UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT ® TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Diajukan oleh: Aquina Alia Retnowati NIM : 998114072 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI “Kristus Yesus datang ke dunia untuk menyelamatkan orang berdosa“, dan di antara mereka akulah yang paling berdosa. (1Tim 1:15) Nothing in the world can take the place of Persistence. Talent will not; nothing is more common than unsuccessful men with talent. Genius will not; unrewarded genius is almost a proverb. Education will not; the world is full of educated derelicts. Persistence and determination alone are omnipotent. The slogan “Press On” has solved and always will solve the problems of the human race. - Calvin Coolidge Kupersembahkan untuk: Mama dan Papaku Adikku, ‘Sahabat’ dan Temanku iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji syukur kepada Tuhan yang telah memberikan jalan serta rahmat dalam penyusunan skripsi ini. Atas berkat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT® TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis mengucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang telah membantu dengan memberikan dukungan secara material maupun spiritual: 1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, yang telah memberikan ijin dalam melaksanakan penelitian ini. 2. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing skripsi dan dosen penguji yang memberikan bimbingan dan pengarahan selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini selesai. 3. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt, dan Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberi masukan. 4. Pak Sarwanto, staf Laboratorium Mikrobiologi yang telah memberikan pelayanan sebagai laboran selama bekerja di laboratorium. 5. Papa, mama dan adikku yang telah memberikan doa dan dukungan. 6. Rm. Agung, SJ., yang telah membantu meminjamkan kamera digital dan memberikan saran yang bermanfaat untuk penelitian ini vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7. Teman-teman, yang memberikan semangat dan bantuan yang berarti selama mengerjakan penelitian ini. 8. Seluruh pihak yang telah banyak membantu yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna karena penulis menyadari keterbatasan pengetahuan dan pengalaman. Oleh sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran. Penulis berharap semoga skripsi in bermanfaat bagi perkembangan ilmu farmasi. Yogyakarta, Desember 2007 Penulis vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Yogyakarta, 21 Desember 2007 Penulis, Aquina Alia Retnowati viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................ii HALAMAN PENGESAHAN..................................................................................iii HALAMAN PERSEMBAHAN ..............................................................................iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................v PRAKATA ................................................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................................viii DAFTAR ISI.............................................................................................................ix DAFTAR TABEL ...................................................................................................xiii DAFTAR GAMBAR...............................................................................................xiv DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................................xv INTISARI ...............................................................................................................xvii ABSTRACT ............................................................................................................xviii BAB I PENDAHULUAN.........................................................................................1 A. Latar Belakang ............................................................................................1 1. Perumusan Masalah..............................................................................3 2. Keaslian Penelitian ...............................................................................3 3. Manfaat Penelitian................................................................................3 B. Tujuan Penelitian ........................................................................................4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ......................................................................5 ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI A. Susu Fermentasi ..........................................................................................5 B. Susu Fermentasi Yakult® ............................................................................10 C. Bakteri Asam Laktat (BAL)........................................................................11 D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL) ..........................14 E. Bakteri Uji...................................................................................................14 1. Escherichia coli....................................................................................14 2. Enterococcus faecalis...........................................................................15 F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri .....................................................17 1. Metode Difusi.......................................................................................17 2. Metode Dilusi .......................................................................................18 3. Metode Turbidimetri ............................................................................19 G. Keterangan Empiris ....................................................................................19 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..............................................................22 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ..................................................................22 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.............................................22 1. Variabel Penelitian ...............................................................................22 2. Definisi Operasional.............................................................................23 C. Bahan dan Alat............................................................................................24 1. Bahan Penelitian...................................................................................24 2. Alat Penelitian ......................................................................................26 D. Tata Cara Penelitian ....................................................................................26 1. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate ..........................................................................................26 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® .................................................................................................26 3. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ..............................................................................34 4. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc.......................................................................................................34 E. Analisis Hasil ..............................................................................................35 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................36 A..Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate ............................................................................................................36 B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ........................................................................................................38 1. Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®............38 2. Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.......46 3. Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ..............50 C. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp .................58 D. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp. terhadap E.coli dan E. faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc ..................................................................................................60 1. Pembuatan Suspensi E.coli dan E. faecalis..........................................60 2. Pembiakan E.coli dan E.faecalis Secara Pour Plate ............................61 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3. Pengujian Potensi Antibakteri dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc............................................................................................61 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................68 A. Kesimpulan .................................................................................................68 B. Saran ...........................................................................................................68 DAFTAR PUSTAKA ...............................................................................................69 LAMPIRAN..............................................................................................................72 BIOGRAFI PENULIS .............................................................................................90 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat........................................................................................... 14 Tabel II. Hasil Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ............................................................................. 46 Tabel III. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ............................................................................. 49 Tabel IV. Hasil Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.... 57 Tabel V. Hasil Determinasi Isolat Bakteri dalam Fermentasi Susu Yakult® ..... 58 Tabel VI. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli waktu inkubasi 24 jam ....................................................................................................... 63 Tabel VII. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.faecalis waktu inkubasi 24 jam .................................................................................................. 64 xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Skema Kerja Penelitian ....................................................................... 21 Gambar 2. Hasil Pengecatan Gram Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ............................................................................................... 41 Gambar 3. Hasil Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 43 Gambar 4. Hasil Pengecatan Spora Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 45 Gambar 5. Hasil Uji Potensi Antibakteri Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap E. coli. ...... 63 Gambar 6. Hasil Uji Potensi Senyawa Antibakteri Lactobacillus dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap E. faecalis..............................................64 xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Daftar Komposisi Media MRS (Man Rogosa Sharpe) Agar dan Broth Oxoid......................................................................................... 72 Lampiran 2. Hasil Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan metode streak plate ............................................................................. 74 Lampiran 3. Hasil Pengamatan Pergerakan Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan metode tusukan ......................................................... 75 Lampiran 4. Hasil Uji Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dalam MRS Agar Tegak........................................................ 76 Lampiran 5. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dalam MRS Agar Miring....................................................... 77 Lampiran 6. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®dalam MRS Cair (Broth) ........................................................ 78 Lampiran 7. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®dalam MRS Agar Plate .......................................................... 79 Lampiran 8. Hasil Uji Oksidase Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® .... 80 Lampiran 9. Hasil Uji O-F dengan Parafin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 81 Lampiran 10. Hasil Uji O-F tanpa Parafin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® .................................................................................................82 Lampiran 11. Hasil Uji Penggunaan Sitrat Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 83 xv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 12. Hasil Uji Dekarboksilase Lisin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ..............................................................................84 Lampiran 13. Hasil Uji Hidrolisis Gelatin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 85 Lampiran 14. Hasil Uji Pembentukan H2S Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 86 Lampiran 15. Hasil Uji Indol Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® .......... 87 Lampiran 16. Hasil Uji MR (Methyl Red) Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ................................................................................................ 88 Lampiran 17. Hasil Uji VP (Voges Proskauer) Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® ............................................................................. 89 xvi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI INTISARI Susu fermentasi merupakan susu yang dihasilkan dari proses fermentasi beberapa jenis bakteri, terutama bakteri asam laktat (BAL). Hasil dari fermentasi tersebut sebagian besar adalah senyawa asam laktat yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate; isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult®; pengujian potensi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode difusi menggunakan paper disc. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan isolat bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli tetapi tidak untuk E. faecalis. Kata kunci: Yakult®, susu fermentasi, E. coli, E. faecalis, potensi antibakteri, Lactobacillus sp. xvii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Fermented milk is milk which produced by bacterial fermentation process, particularly acid lactic bacteria. Most of the fermentation’s result is lactic acid which have potential to inhibit pathogen bacterial growth This research was aimed to examine antibacterial potential of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk toward Escherichia coli and Enterococcus faecalis. This research was done in several stages i.e. isolation of bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk by streak plate method; achievement of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk and potential examination of Lactobacillus sp compounds by paper disc diffusion method. This research was a pure experimental and explorative descriptive research. The result of research indicated that compounds produced by isolated bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk had antibacterial potential toward E.coli but not with E.faecalis. Keywords: Yakult®, fermented milk, E.coli, E.faecalis, antibacterial potential, Lactobacillus sp. xviii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Susu fermentasi dihasilkan dari susu (air, casein, laktosa, lemak, lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997) yang telah difermentasi oleh beberapa jenis bakteri sehingga menghasilkan senyawa yang dapat memberi karakteristik rasa, warna dan tekstur tertentu yang berbeda dari susu biasa (Atlas, 1997). Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat yang menghasilkan metabolit sekunder yang dapat menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan (Buckle, Edwards, Fleet & Wootton, 1987). Yakult® termasuk produk susu fermentasi yang beredar di pasaran yang mengandung bakteri non patogen yang berguna untuk menjaga kesehatan dengan mempertahankan keseimbangan flora usus di saluran pencernaan. Maksud mempertahankan keseimbangan flora adalah mempertahankan keadaan dimana bakteri non patogen menghasilkan efek menguntungkan (contoh: menghasilkan senyawa antimikroba) bagi usus, dapat menetralkan efek merugikan dari bakteri patogen dan bakteri pembusuk (sebagai flora yang berpotensi patogen). Hal ini dapat membantu meningkatkan sistem kekebalan di usus sehingga manusia terhindar dari penyakit-penyakit yang berhubungan dengan organ tersebut (Anonim, 2006). Produk ini mengandung bakteri yang merupakan salah satu genus bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang menghasilkan asam laktat sebagai hasil utama dari metabolisme fermentasi karbohidrat (Daeschel, 1989). Senyawa 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2 hasil fermentasi tersebut diketahui dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain (Frazier & Westhoff, 1988). Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam (pH sekitar 3,5). Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester, Anderson, Roberts, Pearsall & Nester, 2001), seperti Enterococcus faecalis dan E.coli (Holt, Krieg, Sneath, Stanley & Williams, 2000). Dari sekian banyak spesies flora usus manusia, E.coli dan E.faecalis termasuk salah satu di dalamnya. E.coli dan E.faecalis termasuk bakteri yang berpotensial patogen di usus (Todar, 2002). Bila terjadi ketidakseimbangan flora, jumlah E.coli akan meningkat dan eksotoksin yang dihasilkan oleh E.coli juga bertambah. Eksotoksin ini yang dapat menyebabkan terjadinya diare (Nester et al., 2001). Begitu juga dengan E.faecalis, ketika tidak terjadi keseimbangan flora usus, populasi E.faecalis akan meningkat dan menghasilkan cytolysin dalam jumlah yang besar sehingga mengakibatkan penyakit infeksi enterococcal pada manusia (Koneman, Allen, Janda, Schreckenbergen, & Winn,1997). Riana (2001) meneliti potensi senyawa yang dihasilkan oleh proses fermentasi yang dilakukan bakteri dalam dua produk susu fermentasi yaitu Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi. Hasil penelitian Riana (2001) menyimpulkan bahwa metabolit sekunder bakteri yang diisolasi dari Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E.coli dan S. aureus. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 Berdasarkan latar belakang permasalahan di atas, diuji potensi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, khususnya terhadap E.coli dan E. faecalis. Senyawa dari bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diharapkan mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan E. faecalis. Uji potensi tersebut dapat ditunjukkan dengan diameter zona hambat yang terbentuk. 1. Perumusan Masalah a. Bagaimana identitas isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® ? b. Apakah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® menunjukkan potensi antibakteri terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis atau tidak? 2. Keaslian Penelitian Penelitian berjudul Uji Potensi Antibakteri Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap Enterococcus faecalis belum pernah dilakukan. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi senyawa penghambat yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli dan E.faecalis. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi bagi pengobatan, tentang senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dalam menghambat bakteri patogen di saluran pencernaan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4 B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan: a. Mengetahui identitas isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® b. Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E. coli dan E. faecalis. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Susu Fermentasi Bahan pangan (makanan/minuman) merupakan medium pertumbuhan yang baik bagi bermacam-macam mikroorganisme. Pertumbuhan dan aktivitas mikroorganisme di dalam bahan pangan mengakibatkan kualitas pangan menjadi rusak dan terjadi pembentukan toksin. Bagi yang mengkonsumsinya dapat mengalami keracunan, bahkan kematian. Tidak semua mikroorganisme merugikan, ada mikroorganisme yang bersifat menguntungkan (Pelczar & Chan, 1988). Keuntungannya yaitu dengan menghasilkan produk pangan khusus berupa pangan fermentasi seperti keju, tempe, tape, bir, anggur, yoghurt dan lain-lain yang dapat meningkatkan nilai gizi (Tarigan, 1988). Pangan fermentasi adalah pangan yang dihasilkan dari fermentasi mikroorganisme dengan tekstur dan rasa yang lebih disukai daripada pangan biasa. Contoh pangan fermentasi yaitu sour cream, yoghurt dan blue cheese yang menggunakan bakteri sebagai mikroorganismenya dan susu sebagai media fermentasinya; minuman keras seperti bir dan wine, menggunakan mikroorganisme fungi dan media fermentasinya adalah air beras dan anggur; bumbu makanan Asia seperti soy sauce dan miso menggunakan fungi untuk memfermentasi kedelai (Nester et al, 2001; Frazier & Westhoff, 1988). Susu termasuk bahan pangan yang bernutrisi tinggi. Bentuknya cair dan memiliki pH 7,0. Bahan yang terkandung di dalam susu adalah air (sekitar 87 %), casein (2,5 %), laktosa (5 %), lemak (4 %), sisanya lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997). Hal itu berarti susu merupakan media organik yaitu media yang 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6 tersusun dari bahan-bahan organik. Media adalah bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba dapat tumbuh dengan baik dalam suatu media jika media tersebut: harus mengandung nutrisi yang mudah digunakan oleh bakteri, mempunyai pH yang sesuai, dan tidak mengandung zat-zat penghambat. Ada pula media sintetik yaitu media yang susunan kimianya dapat diketahui dengan pasti seperti media MRS (de Man Rogosa Sharp) yang digunakan dalam penelitian ini (Jutono dkk, 1980). MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l): peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05. Media tersebut memenuhi syarat sebagai pengganti susu karena memiliki karbohidrat (glucose), protein (peptone, yeast extract, lab-lemco), mineral (magnesium, mangan) dan komponen lain. MRS merupakan media yang mendukung pertumbuhan bakteri asam laktat sebanyak-banyaknya (Bridson, 1998). Mikroorganisme memperoleh energi untuk tumbuh dengan memetabolisme bahan yang terkandung di dalam susu sehingga dapat merusak kualitas susu tersebut. Bentuk kerusakan yang ditimbulkannya berupa perubahan pada penampilan, susunan kimia dan cita rasa susu (Fardiaz, 1992). Perubahan ini terjadi disebabkan adanya pembentukan gas, lendir, dan alkali; pemecahan protein, dan lemak; perubahan warna dan rasa pada susu. Supaya bisa dikonsumsi, kerusakan susu harus dicegah dengan meminimalisir mikroorganisme yang hidup di dalam susu dengan proses pengawetan. Selain mengurangi mikroorganisme, proses ini harus tetap menjaga kualitas susu tersebut. Pengawetan susu dilakukan dengan bermacam cara, yaitu PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 proses pemanasan, pendinginan, pengeringan dan fermentasi (Frazier & Westhoff, 1988). Pemanasan susu cara pasteurisasi yaitu proses memanaskan susu yang dapat merusak bakteri patogen tanpa mengubah rasa dan nutrisi susu. Karena bakteri patogen terbunuh, susu tidak dapat menyebabkan penyakit, tetapi bakteri berspora dan bakteri termofil tidak dapat terbunuh dengan cara ini (Tarigan, 1988). Pendinginan dilakukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme di dalam susu selama proses penyimpanan. Untuk proses pengeringan, susu diubah menjadi bentuk kering, contohnya susu skim yang tidak ada kandungan air di dalamnya. Proses pengawetan susu dengan fermentasi, menggunakan fermentasi asam laktat (fermentasi karbohidrat menjadi asam laktat) sebagai jalan untuk mendapatkan senyawa (asam laktat) yang dapat menghambat bakteri patogen di dalam susu, sehingga kultur bakteri yang dibutuhkan untuk fermentasi ini adalah bakteri dari golongan bakteri asam laktat, karena hanya golongan bakteri ini yang dapat melakukan fermentasi asam laktat (Frazier & Westhoff, 1988). Fermentasi merupakan reaksi keseimbangan oksidasi reduksi dimana beberapa atom energi (donor elektron) direduksi dan yang lain dioksidasi. Pada jalan fermentasi, senyawa organik merupakan donor elektron (agen pereduksi) dan produk substrat bertindak sebagai akseptor elektron (agen pengoksidasi) (Atlas, 1984). Proses fermentasi juga didefinisikan sebagai proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara anaerobik, yaitu tanpa memerlukan oksigen. Senyawa yang dapat dipecah dalam proses fermentasi terutama adalah karbohidrat, sedangkan asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa jenis bakteri tertentu. Pada bakteri dikenal paling sedikit tiga jalur pemecahan glukosa (karbohidrat) yaitu: Jalur PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis ditemukan pada fungi dan kebanyakan bakteri. Senyawa yang dihasilkan adalah asam laktat (pada BAL), etanol, dan CO2 (pada khamir) (Fardiaz, 1992). Jalur Entner-Doudoroff (ED) hanya ditemukan pada beberapa bakteri. Hasil akhir yang diperoleh berupa etanol. Jalur Heksamonofosfat (HMF) dan Fosfoketolase ditemukan pada bakteri tergolong laktobasili heterofermentatif. Senyawa akhir yang terbentuk adalah asam laktat, etanol, dan CO2 (Boyd, 1984). Di antara ketiganya yang berguna sebagai senyawa penghambat bakteri adalah asam laktat (Prangdimurti, 2006). Untuk fermentasi asam amino, asam amino difermentasi oleh bakteri berjenis Clostridia menghasilkan senyawa lain, seperti asam propionat dan asam asetat (Fardiaz, 1992). Dalam fermentasi pangan, kecepatan pertumbuhan mikroorganisme sangat penting karena mempengaruhi hasil fermentasi. Kecepatan pertumbuhan itu ditentukan oleh kondisi lingkungan. Untuk mendapatkan hasil fermentasi yang diinginkan, kondisi lingkungan perlu dijaga. Kondisi secara natural yang ada di dalam pangan seperti kelembaban, keasaman, dan nutrien disebut faktor intrinsik. Kondisi lingkungan seperti temperatur dan atmosfer (ada/tidaknya oksigen) penyimpanan pangan disebut faktor ekstrinsik (Nester et al., 2001). 1. Kelembaban. Produk pangan berubah secara drastis ketika air dapat diambil oleh mikroorganisme untuk tumbuh. Daging segar dan susu adalah contoh bahan pangan yang mempunyai banyak air dan dapat mendukung pertumbuhan mikroorganisme. Roti, kacang, dan makanan kering mempunyai lingkungan yang kering. Beberapa makanan yang kaya gula, seperti selai dan jelly yang nampaknya lembab, airnya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme karena air tersebut berinteraksi secara kimiawi dengan gula. Makanan yang mengandung garam tinggi mempunyai kelembaban yang sedikit (Nester et al., 2001). Water activity (aw) digunakan untuk memperkirakan jumlah air dalam makanan. Air murni ber- aw: 1.0. Makanan segar ber-aw: 0.98, ham ber-aw: 0.91, selai ber- aw: 0.85, dan kue ber- aw: 0.7. Bakteri biasanya membutuhkan aw sekitar 0.9 untuk tumbuh, yang menjelaskan mengapa pangan yang kelembabannya tinggi dapat membusuk lebih cepat daripada makanan kering, bergula, atau makanan bergaram (Nester et al, 2001). 2. pH pH pangan juga penting untuk menentukan mikroorganisme yang bisa bertahan dan hidup dalam pH tersebut. Banyak bakteri termasuk yang patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5. Pengecualian untuk bakteri asam laktat yang dapat tumbuh pada pH rendah 3,5 dan digunakan untuk produksi pangan fermentasi seperti yoghurt dan sauerkraut. Grup bakteri ini memproduksi asam laktat sebagai hasil metabolisme fermentasi. Meskipun mereka berguna dalam produksi pangan yaitu tumbuh dan memproduksi asam, tapi mereka juga penyebab utama pembusukan susu yang tidak dipasteurisasi dan bahan pangan lain (Nester et al, 2001). 3. Nutrien Nutrien ada dalam makanan seperti faktor intrinsik lainnya yaitu menentukan jenis mikroorganisme yang dapat tumbuh di dalamnya. Mikroorganisme yang memerlukan vitamin tidak dapat tumbuh di dalam pangan yang kurang vitaminnya. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 Kemampuan mikroba dalam mensintesis vitamin, dapat tumbuh jika kondisi lainnya baik (Nester et al, 2001). Pada umumnya nutrien harus disediakan hal-hal berikut ini: (1) donor hidrogen dan penerima hidrogen kira-kira 2 g/L; (2) sumber karbon kira-kira 1 g/L; (3) sumber nitrogen kira-kira 1 g/L; (4) mineral-mineral belerang dan fosfor, masingmasing kira-kira 50 mg/L; unsur-unsur lain masing-masing 0,1-1 mg/L; (5) faktorfaktor pertumbuhan : asam amino, purin, pirimidin, masin-masing kira-kira 50 mg/L; vitamin-vitamin, masing-masing 0,1-1 mg/L. Untuk mempelajari metabolisme mikroba biasanya perlu dibuat media yang seluruhnya sintetik, sehingga sifat dan konsentrasi tiap bahan diketahui secara tepat. Dalam keadaan biasa, lebih murah dan sederhana bila digunakan bahan alami seperti ekstrak ragi, sari protein atau zat-zat sejenis. Untuk banyak organisme, satu senyawa (seperti asam amino) dapat berlaku sebagai sumber energi, sumber karbon, dan sumber nitrogen; mikroorganisme lain memerlukan senyawa yang berbeda untuk tiap sumber (Jawetz dkk, 1996) 4. Temperatur Penyimpanan Temperatur ini mempengaruhi kecepatan pertumbuhan mikroorganisme dalam makanan. Di bawah titik beku, air menjadi kristal dan tidak dapat diperoleh, pertumbuhan mikroba pun terhenti karena membutuhkan kelembaban. Pada suhu yang rendah, banyak reaksi enzim berjalan dengan lambat sehingga mikroorganisme tidak dapat tumbuh. Hal ini dapat mengurangi kecepatan pertumbuhan (Nester et al., 2001). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 5. Atmosfer Ada atau tidaknya oksigen mempengaruhi populasi mikroorganisme yang tumbuh di dalam pangan. Contohnya Pseudomonas yang merupakan aerob obligat dan bakteri ini tidak dapat tumbuh dalam pangan yang disimpan pada kondisi tanpa oksigen. Tidak adanya oksigen dalam pangan memungkinkan pertumbuhan bakteri lain seperti anaerob obligat Clostridium botulinum (Nester et al., 2001). B. Yakult Yakult® adalah minuman susu fermentasi, yang dibuat dengan cara memfermentasi susu bubuk skim yang mengandung bakteri asam laktat hidup. Pada tahun 1930, Dr. Minoru Shirota, seorang dokter dan peneliti di bidang mikrobiologi, telah berhasil mengkulturkan berbagai jenis bakteri asam laktat dan memilih satu jenis bakteri yang bersifat paling tahan terhadap cairan pencernaan. (Anonim, 2006). Bahan-bahan Yakult® terdiri dari bakteri, susu bubuk skim, sukrosa, glukosa, aroma, dan air. Kandungan gizi di dalam Yakult® (kalori 48 kcal) adalah protein 0,8 g; lemak 0,0 g; karbohidrat 11,3 g; kolesterol tidak terdeteksi; Kalsium 28,0 g; Natrium 7,8 mg; Kalium 31,2 mg; Indeks glycaemic 46 (rendah) (Anonim, 2006). Yakult® harus selalu disimpan pada suhu di bawah 10°C supaya kualitasnya terjaga. Warna Yakult® coklat muda dan volume per botolnya 65 ml. (Anonim, 2006). Manfaat Yakult® terletak pada bakterinya yang mampu hidup sampai usus kita karena bakteri ini dapat memberikan manfaat seperti: mencegah gangguan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 pencernaan, meningkatkan daya tahan tubuh, meningkatkan jumlah bakteri berguna dalam usus, mengurangi racun dalam usus, membatasi jumlah bakteri yang merugikan usus (Anonim, 2006). Yakult® mulai diproduksi dan dipasarkan di Taiwan pada tahun 1964, kemudian diikuti dengan hal yang sama di negara-negara lainnya di Asia, Australia dan dipasarkan di Eropa tahun 1990-an. Saat ini jaringan global Yakult® berkembang meliputi 22 negara dan dikonsumsi sebanyak 15 juta botol perhari (Anonim, 2006). Susu Fermentasi Yakult® pernah diteliti Riana (2001) dengan menguji daya hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi tersebut terhadap E. coli dan S. aureus. Menurutnya dengan metode difusi sebagai salah satu metode pengujian antibakteri menunjukkan bahwa senyawa antibakteri tersebut tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli dan S. aureus. C. Bakteri Asam Laktat (BAL) Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri golongan gram positif, tidak berspora dan mempunyai kemampuan dalam memfermentasi gula menjadi asam laktat (Singleton & Sainsbury, 2001). Kebanyakan BAL tidak sensitif oleh O2 dan dapat tumbuh saat ada O2 sama baiknya dengan tidak ada O2. BAL termasuk anaerob aerotoleran. Yang termasuk bakteri asam laktat adalah famili Lactobacillaceae yaitu Lactobacillus dan famili Streptococaceae terutama Leuconostoc, Streptococcus dan Pediococcus. Bakteri ini sering digunakan dalam pembuatan produk-produk fermentasi seperti fermentasi sayuran, fermentasi susu dan fermentasi ikan (Fardiaz, 1992). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13 Fermentasi asam laktat merupakan salah satu tipe fermentasi karbohidrat yang dilakukan oleh bakteri asam laktat dengan menghasilkan asam laktat seluruhnya, disebut fermentasi homolaktat, sedangkan bila menghasilkan asam laktat dan senyawa lain seperti etanol dan CO2 disebut fermentasi heterolaktat (Singleton & Sainsbury, 2001). Bakteri asam laktat memetabolisme karbohidrat untuk memperoleh energi dan biasanya terbatas pada lingkungan yang mengandung karbohidrat (Madigan, Martinko & Parker, 2000). Metabolisme pada BAL (Bakteri Asam Laktat) melalui dua jalur yang berbeda yang digunakan untuk menggolongkan BAL homofermentatif dan heterofermentatif. Golongan homofermentatif memproduksi asam laktat dari glukosa lebih dari 85 % melalui jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP), sedang golongan heterofermentatif melalui jalur Fosfoketolase memproduksi asam laktat 50% dan menghasilkan produk lain yaitu asam asetat, etanol dan CO2 melalui jalur Heksosa Monofosfat Shunt (HMS). Perbedaan jalur tersebut disebabkan oleh enzim-enzim yang dimiliki berbeda (Ray & Sandine, 1992). Dalam industri, susu yang difermentasi dihasilkan dengan cara menginokulasi susu yang telah dipasteurisasi dengan suatu biakan mikoorganisme yang disebut biakan pemula (starter culture). Biakan pemula tersebut digunakan untuk menghasilkan fermentasi yang dikehendaki, sehingga menjamin dihasilkannya produk yang baik dan seragam (Pelczar & Chan, 1988). Fermentasi di dalam susu biasa dilakukan oleh bakteri asam laktat dengan memetabolisme laktosa susu melalui jalan fermentasi asam laktat. Terkumpulnya asam laktat sebagai produk akhir fermentasi tersebut, menjadikan asam laktat berguna sebagai pengawet alami (Nester PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14 et al., 2001). Bakteri asam laktat sebagai starter culture (biakan pemula) yang berbeda-beda dengan fraksi susu sebagai starting substrate, menghasilkan produk susu fermentasi yang berbeda-beda pula. Sour cream contohnya, menggunakan Streptococcus cremoris atau Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat dan Leuconostoc cremoris untuk menghasilkan rasa yang khas. Contoh lain, Bulgarian buttermilk dibuat oleh Lactobacillus bulgaricus sehingga menghasilkan asam laktat dan rasa yang khas (Atlas, 1997). Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat (Pelczar & Chan, 1988). Produk Fermentasi Mikroorganisme Utama Perubahan Yang Yang Melakukan Fermentasi Dihasilkannya Rum masam yang dibiaki Sama dengan yang digunakan Asam dan rasa/ mikroorganisme untuk pembuatan susu mentega aroma yang dibiaki bakteri, yaitu Streptokokus, Leukonostok. Susu bulgaria Lactobacillus bulgaricus Susu acidofilus L. acidophillus Yogurt Streptococcus termophilus L. bulgaricus S. lactis L. bulgaricus Khamir peragi laktosa Sama dengan yang dijumpai Asam pada kefir aroma Kefir Kumiss Asam aroma Asam aroma Asam aroma Asam aroma dan rasa/ dan rasa/ dan rasa/ dan rasa/ dan rasa/ D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL) Senyawa antibakteri dalam bakteri asam laktat (BAL) yang paling banyak ditemukan adalah asam laktat. Bakteri asam laktat menghasilkan sejumlah besar asam laktat sebagai hasil akhir dari metabolisme karbohidrat. Asam yang dihasilkan akan menurunkan nilai pH dari lingkungan pertumbuhannya dan menimbulkan rasa PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15 asam. Hal ini akan menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroba patogen lainnya (Buckle dkk, 1987). Ray & Sandine (1992) melaporkan bahwa efek antibakteri dari asam laktat sangat kecil. Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam (pH sekitar 3,5). Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester et al, 2001). E. Bakteri Uji 1. Escherichia coli E.coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang lurus, fakultatif anaerob, fermentasi dan respirasi sebagai metabolismenya (Holt, et al, 2000). E. coli adalah anggota flora normal usus besar dan termasuk bakteri enterik. Bakteri enterik pada umumnya tidak menyebabkan penyakit dalam usus, tetapi berperan terhadap fungsi dan nutrisi normal. Ketika terjadi infeksi yang penting secara klinik biasanya disebabkan oleh E. coli. Tempat paling sering terkena infeksi adalah saluran kemih, saluran empedu, dan tempat lain di rongga perut. Ketika pertahanan normal inang menjadi tidak memadai yaitu pada bayi / lanjut usia, pada pasien stadium akhir, pada pasien pengguna obat imunosupressan, saat pemasangan kateter uretra/ infus vena, bakteri dapat bersifat patogen. Sifat patogennya dapat menyebabkan perempuan mengalami infeksi saluran kemih juga menyebabkan infeksi pada saluran intestinal karena E.coli mengeluarkan enterotoksin, menginvasi dan mengkolonisasi usus; juga menyebabkan infeksi nosokomial seperti sepsis dan meningitis (Jawetz, 1996). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16 E. coli penyebab yang lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90% wanita muda. E. coli sangat sering menyebabkan diare dan ditemukan di seluruh dunia khususnya pada bayi di negara berkembang (Jawetz dkk, 1996). 2. Enterococcus faecalis E.faecalis merupakan bakteri yang mempunyai sel berbentuk cocci, berantai pendek, tidak membentuk endospora, gram positif, termasuk fakultatif anaerob dan memfermentasi laktosa (Holt et al., 2000) E.faecalis yang bergenus Enterococcus merupakan flora normal dari gastrointestinal dan saluran kemih. Bakteri ini biasanya dapat menjadi penyebab penyakit pada manusia, dan penyakit tersebut dapat menjadi parah karena resisten terhadap antimikroba (Koneman et al., 1997). E.faecalis sering menyebabkan 8590% infeksi nokosomial. Tempat infeksi yang paling sering adalah saluran kemih, luka tusuk, saluran empedu dan darah (Jawetz dkk, 1996). Beberapa strain E.faecalis menghasilkan sitolisin (cytolysin) yang bertindak sebagai hemolisin yang menyerang eritrosit manusia. E.faecalis lebih sering diisolasi dari spesimen klinis manusia dan dari saluran gastrointestinal manusia. Bakteri ini lebih sering diisolasi yang menghubungkan dengan 80%-90% infeksi enterokokal manusia (Koneman et al., 1997). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17 F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri Pengujian potensi senyawa antibakteri dapat dilakukan dengan metode: 1. Metode difusi Metode difusi merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur daya hambat obat terhadap bakteri dengan cara mencampurkan biakan ke dalam agar cair dan membiarkannya hingga padat (Jawetz & Melnick, 1986) a) Metode Kirby Bouwer : Suspensi bakteri dengan konsentrasi tertentu dioleskan pada permukaan media hingga rata. Di atas media diletakkan paper disc yang mengandung bahan uji, kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 18-24 jam dan hasil dibaca dengan mengukur zona hambatan (Hugo & Russel, 1987; Anonim, 1992). b) Metode Sumuran : Penyiapan dilakukan seperti metode Kirby Bouwer. Setelah biakan siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus permukaan media. Ke dalam sumuran diteteskan larutan uji, lalu inkubasi 18-24 jam pada suhu 37 °C. Cara pembacaan hasil sama dengan cara Kirby (Hugo & Russel, 1987). Pengujian senyawa antibakteri dalam bentuk polimer sukar dan lambat berdifusi ke dalam agar (Hurst & Hoover, 1993). Menurut penelitian Riana (2001) pengujian daya hambat metabolit sekunder bakteri di dalam Susu Fermentasi Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi kurang efektif karena menurutnya metabolit sekunder bakteri terebut sukar berdifusi ke dalam media agar. c) Metode Paper Disc: Mula-mula 1 ml suspensi bakteri dicampur dengan 4 ml agar base 1,5 % pada temperatur 50°C kemudian dituang pada Mueller Hinton Agar PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18 dan dibiarkan membeku. Setelah itu letakkan disk dengan bahan uji di atasnya kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Hasil dibaca seperti cara Kirby Bouwer (Trihendrokesowo, 1986). 2. Metode dilusi Metode ini merupakan metode di mana sejumlah obat sebagai antibakteri dicampur dalam pembenihan mikrobia uji dalam bentuk cair/padat. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi mikrobia uji. Pada dilusi padat, setiap konsentrasi obat dicampurkan ke dalam media agar, setelah menjadi padat baru ditanami mikrobia uji dan setelah itu diinkubasi (Hugo & Russel,1987). Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi kemudian ditambahkan pada media yang mengandung bakteri uji sehingga hasil yang diperoleh adalah kekeruhan. Kekeruhan menunjukkan adanya daya hambat obat pada konsentrasi tersebut. Oleh karena itu, pada metode ini Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari obat tersebut dapat ditentukan. Ada tiga macam cara metode dilusi : a) Macro Broth Dilution. Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi pada 10 tabung kemudian ditambahkan ke dalam media cair yang telah diinokulasi dengan bakteri. Kemudian suspensi ini diinkubasi selama 15-16 jam pada suhu 35°C. Hasilnya dilihat dengan membaca kekeruhan pada masing-masing konsentrasi sehingga bisa menentukan MIC (Koneman et al, 1997). b) Micro Broth Dilution. Cara kerja yang digunakan sama dengan metode Macro Broth Dilution hanya tabung yang digunakan berbeda (Koneman et al, 1997). c) Agar Dilusi. Menggunakan satu seri plate agar, masing-masing mengandung konsentrasi senyawa antibakteri yang berbeda yang berkisar pada dosis PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19 terapeutik. Pembacaan hasil sama dengan metode Macro Broth Dilution (Koneman et al, 1997). 3. Metode turbidimetri Metode ini mengidentikkan pertumbuhan bakteri dengan kekeruhan yang diukur dengan spektrofotometer. Turbidimetri merupakan metode yang sangat cocok untuk mengevaluasi pengaruh senyawa antibakteri pada saat pertumbuhan. Kelemahan metode ini adalah hanya populasi yang terkecil (106 CFU/ml) yang dapat terdeteksi oleh spektrofotometer secara akurat. Oleh karena itu, metode turbidimetri tidak dapat digunakan untuk mendeteksi jumlah bakteri dan perubahan jumlah populasi bakteri yang rendah. Pengukuran jumlah bakteri yang kurang dari 106 CFU/ml dengan spektrofotometer tidak memberikan perubahan nilai Optical Density (OD) (Davidson & Parish, 1989) G. Keterangan Empiris Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat (BAL) yang dapat menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan. Salah satu produk susu fermentasi yang sudah beredar di Indonesia bahkan mancanegara adalah Yakult®. Produk ini mengandung bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dapat menghambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk (flora normal yang berpotensi patogen), seperti E.coli dan E.faecalis, yang mempunyai habitat di usus besar dan urogenital manusia. Untuk mengetahui potensi antibakteri dan daya hambat dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli dan E.faecalis, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20 maka perlu dilakukan pengujian potensi antibakteri senyawa tersebut dengan metode difusi paper disc dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk. Tetapi sebelum itu, bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diisolasi dan diidentifikasi terlebih dahulu. Data yang diperoleh dari identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® berupa data morfologi koloni, morfologi sel dan sifat biokimia. Data uji potensi dan identifikasi dianalisis secara deskriptif dan dilengkapi dengan gambar mikrofotografi dan foto. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan data hasil identifikasi (morfologi koloni, morfologi sel, uji biokimia) dengan menggunakan buku pedoman baku determinasi bakteri (Holt et al, 2000) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21 Isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate Isolat biakan murni bakteri dalam susu fermentasi Yakult® Identifikasi Isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® Morfologi sel : 1. bentuk sel 2. rangkaian sel 3. pergerakan bakteri 4. sifat gram 5. ada/tidaknya spora 6. sifat acid fast Morfologi koloni : Pertumbuhan bakteri dalam : 1. media MRS agar miring, 2. media MRS agar tegak, 3. media MRS agar plate, 4. media MRS cair Uji biokimia : 1. test katalase 2. test oksidase 3. test OF tanpa dan dengan parafin 4. penggunaan sitrat 5. test dekarboksilase lisin 6. test hidrolisis gelatin 7. test pembentukan H2S 8. test Indol 9. test MR 10. test VP Determinasi isolat bakteri berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al., 2000) Genus isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® Isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult® Pengujian potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan metode difusi paper disk Gambar 1. Skema Kerja Penelitian PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel bebas : Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®. b. Variabel tergantung : Diameter zona hambat yang terbentuk. c. Variabel pengacau terkendali : Media penanaman dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® yaitu MRS (de Man Rogosa Sharpe), media penanaman dan identifikasi Escherichia coli dan Enterococcus faecalis yaitu Nutrien Agar dan Nutrien Broth, suhu inkubasi 37°C, waktu inkubasi 24 jam, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mac Farland II (6 x 108 CFU/ml), diameter paper disc 6 mm, volume suspensi bakteri uji (1 ml), volume senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® yang diujikan pada bakteri uji E. coli dan E. faecalis (10 ml). 22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23 2. Definisi operasional a. Potensi antibakteri adalah kemampuan senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri uji E. coli dan E. faecalis dengan menunjukkan diameter zona hambat yang lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol negatif b. Yakult® adalah suatu produk susu fermentasi yang mengandung bakteri asam laktat, sukrosa dan susu skim. Konsistensinya berbentuk cair dan dikemas di dalam botol plastik bervolume 75 ml. Produk ini berasal dari Jepang dan telah diproduksi dan dipasarkan di banyak negara termasuk Indonesia. c. Escherichia coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta. d. Enterococcus faecalis ATCC 33816 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta. e. Senyawa antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri uji E. coli dan E. faecalis. f. Zona hambat adalah zona jernih bakteri uji yaitu E. coli dan E. faecalis di sekitar paper disc yang telah diinokulasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat. g. Media MRS (de Man Rogosa Sharpe) (Oxoid) adalah media untuk memacu pertumbuhan dan mengidentifikasi bakteri asam laktat yaitu bakteri yang menghasilkan produk akhir berupa asam laktat dari hasil metabolisme karbohidrat secara fermentasi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 C. Bahan dan Alat 1. Bahan penelitian a. Yakult® (produksi PT Yakult Indonesia Persada Sukabumi), b. Media pertumbuhan dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® adalah MRS (de Man Rogosa Sharpe) (Oxoid) dengan komposisi (g/l) : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05. c. Biakan murni bakteri uji : Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USD dan Enterococcus faecalis ATCC 33816 dari Balai Kesehatan Yogyakarta. d. Media pertumbuhan dan identifikasi biakan murni bakteri uji adalah NA (Nutrient Agar) (Oxoid) dengan takaran 28 g/L dengan komposisi (g/l) : “lablemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5; agar 15 dan NB (Nutrient Broth) dengan takaran 37 g/L dengan komposisi (g/l) : “lablemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5. e. Bahan untuk uji identifikasi morfologi sel : 1) Gerakan bakteri metode tusukan : media agar semi solid (0,2-0,4 % agar) 2) Pengecatan a) Pengecatan gram : kristal violet (gram A), iodine (gram B), alcohol 96 % (gram C), safranin (gram D) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25 b) Pengecatan acid fast : Ziehl Neelson carbolfuchsin, methylen blue, alcohol 96 %, c) f. Pengecatan spora : malachite green 5%, safranin Bahan untuk uji identifikasi morfologi koloni: 1) Medium Cair : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Broth (Oxoid) 2) Medium Agar : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Agar (Oxoid) g. Bahan untuk tes biokimia : 1) Uji oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine 2) Uji katalase : reagens hidrogen peroksida 3) Uji fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco) 4) Uji sitrat : medium Simmon’s citrate (Difco) 5) Uji dekarboksilase lisin : medium LIA (Lysin Iron Agar) (Oxoid) 6) Uji hidrolisis gelatin : Nutrient Broth (Oxoid ) dan 12 % gelatin 7) Uji hidrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Oxoid) 8) Uji indol : medium triptone water dengan reagen Kovac 9) Uji MRVP : medium MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer) (Oxoid), methyl red, larutan nafto 5 % dan KOH 40 % h. Larutan standar Mc Farland II (6 x 108 CFU/ml) i. Aquadest steril j. Kontrol positif : Penicillin (paper disc) k. Kontrol negatif : Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri l. Paper disc steril berdiameter 6 mm PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 26 2. Alat penelitian Autoklaf (ALP Co.Ltd), Microbiological Safety Cabinet, Centrifuge (Heraust Christ), Filter bakteri 0,2 μm (Millipore), Jangka sorong, Mikropipet (Nichiryo 5000 DG), Inkubator (WTB Binder, Memert), Oven (WTC Binder), Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30), Shaker (Stuart Scientific), Jarum ose, Jarum inokulasi, Alat-alat gelas (Pyrex). D. Tata Cara Penelitian 1. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteri dari susu fermentasi Yakult® dilakukan dengan metode streak plate. Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 2 hari pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, akan terlihat koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni diharapkan berasal dari satu sel bakteri dan terdiri dari satu spesies bakteri. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya. 2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Bakteri dari susu fermentasi Yakult® diidentifikasi dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni dan uji biokimia. a. Pengamatan morfologi sel meliputi pergerakan bakteri dengan metode tusukan, dan pengecatan bakteri yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast, pengecatan spora, dan pengecatan dinding sel. 1) Pergerakan bakteri : Metode Tusukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 Biakan bakteri diinokulasikan pada media agar semi solid (0,2-0,4 % agar) yang telah steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. 2) Pengecatan bakteri a) Pengecatan gram Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® di atas obyek gelas, lalu difiksasi dengan api. Pulasan tersebut ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir untuk membuang sisa cat. Larutan iodin diteteskan ke atas pulasan tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol sebagai larutan peluntur. Pulasan tersebut dicuci dengan air mengalir lagi dan diberi larutan safranin. Langkah berikutnya pulasan yang telah diberi safranin tersebut dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan mengering. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X menggunakan minyak emersi. Pada pengamatan sifat gram, apabila warna sel adalah violet, menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif. Namun, sebaliknya bila warna merah yang terjadi, berarti bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. b) Pengecatan acid fast Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® di atas obyek gelas dan memfiksasinya di atas pembakar spiritus. Kemudian ditutup dengan sepotong kertas filter, lalu larutan carbolfuchsin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 ditambahkan di atasnya. Setelah itu, dipanaskan di atas api spiritus dengan nyala kecil dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, obyek gelas didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dianginanginkan. Dicuci dengan alkohol 96 % sambil digoyang-goyangkan sampai seluruhnya tidak tampak. Sesudah itu, dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan. Methylen biru dibubuhkan di atas obyek gelas dan didiamkan selama 20-30 detik. Dicuci, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat sampai 1000X menggunakan minyak emersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah, sedangkan yang non acid fast berwarna biru. c) Pengecatan spora Pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® dibuat di atas obyek gelas dan difiksasi dengan api. Setelah itu, malachite green diteteskan ke atas pulasan tersebut dan dipanaskan kembali selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi cat safranin selama 30-40 detik. Berikutnya dicuci dengan air mengalir kembali dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X. Sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau. b. Pengamatan morfologi koloni. 1) Penanaman pada medium MRS agar tegak Medium MRS agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dasar tabung. Kemudian diinkubasi pada temperatur 37°C selama 48 jam. Setelah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29 itu, dilakukan pengamatan pertumbuhan pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan. 2) Penanaman pada medium MRS agar miring Medium MRS agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan lurus. Lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, topografi, warna chromogenesis, bau, konsistensi dan warna medium. 3) Penanaman pada medium MRS cair Medium MRS cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan, bau dan endapan. 4) Penanaman pada medium MRS agar Medium MRS agar pada cawan petri diinokulasi secara goresan dengan biakan bakteri menggunakan jarum ose. Sesudah itu, diinkubasi selama 48 jam pada temperatur 37°C selama 48 jam. Pertumbuhan, bentuk koloni, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan struktur dalamnya akan diamati setelah terbentuk koloni pada permukaan agar cawan petri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30 c. Uji biokimia 1) Uji katalase Satu atau dua ose isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth sebanyak 5 ml lalu H2O2 3% diteteskan ke dalamnya. Bila terbentuk gelembung gas O2 berarti katalase positif, sedangkan sebaliknya bila tidak ada gelembung atau buih berarti katalase negatif. 2) Uji oksidase Larutan tetramethyl-paraphenyldiamine diteteskan pada kertas saring. Satu ose dari kultur bakteri diletakkan pada kertas saring tersebut, kemudian diamati hasilnya. Reaksi positif terjadi apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit. Hal ini berarti bakteri tersebut memiliki enzim oksidase sitokrom. Sebaliknya bila tidak terjadi perubahan warna, berarti sebagai reaksi negatif. 3) Uji oksidasi fermentasi (O-F) Medium O-F yang mengandung glukosa diisikan ke dalam 4 tabung reaksi. Dua di antaranya diinokulasi dengan kultur isolat bakteri umur 24 jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Sedangkan dua yang lain berfungsi sebagai kontrol (tanpa inokulasi isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult®) Salah satu dari 2 tabung yang sudah diinokulasi tersebut ditetesi parafin, sedangkan yang lain tidak. Lalu keempat tabung itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Setelah 48 jam, hasilnya diamati dengan melihat perubahan warna pada medium O-F. Warna asal medium O-F adalah hijau PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 dan bila medium yang ditutupi parafin berubah warna menjadi kuning berarti bakteri tersebut memetabolisme karbohidrat secara fermentatif, sedangkan untuk yang tidak ditutupi parafin bila mediumnya berubah warna menjadi kuning berarti bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara oksidatif 4) Uji sitrat Satu tabung medium Simmon’s citrate yang berbentuk agar miring diinokulasi dengan satu ose kultur bakteri secara goresan. Untuk kontrol disiapkan juga satu tabung medium Simmon’s citrate tanpa inokulasi bakteri. Kemudian keduanya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Hasil yang diperoleh bila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. 5) Uji dekarboksilase lisin Tabung berisi medium LIA (Lysin Iron Agar) diinokulasi dengan kultur isolat bakteri secara tusukan dan juga dibuat kontrol (medium Lysin Iron Agar tanpa inokulasi bakteri) dibuat juga sebagai pembanding. Setelah itu, kedua tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan 48 jam. Bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan setelah 48 jam berwarna ungu kembali, berarti reaksi tersebut positf. Perubahan warna menjadi kuning menandakan bahwa bakteri melakukan fermentasi dan dekarboksilasi. berwarna ungu kembali berarti lisin mengalami PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32 6) Uji hidrolisis gelatin Kultur bakteri diinokulasikan secara tusukan pada media dengan komposisi nutrient broth 13 g/L, gelatin 12 % dan agar 0,3 %. Kontrol yang berisi medium tanpa inokulasi bakteri juga dibuat untuk pembanding. Lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Pada saat pengamatan, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Terjadinya pencairan gelatin dibandingkan dengan kontrol membuktikan bahwa bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase. 7) Uji pembentukan H2S Kultur isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® diinokulasikan ke dalam medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) miring secara goresan dan tusukan. Untuk kontrol adalah medium TSIA tanpa inokulasi bakteri. Empat puluh delapan jam dan 37°C sebagai waktu dan suhu inkubasi uji tersebut. Terbentuknya endapan hitam pada bekas inokulasi menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase. Bila bagian slant berwarna kuning dan butt berwarna merah, menunjukkan bahwa glukosa difermentasikan, sedangkan bila seluruh medium (slant dan butt) berwarna kuning, maka artinya laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan. Kalau ada pembentukan gas pada bagian butt dan medium kadangkala terpecah, berarti ada pembentukan gas H2 dan CO2. Sebaliknya, apabila glukosa, laktosa dan sukrosa tidak difermentasikan, pada bagian slant dan butt akan berwarna merah. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 33 8) Uji pembentukan indol Satu ose kultur bakteri diinokulasikan ke dalam satu tabung medium tripton water dan kemudian diinkubasi selama 48 jam dan suhu 37°C. Satu tabung medium pepton water yang lain digunakan untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37°C. Reagen Kovac ditambahkan ke dalamnya setelah inkubasi. Bila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium maka itu berarti hasilnya positif. Reaksi ini menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian gugus indol dari triptofan sehingga indol akan menumpuk dalam medium biakan sebagai produk buangan. 