ISOLASI DAN UJI DAYA ANTIOKSIDAN SENYAWA

Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
UJI DAYA ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID DAUN Plantago
major L.
THE DETERMINATION OF ANTIOXIDANT POTENCY OF FLAVONOIDS
FROM Plantago major L. LEAVES
Oleh:
Triana Hertiani *), Suwijiyo Pramono *) dan Supardjan A.M **).
*) Lab. Fitokimia, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada
**) Lab. Sintesis Obat, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada
ABSTRAK
Telah dilakukan pengujian daya antioksidan senyawa flavonoid daun Plantago major L. Isolasi
flavonoid dilakukan dengan menggunakan kromatografi kertas preparatif dengan fase gerak air suling.
Isolat yang diperoleh diuji daya antioksidannya menggunakan metode asam tiobarbiturat yang
dimodifikasi dengan kuersetin sebagai pembanding positif.
Hasil isolasi menunjukkan bahwa terdapat setidaknya 3 isolat yang aktif sebagai antioksidan dengan
daya antioksidan sebagai berikut: isolat A 41,08%  4,96%; isolat B 24,88%  5,39%; isolat C 21,08%  6,52%
sedangkan kuersetin menunjukkan potensi sebesar 33,86%  8,32%.
Kata kunci: uji daya antioksidan, flavonoid, Plantago major L.
ABSTRACT
A research has been done to determine the antioxidant potency of flavonoids substances from Plantago
major L. leaves. Isolation was done using a preparative paper chromatography with aquadestilata as a mobile
phase.
The isolates have been examined the antioxidants potencies using the modification of a thiobarbituric
acid method with quercetin as a reference.
The result has shown that there were at least three active isolates with potencies (%) as followed i.e.
isolate A 41,08  4,96; isolate B 24,88  5,39; isolate C 21,08  6,52 while quercetin has shown its potency of
33,86  8,32.
Key words: antioxidant potency assay, flavonoid, Plantago major L.
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
234
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
PENDAHULUAN
Peningkatan pengetahuan dalam bidang kesehatan telah menyadarkan masyarakat
mengenai pentingnya suplemen antioksidan untuk pencegahan berbagai penyakit degeneratif.
Antioksidan sintetik seperti BHA (butylated hidroxy aniline) dan BHT (butylated hidroxy
toluen) telah diketahui memiliki efek samping yang besar antara lain menyebabkan kerusakan
hati. Di sisi lain alam menyediakan sumber antioksidan yang efektif dan relatif aman seperti
flavonoid, vitamin C, beta karoten dan lain-lain. Hal tersebut mendorong semakin banyak
dilakukan eksplorasi bahan alam sebagai sumber antioksidan (Kikuzaki dan Nakatani, 1993).
Flavonoid seperti kuersetin, rutin, diketahui sebagai antioksidan yang potensial.
Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya
gugus hidroksi fenolik dalam stuktur molekulnya. Ketika senyawa-senyawa ini bereaksi
dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi
inti aromatik (Cuvelier et al., 1994).
Daun Plantago major L. diketahui mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai
antioksidan (Hertiani dan Pramono, 1999), tetapi belum pernah dilakukan isolasi senyawa
flavonoid tersebut dan uji potensinya sebagai antioksidan. Hal tersebut mendorong
dilakukannya penelitian tentang isolasi dan uji daya antioksidan senyawa flavonoid daun
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
235
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Plantago major L. menggunakan modifikasi dari metode asam tiobarbiturat oleh Ottolenghi
(Kikuzaki dan Nakatani, 1993) dengan kuersetin sebagai kontrol positif.
METODOLOGI
Peralatan yang dipergunakan adalah spektrofotometer uv-sinar tampak Hitachi,
peralatan gelas, neraca Chyo Yupiter C3-100, inkubator 40C, mikropipet Socorex 2-50l
dan 200-1000l, termometer, centrifuge model DSC 158, bejana pengembang kromatografi
kertas dan lampu uv 366 nm.
