pengantar kromatografi

PENGANTAR KROMATOGRAFI
A. PENDAHULUAN
Takrif
Kromatografi merupakan teknik pemisahan senyawa campuran berdasarkan perbedaan
kecepatan migrasi, karena adanya perbedaan koefisien distribusi masing-masing senyawa di
antara dua fase yang saling bersinggungan dan tidak saling campur, yang disebut sebagai fase
gerak (mobile phase) yang berupa zat cair atau zat gas, dan fase diam (stationary phase) yang
berupa zat cair atau zat padat. Apabila pemilihan kedua fase dilakukan secara tepat, maka lambat
laun komponen sampel akan memisah. Aplikasi kromatografi berkembang dengan cepat
sehingga memungkinkan diperoleh suatu pemisahan, isolasi, dan identifikasi komponenkomponen dengan struktur yang hampir sama satu dengan yang lain yang terdapat dalam suatu
sampel. Hal tersebut tidak mungkin diperoleh dengan cara pemisahan yang lain. Teknik
kromatografi digunakan pada hampir setiap metode analisis sampel kompleks karena
kemampuan pemisahannya, kecepatannya, dan penggunaan jumlah sampel yang sedikit.
Klasifikasi
Metode kromatografi secara umum dapat dibedakan berdasarkan fase gerak dan fase
diam yang digunakan. Berdasarkan fase gerak, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi
gas (GC = gas chromatography) dan kromatografi cair (LC = liquid chromatography).
Berdasarkan fase diam dapat digunakan sebagai dasar klasifikasi selanjutnya. Padatan yang
bersifat sebagai adsorben, dapat digunakan sebagai fase diam dengan mekanisme pemisahan
berdasarkan kekuatan interaksi fisik permukaan (adsorpsi) di antara kedua fase. Bila fase
geraknya gas disebut kromatografi gas padat (GSC = gas solid chromatography), dan bila fase
geraknya cair disebut kromatografi cair padat (LSC = liquid solid chromatography). Fase diam
cair yang disalutkan pada penyangga padatan, dapat digunakan sebagai sebagai fase diam dengan
mekanisme pemisahan berdasarkan partisi komponen sampel di antara dua cairan yang tidak
saling campur. Bila fase geraknya gas disebut kromatografi gas cair (GLC = gas liquid
chromatography), dan bila fase geraknya cair disebut kromatografi cair cair (LLC = liquid liquid
chromatography). Dengan demikian, kromatografi cair-cair disebut juga sebagai kromatografi
partisi dan kromatografi cair padat disebut juga sebagai kromatografi penjerapan / adsorpsi.
Dalam kromatografi cair dikenal dua metode yang lain, yaitu kromatografi penukar ion (IEC =
ion exchange chromatography) dan kromatografi eksklusi (EC = exclusion chromatography).
Pada kromatografi penukar ion, komponen ionik sampel dipisahkan berdasarkan pertukaran
selektif dengan ion counter pada fase diam. Pada kromatografi eksklusi pemisahan terjadi
berdasarkan ukuran dan geometri molekul.
Berdasarkan kepolaran relatif fase diam terhadap fase gerak, maka kromatografi
dibedakan menjadi kromatografi fase normal (normal phase) dan fase terbalik (reversed phase).
1
Pada kromatografi fase normal digunakan fase diam polar dan fase gerak nonpolar, sedangkan
pada kromatografi fase terbalik, fase diam relatif nonpolar dibanding fase gerak.
Berdasarkan instrumen yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi
kolom dan kromatografi planar. Apabila fase diam dipadatkan di dalam pipa gelas atau pipa
logam, kemudian fase gerak gas atau cair dialirkan melalui fase diam tersebut berdasarkan
gravitasi ataupun dengan tekanan, maka cara ini disebut sebagai kromatografi kolom. Apabila
fase diam berupa kertas berpori (kromatografi kertas) ataupun padatan halus yang diratakan pada
plat gelas atau plat aluminium (kromatografi lapis tipis), kemudian fase gerak cair akan bergerak
karena pengaruh daya kapilaritas (metode ascendens) atau gravitasi (metode descendes), maka
cara ini disebut sebagai kromatografi planar.
II. KOEFISIEN PARTISI ATAU KONSTANTA DISTRIBUSI
Apabila solut masuk ke dalam suatu sistem kromatografi, maka akan segera terdistribusi
di antara fase diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak dihentikan, maka akan terjadi
kesetimbangan di antara kedua fase. Distribusi molekul-molekul solut di antara kedua fase
ditentukan oleh tetapan kesetimbangan yang disebut koefisien partisi atau konstanta distribusi
(K), yang merupakan harga perbandingan konsentrasi solut pada tiap fase:
K
Cs
Cm
Cs adalah konsentrasi solut dalam fase diam (stationary phase), dan Cm adalah konsentrasi solut
dalam fase gerak (mobile phase).
2
KROMATOGRAFI KERTAS
A. PENDAHULUAN
Mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas (KK) umumnya berdasarkan partisi
sehingga teknik ini dikenal dikenal sebagai Paper Partition Chromatography, dimana fase diam
adalah air yang disokong oleh molekul-molekul selulosa dari kertas, dan fase gerak biasanya
merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut organik dan air. Namun pada kertas yang telah
dimodifikasi dengan penambahan alumina, silika gel, atau ion exchange resin, mekanisme
pemisahannya dapat menjadi berbeda dengan teknik pengerjaan yang sama.
B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KERTAS
1. Penyiapan Fase Gerak / Eluen
Eluen biasanya merupakan campuran yang terdiri dari pelarut organik sebagai eluen
utama, air dan berbagai tambahan seperti asam, basa, atau pereaksi kompleks, untuk
memperbesar kelarutan dari beberapa komponen dan untuk mengurangi kelarutan komponen
lainnya. Idealnya eluen tidak mengandung air dan terdiri dari cairan yang tidak campur dengan
air, karena air merupakan komponen dari fase diam. Namun dalam praktek seringkali air
digunakan sebagai salah satu komponen campuran eluen, dengan pertimbangan bahwa air yang
berperan sebagai fase diam telah terikat kuat pada selulosa kertas melalui hidrogen bonding.
Eluen harus murni dan sangat mudah menguap tanpa meninggalkan residu / sisa / noda sehingga
tidak mengganggu dalam pendeteksian bercak. Karena mudah menguap, maka komponen
sampel akan cepat mencapai kesetimbangan distribusi di dalam fase gerak dan fase diam, namun
volatilitas yang terlalu tinggi akan membuat eluen lebih cepat hilang meninggalkan kertas
setelah bergerak sehingga komponen sampel tidak dapat mencapai kesetimbangan secara
optimal. Kecepatan bergeraknya harus tidak cepat dipengaruhi oleh perubahan suhu.
Tiap eluen memiliki perbandingan tertentu dalam campurannya, sehingga untuk
menghasilkan campuran dengan perbandingan yang sesuai harus dibuat secara hati-hati dan teliti
sekalipun dengan gelas ukur. Karena mudah menguap, maka eluen harus dibuat baru untuk
menjamin agar komposisi dalam campurannya tetap dapat dipertahankan hingga akhir elusi.
Eluen tidak boleh digunakan setelah selang beberapa lama. Untuk elusi selama satu malam,
eluen hanya digunakan satu kali pakai.
Berikut ini adalah contoh cara pemilihan eluen. Senyawa organik polar akan lebih mudah
larut dalam air daripada dalam zat cair organik. Oleh karena itu gerakan komponen akan lambat
jika digunakan pelarut anhidrida, namun penambahan air pada pelarut akan menyebabkan
komponen-komponen untuk bergerak. Oleh karena itu n-butanol bukan merupakan pelarut untuk
asam amino jika tidak dijenuhkan dengan air. Selain itu, penambahan asam cuka disertai dengan
pemberian lebih banyak air akan menjadi baik, karena menaikkan kelarutan asam amino
terutama yang bersifat basa. Campuran ketiga pelarut tersebut sangat baik digunakan untuk
3
pemisahan asam amino. Banyak senyawa polar lain yang memiliki karakteristik kelarutan yang
mirip asam amino, seperti indol, guanidin dan fenol, sehingga dapat dipisahkan menggunakan
campuran tersebut. Beberapa contoh dari macam-macam campuran eluen dapat dilihat seperti
dalam tabel berikut:
2. Penjenuhan Bejana / Chamber Kromatografi
Penjenuhan bejana dilakukan dengan melapisi dinding bagian dalam bejana kromatografi
dengan kertas saring, sekurang-kurangnya setengah keliling bejana dan hampir mencapai bagian
atas bejana, yang berperan sebagai parameter tingkat kejenuhan bejana terhadap uap eluen.
Setelah itu sejumlah eluen dimasukkan ke dalam bejana kromatografi hingga tinggi permukaan
eluen dalam bejana lebih kurang 2 cm. Tutup rapat bejana dan biarkan hingga seluruh isi bejana
jenuh dengan uap eluen, yang ditunjukkan oleh terbasahinya seluruh permukaan kertas saring
pada dinding bagian dalam bejana oleh eluen. Bejana harus berada dalam kondisi jenuh oleh uap
eluen sebelum digunakan untuk elusi agar elusi bejalan stabil. Sedapat mungkin menggunakan
bejana sekecil mungkin, sehingga kejenuhan dan homogenitas atmosfer dalam bejana lebih
mudah dicapai
3. Penyiapan Kertas Kromatografi
Kertas yang digunakan dalam kromatografi kertas adalah kertas berpori dari selulosa
murni, memiliki afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lain dengan membentuk hidrogen
bonding. Bersifat reduktor sedang, dan bereaksi dengan oksidator bila kontak dalam waktu yang
lama. Oleh karena itu pereaksi yang korosif seperti H2SO4 pekat tidak dapat digunakan sebagai
spray reagent. Kertas yang banyak digunakan hingga sekarang adalah kertas saring Whatmann
No.1. Meskipun demikian jenis kertas Whatmann dengan berbagai nomor pun banyak
digunakan, dimana semuanya dibuat dengan kemurnian yang tinggi dan tebal yang merata.
4
Sekalipun berperan sebagai suport / penyokong / penyangga, namun kertas juga
memberikan efek-efek serapan yang disebabkan oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil
sehingga kertas memiliki afinitas besar terhadap air atau pelarut polar lain dengan membentuk
hidrogen bonding. Selain itu sejumlah kecil gugus karboksil dalam selulosa dapat menaikkan
efek pertukaran ion. Dengan demikian kertas memiliki pengaruh terhadap kecepatan alir eluen.
Penurunan kerapatan dan kenaikkan ketebalan kertas akan menaikkan kecepatan alir eluen.
Kertas Whatmann no. 1 termasuk dalam kelompok medium sehingga memiliki karakter
medium flow rate. Kertas yang lebih tebal seperti Whatmann No. 3 atau 3 MM digunakan untuk
pemisahan pada jumlah yang lebih besar, karena dapat menampung cuplikan lebih banyak tanpa
menambah area noda awal. Sedangkan untuk penggunaan umum biasanya digunakan yang
medium flow rate. Berikut adalah macam-macam kertas Whatmann dengan karakteristik aliran
eluen yang dihasilkan :
Kertas tersedia dalam berbagai standar lembaran, bulatan, gulungan dan dalam bentuk
tertentu. Kertas harus disimpan di tempat yang jauh dari sumbar uap, terutama amonia yang
memiliki afinitas tertinggi terhadap selulosa, jangan disimpan di tempat yang memiliki
perubahan kelembaban yang tinggi, dan tidak boleh tersentuh oleh zat-zat yang tidak
dikehendaki. Jika dikehendaki pemisahan dengan sistem fase terbalik maka kertas dapat dilapisi
dengan senyawa hidrofobik, seperti lateks dari karet, minyak mineral, minyak silikon, dengan
pelarut polar sebagai eluen. Kondisi tersebut sesuai untuk pemisahan asam-asam lemak atau
senyawa nonpolar yang bergerak terlalu cepat karena sulit terpartisi pada fase diam polar.
Sebelum digunakan, kertas dipotong dengan ukuran yang disesuaikan dengan ukuran
chamber dan banyak sedikitnya cuplikan. Kertas diberi tanda berbentuk garis dengan jarak
tertentu dari bagian bawah sebagai tempat penotolan dan dimaksudkan agar saat kertas
dicelupkan pada eluen, maka spot tidak tercelup di dalam eluen. Tentukan jarak solvent front
yang merupakan garis batas akhir perambatan eluen, yang tidak lain adalah jarak atau waktu
yang dibutuhkan untuk melakukan elusi. Apabila eluen telah mencapai solvent front maka elusi
diakhiri. Komponen-komponen sampel harus dapat memisah sebelum eluen merambat hingga
solvent front. Tanda garis berjarak tertentu dari bagian atas kertas berfungsi sebagai tanda
dimana kertas akan dilipat kemudian digantungkan pada tutup chamber.
5
4. Penempatan Cuplikan pada Kertas
Larutan sampel yang akan dipisahkan, ditotolkan pada kertas pada daerah yang telah
diberi tanda sehingga totolan membentuk noda / spot. Pada saat penotolan, kertas dibiarkan pada
kondisi mendatar sehingga spot dalam keadaan kompak yang berbentuk bulat dengan diameter
tidak lebih dari 0,5 cm. Besarnya diameter terkait dengan tebal dan karakteristik serapan kertas.
Spot yang lebih kecil akan menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Penotolan tidak boleh
terlalu banyak karena akan menyebabkan tidak tercapainya kesetimbangan distribusi selama
elusi sehingga terbentuk kedudukan atau lokasi yang kabur. Hal yang diutamakan dalam
penotolan bukanlah jumlah volume, namun banyaknya cuplikan yang tertinggal bila eluen telah
menguap.
Apabila sampel terlalu encer untuk ditotolkan satu
kali, maka spot sampel dipekatkan dengan cara
menotolkan berulang-ulang di tempat yang sama, dengan
jarak waktu setelah totolan sebelumnya mengering. Spot
sebaiknya dibiarkan mengering di udara, namun bila
mungkin dapat pula dikeringkan dengan bantuan kipas
angin. Pengeringan tidak boleh menggunakan udara
panas, terutama jika larutan bersifat asam karena kertas
akan menjadi hitam. Pada analisis kualitatif yang
dilanjutkan dengan kuantitatif, penotolan dapat dilakukan
dengan gelas pipet mikro yang dapat diatur volume
penotolan dengan diameter sama. Namun pada analisis
kualitatif sederhana dapat digunakan pipa kapiler / gelas kapiler atau bahkan batang tusuk gigi
yang telah dipotong bagian ujungnya.
5. Elusi
Setelah totolan terakhir kering, pasang kertas pada penggantung dan masukkan ke dalam
bejana hingga kertas tercelup di dalam fase gerak, namun tidak boleh melampaui totolan karena
komponen akan terlarut dari kertas. Kertas dapat digantung ataupun diletakkan sehingga pelarut
bergerak ke atas, atau ke bawah, atau mendatar tergantung pada teknik elusi yang dikerjakan.
Saat pencelupan, permukaan kertas jangan sampai terlalu terbasahi oleh eluen karena hal ini
tidak akan memisahkan sama sekali atau dapat menyebabkan daerah noda menjadi kabur. Tutup
bejana dengan rapat dan biarkan terjadi proses elusi. Bejana harus ditutup rapat selama proses
elusi agar bejana dipertahankan dalam kondisi jenuh oleh uap eluen. Selain itu, komposisi
campuran eluen tetap dapat dipertahankan hingga akhir elusi agar elusi berjalan stabil. Semakin
banyak komposisi eluen, maka akan semakin sulit mempertahankan komposisi campurannya.
6
Proses pemisahan yang terjadi dikenal sebagai analisa kapiler, karena eluen bergerak ke
atas (ascending) melalui serta-serat kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen
sampel pada perbedaan jarak dalam arah aliran eluen, dengan laju perambatan lambat dan makin
lama menurun karena pengaruh dari gaya berat. Namun perambatan yang lambat akan
memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kesetimbangan distribusi selama elusi sehingga
menghasilkan pemisahan yang semakin baik dengan bercak yang jelas dan tidak kabur.
Kecepatan aliran eluen akan meningkat seiring penurunan viskositas eluen dan kenaikan suhu.
Amati
pemisahan
komponen
yang terjadi
hingga
perambatan eluen mencapai jarak yang telah ditetapkan (solvent
front). Bila eluen telah bergerak sampai jarak yang cukup
jauhnya atau sampai pada jarak yang telah ditentukan sebagai
solvent front, maka kertas diambil dari bejana. Kedudukan dari
permukaan eluen harus selalu diberi tanda segera setelah kertas
diambil dari bejana. Penandaan dapat menggunakan pensil pada
sisi samping kertas. Seperti halnya pada pengeringan noda,
pengeringan eluen setelah elusi sebaiknya dibiarkan di udara.
