ISOLASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID

campuran CH3COONa dengan H3BO3, dan
NaOCH3. Data pergeseran pita serapan
sebelum dan sesudah ditambahkan pereaksi
geser menentukan jenis senyawa golongan
flavonoid.
tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g serbuk
Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol,
dan dikocok kuat. Uji positif flavonoid
menghasilkan warna kuning atau jingga pada
lapisan amilalkohol.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Golongan Flavonoid (Harborne 1987)
Alkaloid
Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam
10 mL CHCl3 dan 4 tetes NH4OH. Larutan
disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam
tabung reaksi tertutup. Ekstrak CHCl3 dalam
tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4
2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke
dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam
ini diteteskan pada lempeng tetes dan
ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan
DragendoRf
yang akan menimbulkan
endapan berturut-turut berwarna putih,
cokelat, dan merah jingga jika terdapat
alkaloid.
Sebanyak 0.5 g ekstrak dilarutkan dengan
10 mL metanol-HCl 1 N (1:1) dan dipanaskan
pada suhu 95 °C selama 1 jam. Setelah itu,
didinginkan dan disaring, lalu filtratnya
diekstraksi dengan etil asetat.
Saponin
Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10
mL air panas dan dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan
untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam
tabung reaksi tertutup kemudian dikocok
selama 10 detik dan didiamkan selama 10
menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan
terbentuknya buih yang stabil.
Triterpenoid dan Steroid
Sebanyak 0,1 g ekstrak dilarutkan dengan
25 mL etanol panas (50 °C). Larutan disaring
dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai
kering. Residu ditambahkan eter dan ekstrak
eter dipindahkan ke dalam lempeng tetes.
Kemudian ditambahkan 3 tetes anhidrida
asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji
Lieberman-Buchard). Warna merah atau ungu
menunjukkan
kandungan
triterpenoid,
sedangkan
warna
hijau
atau
biru
menunjukkan kandungan steroid.
Tanin
Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10
mL air panas, dididihkan selama 5 menit, dan
disaring. Sebagian filtrat yang diperoleh
ditambahkan larutan FeCl3 1%. Hasil positif
ditunjukkan oleh warna hijau kehitaman.
Flavonoid
Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10
mL air panas dan dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu, disaring dan filtratnya digunakan
untuk pengujian. Filtrat dimasukkan ke dalam
Antosianidin
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat
ditambahkan 3 tetes CH3COONa lalu diamati,
kemudian ditambahkan 3 tetes FeCl3 dan
diamati
lagi.
Antosianidin
dengan
CH3COONa memberikan warna merah atau
ungu dan bila ditambahkan FeCl3 menjadi
biru.
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat
ditambahkan
Na2CO3
lalu
diamati.
Antosianidin memberikan warna ungu, biru,
atau hijau.
Flavon, Kalkon, Auron, dan Flavonol
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat
ditambahkan 3 tetes CH3COOPb lalu diamati
warnanya. Flavon memberikan warna jingga
hingga krem, kalkon memberikan warna
jingga tua, dan auron memberikan warna
merah.
Sebanyak 1 mL ekstrak etil asetat
ditambah 3 tetes NaOH 0,1 N lalu diamati
warnanya. Flavon memberikan warna kuning,
flavonol memberikan warna kuning, jingga
hingga krem, dan kalkon memberikan warna
krem hingga merah tua.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar Air
Penentuan kadar air dilakukan dengan
metode gravimetri evolusi tidak langsung.
Bobot air dihitung setelah proses pengeringan
dengan suhu 105 °C pada periode waktu
tertentu sampai diperoleh bobot yang konstan.
Menurut Harjadi (1993), air yang terikat
secara fisik dapat dihilangkan dengan
pemanasan pada suhu 100–105 °C. Salah satu
kegunaan penentuan kadar air adalah untuk
mengetahui ketahanan suatu bahan dalam
penyimpanan.
4
Sampel yang digunakan dalam penelitian
ini adalah serbuk daun dandang gendis. Kadar
airnya diperoleh sebesar 9.74% (Lampiran 2).
Menurut Winarno (1997), sampel dapat
disimpan dalam jangka waktu lama jika
memiliki kadar air di bawah 10%. Nilai kadar
air yang diperoleh kurang dari 10%. Hal ini
menunjukkan bahwa sampel memiliki masa
simpan yang relatif lama.