Bahan yang dipergunakan adalah daun Plantago major L. yang dikumpulkan pada
bulan September 1998 dari BPTO Tawangmangu dan dideterminasi di laboratorium
Farmakognosi bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM, etanol absolut, asam 2tiobarbiturat, asam fosfomolibdat (E Merck) asam linoleat (Sigma) sebagai pereaksi dan
kuersetin sebagai pembanding.
CARA KERJA
Skema kerja:
Infus serbuk daun kering
Uapkan sampai kental
Tambahkan etanol sampai endapan sempurna dan disentrifuge
Filtrat diuapkan
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
236
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Kromatografi kertas
Semprot dengan asam fosfomolibdat dalam aseton
Diikuti dengan penambahan uap amoniak
Isolasi bercak yang positif (biru abu-abu )
dengan Kromatografi kertas
Uji potensi antioksidan
Uji potensi antioksidan dengan metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi: (Ottolenghi
cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993).
Ke dalam vial bertutup ulir (50 ml) dengan diameter 38 cm dan tinggi 75 mm dimasukkan
campuran sampel (2 mg) dalam 4 ml etanol, lalu ditambahkan 4,1 ml 2,53% asam linoleat
dalam etanol ditambah 8 ml dapar fosfat 0,5 M (pH 7) dan akuades 3,9 ml. Campuran tersebut
diinkubasi pada 40 C dalam gelap. Asam linoleat akan mengalami reaksi autooksidasi
menjadi TBArs (Asam 2-tiobarbiturat reacting substance). Reaksi autooksidasi tersebut akan
dihalangi oleh senyawa reduktor yang diperkirakan terdapat dalam sampel sehingga akan
menurunkan jumlah TBArs yang terbentuk.
Setiap 24 jam campuran diatas diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan pereaksi
asam 2-tiobarbiturat (selanjutnya disebut TBA) dipanaskan di atas penangas air mendidih
selama 10 menit dan setelah dingin disentrifugasi pada 3200 rpm selama 20 menit. Senyawa
TBArs yang terbentuk akan bereaksi dengan TBA membentuk senyawa kompleks yang
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
237
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
berwarna merah jambu. Filtrat dibaca absorbansinya pada 534,2 nm. Aktivitas antioksidan
ditentukan berdasarkan absorbansi pada hari akhir.
Penetapan potensi antioksidan menggunakan rumus sebagai berikut (Yen dan Hsieh,
1997):
Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi sampel
% penghambatan =
x 100%
Absorbansi kontrol negatif
Daya antioksidan dinyatakan sebagai % penghambatan untuk bobot sampel 1 mg.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 3 bercak yang positif sebagai
antioksidan dengan metode asam fosfomolibdat seperti ditunjukkan oleh data kromatogram
pada tabel I. Metode asam fosfomolibdat merupakan metode pendahuluan untuk mengetahui
aktivitas senyawa antioksidan secara kualitatif (Ranganna, 1978). Prinsip kerjanya adalah
reaksi oksidasi-reduksi sebagaimana dijelaskan sebagai berikut:
2 MoO3
MoO2.MoO3
Pada reaksi tersebut Mo(IV) dari H3(P(MO3O16)4) direduksi dengan adanya senyawa
antioksidan menjadi Mo(IV) yang berupa campuran oksidan yang berwarna biru abu-abu
(Jork et al., 1990).
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
238
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Untuk uji secara kuantitatif dilakukan dengan metode TBA. Metode ini mudah dan
murah serta banyak digunakan untuk uji antioksidan. Metode ini memiliki kerugian yaitu
waktu pengujian relatif lama (Wu dan Brewer, 1993).
Tabel I. Data kromatogram fraksi non musilago dengan pelarut etanol, fase diam kertas
Whatman no. 1, fase gerak akuades.