Bila dikehendaki dapat menggunakan kipas angin. Pengeringan
tidak boleh menggunakan udara panas, karena dapat merusak
beberapa komponen.
Eluen harus cepat menguap tanpa meninggalkan residu sehingga
tidak mengganggu pengamatan. Penghilangan eluen harus
dilakukan
secara
sempurna
untuk
mencegah
pengaruh
penambahan pereaksi saat deteksi. Selain itu penting pula
terutama dalam teknik kromatografi 2 arah, dimana jejak eluen
yang pertama harus hilang sebelum elusi yang kedua. Dalam hal
ini elusi dilakukan pada eluen yang lebih mudah menguap terlebih
dahulu.
7
6. Deteksi Daerah Noda
Senyawa yang berwarna dapat dilihat sebagai noda berwarna yang terpisah pada akhir
elusi. Sedangkan untuk senyawa yang tak berwana deteksi dapat dilakukan secara fisika ataupun
kimia. Secara fisika, deteksi bercak komponen umumnya dilakukan dengan melakukan
pengamatan di bawah sinar ultraviolet sebelum dan sesudah elusi. Panjang gelombang yang
umum digunakan adalah 366 nm dan 254 nm. Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik
fosforescen atau fluorescen.
Secara kimia, deteksi bercak komponen dilakukan dengan penyemprotan pereaksi kimia
tertentu yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua komponen.
Penyemprotan dilakukan dari samping ke samping atau dari atas ke bawah. Pada kondisi ideal,
tiap komponen memberikan warna yang khas bila diberi suatu pereaksi, kecuali untuk
komponen-komponen yang memiliki struktur kimia yang hampir sama akan memberikan warna
yang hampir sama pula. Penambahan pereaksi yang kedua dapat menghasilkan perubahan warna
yang khas terhadap beberapa komponen, namun menyebabkan lenyapnya komponen yang lain.
Penguapan yang cepat dari pelarut spray reagent dibutuhkan untuk mencegah difusi dari
bercak-bercak komponen. Pelarut pereaksi yang biasa digunakan yaitu etanol, propanol, nbutanol, kloroform ataupun campuran dari pelarut-pelarut tersebut. Campuran berair dapat
digunakan namun harus seminimal mungkin karena dapat memberikan efek melemahkan kertas.
Penyemprotan spray reagent harus dilakukan di lemari asam. Selesai penyemprotan alat harus
segera dibersihkan untuk mencegah lubang penyemprot menjadi buntu.
7. Identifikasi Senyawa
Identifikasi
bercak
komponen dilakukan dengan
menghitung harga Retardation Factor (Rf) sebagai derajat
retensi, yang didefinisikan sebagai angka banding antara jarak
tempuh bercak dari tempat totolan terhadap jarak tempuh
eluen. Dalam penentuan Rf, letak bercak komponen diukur
dari pusat bercak. Harga Rf adalah spesifik untuk masingmasing
senyawa,
karena
ditentukan
oleh
koefisien
distribusinya. Apabila sampel mengandung komponen yang
struktur kimianya hampir sama, maka akan diperoleh bercak
dengan harga Rf yang berdekatan. Dalam hal ini perlu
melakukan teknik dua dimensi.
Harga
Rf
dari
komponen
sampel
kemudian
dibandingkan dengan harga Rf senyawa baku yang dielusi pada kondisi yang sama. Apabila
harga Rf keduanya relatif sama maka dapat diduga bahwa sampel mengandung senyawa yang
sama dengan senyawa baku. Guna memastikan hasil analisis kualitatif tersebut di atas, seringkali
diperlukan data analisis kualitatif metode lain sebagai data pendukung.
8
Harga Rf yang dihasilkan seringkali berbeda dari Rf yang dimuat dalam literatur, karena
harga ini ditentukan oleh kondisi percobaan seperti tempertur, ukuran spot, kualitas kertas,
kejenuhan bejana, dll. Oleh karena itu, bila harga Rf dibuat daftar untuk dipublikasikan maka
semua kondisi yang digunakan dalam elusi harus dipaparkan. Guna membandingkan data,
seringkali digunakan pula harga retensi relatif, Rr, yang didefinisikan sebagai angka banding
antara jarak tempuh bercak senyawa sampel terhadap jarak tempuh bercak senyawa baku.
Faktor-faktor yang menentukan harga Rf antara lain:
1. Eluen. Perubahan yang sangat kecil komposisi eluen dapat menyebabkan perubahan
harga Rf, karena perubahan komposisi eluen akan mempengaruhi koefisien distribusi.
2. Suhu. Perubahan suhu akan mempengaruhi harga koefisien distribusi dan kecepatan
aliran eluen.
3. Ukuran bejana. Volume bejana akan mempengaruhi homogenitas atmosfer dalam bejana
dan pencapaian tingkat kejenuhan bejana. Jika digunakan bejana besar maka ada tendensi
elusi terjadi lebih lama, terjadi perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, sehingga
akan mempengaruhi koefisien distribusi.
4. Kertas. Ketebalan dan kerapatan kertas akan mempengaruhi kecepatan aliran sehingga
akan mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5. Sifat campuran. Berberapa senyawa akan mengalami partisi di antara volume-volume
yang sama dari fase diam dan fase gerak, sehingga hampir selalu mempengaruhi
karakteristik kelarutan satu terhadap yang lain.
C. TEKNIK ELUSI
1. Metode Penaikkan (Ascending)
Pada metode ini, eluen diletakkan di bagian bawah bejana, dan kertas dicelupkan di
atasnya. Eluen akan merambat ke atas dengan gaya kapiler dengan laju perambatan yang pelan,
dan makin lama menurun karena pengaruh dari gaya berat. Namun demikian perambatan yang
pelan memperbesar kemungkinan untuk tercapainya kondisi kesetimbangan sehingga
menghasilkan pemisahan yang baik.
Gambar (a) menunjukkan kertas diletakkan pada penggantung yang dikaitkan dengan
tutup bejana. Gambar (b) menunjukkan kertas berbentuk silinder dengan spot sampel ditotolkan
melingkar dekat ujung bawah kertas. Ujung pertemuan kertas dikaitkan dari atas ke bawah, dan
silinder didirikan dengan ujung bawah tercelup di dalam eluen. Gambar (c) menunjukkan bentuk
9
bejana berbentuk silinder, dimana gabus dengan lubang untuk batang pengait digunakan sebagai
tutup.
2. Metode Penurunan (Descending)
Pada metode ini di dalam bejana yang dapat terbuat dari
gelas, platina, atau logam tahan karat dilengkapi dengan lubang
untuk memasukkan eluen, bak eluen, dan batang gelas yang
berfungsi untuk menyangga agar kertas tidak lepas. Meskipun
desain bejana yang digunakan lebih rumit, namun cara ini lebih
cepat karena eluen mengalir dari atas ke bawah. Pada menitmenit awal, eluen mengalir oleh gaya kapiler, dan akan mengalir
oleh gaya gravitasi setelah eluen melintasi batang gelas.
3. Metode Mendatar/Melingkar (Circular)
Pada metode ini, kertas berbentuk lingkaran dan di bagian tengahnya diberi lubang
sebagai tempat untuk meletakkan sumbu yang terbuat dari gulungan kertas ataupun benang.
Cawan petri dapat digunakan sebagai tempat eluen. Sampel diteteskan di sekitar pusat kertas,
kemudian kertas diletakkan horisontal sehingga sumbu tercelup dalam eluen. Melalui sumbu
tersebut eluen akan naik yang kemudian membasahi kertas, dan oleh daya kapiler eluen akan
mengembang melingkar ke arah tepi kertas sambil membawa komponen-komponen sampel.
Bercak-bercak yang terjadi berupa garis lengkung dengan diameter makin panjang bila bercak
makin ke tepi.
4. Metode Dua Dimensi (Two Dimensional)
Pada metode ini, elusi dilakukan secara berturut-turut dalam dua arah yang saling tegak
lurus. Kertas berbentuk persegi dan sampel ditotolkan pada salah satu sudut. Elusi dengan
campuran eluen 1, dengan ujung kertas AB dicelupkan sehingga memberikan pemisahan seperti
ditunjukkan pada gambar a. Setelah itu lembaran kertas diambil dan dikeringkan, kemudian
diputar 90o dan dielusi untuk kedua kalinya dengan ujung AC tercelup dalam eluen yang
berbeda. Dengan cara ini, komponen-komponen yang tidak terpisah sempurna dengan sistem
eluen pertama dapat menjadi sempurna bila digunakan kombinasi dengan sistem eluen kedua.
Hasil elusi ini akan memberikan bercak seperti pada gambar b.
10
D. MEKANISME PEMISAHAN DALAM KROMATOGRAFI KERTAS
Setelah eluen mengenai spot sampel, dengan segera sampel akan berinteraksi dengan
kedua fase dengan prinsip solve disolve like, dimana bagian polar dari senyawa akan berinteraksi
dengan fase yang polar sedangkan bagian nonpolar dari senyawa akan berinteraksi dengan fase
yang nonpolar. Dengan demikian senyawa akan terdistribusi di antara kedua fase dengan
perbandingan tertentu, tergantung pada besar kecilnya afinitas senyawa pada masing-masing
fase. Senyawa yang polar akan lebih banyak terdistribusi di dalam fase yang polar, demikian
pula sebaliknya. Adanya aliran fase gerak, maka fase gerak yang telah mengandung sebagian
komponen sampel akan terdesak ke atas (pada metode ascending), sehingga akan terjadi
distribusi baru antara fase gerak dengan fase diam yang baru. Pada waktu yang bersamaan,
distribusi baru juga terjadi pada daerah totolan antara fase gerak yang baru dengan fase diam
yang telah mengandung sebagian komponen sampel. Karena komponen-komponen sampel
hanya dapat bergerak bersama eluen, maka kecepatan perpindahan / migrasi komponen
tergantung pada fraksi waktu (lamanya) saat komponen berada dalam eluen. Apabila komponen
mengalami retensi pada fase diam maka lamanya komponen tersebut berada dalam eluen lebih
kecil dibanding dengan komponen yang tidak mengalami retensi pada fase diam. Pemisahan
terjadi karena salah satu komponen sampel tertahan oleh fase diam dan yang lain dibawa oleh
fase gerak. Dengan demikian akan terjadi perbedaan kecepatan migrasi (partisi) dari masingmasing komponen sehingga akan diperoleh noda / bercak dari komponen-komponen sampel.
11
E. ANALISIS KUANTITATIF
Selain untuk keperluan analisis kualitatif, kromatografi kertas dapat pula digunakan
untuk analisis kuantitatif yang dalam hal ini ukuran spot dari sampel dan senyawa baku sedapat
mungkin sama. Analisis kuantitatif dapat dilakukan antara lain dengan:
1. Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan area dari bercak. Pengukuran
area dapat dilakukan dengan planimeter, kertas bergaris-garis bujur sangkar, atau dengan
menggunting bercak kemudian ditimbang.
2. Mengukur transmisi cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri.
3. Menggunting area dari bercak, kemudian diekstraksi dan ditetapkan kadarnya secara
spektrofotometri.
F. PENGGUNAAN KROMATOGRAFI KERTAS
Kromatografi kertas dapat digunakan untuk pemisahan senyawa anorganik (logam,
isomer dari kompleks logam), pemisahan senyawa organik (uji kemurnian obat, makanan,
kosmetik, deteksi kontaminan dalam makanan minuman, deteksi obat dan metabolitnya pada
hewan uji atau manusia), serta analisis pada bidang biokimia (pemisahan asam amino dan
peptida untuk menemukan struktur dari protein, pengujian asam amino atau gula dalam cairan
biologis) dimana jumlah sampel sangat terbatas.
12
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
A. PENDAHULUAN
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), dapat digunakan dengan 2 tujuan yaitu sebagai metode
untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, preparatif dan untuk menjajaki sistem fase gerak dan
sistem fase diam yang akan digunakan pada kromatografi kolom ataupun kromatografi cair
kinerja tinggi. Teknik operasional pada KLT hampir sama dengan KK, namun sebagai pengganti
kertas adalah lapisan tipis dari partikel halus adsorben pada permukaan lempeng gelas, logam,
atau plastik. Fase diam pada KLT sering disebut adsorben, walaupun pada kondisi tertentu dapat
berfungsi sebagai penyangga zat cair pada sistem partisi. Dengan demikian penggunaan istilah
adsorben bukan berarti bahwa mekanisme pemisahan selalu berdasarkan adsorpsi. Pemisahan
dapat berdasarkan adsorpsi atau partisi, tergantung kondisi percobaan dan metode pembuatan
lempeng.
B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KERTAS
1. Penyiapan Adsorben
Adsorben yang umum digunakan adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium
oksida), kieselguhr (tanah diatome), dan selulosa. Silika gel relatif asam sehingga sering
digunakan untuk senyawa asam, dan umumnya digunakan untuk kromatografi adsorpsi maupun
partisi. Sedangkan alumina relatif basa sehingga sering digunakan untuk pemisahan basa. dan
umumnya digunakan untuk kromatografi adsorpsi. Hal tersebut dilakukan untuk meminimumkan
reaksi asam basa antara adsorben dan senyawa yang dipisahkan. Kieselguhr dan selulosa
merupakan bahan penyangga lapisan zat cair pada sistem partisi, sehingga sering digunakan
untuk pemisahan senyawa polar seperti asam amino, karbohidrat, nukleotida, dan senyawa
hidrofil alam. Beberapa contoh adsorben yang dapat digunakan beserta penggunaannya adalah
sebagai berikut :
Di antara adsorben tersebut di atas, silika gel adalah yang paling banyak digunakan.
13
Gambar di samping menunjukkan bahwa silika gel
(SiO2) merupakan rantai -O-Si-O- dimana pada bagian
permukaan silika berupa gugus-gugus hidroksil -OH, oleh
karena itu silika gel relatif bersifat polar. Oleh karena itu,
KLT umumnya menggunakan sistem fase normal. Namun
tidak menutup kemungkinan bahwa dalam KLT digunakan
sistem fase terbalik. Dalam hal ini permukaan silika gel terlebih dahulu dimodifikasi agar tidak
lagi mengandung gugus hidroksil, melalui reaksi silanisasi menggunakan dichlorodimethyl
silane seperti terlihat pada gambar berikut:
Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika, maka akan semakin hidrofobik.
Silika gel yang digunakan umumnya ditambah dengan binding agent / binder / perekat
untuk memberikan kekuatan pada lapisan, menambah adhesi terhadap penyangga, dan membuat
lapisan menjadi lebih kohesi. Binding agent yang banyak digunakan yaitu kalsium sulfat,
CaSO4.½ H2O 10 – 15 %, yang lebih dikenal sebagai gipsum sehingga silika gel ini diberi kode
G. Pengikat lain yang dapat dipakai yaitu pati 3% dan polimer organik, seperti polivinil alkohol.
Lapisan yang tidak mengandung pengikat dapat melekat dengan dukungan keseragaman ukuran
partikel.
Selain itu silika gel juga sering ditambah dengan indikator luminescence (fosforescence
pada λ 254 nm ; fluorescence pada λ 366 nm) untuk membantu penampakan bercak tak
berwarna. Silika gel yang telah ditambah indikator luminescence kemudian diberi kode F atau
UV. Indikator luminescence merupakan senyawa yang apabila dikenai radiasi elektromagnetik
ultraviolet (UV) pada λ 254 nm atau λ 366 nm, maka akan menyerap energi radiasi tersebut
untuk mengeksitasikan elektron-elektronnya ke tingkat energi yang lebih tinggi (exited state).
Saat elektron-elektron yang tereksitasi tersebut kembali ke tingkat energi dasar (ground state),
maka akan mengemisikan cahaya. Emisi cahaya dari senyawa yang menyerap energi radiasi
dengan λ 254 nm berupa peristiwa fosforescence, sedangkan emisi cahaya dari senyawa yang
menyerap energi dengan λ 366 nm berupa peristiwa fluorescence. Oleh karena itu silika gel yang
telah ditambah indikator luminescence akan berpendar dengan penampakan warna tertentu. Jika
di atas lempeng tersebut terdapat suatu noda / bercak senyawa yang terlelusi, maka sinar UV
tidak dapat mencapai indikator luminescence, sehingga indikator luminescence yang berada di
bawah noda tersebut tidak dapat menyerap energi radiasi elektromagnetik yang mengenainya.
Hal tersebut terjadi karena silika gel yang telah mengandung indikator luminescence tertutup
14
oleh noda. Akibatnya tidak terjadi eksitasi elektron, yang secara otomatis tidak terjadi emisi
cahaya. Dengan demikian pada bagian tersebut akan tampak peredaman bercak, yaitu pada
bagian bercak tampak gelap dengan latar belakang yang berpendar. Hal inilah yang menjadi
dasar deteksi bercak dengan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Fluorescen & fosforescen, keduanya merupakan bentuk luminescence dengan ciri-ciri:

Fosforescence - terdiri dari senyawa anorganik
- radiasi emisi rusak lebih dari 10-8 detik setelah radiasi eksitasi dihentikan
- disertakan pada lapisan penyerap secara homogen

Fluorescence - terdiri dari senyawa organik
- radiasi emisi rusak dalam 10-8 detik setelah radiasi eksitasi dihentikan
- disertakan pada lapisan penyerap melalui penyemprotan atau pencelupan
Inorganics Phosporescence Indicators (Kode : F254 atau UV254) yang umum digunakan untuk
lapisan silica gel, alumina, dan selulose antara lain :
Warna
Senyawa yang ditambahkan
1. Biru
- Senyawa strontium yang diaktivasi dg Sn
2. Kuning
- Uranil asetat
3. Hijau kuning
- Seng silikat yang diaktivasi Mn
- Seng kadmium sulfat
4. Senyawa
- senyawa pengemisi pada λ 254 nm
Organics Fluorescence Indicators (Kode : F366 atau UV366) yang umum digunakan untuk
lapisan silika gel, alumina, dan selulose antara lain :

Natrium 3 – hidroksipiren – 5,8,10 – trisulfonat

Natrium 3,5 – dihidroksipiren – 8,10 – disulfonat

Natrium fluorescein ; fluorescein atau 2’,7’ – diklorofluorescein

Rhodamin, Rhodamin 6 G

Morin

Zat warna Cyanin

Derivat stilben, contoh: diaminostilbentriazin

Pencegah optik (ultraphor WT BASF) Calcofluor R – white, Leukophor
Keterangan porous size silika gel pun seringkali ditambahkan sebagai kode berupa angka
dalam satuan Amstrong. Dengan demikian apabila disebutkan bahwa silika gel yang digunakan
adalah Silika Gel 60 GF254 atau Silika gel 60 UV254, hal tersebut menunjukkan bahwa:

Ukuran pori
: 60 Å

G
: CaSO4.½ H2O sebagai binder

F
: bahan indikator fluorescence / fosforescence yg ditambahkan

254
: dituliskan sesudah F atau UV untuk menandakan λ eksitasi bahan
indikator fosforescence yang ditambahkan
15
Dua sifat penting dari adsorben adalah ukuran partikel dan homogenitasnya karena sangat
berpengaruh pada adhesi terhadap penyangga, laju perambatan, dan hasil pemisahan. Ukuran
partikel yang umum digunakan adalah 1 – 25 mikron. Partikel yang sangat kasar tidak akan
memberikan hasil yang memuaskan, sehingga salah satu alasan untuk menaikkan hasil
pemisahan adalah menurunkan ukuran partikel menjadi butiran halus. Perbedaan adsorben yang
digunakan akan memberikan perbedaan yang besar pada harga Rf meskipun menggunakan eluen
yang sama.
Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada penyangga, khususnya lempeng KLT
kuantitatif dan preparatif, adsorben harus terbebas dari cemaran / pengotor. Pengotor dapat
dihilangkan dengan mencuci adsorben dengan metanol. Pemurnian dapat dilakukan dengan
mendidihkan bubur adsorben dalam metanol beberapa menit, kemudian dibiarkan beberapa jam
pada suhu kamar. Setelah itu adsorben disaring, dikeringkan pada suhu kamar, kemudian pada
suhu 110 oC selama 1 jam. Selain itu penghilangan cemaran dapat pula dilakukan dengan praelusi menggunakan eluen yang lebih polar daripada eluen yang akan digunakan pada pemisahan,
contoh : sebelum digunakan untuk pemisahan senyawa, lempeng adsorben yang telah aktif
dielusi dengan metanol untuk membawa cemaran ke salah satu ujung, setelah itu diaktifkan
kembali.
Berdasarkan aktivitas adsorpsi relatif terhadap alumina, disusun tingkat aktivitas
Brockmann, sehingga adsorben digolongkan ke dalam golongan I (aktivitas tertinggi) hingga V
(aktivitas terendah). Silika gel dan alumina yang sering digunakan pada KLT memiliki aktivitas
adsorpsi antara II dan III dengan kelembaban relatif antara 40 – 65%.
Adsorben dari industri yang
berbeda
memiliki
sifat
yang
berbeda, seperti pH, ukuran pori,
laju aliran, kemurnian, dan daya
memisahnya. Tabel di samping
adalah contoh adsorben yang ada di
pasaran berikut dengan industri
penghasilnya.
16
2.Pembuatan Lempeng KLT
Penyangga yang digunakan dapat berupa kaca / gelas, logam, ataupun plastik. Ukuran
penyangga disesuaikan dengan jenis pemisahan yang hendak dilakukan dan ukuran bejana yang
digunakan. Bahkan untuk analisis kualitatif yang sederhana dapat digunakan obyek glas.
Kebanyakan penyangga yang dijual berupa lempeng kaca dengan ukuran 20 x 20 cm, 20 x 10 cm
atau 20 x 5 cm. Sedangkan lempeng siap pakai umumnya menggunakan lembaran plastik atau
lembaran aluminium sebagai penyangga. Permukaan penyangga harus halus dan rata.
Sebelum digunakan, penyangga dicuci dengan detergen, dibilas dengan air, kemudian
dengan akuades dan keringkan. Bila perlu bilas pula dengan aseton atau dibersihkan dengan
tissue yang dibasahi aseton ataupun heksana untuk menghilangkan lemak atau pengotor yang
mungkin masih tertinggal. Selain itu, dengan aseton permukaan penyangga akan semakin cepat
kering. Suatu hal yang perlu diperhatikan adalah jangan menyentuh permukaan penyangga yang
telah bersih dengan jari-jari.
Ada 4 cara yang dapat digunakan untuk pembuatan lapisan tipis, yaitu penuangan,
penyemprotan, pencelupan, dan pembentangan, yang dapat dilakukan secara manual ataupun
machinal. Sebelum digunakan untuk membuat lapisan pada suatu penyangga, adsorben harus
dibuat bubur / slurry terlebih dulu. Kekentalan optimum bubur untuk membuat lapisan adsorben
tergantung pada metode yang digunakan untuk membuat lapisan.
Jika adsorben sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tidak
menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituang di atas lempeng hingga melapisinya.
Adsorben yang umum digunakan pada metode penuangan tersebut adalah alumina yang dalam
pembuatan bubur tidak menggunakan air, melainkan cairan volatil seperti etanol, etil asetat.
Lempeng-lempeng kecil seperti obyek glas dapat dilapisi
dengan cara mencelupkan 2 obyek glas dalam keadaan berhimpit
ke dalam bubur adsorben dalam pelarut organik, seperti kloroform
atau campuran kloroform:metanol (2:1) atau cairan volatil lain,
kemudian angkat dan biarkan bubur yang berlebih mengalir
melalui sisi bawah. Setelah itu pisahkan obyek glas dan bersihkan
bubur yang terdapat pada bagain tepi. Biarkan mengering selama
5-20 menit. Lapisan silika gel dan alumina yang dibuat dengan
cara ini sudah cukup teraktifkan tetapi tidak sempurna. Lapisan
tersebut harus dibuat baru setiap hari atau disimpan dalam wadah
bertutup baik dan lingkungan kering (desikator). Dalam hal ini tebal lapisan yang pasti tidak
diketahui dan lapisan yang dihasilkan tidak cukup baik. Bubur yang kental akan menghasilkan
lapisan yang tebal, sedangkan bubur yang encer akan menghasilkan lapisan yang tipis dan
berbutir-butir. Meskipun demikian, metode ini cukup memuaskan untuk membuat sejumlah
lempeng untuk pemisahan kualitatif secara cepat. Jika lapisan dikehendaki untuk sistem partisi,
maka lapisan harus dihidrasi terlebih dahulu sebelum digunakan, karena pada hakikatnya lapisan
17
tersebut dibuat dalam sistem kering. Hal tersebut dapat dilakukan dengan memegang lempeng di
atas air mendidih, kemudian dibiarkan mengering di udara pada suhu kamar.
Metode
pembentangan
umumnya
digunakan untuk lempeng yang berukuran sedang
ataupun besar. Pembuatan bubur adsorben pada
metode pembentangan umumnya dilakukan dengan
perbandingan x gram adsorben dan 2x ml air atau
pelarut organik, kemudian diaduk dan dilumatkan
dalam
mortir
atau
digojog
perlahan
hingga
homogen (hindari terbentuknya buih) dalam gelas piala bertutup. Jika mengandung gips, maka
makin lama makin kental. Oleh karena itu waktu pengocokan sebaiknya seragam ± 45 detik.
Contoh : untuk membuat lapisan tipis pada 6 lempeng kaca berukuran 20 x 10 cm dan 2 lempeng
20 x 5 cm dengan tebal lapisan 0,25 mm, dapat digunakan 30 g adsorben yang dibuat bubur
dengan 60 ml air. Lempeng kaca yang telah bersih dan kering diatur secara membujur pada
aligning tray. Setelah itu bubur dimasukkan ke dalam spreader. Atur ketebalan spreader sesuai
dengan ketebalan adsorben yang akan dibuat, kemudian letakkan pada lempeng kaca bagian
ujung depan. Masukkan bubur adsorben ke dalam spreader. Tutup spreader yang telah berisi
bubur adsorben, kemudian dorong dengan kecepatan tetap sampai ujung lempeng bagian
belakang. Angkat spreader dan biarkan lempeng mengering pada suhu kamar selama 15 – 30
menit, kemudian aktifkan. Perbandingan adsorben dan air untuk membuat bubur adsorben pada
metode pembentangan dapat dilihat pada tabel berikut:
Jika diperlukan, perbandingan dapat diubah karena
jumlah air yang tepat tergantung pula pada jenis dan
pra perlakuan pada adsorben.
Karena lapisan dibuat dari bubur adsorben
dalam air, maka apabila mekanisme pemisahan yang
diharapkan adalah adsorpsi, lempeng KLT harus
diaktifkan dahulu yaitu dengan pemanasan di dalam oven pada suhu ±100 – 110 oC selama 1 – 3
jam. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan molekul-molekul air yang menempati pusatpusat serapan pada adsorben, yang selanjutnya akan membuka pori-pori adsorben sehingga luas
permukaan spesifiknya meningkat. Luas permukaan spesifik adalah luas permukaan yang diukur
dalam meter persegi tiap gram. Adsorben yang aktif dapat memiliki permukaan spesifik ratusan
meter persegi. Aktivitas tersebut berkaitan dengan kekuatan menyerap dari adsorben, yaitu
adsorben dengan luas permukaan yang besar akan menyerap dengan kuat. Adanya air pada
pusat-pusat serapan akan mengurangi kemampuan adsorpsi sehingga menghambat tertambatnya
komponen sampel ke dalam adsorben. Dengan demikian lamanya pemanasan dan suhu yang
digunakan akan menentukan mekanisme pemisahan, yaitu adsorpsi atau partisi.
18
Jika suhu pengaktifan jauh di atas 110 oC dapat menyebabkan terjadinya dehidrasi yang
ireversibel sehingga pemisahan justru menjadi tidak efektif. Lempeng yang telah diaktifkan
harus disimpan dalam lingkungan kering, yaitu desikator. Lempeng komersial siap pakai,
memiliki keaktifan yang beragam. Namun umumnya dapat digunakan langsung atau dapat
diaktifkan kembali dengan pemanasan.
Pada sistem partisi, lapisan diaktifkan pada suhu ±100 – 110 oC selama 10 menit
sehingga memungkinkan masih tertinggalnya air di dalam lapisan. Selain itu, adanya air di dalam
lapisan tipis dapat diperoleh melalui proses dihidrasi. Dalam hal ini yang berperan sebagai fase
diam adalah air, sedangkan butir-butir lapisan tipis berperan sebagai penyangga. Selain air, zat
cair lain juga dapat digunakan sebagai fase diam, baik zat cair polar, seperti formamida, etilen
glikol; maupun zat cair nonpolar, seperti minyak silikon, minyak parafin. Pada umumnya lapisan
diaktifkan terlebih dahulu untuk menghilangkan air dari lapisan, kemudian dicelupkan secara
perlahan ke dalam larutan zat cair 20% di dalam formamida atau etilen glikol di dalam aseton,
minyak silikon 5% dalam eter. Setelah itu lapisan dibiarkan mengering tanpa pemanasan.
Lempeng KLT berukuran obyek glas dapat digunakan untuk memisahkan campuran
hingga 4 komponen dalam waktu 5 menit. Lapisan mudah dibuat, umumnya tidak memerlukan
pengaktifan dan menghasilkan pemisahan yang tajam hanya dengan alat gelas sederhana.
Kekurangan lempeng KLT berukuran obyek glas antara lain: lapisan yang dihasilkan tidak cukup
baik dan lapisan relatif tipis dengan ketebalan lapisan yang tidak dapat ditentukan (jika dibuat
dengan metode pencelupan), jarak elusi relatif pendek. Dengan demikian diameter totolan harus
sekecil mungkin, sehingga satu lempeng hanya dapat digunakan untuk 3 macam totolan.
Pada penggunaan lempeng besar dibutuhkan bejana yang besar pula, sehingga selain
secara ekonomi lebih mahal dan membutuhkan volume eluen yang lebih banyak, waktu untuk
penjenuhan lama dan biasanya memerlukan waktu elusi selama 30 menit hingga 1jam. Selain itu
pada penggunaan lempeng dengan ukuran sedang atau besar (20 x 20 cm, 20 x 10 cm atau 20 x 5
cm) memerlukan alat khusus dalam membuat lapisan. Namun lempeng besar memiliki beberapa
kelebihan, antara lain lapisan lebih tebal dengan ketebalan yang dapat diatur karena dibuat
dengan metode pembentangan, lapisan melekat secara lebih baik, memungkinkan untuk
melakukan analisis cuplikan lebih banyak secara serempak, jarak elusi lebih panjang sehingga
memungkinkan pemisahan campuran yang lebih kompleks.
Tebal lapisan merupakan faktor penting dalam KLT. Tebal standar adalah 250 mikron
atau 0,25 mm, sedangkan lapisan yang lebih tebal (0,5 – 2,0 mm) digunakan untuk pemisahan
yang bersifat besar dengan jumlah adsorben hingga 250 mg untuk lempeng berukuran 20 x 20
cm. Tebal optimum untuk lapisan KLT preparatif ± 1 – 1,5 mm. Lapisan tebal sulit untuk dibuat
dan menghasilkan pemisahan yang relatif buruk. Pada umumnya bubur adsorben yang digunakan
untuk mencetak lapisan KLT preparatif agak lebih kental daripada untuk KLT biasa. Pada
lapisan yang mengandung perekat kalsium sulfat, pengentalan dapat terjadi dengan membiarkan
bubur lebih lama sebelum lapisan dicetak. Cara lain harus digunakan adsorben lebih banyak
19
dalam pembuatan bubur. Salah satu kesulitan dalam penggunaan lapisan yang tebal yaitu
tendensi mengelupas bila telah kering. Oleh karena itu lapisan harus dibiarkan mengering selama
beberapa jam sebelum diaktifkan, sehingga dapat mencegah peretakan dan pengerasan bagian
luar. Dalam hal ini dianjurkan untuk menyimpan lapisan tanpa diaktifkan terlebih dahulu, dan
diaktifkan menjelang digunakan.
Lempeng komersial siap pakai yang tersedia umumnya dalam bentuk lembaran dengan
penyangga logam, sehingga dapat dipotong dengan ukuran sesuai kebutuhan. Selain dapat
menghemat waktu yang diperlukan untuk pembuatan lempeng, penggunaan lempeng komersial
lebih disukai karena lebih terjamin homogenitas dan ketebalannya, lapisan fase diam lebih
kompak dan stabil sehingga tidak mudah lepas, seringkali dapat langsung digunakan tanpa harus
pengaktifan lagi, serta hasil lebih reprodusibel. Penyentuhan dengan jari-jari pada lempeng akan
merusak permukaan lapisan dan melepaskan partikel-partikel dari permukaan. Namun hal
tersebut lebih banyak terjadi pada lempeng buatan sendiri daripada lempeng siap pakai.
Penggunaan lempeng komersial siap pakai pada KLT preparatif lebih disukai, karena
tersedia dalam ukuran besar, dengan lapisan tebal dan berkualitas tinggi, sehingga mudah ditotoli
tanpa merusak lapisan. Penggunaan lapisan ini memungkinkan diperoleh modifikasi dengan
lapisan tirus, yaitu dengan lapisan yang lebih tebal pada daerah ujung atas yang bertujuan untuk
memperkuat pemisahan. Lapisan buatan sendiri hanya memiliki satu keuntungan yaitu lebih
murah.
3. Penyiapan Fase Gerak
Eluen yang digunakan umumnya bersifat non polar, sehingga KLT lebih banyak dijumpai
sebagai sistem fase normal. Salah satu alasannya adalah untuk mengurangi serapan dari setiap
komponen dalam campuran eluen. Jika komponen campuran eluen memiliki polaritas yang
tinggi, terutama akuades, akan dapat mengubah mekanisme pemisahan menjadi partisi dan tidak
lagi adsorpsi. Pada sebagian besar kasus, eluen tunggal akan menggerakkan bercak terlalu jauh
atau bahkan tidak dapat menggerakkan. Oleh karena itu seringkali harus mencampur eluen untuk
memperoleh kepolaran yang diinginkan. Campuran yang baik akan menghasilkan eluen yang
memiliki kekuatan bergerak sedang, namun sebaiknya tidak mencampur lebih dari 2 eluen,
karena campuran yang kompleks akan cepat mengalami perubahan dengan adanya perubahan
suhu. Pencampuran eluen dengan perbedaan kepolaran yang sangat berbeda dapat menyebabkan
terpisahnya eluen. Hal tersebut dapat ditunjukkan dengan terbentuknya bercak berbentuk bulan
setengah yang aneh, atau diperoleh 2 garis depen eluen pada lapisan. Namun dalam beberapa
kasus , fenomena ini digunakan untuk upaya peningkatan pemisahan. Tingkat kualitas kemurnian
eluen harus diperhatikan terutama untuk KLT kuantitatif. Bila memungkinkan gunakan eluen
pro-kromatografi, atau setidaknya pro-analisis. Sedangkan untuk keperluan sehari-hari dapat
digunakan eluen dengan tingkatan yang lebih rendah, namun harus diingat bahwa keberadaan
20
pencemar terkadang memberikan perubahan yang berarti. Pertimbangan lain dalam pemilihan
eluen, umumnya sama dengan KK.
Pemisahan yang optimal sangat ditentukan oleh pasangan fase gerak dan fase diam yang
sesuai dengan komponen yang akan dipisahkan, contoh bila komponen yang akan dipisahkan
adalah:
1. Hidrokarbon jenuh hampir tidak diabsorpsi sehingga merambat paling cepat.
Hidrokarbon tak jenuh diserap makin kuat. Semakin banyak ikatan rangkap dalam
molekul, maka penyerapan akan semakin kuat. Oleh karena itu, untuk pemisahan
hidrokarbon dipilih adsorben yang aktif dengan pelarut yang agak polar, atau
digunakan sistem fase terbalik.
2. Adanya gugus fungsional pada hidrokarbon mengakibatkan adsorpsi makin kuat
