7 BAB II KAJIAN PUSTAKA 2.1 Agar Agar merupakan campuran

BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1
Agar
Agar merupakan campuran polisakarida yang diekstraksi dari dinding sel
ganggang merah (Rhodophyta), khususnya genus Gracilaria dan Gelidium. Agar
merupakan sebuah polisakarida kompleks terbarukan yang terdiri dari agarosa
dan agaropektin yang digunakan dalam penyusunan media pertumbuhan
mikroba, permen dan agar jelly. Agarosa memiliki potensi pemanfaatan sebagai
pangan, farmasi dan industri kosmetik seperti penyedia biomassa potensial,
sumber oligosakarida, anti bakteri, anti kanker dan antioksidan, serta dapat
mempengaruhi sel-sel melanoma sehingga dapat melembabkan dan memutihkan
kulit (Kobayashi 1997).
Agarosa memiliki berat molekul di atas 100.000 Daltons dengan kadar
sulfat rendah di bawah 0,15%. Agaropektin memiliki berat molekul lebih ringan
sebesar kurang dari 20.000 Daltons tetapi dengan kadar sulfat tinggi sekitar 5%
sampai 8% (Kim Sang Moo 2010). Kandungan sulfat pada agarosa rendah
sehingga sering dimanfaatkan sebagai media pertumbuhan bakteri. Kandungan
sulfat mempengaruhi gel strength sehingga agar yang mengandung agarosa akan
mudah memadat. Agarosa terdiri dari rantai D-galaktosa yang berikatan secara
1,3 dengan 3,6-anhidro-L-galaktosa dan rantai 3,6-anhidro-L-galaktosa yang
berikatan secara 1,4 dengan D-galaktosa.
Gambar 1. Struktur Agarosa
(Sumber : Moo 2010)
7
8
Pemanfaatan agarosa dalam bidang bioteknologi (Renn 1990 dalam
Rasyid 1999):
1
Elektroforesis
Gel agarosa digunakan sebagai media elektroforesis untuk pemisah protein,
asam nukleat dan derivat keduanya.
2
Immunologi
Penggunaan agarosa dalam immunologi adalah untuk mendeteksi dan
mempelajari berbagai jenis antigen, terutama indikator penyakit dan
penentuan spesifikasi antibodi.
3
Kromatografi
Agarosa efektif untuk pemisahan senyawa karena bersifat uniform. Cocok
digunakan untuk pemisahan senyawa dengan berat molekul lebih dari
250.000
2.2
Enzim Agarase
Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam
amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim
memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein,
enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi,
antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel (Girindra 1986).
Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan dalam
aktivitas biologis. Enzim ini berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya
sangat khas. Enzim dalam jumlah yang sangat kecil dapat mengatur reaksi
tertentu sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan hasil
reaksinya. Enzim akan kehilangan aktivitasnya karena panas, asam dan basa kuat,
pelarut organik atau apa saja yang bisa menyebabkan denaturasi protein. Enzim
dinyatakan mempunyai sifat yang sangat khas karena hanya bekerja pada
substrat tertentu (Girindra 1986).
Enzim tersusun atas dua bagian. Apabila enzim dipisahkan satu sama
lainnya menyebabkan enzim tidak aktif. Namun keduanya dapat digabungkan
9
menjadi satu, yang disebut holoenzim. Kedua bagian enzim tersebut yaitu
apoenzim dan koenzim (Girindra 1986).
Agarase adalah enzim yang berperan dalam proses hidrolisis agar.
Agarase digunakan untuk menyiapkan protoplas dari ganggang laut (Araki 1998)
dan untuk mengisolasi asam deoksiribonukleat (DNA) dari gel agarosa (Sugano
1993).
Berdasarkan mekanismenya dalam menghidrolisis agarosa, enzim
agarase diklasifikasikan kedalam dua kelompok yaitu α-agarase yang memotong
ikatan α-1,3 dari agarosa dan β-agarase yang memotong ikatan β-1,4 dari
agarosa (Sugano 1993). Bakteri pada kelompok I dapat melembutkan agar
(media) dan membentuk cekungan di sekitar koloni dan kelompok II
menyebabkan pencairan luas agar (media) (Kobayashi 1997).