Sinar tampak
Kode
Bercak
UV 366
hRf
Tanpa
perlakuan
Uap
Amoniak
Asam
fosfomolibdat
Tanpa
perlakuan
Uap
amoniak
D
96
Coklat
Kuning
-
Kuning hijau
Hijau
C
80
-
Kuning cerah
+
Biru gelap
Hijau
B
50
-
Kuning cerah
+
Biru terang
Biru hijau
A
5
Kuning coklat
Kuning cerah
+
Coklat gelap
Coklat gelap
Keterangan: - : tidak terdeteksi; +: bercak biru abu-abu.
Data kromatogram di atas menunjukkan bahwa terdapat 4 bercak yang kemungkinan
merupakan flavonoid. Jika mengacu pada Mabry et al.(1970), dan Markham (1982), tentang
hubungan antara warna bercak dengan struktur flavonoid maka kemungkinan sruktur
flavonoid dari masing-masing bercak tersebut adalah seperti tercantum pada tabel II sebagai
berikut:
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
239
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Tabel II. Kemungkinan struktur flavonoid bercak kromatogram pada tabel 1.
Kode
Warna bercak flavonoid
bercak
UV 366 nm
NH3/UV366 nm
Kemungkinan type flavonoid
A
Coklat gelap
Coklat gelap
Flavon atau flavonol dengan 3-OH tersubsitusi
dan
5-OH
bebas;
dihidroflavonol,
atau
biflavonil
dan
isoflavon,
flavanon
dengan 5-OH
B
Biru terang
Biru hijau
Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau
flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH
tersubstitusi.
C
Biru gelap
Hijau
Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau
flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH
tersubstitusi.
D
Kuning hijau
Hijau
Flavonol dengan 3-OH bebas dan atau tanpa
5-OH bebas.
Struktur umum flavonoid adalah sebagai berikut:
2'
8
7
1'
4'
O
6'
6
4
5
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
3'
5'
3
O
240
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Isolat hasil kromatografi preparatif yaitu isolat A,B,C dan kuersetin sebagai kontrol
positif diuji daya antioksidannya dengan metode TBA yang dimodifikasi. Pemilihan kuersetin
sebagai senyawa pembanding karena senyawa ini telah diketahui memiliki aktivitas yang
tinggi sebagai antioksidan. Hal tersebut kemungkinan disebabkan adanya gugus orthodihidroksi pada posisi 3’ dan 4’, gugus OH pada posisi 3,5 dan 7 (Foti et al., 1996)
Pada awal uji dilakukan penentuan panjang gelombang serapan maksimal, waktu
operasional dan masa inkubasi. Hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimal adalah
pada panjang gelombang 532,4 nm.
Penentuan waktu operasional sampai dengan jam ke-5 menunjukkan bahwa pengujian
pada jam ke-1 memberikan hasil yang relatif stabil sehingga untuk pengujian selanjutnya
waktu operasional ditentukan antara 1 – 1 ½ jam setelah sentrifugasi untuk menyamakan
kondisi percobaan.
Penentuan masa inkubasi dilakukan pada kontrol negatif memberikan data seperti
ditunjukkan oleh grafik pada gambar 1. Pada gambar tersebut terlihat adanya peningkatan
absorbansi pada hari ke-0 sampai dengan hari ke-8 yang menunjukkan proses autooksidasi
masih berlangsung. Terlihat bahwa mulai hari ke-8, absorbansi relatif stabil, sehingga
penelitian dilakukan pada hari ke-8 dari masa inkubasi. Diharapkan pada hari ke-8 itu semua
asam linoleat pada kontrol negatif telah mengalami autooksidasi membentuk TBArs. Dengan
demikian TBArs yang terbentuk sudah maksimal.
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
241
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
0.2
0.15
Absorbansi 0.1
0.05
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Hari ke-
Gambar 1. Penentuan masa inkubasi kontrol negatif
Prinsip kerja dari metode ini adalah proses autooksidasi dari asam linoleat
menghasilkan senyawa TBA-reacting substance (TBArs) seperti misalnya malondialdehida
yang dengan adanya asam 2-tiobarbiturat (TBA) akan membentuk senyawa berwarna merah
jambu yang kemudian diukur absorbansinya pada 532 nm. (Kikuzaki dan Nakatani, 1993).