Isolasi Senyawa Golongan Flavonoid
Tahap pertama dalam isolasi senyawa
golongan flavonoid adalah maserasi sampel
dengan pelarut etanol 70%. Etanol 70%
digunakan karena flavonoid bersifat polar,
dengan sejumlah gugus hidroksil, baik yang
terikat ataupun yang tidak terikat gula
(Markham 1988). Selain itu, berdasarkan
Macari et al. (2006), aktivitas antioksidan
tanaman obat dalam etanol 70% lebih tinggi
dibandingkan dengan beberapa pelarut
lainnya. Maserasi dilakukan berulang kali
sampai filtrat tidak berwarna hijau lagi,
sehingga dapat dianggap semua senyawa yang
berbobot molekul rendah telah terekstraksi
(Harborne 1987). Filtrat yang diperoleh
dipekatkan dengan penguap putar sehingga
diperoleh ekstrak kasar etanol. Rendemen
yang dihasilkan dari 200.04 g serbuk daun
dandang gendis yang dimaserasi adalah 31.24
% (Lampiran 3).
Ekstrak daun dandang gendis kemudian
dipartisi cair-cair menggunakan pelarut nheksana untuk menghilangkan kandungan
lemak. Tahapan selanjutnya adalah hidrolisisasam
terhadap
ekstrak
bebas-lemak.
Hidrolisis bertujuan memutus gula dari
aglikon flavonoid. Hasil hidrolisis kemudian
dipartisi dengan etil asetat untuk memisahkan
aglikon flavonoid dengan gulanya. Aglikon
flavonoid akan berada dalam fraksi etil asetat
dan gula dalam fraksi air (Markham 1988).
Pemisahan aglikon flavonoid dilakukan
dengan KLT preparatif menggunakan eluen
BAA dengan nisbah 4:1:5 (Markham 1988).
Noda pemisahan diamati di bawah lampu UV
254 nm, dan diperoleh 3 noda (Gambar 4).
Nilai Rf untuk fraksi 1, 2, dan 3 berturutturut adalah 0.25, 0.52, dan 0.85. Setiap fraksi
dikerok, kemudian dilarutkan dengan etanol
hingga jumlah setiap fraksi mencukupi untuk
analisis kualitatif, uji aktivitas antioksidan,
dan analisis senyawa golongan flavonoid.
F3
Rf 0.85
F2
Rf 0.52
F1
Rf 0.25
(a)
(b)
Gambar 4 Noda pemisahan di bawah lampu
UV 254 nm: KLT (a), KLT
preparatif dengan eluen BAA (b).
Uji Aktivitas Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat
dan ketiga fraksi hasil KLT preparatif
dilakukan dengan metode DPPH (Lampiran
4). Metode ini dipilih karena mudah
digunakan, cepat, dan cukup teliti (Prakash
2001). Aktivitas antioksidan metode DPPH
dinyatakan dengan nilai IC50, yakni
konsentrasi sampel yang mampu menghambat
aktivitas DPPH sebesar 50%.
Ekstrak etil asetat memiliki aktivitas
antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 178.40
mg L-1. Fraksi 2 (F2) hasil KLT preparatif
menunjukkan nilai IC50 yang paling kecil,
yakni 52.93 mg L-1. Semakin kecil nilai IC50,
semakin tinggi pula aktivitas antioksidan
(Molyneux 2004). Fraksi 1 (F1) dan fraksi 3
(F3) memiliki aktivitas antioksidan yang
kecil. Nilai IC50 cukup besar yakni 43932.07
mg L-1 dan 9226.48 mg L-1. Menurut Hanani
et al. (2005), suatu senyawa dikatakan
memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi
jika memiliki nilai IC50 kurang dari 200 mg L1
. Namun, jika dibandingkan dengan BHT
sebagai kontrol positif, aktivitas antioksidan
F2 masih lebih rendah. Nilai IC50 untuk BHT
sebesar 16.71 mg L-1 (Tabel 3).
Tabel 3 Aktivitas antioksidan
Larutan uji
IC50 (mg L-1)
BHT
16.71
Ekstrak etil asetat
178.40
F1
43932.07
F2
52.93
F3
9226.48
Golongan Flavonoid Fraksi Aktif
Analisis F2 sebagai fraksi teraktif dari
ekstrak daun dandang gendis dilakukan
5
dengan merekam spektrum UV-tampak.
Identifikasi senyawa golongan flavonoid
didasarkan
pada
perubahan
panjang
gelombang setelah ditambahkan pereaksi
geser (Lampiran 5). Spektrum UV-tampak F2
dalam pelarut metanol (Gambar 5)
menunjukkan serapan maksimum pita 1 pada
panjang gelombang 332 nm dan pita 2 pada
panjang gelombang 274 nm.
A
b
s
o
r
b
a
n
s
Panjang gelombang (nm)
NaOCH3
NaOCH3 setelah 5 menit
Gambar 6 Spektrum F2 dengan penambahan
pereaksi geser NaOCH3 dan
NaOCH3 setelah 5 menit.