Gambar 2. Posisi Pemotongan Agarosa oleh Enzim α-agarase dan βagarase
(Sumber : Eckborg 2005)
α-agarase
yang
menghidrolisis
ikatan α-1,3
dari agarosa
akan
menghasilkan rangkaian oligosakarida yang disebut agarobiose. Sedangkan βagarase yang menghidrolisis ikatan β-1,4 dari agarosa akan menghasilkan
rangkaian oligosakarida yang disebut neoagarobiose (Moo 2010).
10
Gambar 3. Struktur Agarobiose (A), Struktur Neoagarobiose (B)
(Sumber : Moo 2010)
Berdasarkan sekuen gen glikosida hidrolase, ada tiga famili βagarase yaitu GH-16, GH-50 dan GH-86. Famili GH-16 ditemukan sangat
melimpah dengan
Aeromonas
β-agarase yang berasal dari Streptomyces coelicolor A3,
sp., Pseudomonas sp. ND137,
Pseudoalteromonas CY24,
Pseudoalteromonas atlantica ATCC 19262 dan dari Zobellia galactanivorans.
Family GH-50 mengandung
sedangkan
family
dua
β-agarase
dari
Vibrio
sp.
JT0107,
GH-86 mengandung β-agarase dari P. alantica (Allouch
2003).
Tahapan
reaksi degradasi agarosa oleh β-agarase terkarakterisasi
dengan baik pada Pseudoalteromonas atlantica ATCC 19262. Pada bakteri ini
terdapat
dua
jenis β-agarase
yang
bekerja
secara
sekuensial.
Enzim
ekstraseluler endo-β- agarase I memiliki aktivitas mendepolimerisasi agarosa
menjadi neoagarotetrosa sebagai produk akhir. Neoagarotetrosa kemudian akan
dihidrolisis lebih lanjut oleh 2 enzim periplasmik, β-agarase II (lebih
dengan sebutan neoagarotetrosa hidrolase) dan neoagarobiose
dikenal
hidrolase, yang
menghasilkan produk akhir berupa 3,6-anhidro-L-galaktosa dan D-galaktosa
(Vera 1998).
Berbeda halnya dengan β-agarase yang dihasilkan oleh banyak kelompok
bakteri, enzim α-agarase diketahui hanya dihasilkan oleh Alteromonas agaroliticus
GJIB. Sistem agarolitik pada bakteri ini terdiri atas 2 enzim yaitu suatu αagarase yang memecah ikatan α-(1,3) dari agarosa menjadi oligosakarida dalam
bentuk agarobiosa dan enzim β-galaktosidase spesifik untuk kehadiran 3,6anhidro-L-galaktosa sebagai produk akhir (Vera 1998).
11
Sejauh ini, beberapa agarase telah diisolasi dari mikroorganisme yang
berbeda, termasuk Alteromonas sp. (Kirimura 1999 dan Wang 2006),
Pseudoalteromonas sp. (Vera 1998), Vibrio (Araki 1998), Cytophaga
(Duckworth 1969) dan Thalassomonas (Ohta 2005). Semua mikroorganisme
tersebut merupakan bakteri gram negatif. Di samping itu, agarase juga telah
diisolasi dari beberapa bakteri non-marine, seperti dari tanah (Sampietro 1971),
sungai (Agbo 1979) dan limbah (Hofsten 1975).
Kemampuan mendegradasi agarosa oleh agarase membuat agarase sangat
bermanfaat dalam industri makanan, industri kosmetik, dan medis. Produk
degradasi dari agar, neoagarooligosakarida menghambat pertumbuhan bakteri
dan memperlambat laju degradasi pati. Selain itu, neoagarobiose (NA2),
merupakan suatu senyawa langka karena memiliki kemampuan sebagai
pelembab dan memberikan efek pemutih pada sel melanoma (Kobayashi 1997).
Fraksi polisakarida dari ganggang laut oleh agarase juga memiliki aktivitas
merangsang makrofag (Kirimura 1999 dan Ohta 2005).
2.3
Teknik 16S rRNA
RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti pembentuk protein
pada suatu makhluk hidup. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang
identik pada seluruh organisme. Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein
yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar
(large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokariotik berdasarkan
nilai koefisien sedimentasi, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Gen 16S
rRNA merupakan bagian dari subunit kecil ribosom dan berperan penting
dalam pengenalan ujung 5’–mRNA serta memposisikan pada letak yang tepat
dalam ribosom (Clarridge 2004).
RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya
sangat lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan
urutan basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik
karena mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan
kronologi evolusi bumi.
Sebaliknya,
urutan basa
yang
bersifat
variatif
12
dapat
digunakan
untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur
dalam satu spesies (Pangastuti 2006).
Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek sehingga tidak
ideal dari segi analisis statistika. Sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur
sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis. Sekuens
gen 16S rRNA ini dapat digunakan untuk identifikasi bakteri yang mengalami
penyimpangan strain fenotip. 5S memiliki 120 urutan basa, 16S memiliki 1500
urutan basa, dan 23S memiliki 2900 urutan basa (Pangastuti 2006).
Jadi metode 16s rRNA adalah teknologi analisis secara molekuler dengan
menganalisis sekuen gen 16S rRNA. Gen ini adalah gen yang mengkode RNA
ribosomal sub unit kecil ribosom (16S untuk prokariot) dan memiliki urutan yang
khas dan berbeda pada setiap bakteri sehingga bisa dijadikan penanda molekuler
untuk proses identifikasi (Claridge 2004). Dua bakteri dapat dikelompokkan
dalam satu genus bila memiliki kemiripan maksimum (maximum identity) ≥ 93
≤97%. Sementara dua bakteri dianggap sebagai satu spesies bila memiliki
kemiripan maksimum ≥ 97% (Hagstrom 2002).
Analisis gen penyandi 16S rRNA praktis untuk definisi spesies, karena
molekul ini bersifat ubikuitus, sehingga dapat dirancang suatu primer yang
universal untuk seluruh kelompok. Penentuan spesies baru pun dapat dilakukan
tanpa mengisolasi mikroorganisme yang bersangkutan.
Secara umum, beberapa keuntungan menggunakan metode 16S rRNA
adalah :
Molekul yang dikode oleh gen 16S rRNA ini ditemukan pada semua prokariot
Memiliki jumlah nukleotida yang cukup banyak untuk dibandingkan satu
dengan lainnya
Memiliki basa-basa yang lestari
Memiliki daerah variable yang cukup untuk melihat hubungan kekerabatan
antar mikroorganisme
13
2.4
Identifikasi 16S rRNA dengan Metode Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Identifikasi
molekuler
digunakan untuk mempelajari kesamaan
deoxyribonucleic acid (DNA) atau homologi genetik diantara organisme.
Kesamaan DNA dapat dipelajari dengan sekuensing terhadap basa DNA
atau RNA dan hibridisasi DNA (Malik 2006). Penggunaan untai gen
ribosomal RNA untuk klasifikasi mikroorganisme saat ini merupakan salah
satu
analisis
yang cukup akurat untuk menentukan kekerabatan diantara
mikroorganisme (Suryadi 2002). Situs DNA molekul 16S rRNA dikenal
mempunyai
informasi
genetik
yang
cukup
lengkap
untuk
melihat
kekerabatan bakteri (Leblond 1996).
Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase
Chain Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode untuk membuat salinan
segmen spesifik dari suatu DNA.
Metode ini jauh lebih cepat daripada
pengklon gen dengan DNA plasmid atau DNA faga
dan seluruhnya
dilakukan in vitro (Campbell 2002).
Gen pengkode 16S rRNA terdapat bagian penyimpan yang berguna
untuk mendesain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa
fragmen. Fragmen ini termasuk bagian
hipervariable yang tidak mudah
termutasi dan mengandung tanda urutan spesifik spesies yang berguna untuk
mengidentifikasi bakteri hingga ke level spesies (Israhmadini 2008).
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,
annealing dan ekstensi utas DNA oleh enzim DNA polymerase. Setiap siklus
dikondisikan pada temperatur berbeda yang telah diprogram oleh mesin yang
disebut thermal cycler. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus, siklus ini meliputi:
denaturasi (95°C), untaian ganda DNA target dipisahkan
annealing (55-60°C), primer dibiarkan berikatan dengan ujung-ujung
urutan DNA target yang spesifik, dan
ekstensi (72°C) merupakan proses pemanjangan pita DNA setelah berikatan
dengan primer.