Proses autooksidasi tersebut dapat dihalangi oleh senyawa antioksidan, sehingga TBArs yang
terbentuk akan lebih sedikit daripada tanpa penambahan senyawa antioksidan.
Data pengujian daya antioksidan isolat dan kontrol positif ditunjukkan pada tabel 3
dan diilustrasikan pada gambar 2.
Tabel III. Data hasil pengujian daya antioksidan
Sampel
I
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
II
Daya antioksidan (%)
III
Rerata
SD
242
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
A
43,46
44,39
35,38
41,08
4,96
B
33,13
23,98
23,62
24,88
5,39
C
18,21
28,55
16,49
21,08
6,52
Kuersetin
38,21
24,36
39,00
33,86
8,32
Keterangan: I,II,III : replikasi ke-1, ke-2 dan ke-3; SD : standar deviasi
atau diilustrasikan pada gambar 2 sebagai berikut:
50
40
Daya
30
Antioksidan
20
(%)
10
0
Isolat A
Isolat B
Isolat C
Kuersetin
Sampel
Gambar 2. Data hasil pengujian daya antioksidan
Hasil pengujian daya antioksidan di atas menunjukkan harga standar deviasi yang
besar. Hal tersebut kemungkinan disebabkan sampel belum merupakan senyawa murni,
sehingga jumlah senyawa aktif yang bereaksi sebagai antioksidan dalam tiap replikasi sampel
tidak sama.
Hasil statistika dengan uji t taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa isolat A
berbeda bermakna dengan isolat B dan C dan kuersetin dan menunjukkan daya antioksidan
yang paling tinggi.
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
243
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
KESIMPULAN
Dalam daun Plantago major L. setidaknya terdapat 3 senyawa flavonoid yang aktif
sebagai antioksidan menurut metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi (Ottolenghi,
1959 cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Isolat A memiliki daya antioksidan tertinggi yaitu
sebesar 41,08%.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penelitian ini terlaksana dengan bantuan dana URGE dari Dirjen DIKTI, Depdiknas
RI.
DAFTAR PUSTAKA
Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1994, Comparison of The Antioxidative Activity
of Some Acid Phenols: Structure-Activity Relationship, Biosci. Biothech. Biochem.,
56(2), 324 – 325.
Foti, M., Piatelli, M., Baratta, M.T., and Ruberto, G., 1996, Flavonoids, Coumarins, and
Cinnamic Acids as Antioxidants in a Micellar System. Structure-Activity
Relationship, J.Agric. Food. Chem., 44(2), 497-500.
Hertiani, T., dan Pramono, S., 1999, Uji Pendahuluan Kandungan Antioksidan dalam Infus
Daun Plantago major L., Makalah, Seminar Biologi Menuju Milenium III, Fakultas
Biologi UGM, Yogyakarta.
Jork, H., Funk, W., Fischer, W., and Wimmer, H., 1990, Thin Layer Chromatography,
Reagents and Detection Methods, Physical and Chemical Detection Methods:
Fundamentals, Reagents I, Vol. Ia, VCH, New York.
Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, J.
Food Sci., 58(6), 1407
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
244
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic Identification of
Flavonoids, Springer-Verlag, New York.
Markham, K.R., 1982, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh
Padmawinata, K., 1988, Penerbit ITB, Bandung.
Ottolenghi, A., 1959, Interaction of Ascorbic Acid and Mithocondrial Lipids, cit Kikuzaki,
H., and Nakatani, N., 1993, J. Food Sci., 58(6), 1407.
Ranganna, S., 1978, Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products, Tata Mc Graw-Hill
Publishing Company Limited, New Delhi.
Wu, S., and Brewer, S., 1993, Screening Antioxidative and Prooxidative Activity in A Solid
Medium Model System, J. Food Biochem., 17(1), 2.
Yen, G. and Hsieh, C., 1997, Antioxidant Effects of Dopamine and Related Compounds,
Biosci. Biotech. Biochem., 61(10), 1647.
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
245
Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000
Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000
246