sesuai urutan berikut: -CH3 < -OR < C=O < -NH2 < -OH < -COOH. Apabila benzena
sebagai eluen dan silika gel atau alumina sebagai adsorben maka eter atau ester akan
merambat paling cepat, disusul oleh aldehid / keton, kemudian alkohol, dan yang
paling lambat adalah asam karboksilat
Sebagai pegangan dalam pemilihan adsorben dan eluen untuk suatu sampel dalam KLT,
dapat menggunakan diagram tringular berikut:
Dengan memutar segitiga pada diagram di atas, maka fase diam dan eluen yang sesuai untuk
berlangsungnya suatu pemisahan ditunjukkan oleh masing-masing sudut segitiga tersebut.
Misalnya, apabila senyawa yang hendak dipisahkan relatif non polar maka digunakan fase diam
yang aktif dan eluen yang nonpolar, dan sebaliknya.
4. Penjenuhan Chamber Kromatografi
Tujuan dan langkah-langkah dalam penjenuhan bejana dilakukan seperti halnya pada KK.
5. Penempatan Cuplikan pada Lempeng
Campuran yang akan ditotolkan dilarutkan terlebih dulu dalam pelarut yang agak
nonpolar, dengan titik didih antara 50 – 90 oC, sehingga mudah menguap dari lapisan.
Konsentrasi larutan yang dibuat umumnya 0,1 – 1%. Air digunakan jika tidak ada pilihan lain.
Penempatan cuplikan umumnya dilakukan seperti pada KK dengan dasar pertimbangan yang
21
serupa. Penggunaan pipa kapiler ataupun mikropipet yang dapat diatur volume penotolannya
akan menghasilkan noda dengan konsentrasi senyawa yang lebih seragam.
Pada umumnya jumlah yang ditotolkan sekitar 50 – 100 µg setiap
bercak untuk mekanisme adsorpsi, sedangkan 5 – 20 µg setiap bercak
untuk mekanisme partisi. Pada penotolan, ujung penetes diusahakan
sedekat mungkin dengan permukaan adsorben namun sedapat mungkin
tidak menyentuh adsorben agar tidak merusak permukaan adsorben di
tempat totolan. Penandaan tempat totolan dengan pensil sebaiknya
dihindari untuk mencegah terlepasnya permukaan adosben. Oleh karena itu
gunakan multi purpose template untuk pemberian tanda dan penotolan.
Ketepatan yang diperlukan untuk penotolan tergantung pada tujuan kromatografi. Pada
KLT kualitatif, akan lebih bermakna apabila pemeriksaan campuran dilakukan pada beberapa
konsentrasi daripada memeriksa cuplikan dengan jumlah yang tepat.. Perbedaan konsentrasi
dapat diperoleh dengan penotolan berulang pada tempat yang sama, misalnya 2 penotolan pada 1
tempat, 4 penotolan pada 1 tempat, dst. Pemeriksaan yang dilakukan dengan berbagai
konsentrasi dapat memberikan informasi tentang jumlah komponen dan konsentrasi relatifnya.
Pada konsentrasi yang lebih besar akan memberikan informasi komponen yang lebih kompleks,
sehingga beberapa komponen belum terlihat jelas pada konsentrasi rendah.
Jika hendak diketahui jumlah cuplikan yang tepat yang ditotolkan
pada lapisan, maka perlu dibuat larutan cuplikan dengan konsentrasi
tepat dan ditotolkan dengan volume yang tepat pula. Hal ini penting
khususnya untuk pengerjaan KLT kuantitatif. Penyediaan larutan yang
volumenya kecil dan banyaknya diketahui
secara tepat untuk
menghasilkan cuplikan pada lapisan merupakan masalah sulit yang
menjadi sumber kesalahan utama pada KLT kuantitatif. Hal ini dapat
diatasi dengan penggunaan pipa kapiler yang diameter dalamnya
diketahui dan akan menyedot larutan dengan volume yang dapat
diketahui ketika dicelupkan ke dalam larutan, seperti mikropipet di atas. Tersedia pula
mikropipet yang dapat menyedot volume larutan 1 – 100 μl.
Kesalahan dalam penotolan dapat diminalisir menggunakan penotol otomatis dengan
ketepatan dan ketelitian tinggi seperti pada gambar berikut:
22
Pada KLT preparatif, cuplikan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi lempeng besar,
kemudian dielusi secara tegak lurus terhadap garis cuplikan sehingga campuran memisah
menjadi beberapa pita. Volume penotolan dapat mencapai 2 ml dengan lebar 1 – 5 mm. Pita
yang seragam dapat diperoleh dengan bantuan mikropipet atau alat penotol berikut:
Jumlah cuplikan yang ditotolkan pada
KLT preparatif dapat mencapai 50 mg
pada lapisan 20 x 20 cm tebal 1 mm untuk
mekanisme adsorpsi, sedangkan untuk
partisi 5 mg. Lapisan dengan tebal 1cm
panjang 1 m dapat digunakan untuk
memisahkan cuplikan hingga 100 g.
Cara ini digunakan untuk memisahkan
campuran sehingga diperoleh senyawa
murni untuk analisis lebih lanjut, untuk meneliti bahan alam yang umumnya berjumlah kecil dan
campurannya kompleks, untuk memperoleh cuplikan murni guna mengkalibrasi KLT uantitatif.
Pelarut untuk penotolan harus benar-benar hilang dari lapisan sebelum dielusi, jika perlu
dengan dibantu dengan hairdryer terutama jika menggunakan air sebagai pelarut.
6. Elusi
Proses elusi pun berjalan seperti halnya pada KK, namun
lempeng KLT tidak digantung melainkan diletakkan pada bejana
dengan ujung bagian atas menyandar pada dinding bejana.
Penandaan solvent front dapat dilakukan dengan menggoreskan
pensil sehingga goresan tersebut akan menahan aliran eluen.
Eluen akan bergerak melalui proses adsorpsi (dan atau partisi)
pada fase diam.
Elusi sebaiknya dilakukan pada suhu tetap untuk
mencegah
perubahan
komposisi
campuran
eluen
yang
disebabkan oleh penguapan ataupun perubahan fase. Seperti
halnya pada KK, kejenuhan atmosfer dalam bejana oleh uap eluen harus senantiasa
dipertahankan selama elusi karena akan mempengaruhi kesetimbangan distribusi. Suatu gejala
23
apabila atmosfer dalam bejana tidak dengan uap eluen yaitu terjadinya pengembangan dengan
permukaan eluen yang berbentuk cekung dimana eluen bagian tepi lebih cepat bergerak daripada
bagian tengah.
Ada 2 cara untuk memekatkan bercak cuplikan yang bundar menjadi garis tipis sebelum
elusi dilaksanakan, yaitu:
1. Lapisan yang telah ditotoli diletakkan di dalam eluen yang sangat polar, seperti metanol.
Kemudian dikembangkan hingga titik yang terletak sedikit di atas titik asal, sehingga
cuplikan akan bergerak bersama eluen dan membentuk garis. Setelah lapisan diangkat
dan dikeringkan, lalu dielusi pada eluen normal.
2. Cuplikan ditotolkan pada lapisan siap pakai dengan penyangga yang tidak menjerap yang
berbentuk pita di sepanjang salah satu sisinya. Eluen akan membawa seluruh cuplikan
dari pita yang tidak menjerap tersebut menuju sisi bagian lapisan yang menjerap, berupa
garis atau pita.
Garis tipis akan memisah menjadi pita, dan menghasilkan pemisahan yang tajam dari cuplikan
berkomponen banyak.
Pada saat elusi, akan dijumpai 3 macam gerakan eluen yang berlainan, yaitu:
1. Eluen bergerak ke atas melalui lapisan, yang dapat
dilihat dengan mudah berupa garis depan yang maju.
2. Uap eluen akan terjerap oleh lapisan di atas garis
depan. Dengan demikian saat garis depan mencapai
bagian atas lapisan, maka uap eluen akan bergerak ke
penjerap yang hampir jenuh dengan komponen eluen
yang lebih volatil.
3. Penguapan pelarut dari lapisan di bawah garis depan.
Gerakan eluen tersebut akan menentukan berapa banyak
pelarut yang benar-benar melewati cuplikan, karena merupakan penjumlahan dari ketiganya.
Namun faktor tersebut dapat dikendalikan dengan penjenuhan bejana.
7. Deteksi Daerah Noda
Deteksi daerah noda dapat dilakukan seperti halnya pada KK. Kebanyakan reagen lokasi
yang digunakan untuk senyawa atau gugus tertentu pada KK dapat digunakan pada KLT dengan
cara yang sama. Selain itu, reagen lokasi yang sering digunakan pada KLT antara lain:
1. Uap iodium. Lempeng diletakkan dalam bejana atau gelas piala tertutup yang berisi
kristal iodium sehingga uap iodium akan terjerap oleh bercak pada lapisan yang
mengandung senyawa organik. Warna bejana akan menjadi ungu. Senyawa tak jenuh
akan memberikan noda tak berwarna, sedangkan senyawa organik yang jenuh akan
memberikan noda berwarna coklat dengan latar belakang putih. Iodium akan menyublim
bila lempeng dikeluarkan dari bejana dan bercak memudar perlahan, namun kedudukan
24
noda dapat diberi tanda dan dibuat permanen dengan disemprot menggunakan larutan
0,5% benzidina dalam alkohol absolut.
2. Asam sulfat pekat. Senyawa organik dapat dideteksi dengan asam sulfat pekat, kemudian
dipanaskan pada suhu ±100 oC. Pada pemanasan, senyawa organik pada lapisan terbakar
hangus menjadi karbon (arang) dan tampak sebagai bercak hitam pada latar belakang
putih. Dalam hal ini dapat digunakan larutan asam sulfat 10% dalam etanol atau 50 –
80% dalam air. Kekorosifan asam sulfat dapat dihindari dengan menggunakan amonium
sulfat. Panas menguraikan amonium menjadi amonia yang menguap dan asam sulfat
yang menghanguskan senyawa organik.
3. Campuran asam sulfat dan kalium bikromat atau dengan asam nitrat.
4. Reagen semprot yang akan menimbulkan warna jika bereaksi dengan bercak cuplikan.
Pada cara ini maka dapat diperoleh informasi gugus fungsi penyusun senyawa, contoh
dugaan adanya aldehid atau keton dapat dipastikan dnegan 2,4-dinitrofenilhidrazin, atau
fenol dapat dipastikan denga reagen besi (III) klorida. Macam-macam reagen dan
penggunaannya dapat dilihat sebagai berikut:
Deteksi bercak pada KLT preparatif tidak boleh merusak senyawa yang dipisahkan,
sehingga cara yang paling sesuai dalam hal ini adalah deteksi di bawah sinar UV. Metode
alternatif yaitu dengan menempelkan selotif pada lapisan sedemikian hingga tegak lurus bercak
pita. Saat diangkat, selotif akan membawa sedikit adsorben yang mengandung pita senyawa yang
selanjutnya dapat dideteksi dengan reagen warna. Alternatif lain yaitu dengan menyemprot
lapisan silika gel dengan air sehingga menjadi tembus cahaya (bening) dan bercak pita terlihat
sebagai daerah buram pada latar belakang tembus cahaya.
8. Identifikasi Senyawa
Identifikasi bercak dilakukan seperti halnya pada KK, dengan parameter harga Rf atau
Rr. Faktor yang memperngaruhi gerakan noda dalam KLT, antara lain:
1. Struktur kimia senyawa yang akan dipisahkan.
2. Sifat adsorben dan derajat aktifitasnya.
3. Homogenitas dan tebal lapisan adsorben, karena akan mempengaruhi aliran eluen.
4. Derajat kemurnian eluen dan perbandingan eluen dalam campuran.
5. Derajat kejenuhan uap eluen dalam bejana.
6. Teknik elusi berdasarkan arah aliran eluen.
7. Cara penotolan dan jumlah sampel yang ditotolkan.
8. Suhu.
9. Kesetimbangan distribusi komponen sampel di antara dua fase.
Jika sampel terdiri dari komponen yang sangat kompleks dan baku pembanding adalah
senyawa murni, maka komponen-komponen senyawa lain dalam sampel akan mempengaruhi Rf
senyawa yang sedang dianalisis. Salah satu pengatasannya adalah dengan metode yang disebut
25
dengan spiking. Spiking dilakukan dengan menambahkan sejumlah tertentu senyawa baku ke
dalam sampel, dan ketiga cuplikan dielusi bersama, yaitu baku murni, sampel, dan sampel yang
telah dispiking. Hasilnya dapat dilihat pada gambar berikut:
Apabila sampel memang mengandung senyawa yang sama dengan senyawa baku, maka noda
senyawa tersebut akan menjadi lebih besar (positif).
9. Dokumentasi
Selain dengan melukis kromatogram dan mencatat harga Rf, kromatogram berukuran
obyek glas dapat didokumentasikan pada buku laporan dengan cara menutup seluruh lapisan
dengan isolatip. Setelah seluruh lapisan menempel pada solatip, kemudian selimuti bagian
belakang lapisan dengan solatip lagi sehingga bentuknya seperti kartu yang dilaminasi. Hasilnya
dapat ditempel pada laporan. Jika digunakan lapisan dengan penyangga plastik atau logam, maka
hasil dapat langsung ditempel setelah permukaan lapisan ditutup dengan solatip.
C. TEKNIK ELUSI
Teknik yang banyak digunakan dalam KLT adalah ascending, namun tidak menutup
kemungkinan dilakukan teknik elusi lain seperti descending dan circular sekalipun alat yang
digunakan menjadi agak sulit. Pada teknik penurunan, tempat eluen diletakkan di bagian atas
bejana dan untuk mengalirkan eluen ke lempeng KLT diperlukan perantara yang dapat berupa
kapas atau gulungan kertas. Setelah elusi, lempeng diambil dari bejana dan dibiarkan kering
tanpa pemanasan. Bila diperlukan dapat digunakan aliran udara yang diarahkan pada permukaan
yang mendatar. Seperti dalam KK, pada teknik elusi 2 arah, maka eluen pertama harus hilang
terlebih dahulu sebelum elusi berikutnya.
D. MEKANISME PEMISAHAN DALAM KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Pemisahan pada KLT terjadi dengan mekanisme yang sama seperti pada KK. Mekanisme
yang sering terjadi pada KLT adalah adsorpsi, namun tidak menutup kemungkinan terjadi proses
partisi, tergantung pada kondisi percobaan dan derajat keaktifan fase diam.
26
E. ANALISIS KUANTITATIF
Prinsip analisis kuantitatif pada KLT sama dengan KK. Sebelum dilakukan analisis,
komponen yang telah dipisahkan harus diisolasi terlebih dahulu. Isolasi komponen sampel dapat
dilakukan dengan:
1. Bercak disedot dengan alat khusus berupa vakum, seperti Craig Tube, kemudian disari.
2. Bercak dikorek dengan spatula, disari dengan pelarut yang sesuai, kemudian disaring.
Analisis kuantitatif dapat dilakukan antara lain dengan:
1. Menggunakan grafik hubungan antara log konsentrasi dan area dari bercak.
2. Mengukur transmisi cahaya yang melalui bercak dengan fotodensitometri.
3. Bercak yang telah diisolasi dan disari kemudian ditetapkan kadarnya secara
spektrofotometri.
Pada KLT preparatif, adsorben yang mengandung pita senyawa yang dianaslis dikerok
dengan spatula, silet, atau pengaduk karet pipih. Pengerokan yang lebih sempurna dapat
dihasilkan dengan bantuan alat sebagai berikut:
Hal ini diutamakan pada pekerjaan kuantitatif. Kemudian senyawa disari dari adsorben dengan
pelarut yang sesuai. Pada pekerjaan preparatif, setelah disari maka pelarut diuapkan dan senyawa
diisolasi. Sedangkan pada pekerjaan kuantitatif, pelarut yang telah mengandung senyawa
dimasukkan ke dalam labu dan diencerkan hingga tanda, kemudian ditetapkan kadarnya secara
spektrofotometri.
Terdapat hubungan antara ukuran bercak / kromatogram dengan konsentrasi senyawa.
Bercak dapat dikuantitasi secara spektroskopi dengan transmisi atau pemantulan. Pada ragam
transmisi, lapisan dilewati cahaya elektromagnetik pada panjang gelombang yang sesuai, dan
energi yang ditransmisikan diukur sebagai transmitan. Alternatif cara di atas adalah dengan
mengukur energi yang diserap senyawa pada lapisan, dimana absorbansi berbanding lurus
dengan konsentrasi. Sedangkan pada ragam pemantulan, sinar disorotkan pada lapisan dan
berkas sinar yang diantulkan diukur. Metode ini terutama dilakukan untuk senyawa yang
berfluoresensi. Energi yang ditransmisikan ataupun dipantulkan diukur dan dicatat sedemikian
hingga bercak tampak sebagai puncak kromatogram, menggunakan instrumen TLC scanner.
27
Luas area kromatogram sebanding dengan konsentrasi. Luas area kromatogram senyawa sampel
dibandingkan dengan luas area kromatogram senyawa baku yang konsentrasinya telah diketahui.
Dengan demikian konsentrasi senyawa sampel dapat dihitung. Berikut adalah contoh
kromatogram yang dihasilkan dari beberapa penelitian:
28
29
KROMATOGRAFI KOLOM
A. PENDAHULUAN
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan (sampel) diletakkan berupa
pita atau lapisan pada bagian atas adsorben di dalam kolom yang berupa tabung. Eluen dibiarkan
