tanaman yang
sedang tumbuh sehingga menginduksi
virulance (vir) gene dari A. tumefaciens untuk
menghasilkan T-DNA. Setelah terintegrasi,
ekspresi dari T-DNA memicu biosintesis
hormon pertumbuhan tanaman dan senyawa
opines yang merupakan nutrisi bagi
A.
tumefaciens.
Kemampuan T-DNA untuk mentransfer
DNA ke organisme eukariotik dan gen yang
berada di T-DNA dapat digantikan dengan
gen apa saja, menjadikan A. tumefaciens
sebagai vektor yang ideal untuk transfer gen
ke suatu organisme eukariotik, seperti
tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman
transgenik, fungi dan sel manusia (Tzfira &
Citovsky 2003). Agrobacterium memiliki tiga
komponen genetik yang digunakan untuk
menginfeksi tanaman. Komponen yang
pertama adalah komponen T-DNA yaitu
fragmen yang ditransfer ke sel tanaman. TDNA terletak di plasmid Ti dari
Agrobacterium. Komponen kedua adalah
virulance (vir) region yang mensintesis
protein vir dan komponen ketiga adalah gen
chromosomal virulance (chv) yang berfungsi
dalam pelekatan bakteri ke dalam sel tanaman
(Sheng & Citovsky 1996).
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan untuk
pemurnian gen kitinase produk PCR adalah
gen kitinase berupa isolat DNA plasmid yang
sudah didapat dari Balai Penelitian
Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI)
yang dimurnikan dengan Pure Link TM Quick
Gel Extraction kit (Invitrogen), dan untuk
verifikasi hasil dengan gel agarosa bahan yang
digunakan adalah serbuk agarosa, buffer TBE
0.5 X, etidium bromida (EtBr), loading buffer
(brom fenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan
marker 1 kb plus (Invitrogen). Teknik cloning
yang dilakukan dapat dibagi menjadi tiga
tahap, yaitu tahap ligasi, transformasi, dan
seleksi transforman. Pada tahap ligasi bahan
yang digunakan antara lain vektor pGEM-T
Easy (Promega), T4 DNA ligase dan buffer
ligasi. Sedangkan bahan yang digunakan pada
tahap transformasi dan seleksi transforman
adalah sel kompeten E.coli XL1-Blue yang
5
diperoleh dari Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan Indonesia (BPBPI), media Luria
Bertani (LB) agar Low Salt (LA) yang telah
ditambahkan ampisilin 100 mg/L + isopropil –
– D – Thiogalaktopiranosida (IPTG)
100mM + 5 – bromo – 4 – kloro – 3 – indiol –
– galaktopiranosida (X-Gal) 40 mg/L.
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan High
Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Restriksi
dilakukan dengan menggunakan enzim dari
Biolabs. Enzim yang digunakan adalah NcoI
dan SpeI. Sedangkan transformasi dengan
menggunakan sel kompeten kimia dari
AGLO, bahan yang digunakan antara lain es
batu, nitogen cair, media Yeast Exctract
Pepton (YEP), antibiotik rifampisin 50 ppm,
dan kanamisin 25 ppm.
Peralatan
yang
digunakan
untuk
pemurnian gen kitinase produk PCR adalah
pisau skapel, timbangan, sentrifus Eppendorf
5417R, dan penangas air. Peralatan yang
digunakan untuk elektroforesis adalah sisir,
cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100
volt, dan perangkat gel doc. Selain itu
peralatan lain yang digunakan adalah shaker
incubator, ruang laminar, autoklaf, pH meter,
magnetic stirer, dan peralatan-peralatan gelas
seperti cawan petri, gelas piala, labu
Erlenmayer, dan gelas ukur.
Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi 2 tahap, yaitu
tahap penemuan gen dan tahap strategi
konstruksi gen. Penelitian yang dilakukan
sebelumnya yaitu menemukan gen kitinase
yang akan digunakan untuk tahapan
selanjutnya dengan cara mencari spesifikasi
gen yang diinginkan pada bank data
www.ncbi.nlm.nih.gov. Kemudian disain
primer berdasarkan informasi yang didapatkan
dari National Center for Biotechnology
Information
(NCBI),
amplifikasi
menggunakan primer spesifik, cloning pada
pGEMT-Easy dan tahap selanjutnya adalah
sekuensing. Setelah tahap I penelitian berhasil
ditemukan maka dilanjutkan ke tahap II
penelitian yaitu strategi konstruksi gen.
Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR
Pemurnian gen kitinase produk PCR
menggunakan Pure Link TM Quick Gel
Extraction dari Invitrogen. Fragmen dipotong
dari gel dengan menggunakan scalpel dan
ditimbang bobotnya. Gel yang sudah dipotong
dilarutkan dengan menggunakan buffer GS1
(gel
solubilization
buffer)
dengan
perbandingan antara sampel dan buffer yang
ditambahkan adalah 1:3. Gel diinkubasi pada
suhu 50o C selama 15 menit, dan setiap 3
menit dibolak-balikan secara perlahan agar
bercampur rata dan larut. Setelah larut gel
tersebut diinkubasi lagi selama 5 menit pada
suhu ruang. Larutan ditransfer ke dalam
tabung lalu disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm (15300 rcf) selama 2 menit pada
suhu 25oC. Setelah disentrifus, sebanyak 500
µL GS1 ditambahkan ke dalam tabung dan
diinkubasi selama 1 menit lalu disentrifus lagi
dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf)
selama 2 menit. Sebanyak 700 µL W9 (wash
buffer) ditambahkan ke dalam tabung lalu
diinkubasi selama 5 menit dan disentrifus
kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama
2 menit. Setelah itu tabung disentrifus kembali
dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf)
selama 2 menit untuk menghilangkan sisa
etanol yang ada. Lalu dielusi dengan 30 µL
buffer TE (Tris-EDTA). Setelah itu diinkubasi
selama 1 menit dan disentrifus kembali
dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf)
selama 2 menit. Hasil elusi diverifikasi pada
gel agarosa 1 %. Sebanyak 2 µL hasil elusi
dilarutkan dengan 1µL loading buffer dan
dimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk
pada gel. Gel diletakkan dalam bak
elektroforesis yang telah diisi dengan buffer
TBE 0.5X. Lalu dihubungkan dengan adaptor
dengan potensial listrik sebesar 100 volt.
Setelah selesai, gel diletakkan di bawah sinar
UV (perangkat gel doc) untuk melihat ada
tidaknya pita yang terbentuk. Ukuran
perkiraan fragmen hasil pemurnian gen
kitinase produk PCR sekitar 1500 bp
(Chaidamsari 2005).
Cloning Gen Kitinase ke pGEMT-Easy
Setelah verifikasi pada gel agarosa
menunjukkan hasil sesuai dengan yang
diharapkan, selanjutnya cloning gen diawali
dengan ligasi gen kitinase dengan pGEMTEasy menggunakan kit dari Promega.
Sebanyak 3.5 µL insert (hasil elusi)
ditambahkan dengan 5 µL buffer ligase, 0.5
µL vektor pGEMT-Easy dan 1µL T4 ligase.
Sehingga total campuran sebanyak 10 µL.
Tabung mikro ditutup rapat dengan parafilm
kemudian diputar sebentar. Setelah itu
campuran diinkubasi selama 1 jam pada suhu
ruang atau semalaman pada suhu 4oC.
Selanjutnya hasil ligasi akan ditransformasi ke
E.coli (XL1-Blue) (Chaidamsari 2005).
Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia
coli (XL1-Blue)
Transformasi gen kitinase ke E.coli (sel
kompeten) menggunakan metode Doyle
6
(1996). Setelah disimpan semalaman pada
suhu 4oC, hasil ligasi ditempatkan di dalam
freezer yang selanjutnya akan dimasukkan ke
dalam sel kompeten. Sebanyak 10 µL kitinase
hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL
XL1-Blue (sel kompeten). Kemudian dikocok
perlahan hingga tercampur rata. Lalu
diinkubasi di dalam es selama 30 menit,
setelah itu diinkubasi dalam penangas air pada
suhu 42o C selama 50 detik. Selanjutnya
tabung tersebut segera dimasukkan ke dalam
es selama 10 menit. Setelah dimasukkan ke
dalam es larutan tersebut ditambahkan dengan
800 µL LB (Luria Bertani) + glukosa dan
dikocok selama 1.5 jam pada suhu 37o C
dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dikocok,
larutan diambil sebanyak 100 µL dan disebar
menggunakan segitiga penyebar ke dalam
media LA yang mengandung ampisilin
100ppm + IPTG (isopropil –
– D –
thiogalaktopiranosida) 100mM + X-Gal (5bromo-4-kloro-3-indiol- -galaktopiranosida)
40 mg/L. Selanjutnya diinkubasi semalam
pada suhu 37oC.
Seleksi transforman dilakukan dengan
pengamatan terhadap koloni yang terbentuk.
Koloni yang terbentuk adalah sel E.coli yang
berhasil ditransformasi, sedangkan yang tidak
berhasil ditransformasi akan mati akibat
penambahan ampisilin. Dua jenis koloni akan
terbentuk pada cawan petri. Koloni yang
berwarna putih menunjukkan sel yang
mengandung plasmid yang berhasil disisipi.
Sedangkan koloni yang berwarna biru
mengandung plasmid yang tidak berhasil
disisipi. Setiap koloni putih yang terbentuk
diberi nomor dan ditandai. Koloni yang
berwarna putih kemudian dengan tusuk gigi
steril diambil sedikit untuk PCR DNA koloni
dan sedikit dipindahkan ke medium LB agar
dalam cawan petri (duplikat koloni).
Konfirmasi Koloni Transforman yang
Membawa Fragmen Sisipan
Konfirmasi
koloni
transforman
menggunakan metode Chaidamsari (2005)
dan dilakukan dengan teknik PCR DNA
koloni.
Proses
PCR
DNA
koloni
menggunakan mesin PCR (Biometra Tpersonal). Proses ini diawali oleh pemecahan
sel (lisis) dengan pemanasan pada suhu 96o C
selama 5 menit kemudian suhu turun menjadi
50oC dan berlangsung selama 90 detik, suhu
naik kembali menjadi 96oC selama 90 detik,
lalu 90 detik selanjutnya pada suhu 45o C, 1
menit pada suhu 96oC dan 40o C selama 1
menit. Setelah pemanasan pada proses lisis,
campuran PCR (buffer lengkap, molecular
water, dNTPs, primer M13F, M13R dan Taq
polimerase) ditambahkan pada setiap sampel.
Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu
94oC selama 30 detik, 55oC selama 1 menit
dan 2 menit pada 72oC selama 30 siklus dan
selanjutnya 72oC selama 5 menit. PCR DNA
koloni dilakukan menggunakan primer
universal M13 F dan R serta koloni bakteri
sebagai cetakan. Hasil PCR DNA koloni
diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih
kemudian dikultur dalam medium LB cair
yang telah ditambahkan ampisilin dan
diinkubasi pada shaker-incubator suhu 37oC,
150 rpm. Dari kultur bakteri yang tumbuh,
selanjutnya dilakukan isolasi DNA plasmid
menggunakan High Pure Plasmid Isolation
Kit (Roche). Hasil isolasi diverifikasi kembali
pada gel agarosa. Tahap selanjutnya akan
dilakukan sekuensing fragmen gen terklon.