Panjang gelombang (nm)
Gambar 5
A
b
s
o
r
b
a
n
s
Spektrum F2 dalam pelarut
metanol.
Berdasarkan puncak serapan pada pita 1
dan 2, F2 diduga merupakan senyawa
flavonoid golongan flavon atau flavonol.
Menurut Markham (1988), flavon dan
flavonol memiliki serapan maksimum pita 2
di 250–280 nm. Sementara untuk pita 1,
flavon memiliki serapan maksimum pada 310
–350 nm dan flavonol pada 330–360 nm. Pita
1 berasal dari cincin B dan C, dan pita 2
berasal dari konjugasi pada cincin A.
Penambahan pereaksi geser NaOCH3 pada
F2 menyebabkan pergeseran batokromik
sebesar 64 nm pada pita 1 (Gambar 6).
Markham
(1988)
melaporkan
bahwa
pergeseran serapan maksimum sebesar 45–65
nm dengan kekuatan serapan yang tidak
menurun menunjukkan adanya gugus
hidroksil di C-4'. Karena itu, dapat
disimpulkan bahwa senyawa flavonoid pada
F2 memiliki gugus hidroksil pada C-4'. Selain
itu, terbentuk pita baru pada 326.5 nm yang
menunjukkan adanya gugus hidroksil di posisi
C-7. Menurut Markham (1988), pita serapan
baru pada 320–335 nm muncul jika terdapat
gugus hidroksil pada C-7.
Tidak terdapatnya gugus hidroksil di C-3
ditunjukkan dengan tidak adanya pergeseran
batokromik pada pita 1 sejauh 50–60 nm
(Markham 1988) pada spektrum AlCl3/HCl
(Gambar 7). Tidak adanya gugus hidroksil
pada C-3 manunjukkan bahwa F2 merupakan
senyawa
flavonoid
golongan
flavon.
Pergeseran batokromik sejauh 17 nm pada
pita 1 menunjukkan adanya gugus hidroksil di
posisi C-5. Penambahan AlCl3 akan
membentuk kompleks dengan gugus hidroksil
di C-5 dan gugus karbonil sehingga terjadi
geseran batokromik. Tidak terbentuknya
kompleks antara AlCl3 dengan gugus odihidroksi pada cincin B menyebabkan tidak
teramati
geseran
hipsokromik
yang
diakibatkan penguraian kompleks tersebut
ketika ditambahkan HCl (Markham 1988).
A
b
s
o
r
b
a
n
s
Panjang gelombang (nm)
AlCl3
AlCl3/HCl
Gambar 7 Spektrum F2 setelah penambahan
pereaksi AlCl3 dan AlCl3/HCl.
6
Penambahan
pereaksi
CH3COONa
menyebabkan pergeseran batokromik sejauh
8.5 nm (Gambar 8) pada pita 2 yang
menunjukkan adanya gugus hidroksil di C-7.
Berdasarkan Markham (1988), intensitas yang
tidak menurun menunjukkan tidak adanya
gugus yang peka terhadap basa, seperti 6,7diOH; 7,8-diOH dan 3',4'-diOH. Pada
spektrum dengan penambahan H3BO3
(Gambar 8), tidak terjadi pergeseran
batokromik yang menunjukkan tidak adanya
gugus o-diOH pada cincin A dan B.
Pergeseran batokromik sejauh 12 sampai 36
nm pada pita 1 akan terjadi jika ada gugus
tersebut (Markham 1988).
(Gambar 9) lebih baik karena hanya
menunjukkan satu noda tunggal. Karena itu,
dapat ditarik simpulan bahwa F2 merupakan
senyawa flavonoid golongan flavon.
Eluen 1
BAA
Eluen 2 BEA
Gambar 9 Kromatogram 2 arah F2 dengan
eluen BAA dan BEA.
A
b
s
o
r
b
a
n
s
Uji Fitokimia dan Golongan Flavonoid
Uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak
etanol (Tabel 4), sedangkan uji golongan
flavonoid dilakukan terhadap ekstrak etanol,
ekstrak etil asetat, dan F2 (Tabel 5).
Panjang gelombang (nm)
Tabel 4 Uji fitokimia ekstrak etanol
CH3COONa
CH3COONa 5 menit
H3BO3
Gambar 8 Spektrum F2 setelah penambahan
pereaksi
NaOMe, NaOMe 5
menit, dan H3BO3.