14
Taq polimerase menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer dengan
menggunakan untai DNA yang lebih panjang sebagai cetakannya. Sedangkan
untuk waktu tergantung pada panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan
sebagai produk amplifikasi. Campuran reaksi PCR terdiri atas komponenkomponen yaitu template DNA, buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),
primer dan unit taq polimerase (Malik 2006).
2.5
Gracilaria sp.
Gracilaria sp. merupakan penghasil agar (agarofit) yang merupakan
senyawa hidrokoloid dari rumput laut yang mempunyai kekuatan gel yang besar.
Selama ini Gracilaria sp. merupakan bahan baku utama industri makanan untuk
pembuatan agar-agar serta bahan kosmetik. Rumput laut ini digolongkan ke dalam
rumput laut merah (Rhodophyta).
Kingdom
Divisi
Kelas
Ordo
Famili
Genus
Spesies
: Protista
: Rhodophyta
: Rhodophyceae
: Gigartinales
: Gracilariaceae
: Glacilaria
: Glacilaria sp.
Gambar 4. Gracilaria sp.
(Sumber : dokumentasi pribadi)
15
Sebanyak 90% Gracilaria sp. hidup di laut dan 10% hidup di air tawar.
Ciri umum dari Gracilaria sp. adalah :
1.
Berwarna merah karena mengandung pigmen fikoeritrin
2.
Mempunyai bentuk thallus silindris atau gepeng dengan percabangan yang
membentuk garpu
3.
Permukaannya halus.
4.
Diameter thallus berkisar antara 0,5 – 2 mm
5.
Panjang dapat mencapai 30 cm atau lebih
6.
Glacilaria tumbuh di rataan terumbu karang dengan air jernih dan arus
cukup
7.
Hidup pada salinitas ideal berkisar 20-28 per mil
Gracilaria merupakan jenis rumput laut yang mempunyai toleransi cukup
luas terhadap faktor-faktor lingkungannya, dapat hidup di perairan yang tenang
dengan substrat berlumpur dan pH berkisar antara 6-9 (Anggadiredja 2006).
Reproduksinya dapat terjadi secara generatif yaitu dengan pembentukan spora
yang selanjutnya tumbuh menjadi ganggang jantan dan betina (Anggadiredja
2006).
2.6
Sargassum sp.
Salah satu jenis dari alga coklat adalah Sargassum sp. Alga ini mampu
tumbuh pada substrat batu karang di daerah berombak (Anggadiredja 2006).
Klasifikasi Sargassum sp. sebagai berikut :
Kingdom
Divisi
Kelas
Bangsa
Suku
Genus
Spesies
: Plantae
: Phaeophyta
: Phaeophyceae
: Fucales
: Sargassaceae
: Sargassum
: Sargassum sp.
16
Gambar 5. Sargassum sp.
(Sumber : dokumentasi pribadi)
Ciri-ciri umum dari jenis ini adalah bentuk thallus umumnya silindris
atau gepeng, cabangnya rimbun menyerupai pohon di darat, bentuk daun melebar,
lonjong, atau
seperti pedang,
yang umumnya soliter,
mempunyai gelembung
udara (bladder)
panjang umumnya mencapai 7 meter (di Indonesia
terdapat 3 spesies yang panjangnya 3 meter), warna thalllus umumnya coklat.
Sargassum biasanya dicirikan oleh tiga sifat yaitu adanya pigmen coklat yang
menutupi warna hijau, hasil fotosintesis terhimpun dalam bentuk laminaran
dan algin serta adanya flagel (Tjondronegoro 1989).
Sargassum tersebar luas di Indonesia, tumbuh di perairan yang
terlindung maupun yang berombak besar pada habitat batu. Pada umumnya
Sargassum tumbuh di daerah terumbu karang (coral reef) seperti di Kepulauan
Seribu, terutama di daerah rataan pasir (sand flat). Daerah ini akan kering pada
saat surut rendah, mempunyai dasar berpasir, secara sporadis terdapat pula
pada karang hidup atau mati, rumput laut coklat tumbuh diatasnya (Atmadja dan
Soelistijo 1988). Sargassum sp. mengandung iodium dan senyawa aktif seperti
senyawa fenol.