mengalir melalui kolom dengan aliran yang dipengaruhi oleh gaya gravitasi, gaya berat, dan
mekanisme adsorpsi. Pita senyawa komponen sampel akan bergerak melalui kolom dengan laju
yang berbeda, memisah, kemudian dikumpulkan berupa fraksi pada saat keluar dari akhir kolom.
B. PROSEDUR FUNDAMENTAL DALAM KROMATOGRAFI KOLOM
1. Penyiapan Adsorben
Adsorben hendaknya memenuhi persyaratan berikut:
1. Tidak larut dalam eluen yang digunakan.
2. Inert, tidak bereaksi dengan sampel.
3. Cukup aktif, sehingga mampu mengadsorpsi sekaligus memungkinkan perambatan
sampel.
4. Memungkinkan aliran yang baik dari eluen.
5. Reprodusibel, dapat diproduksi dengan sifat yang konstan.
Adsorben yang banyak digunakan antara lain:
30
Adsorben yang paling banyak digunakan adalah alumina dan silika.
Mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom umumnya terjadi karena adsorpsi,
sehingga sebelum dibuat menjadi bubur, serbuk adsorben harus diaktifkan terlebih dahulu
dengan pemanasan. Suhu dan lama waktu pemanasan menentukan derajat keaktifan. Tujuan
pengaktifan ini sama seperti pengaktifan lapisan adsorben pada KLT. Sifat adsoben terutama
tergantung pada pH dan derajat keaktifannya. Berdasarkan aktivitas adsorpsi relatif terhadap
alumina, disusun suatu tingkat aktivitas Brockmann, sehingga adsorben digolongkan ke dalam
golongan I (aktivitas tertinggi) hingga V (aktivitas terendah).
Kekuatan adsorpsi gugus polar pada senyawa-senyawa polar akan meningkat dengan
urutan sebagai berikut:
-CO2R, =C=O, -NH2, -OH, -CO2H
Gugus polar pada pemukaan alumina dan silika, terutama gugus hidroksi, akan menarik molekul
komponen sampel melalui interaksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen. Jika titik-titik tersebut
diduduki oleh air atau pelarut berproton seperti alkohol dan amina, maka permukaan tidak dapat
berfungsi lagi sebagai adsorben dan dikatakan menjadi nonaktif. Selain itu afinitas adsorben
dapat dimodifikasi secara kimia dengan penambahan asam.
Berdasarkan sifatnya, adsorben tertentu dapat berperan sebagai katalisator. Hal ini
penting untuk diperhatikan karena dapat menyebabkan terjadinya reaksi dengan komponen
sampel. Meskipun alimina basa lingkup penggunaannya paling luas, namun alumina basa, dapat
menyebabkan perubahan kimia dan menimbulkan reaksi, seperti kondensasi aldehid dan keton.
Oleh karena itu tidak dianjurkan menggunakan aseton sebagai eluen jika adsorben yang
digunakan adalah alumina basa, karena akan terkondensasi menjadi diaseton alkohol. Alumina
basa dapat dimodifikasi menggunakan asam klorida untuk mengubah menjadi bentuk asam, atau
31
menggunakan asam nitrat untuk mengubah menjadi netral. Alumina basa yang mengandung
aluminat dan alumina asam yang mengandung ion klorida dapat berfungsi sebagai penukar ion,
yaitu alumina basa tukar-menukar dengan kation anorganik dan organik, sedangkan alumina
asam tukar-menukar dengan anion anorganik dan organik. Alumina dengan derajat keaktifan I
dapat diperoleh dengan pemanasan pada 380 – 400 oC selama 3 jam.
Silika gel juga dapat digunakan secara luas dengan berbagai eluen. Namun, silika gel
dapat menyebabkan isomerisasi senyawa tertentu seperti terpen dan sterol. Silika gel dengan
keaktifan I dapat diperoleh dengan pemanasan pada 150 – 160 oC selama 3-4 jam.
Pada pemilihan adsorben dan eluen, sebagai pegangan digunakan adsorben yang
polaritasnya sama dengan komponen sampel yang hendak dipisahkan, sedangkan eluen
sebaliknya. Bila digunakan eluen yang kurang polar, pemisahan sempurna tetapi lambat sehingga
diperlukan volume eluen yang lebih banyak, dan waktu analisis yang lebih panjang. Perambatan
komponen dapat dipercepat dengan penambahan eluen yang lebih polar. Tabel berikut memuat
adsorben dan eluen yang disusun berdasarkan kekuatan adsorpsi dan kekuatan elusinya:
2. Penyiapan Eluen
Pemilihan pertama dari eluen adalah bagaimana sifat kelarutannya. Kekuatan zat elusi
adalah daya adsorpsi pada adsorben dalam kolom. Umumnya adsorben polar seperti alumina dan
silika gel, maka kekuatan adsorpsi naik dengan kenaikan polaritas zat yang diserap. Kekuatan
elusi dari eluen pada karbon aktif dalam kolom untuk asam amino dan sakarida diturunkan
dalam urutan berikut: etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < metanol < air. Urutan
tersebut adalah kenaikan polaritas atau penurunan panjang rantai homolog. Sedangkan untuk
alumina dan silika gel urutannya adalah sebaliknya, yaitu: air < metanol < etanol < propanol <
aseton < etil asetat < dietil eter < kloroform < metilen klorida < benzena < toluen < trikloroetilen
< karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana. Kemurnian pelarut harus setinggi mungkin.
32
3. Penyiapan Kolom
Kolom kromatografi dapat berupa pipa gelas, logam atau plastik. Namun umumnya
berupa tabung gelas yang dilengkapi dengan kran pada bagian bawah dan plat penyaring di
dalamnya. Dalam kondisi tertentu, buret pun dapat digunakan sebagai kolom. Beberapa bentuk
kolom dapat dilihat pada gambar berikut:
Kolom (a) bagian bawahnya dapat dilepas untuk mengambil adsorben dan membersihkan kolom.
Kolom (b) seperti buret sederhana. Kolom (c) memiliki sambungan kaca pada bagian atas untuk
tandon eluen. Kolom (d) memiliki tabung plastik kecil untuk mengeluarkan eluen langsung dari
dasar kolom. Kolom (e) memiliki bentuk tabung berupa torpedo. Pada tiap rancangan kolom
dilengkapi dengan penopang atau piringan plat di dalamnya, tepatnya di atas kran untuk
menahan adsorben. Selain itu sebagai penahan adsorben dapat pula digunakan glass wool atau
kapas yang ditutupi pasir bersih 50 – 100 mesh setebal 30 – 60 mm. Kadang dapat pula
digunakan piringan kaca masir.
Ukuran kolom sangat beragam, tergantung pada banyaknya senyawa yang akan
dipisahkan. Umumnya memiliki panjang minimal 10 kali diameter dalam, dan bahkan mungkin
hingga 100 kalinya. Bentuk dan ukuran kolom yang umum digunakan, antara lain:
Perbandingan jumlah adsorben : sampel
30 : 1
Perbandingan panjang : diameter kolom
10 – 15 : 1
Panjang kolom:
a. Sistem multikomponen
Kolom panjang
b. Komponen-komponen dengan afinitas yang sama terhadap adsorben
Kolom panjang
c. Komponen-komponen dengan afinitas yang berbeda terhadap adsorben
Kolom pendek
33
4. Pengisian Kolom
Adsorben dapat dikemas di dalam kolom dengan cara kering ataupun cara basah. Pada
cara kering, selapis pasir / penahan adsorben yang lain diletakkan ke dalam kolom, kemudian
adsorben dituang sedikit-demi sedikit. Setelah setiap penambahan adsorben, permukaannya
harus diratakan dan dimampatkan dengan alat pemampat. Jika semua adsorben telah
dimasukkan, di permukaan atas diletakkan kertas saring dan ditambah selapis pasir lagi,
sehingga tetap menjaga kerataan permukaan adorben jika eluen dialirkan. Setelah itu eluen
dialirkan dari atas kolom dengan kran kolom dalam kondisi terbuka sehingga memungkinkan
eluen meresap hingga ujung akhir kolom. Setelah eluen mencapai ±1 cm di atas bagian atas
kolom, maka kran ditutup dan aliran eluen dihentikan.
Pada cara basah, adsorben dicampur dengan eluen untuk dibuat bubur terlebih dahulu.
Setelah itu bubur adsorben dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi eluen ±1/3 panjang
kolom. Selama adsorben turun perlahan-lahan, kolom diketuk-ketuk pada semua sisi secara
perlahan dengan ballpipet karet atau bahan lain seperti gabus. Hal tersebut dimaksudkan agar
partikel-partikel adsorben dapat menyusun diri dengan kerapatan yang sama sehingga diperoleh
lapisan yang homogen. Jika besarnya partikel-partikel adsorben sama / monodisperse akan lebih
mudah untuk mendapatkan homogenitas pengepakan. Pengemasan cara basah dapat pula
dilakukan dengan memasukkan adsorben kering melalui corong dengan aliran teratur, ke dalam
kolom yang telah berisi eluen ±1/2 panjang kolom. Selama adsorben turun dilakukan hal yang
serupa dengan di atas. Jika adsorben dimasukkan sekaligus, akan diperoleh homogenitas yang
lebih baik. Kran dapat dibuka ataupun ditutup selama pengemasan, asalkan adsorben yang telah
dimasukkan ke dalam kolom tidak boleh ada bagian yang kering, atau harus selalu terendam oleh
eluen. Hal tersebut dapat tercapai dengan mempertahankan eluen ±1 cm di atas permukaan
adsorben. Setelah itu sepotong kertas saring diletakkan di atas adsorben serta ditambah selapis
pasir bersih untuk menutupi kertas saring. Hal tersebut dilakukan untuk menjaga kerataan
permukaan adorben jika sampel dimasukkan.
Partikel-partikel adsorben harus mengisi kolom dengan kerapatan yang sama / homogen,
sebab pengisisan kolom yang tidak teratur dapat merusak batas-batas pita kromatografi. Selain
itu pengisian yang tidak homogen dapat pula disebabkan oleh adanya gelembung-gelembung
udara saat pengisian. Oleh karena itu saat pembuatan bubur, adsorben harus diaduk-aduk dan
dicuci secara berulang dengan eluen untuk menghilangkan gelembung udara.
5. Penanganan Sampel
Sebelum larutan sampel dimasukkan, kran dibuka terlebih dulu untuk mengeluarkan
eluen yang ada di atas permukaan adsorben. Sampel dimasukkan ke dalam kolom pada saat
eluen di atas kolom hampir terserap seluruhnya. Sampel dimasukkan ke dalam kolom dengan
permukaan yang serata mungkin dan harus dicegah terjadinya pengguncangan kolom, karena hal
tersebut dapat memungkinkan rusaknya pita. Pemasukkan sampel ke dalam kolom dapat
34
menggunakan pipet kecil. Agar tidak merusak permukaan adsorben, maka ujung pipet jangan
sampai menyentuh permukaan adsorben. Oleh karena itu ujung pipet ditempelkan pada dinding
kolom dan terletak sedikit ke atas dari permukaan adsorben. Selama sampel dikeluarkan dari
pipet, ujung pipet digerakkan melingkar / berkeliling di dinding kolom namun jangan sampai ada
sampel yang tertinggal di dinding kolom. Setelah seluruh sampel terisikan ke dalam kolom,
maka kran dapat dibuka agar sampel terserap ke lapisan adsorben. Bila hampir seluruh sampel
terserap ke dalam adsorben, maka bagian atas kolom segera dialiri dengan eluen menggunakan
corong pisah.
6. Elusi
Proses terbawanya sampel dari puncak kolom sampai akhir kolom hingga memisah
menjadi komponen-komponennya disebut elusi. Untuk mempertahankan jumlah eluen selalu
dalam kondisi konstan yaitu ±1 cm di atas permukaan adsorben, maka kecepatan tetesan eluat
dari kolom harus sama dengan tetesan eluen dari corong pisah. Pemisahan terjadi karena
komponen sampel lebih banyak tertahan oleh adsorben atau dibawa oleh eluen tergantung dari
afinitas (Kd) komponen tersebut terhadap kedua fase. Pada umumnya lebih lambat jalannya
sampel dalam kolom maka akan diperoleh pita-pita kromatogram yang lebih tegas. Elusi
diteruskan hingga komponen yang dihendaki telah terpisah dan keluar dari kolom, yang
kemudian ditampung dalam beberapa fraksi pada interval waktu penampungan tertentu. Proses
ini dapat dilanjutkan dengan penetapan kadar masing-masing fraksi sehingga dapat diperoleh
kadar komponen dalam sampel campurannya.
Elusi dapat dilakukan secara isokratik ataupun secara gradien. Pada elusi isokratik, eluen
yang digunakan selama elusi selalu sama. Sedangkan pada gradien elusi / elusi landaan, eluen
yang digunakan tidak sama seperti yang digunakan pada awal elusi. Dengan kata lain, pada saat
proses elusi dapat dilakukan penggantian eluen. Jika komponen yang dikehendaki telah terpisah
dari campuran, maka eluen dapat diganti untuk mengeluarkan komponen lain yang masih ada di
dalam kolom.
C. POLA ELUSI (MEKANISME PEMISAHAN) PADA KROMATOGRAFI KOLOM
Setelah sampel dituang pada puncak kolom, dengan segera sampel akan terdistribusi di
antara kedua fase pada puncak kolom. Adanya aliran eluen maka eluen yang mengandung
sebagian sampel akan terdesak ke bagian kolom yang lebih bawah, sehingga akan terjadi
distribusi baru antara eluen dengan adsorben yang baru. Pada waktu yang bersamaan, distribusi
baru juga terjadi pada puncak kolom antara eluen yang baru dengan adsorben yang telah
mengandung sebagian sampel. Karena komponen-komponen sampel hanya dapat bergerak
bersama eluen, maka kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada lamanya
komponen berada dalam eluen, dimana hal tersebut tergantung pada seberapa besar komponen
tertambat pada adsorben. Apabila komponen mengalami retensi kuat pada adsorben maka
35
lamanya komponen tersebut berada dalam eluen lebih kecil
dibanding dengan komponen yang mengalami retensi lemah
pada adsorben. Pemisahan terjadi karena komponen sampel lebih
banyak tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak
tergantung pada afinitas komponen terhadap kedua fase. Dengan
demikian, apabila perbedaan dalam adsobsi cukup besar maka
akan terjadi perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing
komponen di dalam kolom sehingga akan diperoleh pita-pita
komponen di dalam kolom.
Jika pada bagian bawah kolom dihubungkan dengan
detektor maka akan diperoleh signal yang digambarkan sebagai
fungsi waktu, yang kemudian disebut sebagai kromatogram.
Koefisien distribusi menggambarkan kecepatan
rata-rata tiap solut (zona tengah) saat fase gerak bergerak
ke ujung akhir kolom. Harga K dapat dipresentasikan
dengan isoterm yang menggambarkan interaksi solut
dengan fase gerak dan fase diam pada temperatur tertentu.
Pada kondisi ideal, harga koefisien distribusi konstan dalam
kisaran konsentrasi yang luas, sehingga Cs proporsional
terhadap Cm dan korelasi antara keduanya membentuk
kurva garis lurus, seperti pada kurva C pada gambar di
bawah. Apabila pada equilibrium (kesetimbangan) distribusi solut di dalam kedua fase terjadi
reaksi asosiasi atau disosiasi pada salah satu fase, maka akan diperoleh isoterm B atau D.
Sedangkan kurva A disebut isoterm adsorpsi yang menunjukkan korelasi antara jumlah solut
yang diadsorpsi pada permukaan adsorben terhadap jumlah solut dalam fase gerak. Pada
konsentrasi solut tinggi, setelah seluruh tempat pada permukaan adsorben dipenuhi molekulmolekul solut maka tidak ada perubahan perbandingan Cs dan Cm sehingga kurva tampak datar.
Hal tersebut menunjukkan bahwa pada kisaran konsentrasi yang luas, jarang didapat
korelasi linier antara Cs dan Cm, namun pada konsentrasi rendah korelasi Cs dan Cm merupakan
kurva garis lurus (K konstan).
Keseimbangan adsorbsi (adsorption equilibrium)
Jika cairan mengalir sepanjang permukaan aktif suatu padatan, maka akan terjadi
keseimbangan adsorpsi analit yang terserap pada permukaan zat padat tersebut. Bila dibuat
grafik hubungan antara konsentrasi sampel dalam adsorben (Cs) dan konsentrasi sampel dalam
eluen (Cm), maka dapat diperoleh kurva adsorption isotherms seperti berikut:
36
Linier. Konsentrasi sampel yang terserap sebanding dengan konsentrasi sampel dalam eluen,
sehingga kurva linier dan peak yang dihasilkan simetris. Slope dari kurva merupakan
koefisien distribusi sampel yang bersangkutan.
Konveks. Kurva ini terbentuk bila konsentrasi sampel dalam fase diam lebih kecil daripada
konsentrasi sampel dalam fase gerak, sehingga harga Kd menjadi lebih kecil dari harga