Pengurutan basa (sekuensing) fragmen gen
terklon dilakukan di Lembaga Molekuler
Eijkmen Jakarta menggunakan primer
universal M13F dan M13R. Hasil sekuen
selanjutnya dianalisis menggunakan program
bioedit dan BLASTX untuk membandingkan
sekuen nukleotida yang ditranslasi pada
seluruh open reading frame (ORF) dengan
sekuens protein pada basis data. Analisis
menggunakan BLASTX bertujuan untuk
mengetahui kesesuaian urutan basa yang
didapatkan dengan urutan basa yang ada
dalam bank data.
Isolasi DNA Plasmid Rekombinan
Isolasi
DNA
plasmid
dilakukan
berdasarkan hasil PCR DNA koloni yang
diketahui mengandung plasmid terinsersi
fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut
dikulturkan dalam media
LB yang
mengandung ampisilin kemudian diinkubasi
selama 16 jam pada suhu 37oC, 150 rpm.
Plasmid diisolasi dengan menggunakan High
Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Sebanyak
3–4 mL dipindahkan ke dalam tabung mikro
lalu disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
(6753 rcf) pada suhu 25oC selama 2 menit.
Selanjutnya
pelet
yang
dihasilkan
diresuspensikan kembali dengan 250 µL
suspension buffer + RNAse. Setelah itu
ditambahkan kedalamnya 250 µL lysis buffer
dan tabung dibolak-balikan secara perlahan
sebanyak 6-8 kali, kemudian diinkubasi
selama 5 menit pada suhu ruang. Lalu
sebanyak 350 µL binding buffer ditambahkan
kedalamnya dan dibolak-balikan secara
perlahan sebanyak 3-6 kali, kemudian
diinkubasi selama 5 menit di dalam es.
Setelah disimpan di dalam es, suspensi
7
tersebut disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm (15300 rcf) selama 10 menit.
Supernatan yang dihasilkan, dipindahkan
ke dalam tube filter (kolom) dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 12000 rpm (15300
rcf) selama 2 menit. Selanjutnya sebanyak 500
µL wash buffer I ditambahkan kedalamnya
dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm (15300 rcf) selama 2 menit. Kemudian
ditambahkan lagi dengan wash buffer II
sebanyak 700 µL dan disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 rpm (15300 rcf) selama 2
menit. Tabung filter (kolom) disentrifus dalam
keadaan kosong untuk menghilangkan sisa
etanol yang ada. Kemudian ditransfer ke
dalam tabung 1.5 mL yang baru. Lalu
dilarutkan dengan elution buffer sebanyak 30
µL, larutan diinkubasi selama 1 menit untuk
melarutkan DNA yang berada pada membran
filter, selanjutnya disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 12000 rpm (15300 rcf)
selama 2 menit. DNA plasmid diverifikasi
pada gel agarosa 1 %.
Restriksi Gen Kitinase dan pCambia 1303
dengan Enzim Restriksi
Restriksi dilakukan dengan menggunakan
enzim
dari
Biolabs.
Plasmid
yang
mengandung
gen
kitinase
dipotong
menggunakan enzim Nco1 dan Spe1. Restriksi
DNA plasmid dan pCambia 1303 dilakukan
dengan dimasukkannya 7 µL DNA plasmid
dan ditambahkan dengan 8.8 µL dH2O, 0.2 µL
BSA, 2 µL buffer 2 (SpeI), 1 µL enzim SpeI
dan 1 µL enzim NcoI sehingga volum total
yang ada didalam tabung mikro tersebut
sebanyak 20 µL. Campuran diinkubasi selama
3 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya hasil
restriksi dielektroforesis dengan menggunakan
gel agarosa 0.5%. Setelah itu gel ditempatkan
di bawah lampu ultraviolet (UV) untuk
melihat gen kitinase yang sudah terpisah
sempurna dengan vektor (pGEMT). Tahap
selanjutnya fragmen gen kitinase dipotong
dari gel menggunakan scalpel untuk elusi dan
hasil elusi dicek pada gel agarosa 1 %
(Chaidamsari 2005).