KLT 2 arah dilakukan untuk menguji
tingkat kemurnian F2. Dibandingkan dengan
KLT 2 arah yang dilakukan Akbar (2010)
yang menunjukkan dua berkas noda, hasil
KLT 2 arah dengan eluen BAA dan BEA
Golongan senyawa
Hasil uji
Alkaloid
Saponin
Flavonoid
Steroid
Triterpenoid
Tanin
+++
+
+++
+
-
Keterangan:
(+) menunjukkan intensitas warna, (-) menunjukkan
tidak terdapat senyawa tersebut dalam ekstrak etanol.
Tabel 5 Uji golongan flavonoid ekstrak etanol, etil asetat dan F2
Pereaksi
Ekstrak
F2
Golongan flavonoid
Krem
Kuning
Krem
Kuning
Flavon
Flavon, flavonol
Jingga
-
Jingga
Cokelat
Kuning
kecokelatan
Kuning
Cokelat
Kuning
Cokelat
-
Jingga
Kuning
Kuning
-
Etanol
Etil asetat
CH3COOPb
NaOH 0,1 N
Krem
Kuning
H2SO4
Cokelat
CH3COONa
CH3COONa+FeCl3
Na2CO3
Keterangan : (-) Tidak terdeteksi adanya senyawa golongan flavonoid.
Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa
ekstrak etanol daun dandang gendis
mengandung
senyawa
tanin,
steroid,
flavonoid, dan saponin (Tabel 4). Uji
golongan flavonoid terhadap ekstrak etanol,
ekstrak etil asetat, dan F2 menunjukkan
senyawa flavon atau flavonol. Berdasarkan
hasil identifikasi dengan sinar UV-tampak,
dapat disimpulkan bahwa senyawa aktif
antioksidan yang terkandung dalam daun
7
dandang gendis adalah flavon dengan gugus
hidroksil yang terletak pada C-4', C-5, dan C7 (Gambar 10).
OH
HO
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Bermawi N, Kristina NN. 2003. Penyimpanan
in vitro tanaman obat potensial.
Perkembangan Teknol TRO 15:51-60.
O
Blois MS. 1958. Antioxidant determinations
by the use of stable free radical. Nature
181: 1199-1200.
OH
Gambar 10
O
Struktur senyawa flavonoid
hipotesis F2.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etil asetat daun dandang gendis
memiliki aktivitas antioksidan. Fraksi 2
menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi
dibandingkan dengan 2 fraksi lainnya dengan
nilai IC50 sebesar 52.93 mg L-1. Hasil uji
golongan flavonoid, dan spektrum UVtampak memperlihatkan bahwa fraksi 2
dihipotesiskan adalah senyawa flavonoid
golongan flavon dengan gugus hidroksil yang
terletak pada C-4', C-5, dan C-7.
Saran
Perlu diadakan analisis lebih lanjut dengan
spektrometer inframerah, resonans magnetik
inti 1H, 13C, dan spektrometer massa untuk
mengidentifikasi senyawa pasti dalam fraksi
2.
DAFTAR PUSTAKA
Akbar HR. 2010. Isolasi dan identifikasi
golongan flavonoid daun dandang
gendis
(Clinachantus
nutans)
berpotensi
sebagai
antioksidan
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut
Pertanian Bogor.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia.
Padmawinata
K,
Soediro
I,
penerjemah; Niksolihin S, editor.
Bandung: ITB. Terjemahan dari:
Phytochemical Methods.
Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005.
Identifikasi senyawa antioksidan dalam
Callyspongia sp dari Kepulauan
Seribu. Maj Ilmu Kefarmasian 2:127133.
Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar.
Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Kristio 2007. Tanaman obat Indonesia. http://
toiusd. Multiply. com/ journal?
&page_start=160. [23 Mar 2010]
Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM. 2006.
Antioxidant, cytotoxic, and UVBabsorbing activity of Maynetus
guyanensis Klotzch (Celastraceae) bark
extract. Acta Amazonica 36:513-518.
Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi
Flavonoid.
Padmawinata
K,
penerjemah.
Bandung:
ITB.
Terjemahan dari: Techniques of
Flavonoid of Identification.
Molyneux P. 2004. The use of stable free
radical
diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH) for estimazing antioxidant
activity. Songklanakarin J Sci Technol
26:211-219.
Amic D, Beslo D, Trinajstic N, Davidovic.
2003. Structure-radical scavenging
activity relationship of flavonoids.
Croatia Chem Acta 76:55-61.
Pannangpetch et al. 2007. Antioxidant
activity and protective effect against
oxidative hemolysis of Clinachantus
nutans
(Burm.f)
Lindau.
Songklanakarin J Sci Technol 29:1-9.
Andriani A. 2008. Uji potensi larvasida fraksi
ekstrak daun dandang gendis terhadap
larva instar III nyamuk Aedes aegypti
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika
Prakash A. 2001. Antioxidant activity.
Medallion Laboratories Analytical
Progress 19(2).
8