setimbangnya. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris (tailing / pengekoran di
belakang).
Konkav. Kurva ini terbentuk bila konsentrasi sampel dalam fase diam lebih besar daripada
konsentrasi sampel dalam fase gerak, sehingga harga Kd menjadi lebih besar dari harga
setimbangnya. Akibatnya puncak yang dihasilkan tidak simetris (leading / pengekoran di
depan).
D. ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF
Kromatogram dapat menunjukkan waktu yang dibutuhkan untuk elusi suatu pita
komponen sampel. Waktu yang menunjukkan puncak kromatogram disebut sebagai waktu
retensi. Waktu retensi ini spesifik untuk tiap senyawa sehingga dapat digunakan sebagai dasar
analisis kulaitatif. Kromatogram juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif, yaitu dengan
membandingkan AUC (Area Under Curve / luas daerah di bawah kurva) komponen sampel
dengan AUC senyawa baku yang telah diketahui konsentrasinya.
Setelah komponen memisah dan keluar dari kolom, eluat dipisahkan menjadi beberapa
fraksi. Penampungan eluat yang terbagi ke dalam fraksi-fraksi, dapat dilakukan secara manual
dengan tabung reaksi yang diganti pada interval waktu penampungan tertentu. Masing-masing
fraksi yang diperoleh kemudian dianalisis. Senyawa yang tidak berwarna dianalisis dengan spot
tes secara KK atau KLT.
Analisis kuantitatif dapat dilakukan dengan mengukur absorbansi masing-masing fraksi
secara spektrofotometri untuk menghitung kadarnya. Perhitungan kadar masing-masing dapat
dilakukan dengan memasukkan data absorbansi ke dalam persamaan kurva baku Y = BX + A.
Selain itu perhitungan kadar dapat pula dilakukan dengan membandingkan serapan larutan fraksi
dengan serapan larutan baku pada konsentrasi yang telah diketahui. Dengan mengukur volume
eluat yang tertampung pada masing-masing fraksi, maka dapat dihitung jumlah zat uji pada
masing-masing fraksi. Jumlah zat uji yang terdapat dalam seluruh fraksi merupakan jumlah zat
uji yang terdapat di dalam larutan sampel yang dimasukkan ke dalam kolom. Dengan demikian
konsentrasi zat uji di dalam sampel dapat dihitung.
37
HPLC
A. PENDAHULUAN
HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang fase geraknya dialirkan
secara cepat dengan bantuan tekanan, dan hasilnya dideteksi secara instrumen.
B. INSTRUMENTASI
C. FASE GERAK DAN FASE DIAM
Fase Gerak
Kemampuan HPLC untuk memisahkan banyak senyawa terutama tergantung pada
keanekaan fase gerak. Fase gerak pada HPLC sangat berpengaruh pada tambatan dan pemisahan
senyawa. Karena banyak pelarut dapat digunakan untuk HPLC, maka sifat utama fase gerak
harus dipertimbangkan. Fase gerak untuk analisis secara HPLC harus bersifat: murni, tanpa
cemaran, tidak bereaksi dengan kemasan dalam kolom, dapat melarutkan solut, viskositas
rendah, memungkinkan memperoleh kembali cuplikan dengan mudah (jika diperlukan), dan
harganya wajar. Fase gerak untuk HPLC juga harus bebas dari gas terlarut karena dapat
mempengaruhi respon detektor, sehingga menghasilkan sinyal palsu dan mempengaruhi kolom.
Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk mengelusi suatu senyawa.
Kandungan utama fase gerak pada kromatografi fase terbalik adalah air. Kecenderungan air
untuk melarutkan sampel dapat diubah dengan menambahkan pelarut organik yang dapat
bercampur dengan air, garam untuk menimbulkan pengaruh penggaraman, asam, basa, dapar
untuk melarutkan atau mengendapkan asam basa, pereaksi pengompleks untuk menimbulkan
pengaruh pelarutan yang khas untuk gugus fungsi tertentu atau golongan senyawa tertentu.
Pemodifikasi organik yang banyak digunakan yaitu metanol, asetonitril, tetrahidrofuran.
38
Deret eluotropik ditetapkan untuk mengevaluasi polaritas pelarut, dengan parameter yang
sering digunakan yaitu P’ (indeks polaritas). Dasar yang digunakan untuk menentukan skala
polaritas ini adalah ukuran kelarutan dalam dioksan, nitrometan, dan etanol. Kekuatan mengelusi
suatu pelarut dinyatakan dengan elution strength. Secara umum, semakin besar nilai elution
strength, maka senyawa semakin cepat dielusi dari kolom. Harga indeks polaritas dan elution
strength untuk beberapa pelarut yang sering digunakan pada analisis secara HPLC, yaitu:
Pelarut
Indeks
Polaritas (P’)
n-Heksan
0,1
Toluen
2,4
Dietil eter
2,8
Tetrahidrofuran
4,0
Kloroform
4,1
Etanol
4,3
Dioksan
4,8
Metanol
5,1
Asetonitril
5,8
Nitrometan
6,0
Air
10,2
Elution
Strength (SiO2)
0,01
0,22
0,38
0.35
0,26
0,68
0,49
0,73
0,50
0,49
Besar
UV transmission
(nm)
195
285
215
210
235
205
215
205
190
380
170
Berdasarkan harga P’. Maka besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan
persamaan berikut:
n
Pcamp   P'   1 P1 ' 2 P2 '...   n Pn '
i 1
dengan Φ adalah fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang digunakan.
Fase Diam
Mekanisme pemisahan yang banyak digunakan dalam metode HPLC adalah kromatografi
partisi fase terbalik, yaitu fase diam cair diikatkan pada penyangga padat dengan fase diam yang
relatif non polar dibanding fase gerak. Kolom yang biasa digunakan pada kromatografi partisi
fase terbalik adalah kolom dengan kemasan fase terikat. Kolom dengan kemasan fase terikat
memiliki sifat stabil karena fase diamnya terikat secara kimia pada penyangga, sehingga tidak
mudah terbawa oleh fase gerak. Penyangga pada kemasan fase terikat biasanya terbuat dari silika
yang sudah diseragamkan, berpori, dan umumnya partikel memiliki diameter 3,5 atau 10 μm.
Penyangga silika gel (SiO2) merupakan rantai O-Si-O- dimana pada bagian permukaan silika berupa
gugus-gugus hidroksil (-OH), oleh karena itu silika gel
relatif bersifat polar. Pada reversed phase HPLC,
modifikasi silika gel dilakukan dengan menutup gugus
silanol (-SiOH) untuk menghilangkan gugus hidroksil
melalui reaksi silanisasi. Pada reaksi silanisasi kolom
39
partisi fase terikat, bagian organik akan diikatkan secara kimia dengan gugus silanol pada
permukaan silika. Bagian organik tersebut umumnya hidrokarbon rantai panjang. Semakin
panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika maka akan semakin hidrofobik, sehingga fase
gerak umumnya polar. Reaksi silanisasi akan menghasilkan fase diam terikat dengan tipe ikatan
siloksan yang bersifat sangat stabil. Kemasan fase terikat dengan tipe ikatan siloksan (Si-O-Si-C)
dibuat dengan mereaksikan organoklorosilan dengan gugus silanol pada permukaan silika gel
yang terhidrolisis sebagai berikut:
Si
OH
+
Cl
Si(CH 3)2R
Si
O
Si(CH 3)2R
+
HCl
Reaksi Silanisasi
Jika organoklorosilan yang digunakan adalah dichlorodimethylsilane (Si(CH3)2Cl2) maka akan
diperoleh fase diam dimetilsilan menurut reaksi berikut:
Jika organoklorosilan yang digunakan adalah trimetilklorolsilan (Si(CH3)3Cl) maka akan
diperoleh fase diam trimetilsilan menurut reaksi berikut:
CH3
Si
OH
+
Cl
Si(CH 3)3
Si
O
Si
CH3
+
HCl
CH3
Pada kromatografi partisi fase terbalik dengan kemasan fase terikat, R pada siloksan biasanya
berupa gugus C18 (oktadesil) atau C8 (oktil). Reaksi silanisasi untuk membuat isian kolom
oktadesilsilan (ODS atau C18) dibuat dari gugus silanol dan oktadesilklorosilan sebagai berikut:
Si
OH
+
Cl
Si(CH 2)17CH3
Si
O
Si(CH 2)17CH
+
HCl
3
Reaksi Pembuatan Kolom ODS
40
Tabel di bawah menunjukkan berbagai macam gugus yang diikatkan secara kimia pada
penyangga silika, sehingga terbentuk berbagai macam fase diam terikat yang diinginkan, baik
fase diam terikat yang bersifat polar ataupun nonpolar :
Berbagai macam hasil modifikasi fase diam terikat juga dapat digambarkan sebagai berikut:
41
Panjang pendeknya rantai karbon mempengaruhi tertambatnya senyawa pada fase diam. Kolom
dengan karbon rantai panjang bersifat retensif, sehingga senyawa yang memiliki sifat mirip
dengan kolom akan tertambat lebih lama.
C. POLA ELUSI (MEKANISME PEMISAHAN) PADA HPLC
Pada HPLC pemisahan terjadi di dalam kolom, sehingga mekanisme pemisahan atau pola
elusinya seperti pada kromatografi kolom. Gambar di bawah menunjukkan profil konsentrasi
komponen A dan B pada awal dan akhir elusi. Koefisien partisi A > B, oleh karena itu pada
proses migrasi komponen A berada di belakang komponen B. Bersamaan dengan proses migrasi,
terjadi pula efek pelebaran pada kedua pita yang mengurangi efisiensi pemisahan. Pelebaran pita
tidak dapat dihilangkan secara total, namun dapat dikurangi sehingga pelebaran pita terjadi jauh
lebih lambat daripada pemisahan pita. Dengan demikian pemisahan kedua komponen dapat
terjadi secara sempurna pada panjang kolom yang sesuai.
Profil Konsentrasi Solut A dan B pada Jarak Migrasi yang Berbeda
Padatan pendukung pada kromatografi partisi disalut dengan fase diam cair, dan
pemisahan senyawa campuran ditentukan oleh koefisien partisi masing-msing senyawa di antara
kedua fase cair. Pada kedua fase yaitu fase gerak dan fase diam, salah satu diantaranya harus
lebih polar dibanding yang lain. Bila fase diam lebih polar, disebut kromatografi partisi fase
normal. Bila sebaliknya, disebut kromatografi partisi fase terbalik. Pada fase normal, senyawa
polar lebih terbagi ke fase diam dan tertambat lebih lama dibanding senyawa nonpolar. Pada
kromatografi partisi fase terbalik, terjadi hal yang sebaliknya.
D. TEORI KOLOM, TEORI LEMPENG, TEORI LAJU
Teori Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Tujuan utama kromatografi adalah
memisahkan senyawa campuran dalam waktu yang relatif cepat dan wajar, menjadi puncak atau
pita, ketika senyawa bergerak melalui kolom. Ukuran kinerja kolom dapat dilihat dari
kemampuan kolom dalam memisahkan senyawa. Kolom yang efisien mencegah pelebaran
puncak atau menghasilkan puncak yang sangat sempit. Parameter yang paling banyak digunakan
untuk mengukur keefisienan kolom adalah faktor resolusi (R), bilangan lempeng teoritik (N) dan
HETP (High Equivalent to Theoretical Plate).
42
Faktor resolusi adalah ukuran pemisahan dari 2 puncak.
Rs 
Daya pisah , Rs, antara 2 puncak dapat diukur secara kuantitatif
t R 2   t R1   2t
1 / 2w1  w2  w1  w2
dengan persamaan di samping. Harga tR1 dan tR2 adalah
waktu retensi senyawa, sedangkan harga w1 dan w2 adalah
lebar alas puncak.
Berikut adalah contoh pemisahan 2 puncak pada
harga Rs yang berbeda, dengan perbandingan ukuran 2
puncak masing-masing adalah 1/1. ¼. 1/16. Pada gambar
tersebut tampak bahwa pada harga Rs yang semakin kecil,
pemisahan semakin buruk. Bahkan terdapat suatu kemungkinan bahwa 1 puncak yang muncul
tidak mencerminkan satu senyawa, melainkan 2 senyawa atau lebih yang belum memisah,
terlebih apabila kedua puncak memiliki perbandingan ukuran yang relative tinggi, seperti pada 2
puncak dengan perbandingan ukuran 1/16. Daya pisah 2 puncak dikatakan baik apabila memiliki
harga Rs minimal 1,5.
Teori Lempeng
Pada teori lempeng, kolom kromatografi digambarkan sebagai suatu seri lapisan tipis
horisontal yang disebut lempeng teoritik (theoritical plates), dimana pada setiap lempeng akan
terjadi keseimbangan solut antara fase diam dan fase gerak. Gerakan solut dan fase gerak
digambarkan sebagai transfer berurutan dari lempeng satu ke lempeng berikutnya. Pemisahan
akan terjadi lebih baik jika terjadi keseimbangan berkali-kali dalam jumlah yang tinggi. Hal
tersebut dapat tercapai jika bilangan lempeng teoritik juga tinggi. Oleh karena itu, bilangan
lempeng teoritik (N) dapat digunakan sebagai ukuran efisiensi
kolom. Persamaan tersebut menyatakan hubungan waktu retensi
t 
 tR 
N  16    5,54  R 
senyawa (tR) dan lebar alas puncak (w) atau lebar puncak pada
w
 wh 
2
2
setengah tinggi puncak (wh) dengan bilangan lempeng teoritik (N).
43
Bilangan lempeng teoritik berbanding lurus dengan panjang kolom (L). Karena panjang
kolom bermacam-macam, maka diperlukan ukuran keefisienan kolom yang tidak tergantung
pada panjang kolom. HETP atau H merupakan ukuran keefisienan kolom yang lebih disukai
karena memungkinkan perbandingan antara kolom yang panjangnya berlainan, yang dapat
diukur dengan persamaan berikut:
H  HETP 
L
N
Terlihat bahwa apabila H kecil maka N besar, sehingga jumlah terjadinya kesetimbangan di
dalam kolom akan semakin banyak. Dengan demikian pemisahan di dalam kolom akan lebih
efisien.
Plate teori mampu menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif, namun tidak dapat
menggambarkan pengaruh dari variabel-variabel yang menyebabkan terjadinya pelebaran pita,
seperti ukuran partikel, difusi, flow rate, suhu, viskositas pelarut terhadap kinerja kolom. Selain
itu, teori lempeng mengabaikan kinetika transfer massa, oleh karena itu teori lempeng tidak
menjelaskan tentang perubahan konsentrasi yang berhubungan dengan terjadinya satu
keseimbangan pada sebuah kolom dengan tinggi H, sehingga tidak dapat digunakan untuk
memprediksi penampakan kolom dalam hal pemisahan komponen sampel. Oleh karena itu, perlu
diketahui pula tentang teori laju.
Teori Laju
Pada saat migrasi, solut mengalami transfer / distribusi antara fase diam atau fase gerak
berkali-kali. Karena solut hanya dapat bergerak bila berada dalam fase gerak, maka migrasi
dalam kolom juga tidak teratur, sehingga mengakibatkan laju rata-rata solut relatif terhadap fase
gerak juga sangat bervariasi, akibatnya terjadi pelebaran pita solut.
Teori laju didasarkan pada parameter-parameter transfer massa antara fase diam dan fase
gerak, laju difusi solut sepanjang kolom, laju alir fase gerak, dan dinamika fase gerak.
Berdasarkan teori laju, pelebaran pita disebabkan oleh 3 faktor:
1. Difusi eddy (efek perbedaan jarak)
Difusi eddy merupakan aliran tidak teratur yang menyebabkan terjadinya
pencampuran konvektif. Hal ini disebabkan oleh banyaknya kemungkinan diantara
partikel packing yang dapat dilalui oleh solut, sehingga terjadi perbedaan jarak yang
harus dilalui oleh molekul yang satu dengan yang lain. Perbedaan jarak yang dilalui oleh
molekul yang satu dengan yang lain disebabkan oleh perbedaan bentuk, ukuran partikel
pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter kolom. Perbedaan tersebut
mengakibatkan perbedaan waktu keluarnya molekul-molekul dari kolom. Suatu molekul
solut dapat bergerak melalui kolom dekat dinding kolom, suatu daerah dengan kerapatan
packing yang rendah, sehingga molekul tersebut dengan cepat akan mencapai akhir
kolom. Sedangkan molekul solut yang melalui bagian tengah kolom, suatu daerah dengan
44
kerapatan packing yang tinggi, akan mencapai akhir kolom dengan kecepatan yang lebih
rendah. Hal tersebut menyebabkan pelebaran pita untuk tiap solut. Efek tersebut dapat
digambarkan sebagai berikut:
Difusi Eddy
Untuk memperkecil efek tersebut maka digunakan partikel dengan diameter kecil
dan seragam, diameter kolom kecil, pengepakan yang mampat dan homogen. Hal yang
perlu diperhatikan yaitu apabila partikel semakin kecil, maka akan terjadi penurunan
tekanan dalam kolom sehingga diperlukan tekanan yang lebih tinggi agar fase gerak
dapat melalui kolom. Selain itu, dalam hal packing semakin kecil ukuran partikel maka
akan lebih sulit untuk mendapatkan keseragaman kerapatan. Oleh karena itu, pengecilan