Ligasi Gen Kitinase dengan pCambia 1303
Ligasi dilakukan dengan menggunakan T4
ligase dan buffer ligase dari Promega.
Sebanyak 1 µL hasil elusi dicampurkan dalam
tabung steril 500 µL dengan buffer (2x)
sebanyak 5 µL, vektor pCambia sebanyak 3
µL dan T4 ligase sebanyak 1 µL sehingga
volume total menjadi 10 µL. Campuran
diinkubasi selama 1 jam pada suhu ruang atau
semalaman pada suhu 4oC (Chaidamsari
2005). Selanjutnya hasil ligasi gen kitinase
dengan pCambia akan ditransformasi ke sel
kompeten (XL-1 Blue). Sel kemudian
disebarkan diatas medium LB agar yang telah
ditambahkan dengan kanamisin 25 ppm.
Setelah itu diinkubasi semalam pada suhu 37
o
C. Seleksi transforman dilakukan dengan
pengamatan terhadap koloni yang terbentuk.
Koloni yang terbentuk adalah koloni berwarna
putih. Koloni putih yang tumbuh dari gen
kitinase diduplikat dan diisolasi DNA
plasmidnya.
Koloni
putih
tersebut
mengandung DNA rekombinan. Koloni
tersebut juga dibuat duplikatnya dan
dikulturkan dalam media
LB yang
mengandung kanamisin 25 ppm. Lalu dikocok
pada kecepatan 150 rpm selama semalam
pada suhu 37oC. Dari kultur bakteri yang
tumbuh, selanjutnya dilakukan isolasi DNA
plasmid menggunakan High Pure Plasmid
Isolation Kit (Roche). Hasil isolasi
diverifikasi kembali pada gel agarosa 1%.
Transformasi Menggunakan Sel Kompeten
Kimia ke Agrobacterium tumefaciens Strain
AGLO
Setelah hasil verifikasi pada agarosa sesuai
dengan yang diharapkan, tahap selanjutnya
adalah restriksi kembali gen kitinase dengan
enzim restriksi yang sama. Tujuan dari
restriksi ini adalah untuk mengecek gen
kitinase tersebut sudah masuk ke dalam vektor
atau tidak. Selanjutnya jika gen kitinase
tersebut sudah masuk ke dalam vektor
ekspresi maka tahap selanjutnya akan
ditransformasikan ke dalam Agrobacterium.
Transformasi ke Agrobacterium menggunakan
metode Chaidamsari (2005), dengan cara
sebanyak 5-10 L DNA plasmid dimasukkan
ke dalam 500 L sel kompeten, diamkan di
dalam es selama 15 menit. Setelah itu,
diinkubasi di dalam es, diinkubasi kembali
selama 5 menit di dalam nitrogen cair dengan
suhu –260oC dan setelahnya 5 menit pada
suhu 37oC. Kemudian sebanyak 1 mL YEP
(Yeast Exctract
Pepton) ditambahkan
kedalamnya dan dikocok selama 3 jam pada
suhu 28oC dengan kecepatan 150 rpm. Setelah
dikocok, larutan tersebut disentrifugasi
dengan kecepatan 6000 rpm (3800 rcf) selama
3 menit.
Supernatan yang dihasilkan sebagian
dibuang dan sebanyak 200 L supernatan
yang tersisa diresuspensikan dengan pelet
yang terbentuk. Setelah itu sebanyak 200 L
larutan tersebut dipipet dan dimasukkan ke
dalam media LA yang telah berisi antibiotik
kanamisin 25 ppm dan rifampisin 50 ppm.
8
Inkubasi selama 2 hari pada suhu 28o C dalam
kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm.
Setelah diinkubasi selama 2 hari, hasilnya
adalah terbentuknya koloni berwarna putih.