9) Uji MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer) Kultur isolat bakteri diinokulasi dengan jarum inokulasi pada dua tabung yang berisi medium MR-VP. Dua tabung berisi medium yang sama untuk kontrol. Lalu diinkubasi selama 48 jam dan pada temperatur 37°C. Kemudian ditambah reagen methyl red pada dua tabung medium MR-VP (yang satu kontrol), sedangkan dua tabung yang lain (satunya kontrol) ditambah 40% KOH dan 5% larutan α-naphtol. Hasil yang terjadi bila ada perubahan warna menjadi kuning pada uji MR, bakteri tersebut tidak dapat memfermentasikan glukosa. Sebaliknya bila tetap berwarna merah, terjadi fermentasi glukosa. Sedangkan bila ada perubahan warna menjadi merah muda pada uji VR, menandakan bahwa bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34 3. Isolasi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Beberapa ose kultur isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diinokulasi ke dalam medium MRS cair sebanyak 100 ml di dalam erlenmeyer. Lalu diinkubasi selama 3-4 hari pada suhu 37°C dan dilakukan penggojogan berkecepatan 170 rpm di dalam shaker inkubator. Setelah itu disentrifugasi menggunakan sentrifuge yang berkecepatan 5000 rpm selama 1 jam supaya ada pemisahan senyawa penghambat dari biomassa sel yang mengendap. Supernatan disterilisasi dengan filter bakteri steril diameter 0,2 μm sehingga diperoleh metabolit sekunder yang dihasilkan Lactobacillus sp. 4. Pengujian Potensi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc a. Pembuatan suspensi bakteri uji Bakteri uji diinokulasikan pada medium NB (Nutrient Broth) dan diinkubasi selama 1-2 hari. Setelah itu, bakteri uji yang tumbuh di medium NB tersebut disuspensikan ke dalam Nutrient Broth steril sampai kekeruhannya setara dengan larutan standard Mac Farland II (6 x 108 CFU/ml). b. Pembiakan bakteri uji secara pour plate. Nutrien agar steril yang bersuhu 40-50°C masing-masing diinokulasi dengan 1 ml suspensi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis umur 24 jam. Kemudian media yang berisi biakan tersebut dituang ke dalam cawan petri steril digoyang sampai homogen dan dibiarkan memadat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35 c. Pengujian potensi antibakteri dengan metode difusi menggunakan paper disc. Supernatan disiapkan sebanyak 10 ml (yang diperoleh pada tahap 3) di dalam tabung reaksi steril. Kemudian paper disc diambil dengan pinset steril dan dicelupkan selama 10 detik ke dalam supernatan tersebut. Paper disc tersebut dikeringanginkan pada gelas arloji steril untuk menghilangkan ekses air selama 1-2 jam. Paper disc ditempatkan di permukaan medium agar yang telah mengandung bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu, diinkubasi selama 1-2 hari atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc pada suhu 37ºC. Perlakuan ini dibuat agar senyawa antibakteri mempunyai waktu untuk berdifusi ke dalam agar yang telah diinokulasi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disc diukur dengan penggaris. E. Analisis Hasil Data uji potensi antibakteri oleh senyawa yang dihasilkan oleh bakteri diperoleh dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disc dengan menggunakan penggaris. Selain itu juga mengidentifikasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni, dan uji sifat biokimia. Data identifikasi dicocokkan dengan panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000). Hasil pengamatan uji potensi dan identifikasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dideskripsikan dengan foto dan gambar mikrofotografi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN A. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteri berguna untuk memisahkan bakteri dari lingkungannya dan untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya. Teknik isolasi bakteri yaitu teknik penggoresan agar (streak plate), teknik agar tuang (pour plate) dan teknik agar sebar (spread plate) (Lay, 1994). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode streak plate yang merupakan teknik penggoresan agar. Dasar metode streak plate adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam petridish. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi akan terlihat koloni yang terpisah-pisah yang merupakan biakan murni. Biakan murni adalah bakteri yang terdiri dari satu spesies dan berasal dari perbanyakan satu sel bakteri (Jutono dkk, 1980). Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya. Media yang digunakan untuk isolasi bakteri asam laktat dalam susu fermentasi Yakult® adalah media MRS (de Man Rogosa Sharpe) karena media ini digunakan untuk pertumbuhan dan identifikasi bakteri asam laktat yang diduga terdapat dalam susu fermentasi Yakult®. MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l) 36 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37 sebagai berikut : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05 (lampiran 1). Dari komposisinya, media MRS merupakan media yang diperkaya. Menurut Jutono dkk (1980), media yang diperkaya adalah media yang ditambah zat-zat tertentu sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof (memperoleh makanan dan energi dari sumber organik) tertentu. Media merupakan nutrien yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Pada susu fermentasi Yakult®, media yang digunakan adalah susu dengan komposisi sbb: air (sekitar 87 %), casein /protein (2,5 %), laktosa /karbohidrat (5 %), lemak (4 %), sisanya lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997). Pada penelitian ini menggunakan media MRS karena media ini mempunyai komponen yang menyerupai komponen susu seperti protein (pepton), karbohidrat (glukosa) dan lemak (lab-lemco powder). Oleh karena itu bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dapat tumbuh, diisolasi dan menghasilkan senyawa sebagai hasil fermentasi dengan menggunakan media MRS. Pada permukaan media MRS Agar, digoreskan satu ose Yakult® kemudian diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C. Waktu inkubasi 48 jam dipilih karena waktu tersebut cukup bagi bakteri untuk tumbuh dan membentuk koloni. Suhu 37°C ditetapkan karena bakteri tersebut berhabitat dalam tubuh manusia (di dalam usus) maka bakteri itu termasuk bakteri mesofil yang mempunyai suhu optimal pertumbuhan yang mendekati suhu tubuh manusia. Hal ini dapat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 38 meningkatkan pertumbuhan mikroba secara maksimal sehingga dengan cepat akan terbentuk koloni pada permukaan agar di cawan petri. Setelah diinkubasi 48 jam, tumbuh koloni-koloni mikroba yang terbentuk sepanjang goresan pada permukaan agar (Lampiran 2). Koloni hasil streak plate berbentuk circular (bulat), permukaannya licin, elevasinya convex (cembung), bentuk tepinya entire (rata), warnanya putih. Isolat bakteri ini akan digunakan untuk identifikasi dan determinasi serta pengujian potensi antibakterinya terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® Identifikasi mikroba digunakan untuk mengidentifikasi suatu organisme (genus) di alam dengan menggunakan semua sifat yang berkaitan dengan genus yaitu (1) ukuran, bentuk dan susunan organisme; (2) reaksi pewarnaan gram; (3) tipe flagela; (4) ukuran keseluruhan dan penampilan koloni bakteri; serta (5) informasi biokimia. Determinasi mikroba bertujuan untuk menetapkan genus suatu mikroba yang sudah diidentifikasi dengan menggunakan buku acuan sistem klasifikasi dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology yang merupakan kunci bagi identifikasi dan determinasi mikroba (Volk & Wheeler, 1988). 1. Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Morfologi sel dilakukan dengan cara pengecatan dan pengamatan motilitas untuk melihat struktur sel mikroba. Ada tiga pengecatan yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast dan pengecatan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39 spora, kemudian dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat. Morfologi sel penting dilakukan untuk mengetahui ukuran, bentuk, dan rangkaian selnya; ada tidaknya spora; ada tidaknya flagela; sifat gram dan sifat tahan asam (acid fast) sehingga dapat mengetahui struktur selnya. a. Pengecatan gram Pengecatan gram digunakan untuk membedakan bakteri yang bersifat gram positif dan gram negatif. Pengecatan gram ini dilakukan dengan melalui 4 tahapan yaitu pemberian cat utama (larutan crystal violet), pengintensifan cat utama dengan menambahkan larutan mordan, pencucian dengan larutan peluntur (alkohol), dan pemberian cat penutup (cat lawan) larutan safranin. Sifat gram terutama ditentukan oleh sifat fisik dan kimia dinding sel dan membran sitoplasmanya. Dinding sel membran sitoplasma bakteri gram positif mempunyai afinitas terhadap crystal violet sedangkan bakteri gram negatif afinitasnya sangat kecil (Jutono dkk, 1980). Hal ini disebabkan adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positif dan gram negatif sehingga ada perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positif terdiri dari peptidoglikan sedangkan dinding sel bakteri gram negatif mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram positif. Lipida ini akan larut dalam alkohol dan aseton akan digunakan sebagai larutan pemucat sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan daya larut kompleks kristal violet yodium pada dinding sel PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40 bakteri gram negatif. Pada bakteri gram positif akan terbentuk persenyawaan kompleks kristal violet yodium ribonukeat yang tidak larut dalam larutan pemucat. Persenyawaan kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri gram negatif sehingga diduga adanya perbedaan kandungan asam ribonukleat antara bakteri gram positif dan gram negatif (Lay, 1994). Pada waktu pengecatan, larutan crystal violet menembus sel bakteri gram positif maupun sel bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif, zat ini membentuk senyawa yang sukar larut dalam cat peluntur (alkohol). Hal ini tidak terjadi pada sel bakteri gram negatif, akibatnya crystal violet dapat dilunturkan. Pada pemberian cat safranin, sel bakteri gram positif tidak dapat diwarnai, sedangkan sel bakteri gram negatif dapat diwarnai (Jutono dkk, 1980). Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif tampak berwarna biru/ ungu. Pada bakteri gram negatif, bakteri ini tidak mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga dapat dilunturkan dengan cat peluntur (alkohol) dan diwarnai oleh cat lawan (safranin). Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri gram negatif tampak berwarna merah (Jutono dkk, 1980). Perbedaan pewarnaan ini disebabkan dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan dinding sel bakteri gram negatif; kompleks zat pewarna yodium terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan kompleks zat pewarna yodium dapat disingkirkan dari sel (Volk & Wheller, 1988). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41 2 1 3 Gambar 2. Hasil Pengecatan Gram Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®. Perbesaran kuat. Keterangan gambar: 1. Sel berwarna biru (sifat gram positif) 2. Sel berbentuk batang panjang (bacill) 3. Rangkaian sel berantai pendek Pada hasil pengecatan gram, bakteri yang terdapat dalam susu fermentasi Yakult® bersifat gram positif. Hal ini dapat dilihat dengan terbentuknya warna biru pada pengecatan gram tersebut. Jadi bakteri ini memiliki afinitas terhadap crystal violet pada dinding selnya sehingga bakteri tidak dapat didekolorisasi dengan alkohol dan tidak dapat diwarnai oleh safranin. b. Pengecatan acid fast Pengecatan acid fast termasuk pengecatan diferensial karena dapat membedakan bakteri-bakteri yang acid fast (tahan terhadap pencucian asam) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42 dan yang non acid fast (tidak tahan terhadap pencucian asam). Fuchsin yang berwarna merah lebih mudah larut dalam fenol daripada dalam air atau alkohol asam dan fenol lebih mudah larut dalam lemak atau lilin daripada dalam air. Bakteri acid fast yang banyak mengandung lemak dan lilin dalam keadaaan panas sangat mudah menyerap basic fuchsin yang larut dalam fenol. Pada pencucian, basic fuchsin dan fenol sangat tahan terhadap zat pencuci (Jutono dkk, 1980). Bakteri tahan asam (acid fast) dapat mempertahankan cat warna pertama yaitu carbol fuchsin sewaktu dicuci dengan larutan pemucat yang mengandung asam dan alkohol. Bakteri tahan asam (acid fast) akan terlihat merah. Sebaliknya pada bakteri yang non acid fast, larutan pemucat akan melarutkan cat warna pertama sehingga bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan cat warna kedua yaitu metylen blue, bakteri yang tidak tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43 1 Gambar 3. Hasil Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®. Perbesaran kuat. Keterangan gambar: 1. Bakteri berwarna biru (sifat non acid fast) Dari hasil yang diperoleh bakteri yang terkandung dalam susu fermentasi Yakult® berwarna biru sehingga bakteri tersebut merupakan bakteri tidak tahan asam (non acid fast). Jadi bakteri itu tidak mempunyai lemak dan lilin pada dinding selnya sehingga tidak mudah menyerap carbol fuchsin. Cat warna carbol fuchsin akan dilarutkan oleh larutan pemucat (alkohol) sehingga sel bakteri menjadi tidak berwarna. Warna biru terbentuk saat penambahan metylen blue, sehingga sel bakteri yang tidak berwarna menjadi terwarnai oleh cat biru dari methylen blue. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 c. Pengecatan spora Adanya spora dapat ditunjukkan dengan pengecatan spora. Dengan pengecatan tersebut bagian terluar spora tampak seperti cincin kecil berwarna hijau. Tidak semua bakteri membentuk spora. Bakteri dapat membentuk satu spora dalam sel vegetatifnya. Diameter spora dapat lebih kecil atau lebih besar daripada sel vegetatifnya. Letak spora bakteri dapat sentral (di tengah sel), terminal (pada ujung sel) atau sub terminal (parasentral) jika spora terletak di antara tengah-tengah dari ujung sel (Jutono dkk, 1980). Pengecatan spora dalam penelitian ini menggunakan metode pengecatan Schaeffer-Fulton sehingga cat utama yang digunakan untuk membedakan warna spora adalah malachite green. Pada akhir pengecatan, adanya spora dalam sel bakteri akan ditentukan dari warna hijau yang tampak. Pada waktu pengecatan, preparat ulas diberi malachite green dan dipanaskan. Pada bakteri yang berspora, panas ini akan mengembangkan lapisan luar spora sehingga zat warna hijau malachite green dapat masuk ke dalam spora. Setelah dingin warna hijau akan terperangkap di dalam spora kembali. Setelah itu dicuci dengan air mengalir yang bertujuan agar warna malachite green pada sel vegetatif akan tercuci sedangkan pada sel yang berspora, malachite green-nya tidak dapat tercuci. Pada tahap ini spora berwarna hijau sedangkan sel vegetatif tidak berwarna. Pemberian cat safranin membuat sel vegetatif akan berwarna merah sedangkan spora akan berwarna hijau karena safranin yang bersifat basa tidak dapat masuk ke dalam spora (Lay, 1994). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45 1 Gambar 4. Hasil Pengecatan Spora Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Perbesaran kuat. Keterangan gambar: 1. Sel vegetatif berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tidak berspora Dari hasil pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat, sel bakteri yang terkandung dalam susu fermentasi Yakult® menunjukkan warna merah yang tampak sebagai sel vegetatif. Saat penambahan cat utama, sel bakteri tersebut tidak dapat mengikat zat warna malachite green dan pada waktu pencucian, malachite green dapat tercuci oleh air sehingga sel bakteri ini menjadi tidak berwarna. Setelah penambahan safranin, sel bakteri terwarnai oleh cat merah dari safranin sehingga menjadi berwarna merah. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 46 d. Uji pergerakan bakteri Uji pergerakan bakteri ini bertujuan untuk menentukan apakah suatu organisme motil atau tidak. Organisme yang motil biasa disebut organisme yang berflagella. Bakteri yang non motil tidak memiliki flagella. Pada uji pergerakan bakteri ini menggunakan metode tusukan pada media semi solid agar. Media semi solid agar mengandung agar 0,3 %. Kandungan agar 0,2-0,4 % bertujuan supaya tidak mengganggu pergerakan bakteri. Hasil positif akan menunjukkan jika organisme tumbuh menyeluruh dalam media dan media tampak lebih keruh karena terjadi pergerakan bakteri mengarah keluar dari garis inokulasi, sedangkan hasil negatif menunjukkan adanya pertumbuhan hanya pada garis inokulasi saja dan pertumbuhannya tampak jelas. Pada penelitian terhadap isolat bakteri dari susu fermentasi menunjukkan tidak adanya pergerakan bakteri (non motil). Jadi bakteri ini tidak mempunyai flagella untuk bergerak (Lampiran 3 ). Tabel II. Hasil Morfologi Sel Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Morfologi Sel Sifat Gram Sifat Acid-Fast Ada Tidaknya Spora Bentuk sel & Rangkaian sel Motilitas Hasil Percobaan Gram Positif Non Acid Fast Non spora Batang panjang & Berantai pendek Non Motil 2. Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Morfologi koloni digunakan untuk mengidentifikasi koloni, meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni dan sebagainya pada beberapa tipe media (Jutono dkk, 1980). Media yang digunakan adalah MRS (Man Rogosa Sharpe). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 47 Menurut Bridson (1998) MRS merupakan media yang digunakan untuk penanaman dan pertumbuhan bakteri asam laktat. a. Penanaman pada medium MRS (Man Rogosa Sharpe) agar tegak Medium agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan ke dalam tabung, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Pertumbuhan diamati pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan (Jutono dkk, 1980). Pertumbuhan bakteri dalam medium MRS agar tegak mengikuti arah tusukan dengan pertumbuhan yang lebat dari permukaan tabung sampai dasar tabung dan berbentuk filliform (merata pada bekas inokulasi), serta bagian permukaannya melebar (Lampiran 4). b. Penanaman pada Medium MRS agar miring Medium agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan yang lurus, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, konsistensi dan warna medium. (Jutono dkk, 1980). Pengamatan bakteri pada media MRS agar miring menunjukkan bentuk koloni rata sepanjang garis inokulasi, berwarna putih, pertumbuhannya tebal, permukaan licin, elevasinya cembung (conveks), tidak mengkilat, tidak tembus cahaya, dan warna mediumnya tetap coklat (Lampiran 5). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 c. Penanaman pada medium MRS broth Medium cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan ose, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan dan endapan (Jutono dkk, 1980). Pada medium cair yang diinokulasi bakteri dapat digunakan untuk mengetahui kebutuhan oksigen bakteri. Bakteri yang tumbuh pada permukaan medium disebut bakteri aerob; kalau tumbuh keseluruhan antara permukaan dan dasar medium cair disebut bakteri fakultatif anaerob; kalau pertumbuhan bakteri hanya terdapat pada dasar medium saja disebut bakteri anaerob (Berkey, 1994). Pada pengamatan bakteri pada medium MRS Cair terlihat bakteri tumbuh pada permukaan, tidak membentuk selaput, sangat keruh, dan banyak endapannya seperti butiran halus. Berdasarkan kebutuhan terhadap oksigen, bakteri tersebut termasuk bakteri yang bersifat fakultatif anaerob (Lampiran 6). d. Penanaman pada medium MRS agar plate Tujuan identifikasi menggunakan medium MRS agar plate adalah untuk mengamati koloni bakteri yang telah diisolasi dalam susu fermentasi Yakult® supaya dapat diketahui genus bakteri tersebut dan dideterminasi dengan buku panduan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Setelah terbentuk koloni pada permukaan agar cawan petri, maka dilakukan pengamatan pada pertumbuhan, bentuk, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan struktur dalam koloni (Jutono dkk, 1980). Menurut Holt et al., (2000) koloni PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49 Lactobacillus pada media agar plate biasanya berukuran 2-5 mm, konveks (cembung), entire (rata), opaque (tidak dapat ditembus cahaya), dan tanpa pigmen. Pada hasil pengamatan diketahui bahwa permukaan medium MRS agar plate terdapat koloni bakteri (hasil isolasi dari susu fermentasi Yakult®) yang berbentuk circular (bulat/ lingkaran), permukaannya licin, elevasi convex (cembung), bentuk tepi entire (rata), dan bentuk struktur dalamnya opaque (tidak dapat tembus cahaya) (Lampiran 7). Tabel III. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Medium Pertumbuhan Koloni Sifat Morfologi Koloni yang diamati Medium MRS Agar Tegak Pertumbuhan Bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan Pertumbuhan Bentuk pertumbuhan pada bekas goresan Elevasi Kilat (luster) Topografi Ciri-ciri optik Medium MRS Agar Miring Medium MRS Cair Pertumbuhan pada permukaan Kekeruhan Endapan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Merata Filiform (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi merata) Lebat Filiform Morfologi Koloni Lactobacillus sp. menurut Holt et al (2000) Convex (cembung) Tidak mengkilat Licin tidak teratur Opaque (tidak dapat ditembus cahaya) Tidak membentuk selaput Sangat keruh - Banyak, butiran halus - - - - PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50 Medium MRS Agar Plate Pertumbuhan Bentuk koloni Permukaannya Elevasi Bentuk tepi Bentuk struktur dalam Tumbuh koloni di permukaan Circular (bulat) Smooth (licin) Convex Entire (rata) Opaque Convex Entire (rata) Opaque 3. Uji biokimia isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® Uji biokimia bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat biokimianya yaitu : kemampuan bakteri untuk menghasilkan enzim yang dapat dideteksi dengan reagen sederhana, kemampuan bakteri untuk memetabolisme gula atau melakukan reaksi fermentasi, dan kemampuan bakteri untuk menggunakan substrat (glukosa, laktosa, sukrosa) untuk pertumbuhan. a. Uji katalase Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dapat mereduksi H2O2 menjadi H2O dan O2. Uji katalase dilakukan dengan menambahkan 1 tetes pereaksi H2O2 pada tabung reaksi yang berisi medium NB (Nutrien Broth) yang telah diinokulasi dengan bakteri. Uji ini akan bersifat positif bila terbentuk gelembung gas O2 pada medium yang mengandung bakteri tersebut setelah didiamkan beberapa detik (Jutono dkk, 1980 ). Mekanisme reaksi dari uji katalase adalah: (Lay, 1994) enzim katalase H2O2 H2O + ½ O2 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51 Dari hasil uji katalase terhadap bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, bakteri tidak membentuk gelembung gas. Hal ini menandakan bahwa uji katalase bakteri bersifat negatif yang berarti bakteri tidak dapat menghasilkan enzim katalase yang mampu mengkatalisis penguraian H2O2 menjadi H2O dan O2. b. Uji oksidase Uji ini dilakukan dengan menambahkan larutan tetramethylparaphenyldiamine pada kultur bakteri yang digoreskan pada kertas saring. Hal ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri memiliki enzim oksidase sitokrom yang dapat mengoksidasi larutan reagens membentuk indofenol ungu. Apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit berarti reaksi tersebut positif (Lay, 1994). Pada hasil pengamatan terhadap isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, hasil menunjukkan terbentuknya warna ungu tua pada permukaan kertas saring yang berisi bakteri dan reagen tetramethyl paraphenyldiamin yang berarti isolat bakteri bereaksi positif terhadap uji oksidase. Hal ini menandakan bahwa bakteri memiliki enzim oksidase sitokrom yang dapat mengoksidasi larutan reagens sehingga membentuk indofenol ungu (Lampiran 8). c. Uji oksidasi fermentasi (O-F) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52 Tujuan uji ini untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan karbohidrat secara fermentatif dan atau secara oksidatif. Bakteri disebut fermentatif kalau pada media yang ditutup parafin terjadi perubahan dari warna hijau menjadi kuning, sebaliknya bila pada media yang tidak ditutup parafin warna hijau medianya berubah menjadi kuning maka bakteri bersifat oksidatif. Perubahan warna ini terjadi karena ada pembentukan asam yang dihasilkan dari fermentasi ataupun oksidasi glukosa. Asam yang terbentuk ini akan menurunkan pH media dan mengubah warna indikator menjadi kuning. Jika bakteri tidak dapat memfermentasi atau mengoksidasi glukosa maka warna indikator tidak berubah (Lay, 1994). Hasil pengamatan pada media OF dan glukosa yang diinokulasi bakteri tanpa parafin adalah berwarna kuning sedangkan media yang ditutup parafin juga berwarna kuning. Jadi bakteri dapat mengoksidasi dan memfermentasi glukosa sehingga hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat fakultatif anaerob (Lampiran 9 dan 10). d. Uji sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Medium yang digunakan adalah media Simmon’s citrate berbentuk agar miring. Bila bakteri dapat menggunakan sitrat, asam akan dihilangkan dari medium biakan sehingga menyebabkan media menjadi basa dan mengubah warna media dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53 bahwa bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon (Lay, 1994). Pada pengamatan uji ini, isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satumya sumber karbon, ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru (Lampiran 11). e. Uji dekarboksilase lisin Uji ini mempunyai tujuan untuk mengetahui apakah bakteri dapat mendekarboksilase asam amino menghasilkan CO2. Proses dekarboksilasi asam amino lazimnya menghasilkan CO2 dan dapat menetralisasikan lingkungan asam. Hal ini disebabkan enzim dekarboksilase menghilangkan gugus asam dari asam amino dan menghasilkan amina yang membuat media bersifat basa. Proses perubahan warna akan bersifat positif bila terjadi perubahan warna media ungu menjadi kuning dan menjadi ungu kembali akibat pembentukan basa amin (Lay, 1994). Pada pengamatan menunjukkan bahwa bakteri tidak dapat mendekarboksilase asam amino, dapat dilihat dari hasil yaitu terjadi perubahan warna dari ungu menjadi warna kuning dan setelah itu tidak kembali menjadi warna ungu (Lampiran 12). f. Uji hidrolisis gelatin Uji pencairan gelatin bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri memiliki eksoenzim gelatinase yang mampu menghidrolisis gelatin sehingga PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54 gelatin dapat membentuk gel dan bersifat cair. Percobaan dilakukan dengan menusukkan kultur bakteri ke dalam media semi padat yang mengandung NB (Nutrient Broth) dan gelatin. Media diinkubasikan dan diamati kemampuan bakteri dalam mencairkan gelatin. Pada saat pengamatan setelah inkubasi 72 jam 37°C gelatin dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit untuk mengetahui kemampuan bakteri mencairkan gelatin. Bila bakteri mampu mencerna gelatin maka media semi padat gelatin bersifat cair setelah dikeluarkan dari lemari es. Sebaliknya bila bakteri tidak mampu mencerna gelatin maka media semi padat gelatin membeku setelah dari lemari es (Lay, 1994). Dari hasil pengamatan, media gelatin yang diinokulasi bakteri tidak mencair atau membeku setelah disimpan dalam lemari es selama 30 menit. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri tidak mampu mencerna gelatin. Jadi bakteri tidak memiliki eksoenzim gelatinase yang mampu menghidrolisis gelatin sehingga gelatin tidak dapat membentuk gel dan bersifat cair (Lampiran 13). g. Uji pembentukan H2S Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghidrolisis asam amino sistein (mengandung sulfur) sehingga membentuk H2S. Pembuktiannya dapat dilihat dengan terbentuknya endapan hitam (senyawa FeS) pada bekas inokulasi bagian butt (bawah). Mekanisme reaksi yang terjadi: PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55 desulfurase sistein Asam amino sistein H2S + FeSO4 Hidrogen sulfida Ferro sulfat H2S + asam piruvat + NH FeS + H2SO4 Ferro sulfida Asam sulfat Bakteri yang menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dalam media yang kaya sistein akan membentuk H2S. Fe yang terdapat dalam media bereaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air (Lay, 1994). Medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) mengandung FeSO4, indikator merah fenol dan tiga macam gula yaitu sukrosa, glukosa, dan laktosa. Penginokulasian pada medium TSIA dilakukan dengan cara menggores pada bagian slant (atas) dan menusuk pada bagian butt (bawah) (Lay, 1994). Pada hasil pengamatan terhadap isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, di sepanjang bekas inokulasi bagian butt tidak ditemukan endapan hitam yang menunjukkan bahwa bakteri tidak mampu membentuk H2S. Selain itu pada medianya berubah dari warna merah menjadi warna kuning. Perubahan media disebabkan indikator merah fenol di dalam media bereaksi dengan hasil fermentasi bakteri dengan 3 macam gula yaitu glukosa, sukrosa dan laktosa sehingga warna media berubah menjadi wana kuning. Oleh karena itu, seperti pada pengamatan di atas dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut dapat memfermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa (Lampiran 14). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 56 h. Uji pembentukan indol Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian asam amino triptofan menjadi indol. Reagen Kovac ditambahkan setelah inkubasi selama 48 jam untuk melihat adanya indol. Hasil uji ini dikatakan positif bila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium (Lay, 1994). Pada hasil pengamatan menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak dapat membentuk indol. Hal ini dapat dilihat dari tidak terbentuknya cincin merah setelah diberi reagen Kovac setelah didiamkan selama 30 menit. (Lampiran 15). i. Uji MR (Methyl Red) Menurut Lay (1994), uji MR digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga menurunkan pH media pertumbuhannya. Setelah penambahan reagen methyl red, kalau media berwarna merah berarti terjadi fermentasi asam campuran dan bila media berubah menjadi kuning artinya fermentasi asam campuran tidak terbentuk. Dari hasil pengamatan, bakteri mampu memfermentasi karbohidrat menghasilkan asam campuran yang dapat dilihat dari terbentuknya warna merah tua pada media (Lampiran 16). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57 j. Uji VP (Voges Proskauer) Uji VP dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol. Penambahan KOH 40 % dan larutan α-naftol dapat menentukan adanya asetoin suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3 butanadiol. Adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna menjadi merah muda (Lay, 1994). Penambahan larutan KOH 40 % akan mengubah asetoin menjadi diasetil sehingga membentuk warna merah dan α-naftol ditambahkan untuk memperjelas pembentukan warna merah ini. Pengamatan pada bakteri menunjukkan hasil negatif yang berarti bakteri tidak menghasilkan senyawa aktif asetoin sehingga tidak mampu memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol (Lampiran 17). Tabel IV. Hasil Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Uji Katalase Oksidase OF dengan parafin OF tanpa parafin Penggunaan Sitrat Dekarboksilase Lisin Hidrolisis Gelatin Pembentukan H2S Pembentukan Indol MR VP Hasil Percobaan (-) tidak memiliki enzim katalase (+)memiliki enzim oksidase (+)menguraikan karbohidrat secara fermentatif fakultatif (+)menguraikan karbohidrat secara oksidatif anaerob (-) tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon (-) tidak dapat mendekarboksilase asam amino (-) tidak mempunyai enzim gelatinase (-) tidak menghasilkan enzim desulfurase (-) tidak menghasilkan enzim triptofanase (+)menghasilkan asam campuran (-) tidak menghasilkan 2,3 butanadiol Dari hasil pengamatan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult®, maka identifikasi dan determinasi dapat dilakukan untuk memastikan kebenaran genus bakteri tersebut dengan panduan determinasi bakteri Holt et al., (2000). Menurut PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58 Holt, et al (2000) genus Lactobacillus mempunyai sifat gram positif, selnya berbentuk batang, berantai pendek, tidak berspora dan jarang motil, fakultatif anaerob, koloninya convex (cembung), entire (rata), opaque (tidak dapat tembus cahaya) dan tanpa pigmen. Metabolismenya fermentatif dan saccharolastic (sukrosa), produk akhirnya adalah asam laktat, gelatin tidak mencair dan katalase negatif. Tabel V. Hasil Determinasi Isolat Bakteri dalam Fermentasi Susu Yakult® Pengamatan Bentuk sel Susunan sel Sifat Gram Spora Pergerakan Bakteri Kebutuhan akan O2 (Uji OF) Koloni Metabolisme (Uji OF) Uji gelatin Sifat terhadap uji katalase Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Batang Berantai pendek Positif Non spora Non motil Fakultatif anaerob Bakteri dari genus Lactobacillus (Holt et al., 2000) Batang Berantai pendek Positif Non spora Non motil Fakultatif anaerob Convex (cembung), entire (rata), tanpa pigmen Fermentasi Karbohidrat Tidak mencair Negatif Convex (cembung), entire (rata), tanpa pigmen Fermentasi Karbohidrat Tidak mencair Negatif Jadi, dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diisolasi dari susu fermentasi dari Yakult® merupakan genus Lactobacillus. C. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp Ke dalam media MRS diinokulasikan bakteri Lactobacillus sp. dan diinkubasi selama 3-4 hari, kemudian digojog dengan menggunakan shaker berkecepatan 170 rpm. Tujuan penggojogan ini adalah untuk menghomogenkan nutrisi yang ada di dalam media sehingga nutrisi dapat digunakan secara optimal oleh bakteri. Selain itu, untuk memperoleh aerasi yang cukup sehingga bakteri dapat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 59 tumbuh dan berkembang dengan baik serta menghasilkan biomassa sel secara optimal. Setelah dishaker, kemudian disentrifugasi selama 1 jam supaya terjadi pemisahan biomassa sel dengan senyawa penghambat sehingga akan mendapatkan supernatan berupa cairan yang mengandung senyawa penghambat, sedangkan biomassa selnya akan mengendap (Kasanah, Amini & Wahyuono, 1998). Proses sentrifugasi ada gaya sentrifugal yang akan menarik biomassa ke arah dalam (menjadi endapan) dan ada gaya sentripetal yang akan mendorong senyawa penghambat ke arah luar (sebagai supernatan). Senyawa penghambat banyak diproduksi bakteri dan disekresikan ke dalam media pada saat fase stasioner (Suwandi, 1989) . Oleh karena itu, tujuan shaker dilakukan selama 3-4 hari karena pada waktu inkubasi 3-4 hari diharapkan sudah mencapai fase stasioner pada bakteri. Fase eksponensial merupakan fase periode pembiakan yang cepat dan periode yang biasanya teramati ciri khas sel-sel yang aktif melakukan metabolisme menghasilkan metabolit primer. Pada fase ini, kondisi lingkungannya masih baik. Fase stasioner merupakan fase di mana mikroba tetap aktif melakukan metabolisme dan aktif menghasilkan metabolit sekunder. Pada fase ini, persediaan nutrisi dalam lingkungan sudah menipis sehingga terjadi kompetisi memperebutkan nutrisi antara bakteri satu dengan yang lain. Untuk itu bakteri tersebut harus bertahan hidup dengan menghasilkan metabolit sekunder yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan bakteri lain (Bull, 1974). Sesuai dengan tujuan dalam penelitian ini yaitu untuk menguji potensi senyawa penghambat maka yang diambil adalah supernatan, karena di dalamnya mengandung senyawa penghambat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 60 Biosintesis metabolit dari genus Lactobacillus adalah secara fermentasi karbohidrat yang menghasilkan sebagian besar asam laktat sebagai hasil dari metabolismenya (memecah glukosa menjadi asam laktat) (Singleton & Sainsbury, 2001). Senyawa lain yang dihasilkan oleh Lactobacillus selain asam organik seperti asam laktat dan asam asetat adalah diasetil, hidrogen peroksida dan bakteriosin. Senyawa-senyawa tersebut merupakan hasil metabolisme primer dan sekunder dari Lactobacillus (Daeschel, 1989). D. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp. terhadap E.coli dan E. faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc 1. Pembuatan suspensi E.coli dan E. faecalis Satu ml E.coli dan E. faecalis sebagai mikroba uji yang telah ditanam pada media NB (Nutrient Broth) umur 24 jam disuspensikan ke dalam 9 ml NB steril. Kekeruhan suspensi inokulum disesuaikan dengan kekeruhan larutan standar Mc Farland II (Koneman et al, 1997), artinya kekeruhan suspensi E.coli dan E.faecalis dibuat setara dengan kekeruhan larutan standar Mc Farland II. Suspensi E.coli dan E.faecalis harus relatif sama antara satu dengan lainnya. Kesetaraan ini harus dilakukan untuk memenuhi standard jumlah bakteri dalam suatu media sehingga pada waktu uji potensi antibakteri jumlah sel bakteri uji yang satu dengan yang lain mempunyai kepekaan yang seragam terhadap senyawa antibakteri. Kepadatan E.coli dan E.faecalis tersebut setara dengan 6 ×108 CFU (Colony Forming Units) /ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61 2. Pembiakan E.coli dan E.faecalis secara pour plate Sebelum melakukan uji potensi, terlebih dahulu membiakkan E.coli dan E.faecalis di dalam media nutrien agar. Dasar metode pour plate adalah menginokulasi media agar yang sedang mencair pada suhu 50ºC dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya dalam petri dish steril (Jutono dkk, 1980). Sebanyak 1 ml biakan bakteri uji yang berumur 24 jam diambil dan diinokulasikan ke dalam nutrien agar steril yang bersuhu 40-50°C. Kemudian media yang berisi biakan tersebut di-vortex, dituang ke dalam cawan petri steril, digoyang sampai homogen dan dibiarkan memadat. Kelebihan metode ini adalah dari faktor aerasi yaitu dapat menumbuhkan bakteri yang bersifat fakultatif anaerob seperti E. coli dan E. faecalis. 3. Pengujian potensi antibakteri dengan metode difusi menggunakan paper disc. Metode difusi merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur potensi hambat obat terhadap bakteri dengan cara mencampurkan biakan ke dalam media agar yang masih cair dan membiarkannya hingga padat (Jawetz et al, 1986). Pada penelitian ini, uji potensi dilakukan dengan metode difusi paper disc. Metode paper disc dilakukan dengan cara meletakkan paper disc di atas media yang mengandung bakteri uji, kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 1824 jam dan hasil dibaca dengan mengukur zona hambat (Anonim, 1992). Metode difusi ini digunakan karena dapat menentukan kepekaan sensitivitas dan resistensi bakteri terhadap senyawa penghambat. Penggunaan paper disc dilakukan karena paper disc mudah diaplikasikan ke permukaan agar cawan petri PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 62 daripada teknik sumuran. Zona hambatnya ditentukan dari solubilitas dan ukuran molekul senyawa antibakteri tersebut dalam berdifusi di sekitar disc. Selain itu paper disc pada kontrol positf, konsentrasi obatnya sudah terstandarisasi dan siap untuk digunakan. Penicillin digunakan sebagai kontrol positif karena penicillin merupakan antibiotik berspektrum luas ysng dapat menghambat bakteri gram positif dan gram negatif (Koneman et al, 1997). Bakteri uji pada penelitian ini yang bersifat gram negatif adalah E. coli sedangkan yang bersifat gram positif adalah E. faecalis. Kontrol negatif yang digunakan adalah media MRS tanpa inokulasi Lactobacillus sp dan diperlakukan sama dengan perlakuan. Kontrol negatif ini berfungsi untuk memberikan perbandingan terhadap hasil diameter zona hambat yang terbentuk pada perlakuan sehingga dapat menyatakan apakah perlakuan mempunyai potensi atau tidak terhadap bakteri uji. Bila diameter zona hambat perlakuan lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol negatif, berarti perlakuan mempunyai potensi terhadap bakteri uji sedangkan bila diameternya lebih kecil atau sama, berarti perlakuan tidak mempunyai potensi terhadap bakteri uji. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63 Berdasarkan hasil pengamatan, hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus terhadap E.coli adalah Tabel VI. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli waktu inkubasi 24 jam Replikasi I II III IV Rata-rata Diameter zona hambat (mm) Kontrol positif Kontrol negatif Senyawa yang dihasilkan (Penicillin) (MRS) Lactobacillus sp 8,5 7 8 9 6 8 9 7 8,5 8,5 8,5 8 8,8 7,1 8,1 3 1 2 Gambar 5. Hasil Uji Potensi Antibakteri Senyawa yang Dihasilkan Lactobacillus sp dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap E. coli. Keterangan gambar: 1. K(+) : Kontrol positif (Penicillin) 2. K(-) : Kontrol negatif (MRS Broth tanpa inokulasi bakteri) 3. Supernatan berisi senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64 Tabel VII. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp dari susu fermentasi Yakult® terhadap E.faecalis waktu inkubasi 24 jam Replikasi Kontrol positif (Penicillin) I II III IV Rata-rata 8 10 10 10 9,5 Diameter zona hambat (mm) Kontrol negatif Senyawa yang (MRS) dihasilkan Lactobacillus sp 8 11,5 13 12 13 11 12 11 11,5 11,4 3 2 1 Gambar 6. Hasil Uji Potensi Senyawa yang Dihasilkan Lactobacillus sp dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap E. faecalis Keterangan gambar: 1. (K+): Kontrol positif (Penicillin) 2. (K-): Kontrol negatif (MRS Broth tanpa inokulasi bakteri) 3. Supernatan berisi senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 65 Hasil pengamatan menunjukkan bahwa rata-rata diameter zona hambat senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp terhadap E.coli (8,1 mm) lebih besar daripada rata-rata diameter zona hambat kontrol negatif (media MRS Broth) (7,1 mm). Dari perbandingan dengan kontrol negatif tersebut, kemudian dapat dinyatakan potensi hambatnya: apabila diameter zona hambat kontrol negatif lebih kecil daripada diameter zona hambat perlakuan maka perlakuan tersebut mempunyai potensi hambat terhadap bakteri uji. Karena itu, dari hasil pengamatan dan perbandingan di atas dapat disimpulkan bahwa senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi hambat terhadap E. coli. Menurut penelitian Riana (2001), senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® tidak mempunyai daya hambat terhadap E. coli, dengan alasan bahwa E. coli termasuk gram negatif yang memilki lapisan lipopolisakarida pada dinding sel bakteri dan bertindak sebagai barier pelindung sel dari pengaruh luar. Ada perbedaan antara potensi hambat senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp. dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E. coli pada penelitian ini dengan penelitian Riana (2001). Pada penelitian ini, seperti yang telah disimpulkan di atas bahwa senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp. mempunyai potensi hambat terhadap E. coli. Senyawa yang dihasilkan bakteri asam laktat mampu menurunkan pH lingkungan habitat bakteri E. coli sehingga pertumbuhan bakteri tersebut terhambat karena aktivitas metabolisme untuk pertumbuhan hanya dapat dilakukan pada pH netral atau basa (Anonim, 2006). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 66 Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa rata-rata diameter zona hambat senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp terhadap E. faecalis (11,4 mm) sama dengan rata-rata diameter zona hambat kontrol negatif (media MRS Broth) (11,5 mm). Berdasarkan hasil perbandingan dengan kontrol negatif (media MRS Broth) tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® tidak mempunyai potensi hambat terhadap E. faecalis. E. faecalis merupakan bakteri yang aktivitas metabolismenya adalah fermentasi karbohidrat (Holt, 2000) dan menurut Rees (1997) dari metabolisme tersebut, E. faecalis menghasilkan asam laktat. Hal itu berarti E. faecalis mempunyai toleransi terhadap efek asam laktat (menurunkan pH lingkungan) sehingga bakteri tersebut dapat tumbuh dalam lingkungan ber-pH rendah. Pada hasil pengamatan ditemukan zona hambat pada kontrol negatif (media MRS Broth), diduga ada kontaminan bakteri lain yang hidup dalam media tersebut dan melakukan aktivitas penghambatan terhadap bakteri uji E. coli dan E. faecalis. Hal ini mempengaruhi hasil uji potensi hambat senyawa yang sedang diuji. Dari data di atas menunjukkan bahwa rata-rata diameter zona hambat senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli (8,1 mm) hampir sama besar dengan rata-rata diameter zona hambat kontrol positif (penicillin) (8,8 mm). Ini berarti potensi hambat senyawa yang dihasilkan Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E. coli hampir setara dengan potensi hambat kontrol positif (penicillin). Terhadap E. faecalis, penicillin mempunyai rata-rata diameter zona hambat (9,5). Penicillin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 67 sebagai antibiotik mempunyai mekanisme penghambatan pada sintesis dinding sel bakteri gram negatif dan gram positif. Bakteri-bakteri tersebut dihambat melalui difusi antibiotik ke dalam sel dan kemudian pembentukan dinding sel bakteri dirusak (Madigan, Martinko, & Parker, 2000). Jadi berdasarkan mekanisme penghambatan tersebut, bakteri uji pada penelitian ini yaitu E. coli (bakteri gram negatif) dan E. faecalis (bakteri gram positif) dapat dihambat oleh penicillin. Senyawa yang diduga dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus sp dari Yakult® paling banyak adalah asam laktat karena menurut Pederson & Carl, (1971) Lactobacillus dalam susu fermentasi Yakult® termasuk tipe homofermentatif yaitu Lactobacillus menghasilkan sebagian besar asam laktat dalam proses fermentasinya. Mekanisme penghambatan senyawa asam laktat terhadap bakteri patogen adalah dengan menurunkan pH lingkungan menjadi asam sehingga pertumbuhan bakteri yang tidak tahan terhadap lingkungan asam menjadi terhambat. Namun menurut Ray & Sandine (1992) efek antibakteri dari asam laktat sangat kecil. Berdasarkan hasil tersebut di atas, dapat disimpulkan bahwa senyawa yang dihasilkan Lactobacillus dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi hambat terhadap E. coli sedangkan terhadap E. faecalis, senyawa yang dihasilkan Lactobacillus dalam susu fermentasi Yakult® tidak memiliki potensi hambat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Hasil isolasi, identifikasi dan determinasi bakteri dari susu fermentasi Yakult® menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk genus Lactobacillus 2. Senyawa yang dihasilkan bakteri dari susu fermentasi Yakult® memiliki potensi antibakteri terhadap Escherichia coli tetapi tidak memiliki potensi antibakteri terhadap Enterococcus faecalis. B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian mengenai senyawa – senyawa penghambat yang dihasilkan Lactobacillus sp. dari susu fermentasi lainnya. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 69 DAFTAR PUSTAKA Alcamo, 1997, Fundamentals of Microbiology, Fifth Edition, Cummings Publishing Company, USA, 732-733 Alemu M., Kraykaw D., Ohmomo S., and Nitisinprasert S., 2006, Screening and Identification of Thermophilic Lactic Acid Bacteria Producing Antbacterial Substances Determined by OMP Analysis, Available from URL: http://www.thaiscience.info/Article Anonim, 1992, Dasar-dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, Jilid II, Fakultas Kedokteran UGM, Yogyakarta, 110-114. Anonim, 2006, Maintenance of Healthy Intestinal Microbiota, Available from URL: http// www.yakult.com/ europe htm. Atlas, R.M., 1997, Principles of Microbiology, Second Edition, WMC Brown Publisher, Iowa, 238. Boyd, R. F., 1984, General Microbiology, Mosby College Publishing, Missouri, 120. Bridson, E.Y., 1998, The Oxoid Manual, 8th Ed, Oxoid Limited, England, 2-170. Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, G.H., dan Wooton, M., 1987, Ilmu Pangan, Edisi Kedua, diterjemahkan oleh Hari Purnomo dan Ardiono, UI Press, Jakarta, 94. Bull, A.T., and Bushell, M.E., 1974, Polyamine magnesium and ribonucleic acid levels in steady state cultures of the mould Aspergillus nidulans, J. Gen Microbiol, 81, 271-273 Daeschel, M.A., 1989, Antimicrobial Substances From Lactid Acid Bacteria For Uses as Food Preservatives, Journal of Food Technology, 43, 148-155, 164167. Davidson, P.M., and Parish, M.E., 1989, Methods For Testing The Efficacy of Food Antimicrobial, Journal of Food Technology, 148-155. Fardiaz, S., 1992, Mikrobiologi Pangan I, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, 6264. Frazier, W.C., and Westhoff, D.C., 1988, Food Microbiology, Fourth Edition, McGraw-Hill Book Company, New York, 14-15. Holt, Krieg, Sneath, Stanley, and Williams, 2000, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 9th Edition, Lippincot Williams & Wilkins, Phildelphia, 528 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 70 Hugo, W.B., and Russel, A.D., 1987, Pharmaceutical Microbiology, Blackwell Scientific Publication, Oxford, 285-286. Hurst, A., and Hoover, D.G., 1993, Nisin dalam Antimicrobial And Food, 2nd Edition, Marcel, Dekker Inc, New York, 369-394 Jawetz, E., and Melnick, J.L., 1986, Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Tonang, Edisi ke-XVI, Penerbit Buku Kedokteran, EGC, Jakarta, 242, 947, 950, 954. Jawetz, A.J., Melnick, and Adelberg’s, E.A., 1996, Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh Edi Nugroho dan R.F. Maulany, Edisi XX, Penerbit Kedokteran EGC, Jakarta, 234, 236, 238-240. Jenie dan Rini, 1995, Aktivitas Antimikrobial dari Beberapa Spesies Lactobacillus terhadap Mikroba Patogen, dan Perusak Makanan, Buletin Teknologi dan Industri Pangan, IV, 46-51. Jutono, Sudarsono, Hartadi, Suhadi, dan Susanto, 1980, Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum (Untuk Perguruan Tinggi), Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM, Yogyakarta, 90-115. Kasanah. N., Amini dan Wahyuono, 1998, Karakterisasi Senyawa Antimikroba Isolat Aspergillus sp., Hasil Isolasi dari Tanah, Majalah Farmasi Indonesia 9, 4, 167-168. Koneman, E.W., Allen, S.D., Janda, W.M., Schreckenberger, P.C., and Winn, W.C., 1997, Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, Fith Edition, Lippincot Williams and Wilkins, Philadelphia, 597 Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Manajemen PT Grafindo Persada, Jakarta, 129-132. Madigan, M.T., Martinko, J.M., and Parker, J., 2000, Brock Biology of Microorganism, 9th Edition, Prentice Hall Inc., Upper Saddle River, New Jersey, 146-155 Nester, E.W., Anderson, G., Roberts Jr, C.E., Pearsall, N.N., and Nester, M.T., 2001, Microbiology a Human Perspective, Third (3rd) Ed, McGraw Hill, New York, 603, 805, 636. Pelczar, M.J., dan Chan E.C.S., 1988, Dasar-dasar Mikrobiologi II, UI Press, Jakarta, 448, 462, 466, 470-475, 477-479. Pederson Ph.D., and Carl S., 1971, Microbiology of Food Fermentations, The AVI Publishing company Inc, Wesport, Connecticut, 67. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 71 Prangdimurti, E., 2006, Probiotik dan Efek Perlindungannya Terhadap Kanker Kolon, 11 pages, Available from URL : http//www.tumoutou.net /3_sem1_012/endang. Ray, B., and Sandine, 1992, Purification and Properties of An Antimicrobial Substance Produced by Lactobacillus bulgaris, Journal Food SCI, 441-445. Rees, T.J., 1997, The Development of a Novel Antifungal Silage Inoculant, Doctoral Research Thesis, 21 pages, Available from URL : http// www.brighton73.freeserve.co.uk/tomsplace/scientific/phd/Assets/1_li tera.pdf Riana, I., 2000, Daya Antibakteri Metabolit Sekunder dari Lactobacillus sp. dalam Susu Fermentasi Yoghurt (Kefir®) dan Yakult® terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Singleton and Sainsbury, 2001, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, Third Edition, John Wiley Sons Ltd, UK, 300, 424-426, 482-483. Suwandi, U., 1989, Mikroba Penghasil Antibiotik, Cermin Dunia Kesehatan, 58, 3738. Tarigan, J., 1988, Pengantar Mikrobiologi, Departemen Pendidikan Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Jakarta, 310-321. dan Todar, K., 2002., The Bacterial Flora of Humans, Online Textbook of Bacteriology, 24 pages, Available from URL: http// www.textbookofbacteriology.net/ htm Trihendrokesowo, 1986, Dasar-dasar Pemeriksaan Kedokteran UGM, Yogyakarta, 18-42. Mikrobiologi, Fakultas PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 72 LAMPIRAN Lampiran 1: Daftar Komposisi Media MRS (Man Rogosa Sharpe) Agar dan Broth Oxoid PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 73 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 74 Lampiran 2: Hasil Isolasi Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate Keterangan gambar : Koloni isolat bakteri dengan ciri: berbentuk circulair (bulat/ lingkaran), permukaannya licin, elevasi convex (cembung), bentuk tepi entire (rata), bentuk struktur dalamnya opaque (tidak dapat tembus cahaya). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 75 Lampiran 3: Hasil Percobaan Pergerakan Isolat Bakteri Fermentasi Yakult® dengan Metode Tusukan A dari Susu B Keterangan : A. Isolat bakteri pada media semi padat (0,2-0,4 % agar) dengan ciri: pertumbuhan lebat, berbentuk filliform (merata sepanjang bekas inokulasi), tidak ada pergerakan hanya tumbuh pada bekas inokulasi. B. Kontrol (media tanpa inokulasi bakteri) tidak ada pertumbuhan bakteri sepanjang bekas inokulasi. Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak punya flagella sehingga tidak melakukan pergerakan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 76 Lampiran 4: Hasil Uji Morfologi Koloni Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® dalam MRS Agar Tegak A B Keterangan : A. Isolat bakteri pada MRS Agar Tegak dengan ciri-ciri: pertumbuhan lebat, berbentuk filliform (merata pada bekas inokulasi), dan bagian permukaannya melebar. B. Kontrol (Media MRS Agar tegak tanpa inokulasi bakteri) tidak ada pertumbuhan bakteri pada sepanjang bekas inokulasi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 77 Lampiran 5: Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® dalam MRS Agar Miring A B Keterangan : A: Isolat bakteri pada MRS Agar Miring dengan ciri-ciri: bentuk koloni rata sepanjang garis inokulasi, berwarna putih, pertumbuhannya tebal, permukaan licin, elevasinya cembung (conveks), tidak mengkilat, tidak tembus cahaya. B: Kontrol (Media MRS Agar miring tanpa inokulasi bakteri.) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 78 Lampiran 6: Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult®dalam MRS Cair (Broth) A B Keterangan : A: Isolat bakteri pada MRS Cair dengan ciri-ciri: permukaannya tidak membentuk selaput, sangat keruh, dan banyak endapannya seperti butiran halus. B: Kontrol (Media MRS Cair tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Berdasarkan kebutuhan oksigen, maka bakteri dari susu fermentasi Yakult® bersifat fakultatif anaerob. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 79 Lampiran 7: Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult®dalam MRS Agar Plate Keterangan : Isolat bakteri pada media MRS Agar Plate dengan ciri-ciri: membentuk koloni yang circulair (bulat/ lingkaran), permukaannya licin, elevasi convex (cembung), bentuk tepi entire (rata), dan bentuk struktur dalam opaque (tidak dapat tembus cahaya). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 80 Lampiran 8: Hasil Uji Oksidase Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; tidak terbentuk warna ungu tua pada kertas saring. B: Kontrol (kertas saring ditetesi larutan tetramethyl-paraphenyldiamine tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® memiliki enzim oksidase sitokrom yang dapat mengoksidasi larutan reagens sehingga membentuk indofenol ungu. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 81 Lampiran 9: Hasil Uji O-F dengan Parafin Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; membentuk warna kuning pada media O-F dengan parafin. B: Kontrol (media OF dan glukosa dengan parafin tanpa inokulasi bakteri) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 82 Lampiran 10: Hasil Uji O-F tanpa Parafin Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; membentuk warna kuning pada media O-F tanpa parafin. B: Kontrol (media OF dan glukosa tanpa parafin, tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Berdasarkan hasil uji O-F dengan parafin (lampiran 8) dan tanpa parafin (lampiran 9) terhadap bakteri dari susu fermentasi Yakult® di atas dapat disimpulkan bahwa bakteri tersebut dapat melakukan metabolisme fermentasi glukosa secara fakultatif anaerob. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 83 Lampiran 11: Hasil Uji Penggunaan Sitrat Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; tidak terjadi perubahan warna medium menjadi biru. B: Kontrol (media Simmon’s citrate tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak menggunakan sitrat sebagai satu-satumya sumber karbon. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 84 Lampiran 12: Hasil Uji Dekarboksilase Lisin Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning, dan tidak menjadi warna ungu kembali. B: Kontrol (medium LIA (Lisin Iron Agar) tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak dapat mendekarboksilase asam amino dan tidak dapat menghasilkan amina yang bersifat basa. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 85 Lampiran 13: Hasil Uji Hidrolisis Gelatin Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; tidak terjadi pencairan gelatin setelah disimpan dalam lemari es selama 30 menit. B: Kontrol (medium tanpa inokulasi bakteri setelah disimpan dalam lemari es selama 30 menit.) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak mampu mencerna gelatin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 86 Lampiran 14: Hasil Uji Pembentukan H2S Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; tidak terbentuk endapan hitam, media berubah warna dari merah menjadi kuning jingga. B: Kontrol (media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) tanpa inokulasi bakteri) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak mampu membentuk H2S tapi mampu memfermentasi 3 macam gula (glukosa, sukrosa, laktosa) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 87 Lampiran 15: Hasil Uji Indol Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; tidak terbentuk cincin merah setelah diberi reagen Kovac. B: Kontrol (medium tripton water tanpa inokulasi bakteri dan reagen Kovac) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak dapat membentuk indol PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 88 Lampiran 16: Hasil Uji MR (Methyl Red) Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan : A: Perlakuan; terbentuk warna merah tua B: Kontrol (media MR-VP tanpa inokulasi bakteri ditambah reagen methyl red) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® mampu memfermentasi karbohidrat menghasilkan asam campuran PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 89 Lampiran 17: Hasil Uji VP (Voges Proskauer) Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® A B Keterangan A: Perlakuan; tidak terbentuk warna merah. B: Kontrol (media MR-VP tanpa inokulasi bakteri ditambah 40% KOH dan 5% larutan α-naphtol) Kesimpulan: Bakteri dari susu fermentasi Yakult® tidak mampu memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 90 BIOGRAFI PENULIS Aquina Alia Retnowati, lahir di Semarang pada tanggal 28 januari 1982. pernah bersekolah di SD Xaverius Semarang, SMP Kanisius Raden Patah Semarang dan SMU Don Bosko Semarang. Kemudian melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