Koloni yang terbentuk kemudian diambil
dengan tusuk gigi steril dan diberi nomor lalu
dimasukkan ke dalam media agar untuk dibuat
duplikatnya dan dikulturkan dalam media LB
yang mengandung kanamisin 25 ppm dan
rifampisin 50 ppm. Selanjutnya dikocok
selama 2 malam dengan kecepatan 150 rpm
dan dilakukan isolasi DNA plasmid. Setelah
itu, dilakukan restriksi kembali dengan
menggunakan enzim NcoI dan SpeI.
Keberhasilan tahap ini dapat dilihat
berdasarkan hasil restriksi dengan enzim NcoI
dan SpeI. Tahap selanjutnya dari penelitian
ini, akan dilanjutkan oleh peneliti yang lain
dari
hasil
yang
didapatkan
akan
ditransformasikan melalui Agrobacterium ke
eksplan tanaman kelapa sawit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemurnian Gen Kitinase Produk PCR
Strategi dalam konstruksi gen harus
mempertimbangkan dua hal yaitu urutan
nukleotida gen yang akan dikonstruksi dan
vektor ekspresi yang akan digunakan. Gen
kitinase (chi) telah diamplifikasi oleh peneliti
sebelumnya. Hasil PCR produk yang didapat
dari tahap penelitian sebelumnya, dimurnikan
terlebih dahulu untuk menghilangkan
komponen-komponen
yang
dapat
menghambat proses kloning selanjutnya. Hasil
pemurnian PCR produk gen chi ditunjukkan
pada Gambar 3. Berdasarkan hasil yang
didapat, terlihat bahwa pada sumur 2 terdapat
pita yang cukup tebal dengan ukuran yang
sesuai dengan pita marka 1500 bp. Hasil dari
gambar ini menunjukkan bahwa produk PCR
yang telah murni adalah benar gen chi yang
diinginkan.
2000 bp
1500 bp
1000 bp
M
1
M
1
2
2
Gambar 3 Pemurnian PCR produk gen chi.
(M) marker, (1&2) gen chi.
Cloning Gen Kitinase Hasil PCR pada
pGEMT-Easy
Fragmen hasil amplifikasi (PCR) yang
diverifikasi pada gel agarosa (Gambar 3),
dipotong dari gel dan dimurnikan untuk
digunakan pada tahap cloning. Cloning dibagi
menjadi tahap ligasi, transformasi ke dalam
sel kompeten, dan seleksi transforman. Vektor
cloning yang digunakan pada penelitian
adalah pGEMT-Easy dari Promega. Seperti
terlihat pada Gambar 4, plasmid yang
digunakan memiliki basa timin pada bagian
ujungnya (3’ T-overhang). Basa T dari vektor
dapat berikatan dengan fragmen gen hasil
PCR yang memiliki kelebihan basa adenin,
tanpa memerlukan tahapan restriksi terlebih
dahulu. Proses ligasi terjadi dengan adanya
bantuan enzim T4 DNA ligase, yaitu enzim
yang membentuk ikatan fosfodiester diantara
fragmen gen (insert) dan basa dari plasmid
yang digunakan. Proses tersebut dapat
dilakukan pada suhu ruang selama satu jam
atau diinkubasi pada suhu 4o C selama
semalam. Proses ligasi antara gen kitinase dan
vektor cloning dalam hal ini telah berhasil
dilakukan.
Gambar 4 Vektor klon pGEMT-Easy dan
peta restriksi yang dimiliki
(Promega 1999).
Transformasi Gen Kitinase ke Escherichia
coli (XL-1 Blue)
Produk ligasi yang telah berhasil,
kemudian ditransformasi ke dalam sel E. coli
XL1- Blue kompeten. Berdasarkan koloni
yang terbentuk pada media (Gambar 5),
menunjukkan bahwa hasil kloning gen
kitinase ke dalam pGEMT-Easy telah berhasil
dilakukan. Transformasi dilakukan dengan
pemberian kejut panas (heat shock) pada suhu
42oC selama 50 detik. Prinsip utama dari
proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu
dari 0oC ke 42oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan dengan CaCl2. Garam CaCl2