ukuran partikel dilakukan dengan memperhitungkan penurunan tekanan kolom yang
tidak terlalu tinggi, disertai dengan penyesuaian panjang kolom.
2. Difusi longitudinal (difusi molekul sepanjang kolom)
Difusi longitudinal merupakan efek dari gerakan random molekul solut dalam
fase gerak karena adanya perbedaan konsentrasi. Molekul-molekul cenderung berdifusi
dari daerah berkonsentrasi tinggi ke daerah berkonsentrasi rendah. Dengan demikian
pada saat melintasi kolom, molekul-molekul akan menyebar untuk berdifusi baik ke
belakang ataupun ke depan. Oleh karena itu difusi ini
disebut juga difusi memanjang, karena dapat terjadi di
sepanjang kolom, baik pada fase gerak maupun fase
diam. Akibatnya solut yang semula membentuk pita
yang sempit, akan berdifusi ke dalam fase gerak di
sekelilingnya dan melebarkan profil pita.
Efek ini dapat diperkecil dengan menggunakan fase gerak yang bobot jenisnya lebih
tinggi dengan kecepatan linier aliran ditingkatkan.
45
3. Transfer massa non equilibrium (efek ketidakseimbangan)
Aliran yang terus-menerus dari fase gerak dapat menyebabkan penyimpangan
kesetimbangan. Transfer massa non equilibrium terjadi karena pada umumnya aliran fase
gerak terlalu cepat untuk mendapatkan equilibrium (kesetimbangan) solut di antara dua
fase, dimana pada ujung belakang Cs/Cm lebih kecil dari Kd dan pada ujung depan lebih
besar dari K. Hal ini dapat digambarkan sebagai berikut: fase gerak yang berada di front
terdepan akan bertemu dengan fase diam yang masih baru. Namun molekul solut tidak
bergerak dengan cepat karena adanya resistensi antar fase pada fase diam, sehingga
equilibrium tidak terjadi dengan cepat. Akibatnya, solut sudah akan terbawa oleh fase
gerak lebih jauh ke dalam kolom sebelum kesetimbangan antar fase terjadi. Semakin
cepat aliran fase gerak, transfer massa yang terjadi akan semakin terlambat, sehingga pita
solut akan lebih melebar. Demikian pula yang terjadi di inlet kolom, yaitu solut dalam
fase diam akan bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Namun karena transfer
massa solut tidak terjadi dengan segera maka masih ada solut yang tertinggal pada fase
diam. Efek netto dari kedua keadaan ini adalah pelebaran pita pada kedua ujungnya.
Penggunaan partikel packing yang lebih kecil akan mengurangi konsentrasi solut
di fase gerak. Pada gambar di samping terlihat
bahwa (a) konsentrasi sampel saat melintasi
kolom ideal, (b) terjadi pelebaran pita karena
difusi molekul, (c) terjadi pelebaran karena
keseimbangan antara kedua fase belum tercapai.
Pengekoran puncak kromatogram (tailing dan leading)
Pada analisis secara HPLC, kondisi percobaan yang menghasilkan puncak yang simetri
selalu lebih disukai, karena puncak yang asimetri dapat menghsailkan pengukuran bilangan
lempeng teoritik dan faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan
derajat resolusi dan puncak-pincak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta waktu
retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah
peak asimmetry factor (As), yang diukur pada 10% tinggi puncak. Puncak yang simetri memiliki
nilai As sama dengan 1, sedangkan puncak dengan nilai As pada rentang 0,95 – 1,1 masih dapat
dikatakan bai. Parameter lain yang dapat digunakan yaitu peak tailing factor, yang diukur pada
5% tinggi puncak.
46
Gugus silanol yang tidak bereaksi karena adanya halangan sterik dapat memberikan
kepolaran yang tidak dikehendaki dan menyebabkan pengekoran pada puncak kromatogram.
Untuk mengurangi jumlah gugus silanol yang masih bebas, reaksi dilanjutkan dengan
penambahan trimetilklorosilan yang dapat mencapai gugus silanol karena ukurannya yang lebih
kecil dibanding organoklorosilan lain. Penambahan trimetilklorosilan dapat menutupi banyak
gugus silanol yang masih bebas, namun tidak semua gugus tersebut dapat tertutupi.
Puncak kromatogram yang tidak simetri (tailing dan leading) sering dijumpai bila
konsentrasi solut dalam fase gerak terlalu besar. Senyawa-senyawa polar juga berpotensi
menimbulkan tailing apabila masih terdapat residu gugus silanol pada permukaan fase diam.
Penyebab tailing yang lain yaitu ketidaksesuaian antara solut dan kolom, pengemasan kolom
yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi diluar kolom seperti pada injektor.
E. ANALISIS KUALITATIF
Proses terbawanya solut dari puncak kolom sampai akhir kolom disebut elusi. Apabila
detektor ditempatkan pada ujung akhir kolom, maka akan diperoleh sinyal yang digambarkan
sebagai fungsi waktu, yang disebut kromatogram. Kromatogram akan memperlihatkan bahwa
setiap senyawa meninggalkan kolom sebagai puncak simetri, sehingga sinyal detektor yang
tercatat berbentuk kurva Gauss pada waktu yang khas untuk setiap senyawa. Oleh karena itu,
kromatogram dapat menunjukkan waktu yang diperlukan untuk elusi. Waktu yang menunjukkan
puncak signal disebut waktu retensi (tR), yang tidak lain adalah waktu yang dibutuhkan analit
mulai saat diinjeksikan hingga terelusi dan keluar dari kolom pada konsentrasi maksimumnya.
Tiap senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu, antara lain kondisi
kolom, tekanan, suhu, laju aliran fase gerak, dll, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu
dasar untuk analisis kualitatif. Beberapa senyawa memiliki waktu retensi yang berdekatan,
namun tiap senyawa hanya memiliki satu waktu retensi saja. Dengan membandingkan waktu
retensi analit dengan waktu retensi senyawa baku maka analit dapat diidentifikasi.
F. ANALISIS KUANTITATIF
Analisis Kuantitatif Berdasarkan Tinggi Puncak
Tinggi puncak diperoleh dengan membuiat garis antara kedua dasar sisi puncak, dan
mengukur tegak lurus dari garis tersebut hingga puncak kromatogram. Apabila variasi pada
keadaan kolom tidak menyebabkan pelebaran puncak, dimana kromatogram yang diperoleh
berupa pita yang sempit dan tajam, maka analisis kuantitatif lebih baik didasarkan pada tinggi
puncak. Pengukuran ini dapat dilakukan dengan ketelitian tinggi, sehingga data yang diperoleh
akan lebih akurat. Variabel yang perlu dikendalikan pada analisis ini adalah suhu dalam kolom,
laju alir fase gerak, tekanan dalam kolom, dan kecepatan injeksi. Kesalahan relatif yang
disebabkan oleh penginjeksian berkisar antara 5 – 10%.
47
Analisis Kuantitatif Berdasarkan Luas Puncak
Pengukuran dengan cara ini tidak dipengaruhi oleh pelebaran pita, oleh karena itu cara ini
lebih disukai daripada pengukuran tinggi puncak. Pada umumnya, instrumen kromatografi
dilengkapi dengan integrator yang memungkinkan pengukuran luas puncak secara lebih teliti.
Bila tidak ada integrator maka pengukuran harus dilakukan secara manual.
Analisis Kuantitatif secara Kalibrasi dengan Standar
Metode untuk memperkirakan komposisi suatu campuran yang tidak diketahui adalah
dengan membandingkan terhadap suatu seri larutan baku dengan berbagai konsentrasi. Setelah
pembuatan kromatogram dari masing-masing larutan standar, kemudian dibuat kurva baku
dengan tinggi puncak atau luas puncak sebagai fungsi konsentrasi. Sumber kesalahan utama pada
metode ini terletak pada volume larutan yang diinjeksikan yang tidak reprodusibel.
Analisis Kuantitatif dengan Standar Internal
Pada metode ini dapat diperoleh ketelitian tertinggi pada analisis kuantitatif, karena
variasi volume larutan yang diinjeksikan dapat dieliminasi. Pada metode ini sejumlah standar
internal dimasukkan ke dalam tiap larutan standar dan larutan sampel. Analisis kuantitatif
dilakukan dengan rasio luas atau tinggi puncak analit terhadap standar internal. Senyawa yang
digunakan sebagai standar internal harus terpisah dari analit namun dekat dengan puncak analit.
48
DASAR – DASAR SPEKTROFOTOMETRI
A. RADIASI ELEKTROMAGNETIS
Radiasi elektromagnetis merupakan suatu bentuk energi cahaya yang memiliki sifat
dualitik antara sifat gelombang dan sifat partikel. Sifat gelombang radiasi elektromagnetis
diperlihatkan dalam fenomena seperti pembiasan, pemantulan, dan transmisi cahaya. Parameter
sifat gelombang dari radiasi elektromagnetik dijelaskan melalui teori gelombang, meliputi:
kecepatan, frekuensi, panjang gelombang, amplitude, jumlah gelombang, dll. Teori gelombang
tidak dapat menjelaskan tentang fenomena yang berkaitan dengan serapan ataupun emisi dari
tenaga radiasi. Namun hal tersebut dapat dijelaskan melalui teori korpuskuler yang menyatakan
bahwa radiasi elektromagnetis terdiri dari partikel – partikel yang disebut foton. Foton memiliki
energi tertentu dan bergerak dengan kecepatan konstan yaitu sebesar kecepatan cahaya.
Sifat-sifat Gelombang
Radiasi elektromagnetis merupakan gelombang yang tersusun dari komponen
elektrik/listrik dan komponen magnetik, yang keduanya bergetar pada bidang yang tegak lurus
satu sama lain dan tegak lurus terhadap arah rambatnya. Komponen yang aktif bila terjadi
perpindahan energi ketika terjadi interaksi dengan suatu benda adalah komponen elektrik saja.
Gelombang Elektromagnetis
Panjang gelombang (λ) merupakan jarak 2 titik yang menyatakan 1 gelombang penuh atau 1
lingkaran (nm, μm, Å). Jumlah gelombang / bilangan gelombang (υ) merupakan banyaknya
gelombang per cm (cm-1), sedangkan frekuensi (υ) merupakan banyaknya gelombang per detik
(putaran per detik atau Hz). Hubungan antara panjang gelombang, frekuensi dan kecepatan
cahaya yaitu: c/n = υ λ
c = kecepatan cahaya (3 x 1010 cm/detik)
υ = frekuensi
λ = panjang gelombang
n = indeks bias (perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa dan kecepatan
cahaya dalam suatu medium)
49
Frekuensi radiasi dalam setiap medium adalah sama, namun kecepatan dan panjang gelombang
radiasi berbeda dari medium satu ke medium yang lain.
Sifat-sifat Partikel
Seberkas sinar dibayangkan sebagai sederetan foton. Energi masing-masing foton
sebanding dengan frekuensi dari radiasi yang bersangkutan:
E=hυ
E = energi (erg)
E=hc
h = tetapan Plank (6,62 x 10-27 erg.sec)
nλ
Foton yang memiliki panjang gelombang pendek memiliki tenaga yang lebih besar daripada
foton dengan panjang gelombang yang lebih panjang. Intensitas berkas sinar sebanding dengan
jumlah foton, dan tidak tergantung pada tenaga setiap foton.
B. SPEKTRUM ELEKTROMAGNETIS
Spektrum cahaya dari matahari dapat dilihat secara alamiah dalam bentuk pelangi.
Dengan menggunakan serangkaian lensa dan prisma, maka sinar matahari dapat terpecah
menjadi beberapa komponen berwarna dengan urutan sebagai berikut:
Ultra violet – violet – nila – biru – hijau – kuning – jingga – merah – infra merah
Batas sensitivitas mata manusia adalah antara cahaya violet / ungu (λ = 400 nm = 4 x 10-4 mm)
hingga cahaya merah (λ = 800 nm). Ada pula cahaya yang memiliki λ kurang dari 400 nm dan
lebih dari 800 nm, namun tidak dapat dilihat oleh mata manusia.
Radiasi elektromagnetis yang berguna untuk analisa dapat dibagi menjadi beberapa
daerah mulai dari daerah yang energinya paling tinggi hingga daerah yang energinya paling
rendah, yaitu dari sinar gama sampai gelombang radio. Masing-masing daerah dengan panjang
gelombang, transisi energi yang terjadi, beserta penggunaannya dalam analisis dapat dilihat sbb:
50
51
Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia disebut cahaya tampak, yang umumnya
merupakan campuran dari cahaya yang memiliki panjang gelombang 400 – 800 nm. Hubungan
antara warna pada cahaya dan panjang gelombang dapat terlihat pada gambar berikut:
Hubungan Warna dengan Panjang Gelombang
Dalam tabel berikut tercantum warna beserta warna komplementernya yang tidak lain
merupakan pasangan dari setiap 2 warna dari spektrum yang akan menghasilkan warna putih bila
dicampur.
Warna dan Warna Komplementer
52
C. ABSORPSI DAN EMISI
Tiap atom memiliki tingkat energi yang tertentu besarnya (discrete energy states).
Transisi dari satu level energi ke level energi yang lebih tinggi dapat disebabkan radiasi, panas,
atau penembakan dengan partikel-partikel yang energinya relatif sama dengan perbedaan dari
kedua level energi tersebut. Oleh karena setiap level memiliki energi yang tertentu besarnya,
maka setiap sistem hanya dapat menyerap energi yang besarnya tertentu pula, yang disebut
dengan kuanta.
Proses penyerapan energi dari level energi yang paling rendah (ground state) ke level
energi yang lebih tinggi (exited state) disebut absorpsi, sedangkan proses dimana energi yang
diserap dilepaskan kembali disebut emisi. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari
cahaya diserap oleh molekul-molekul. Setiap senyawa memiliki tingkatan energi yang spesifik.
Bila cahaya yang memiliki energi yang sama dengan perbedaan energi antara ground state dan
exited state jatuh pada senyawa, maka energi akan diserap dan elektron-elektron pada ground
state akan dieksitasikan. Elektron yang teksitasi melepaskan energi dan kembali ke tingkat dasar.
absorpsi
X*
X+h
emisi
X = reseptor (atom, ion, molekul) pada level energi rendah / ground state
X* = reseptor pada level energi yang lebih tinggi / exited state
Pelepasan energi dapat berupa radiasi atau panas. Cahaya yang diemisikan dengan energi yang
sama dengan energi yang diserap disebut radiasi resonan, dan hanya terjadi pada atom. Hal
tersebut merupakan dasar dari teknik analisa yang disebut atomic fluorescence. Pada kebanyakan
molekul, energi yang diserap akan dilepaskan kembali berupa panas. Namun ada pula yang
hanya sebagian yang berupa panas (akibat adanya benturan antara molekul satu dengan yang lain
/ collisions) dan sisanya berupa cahaya, dimana proses tersebut disebut dengan luminesensi
(fluoresensi dan fosforesensi), seperi terlihat pada diagram berikut:
Diagram Absorpsi dan Emisi Energi
53
Pada atom, transisi energi terjadi karena perpindahan elektron dari orbit satu ke orbit
yang lain, sehingga disebut sebagai transisi elektronik. Sedangkan pada molekul, transisi energi
merupakan kombinasi dari transisi energi elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Dalam
urutan tersebut yang terbesar adalah energi elektronik dan yang terkecil adalah energi rotasi.
Etotal = Eelek + Evib + Erot
Gambar berikut memperlihatkan beberapa kemungkinan transisi energi pada sebuah molekul
diatomik. Dari masing-masing level energi elektronik (E0 dan E1) ada beberapa kemungkinan
level energi vibrasi (V1, V2, …) dan dari masing-masing level energi vibrasi terdapat beberapa
level energi rotasi (J1, J2, ...).
Skema Level Energi pada Sebuah Molekul
Suatu molekul memiliki energi elektronik, vibrasi, dan rotasi (internal energy) yang tertentu
besarnya (quantized energy), sehingga transisi energi hanya terjadi apabila suatu molekul
dirangsang dengan energi yang sesuai dan besarnya tergantung dari struktur molekul yang
bersangkutan. Grafik hubungan antara peresapan cahaya dan panjang gelombang (atau frekuensi)
disebut spektrum peresapan.
Radiasi inframerah hanya mampu menstimulir transisi vibrasi dan rotasi dari suatu
molekul. Oleh karena trasisi vibrasi selalu disertai dengan transisi rotasi, maka spektrum
peresapan inframerah tidak merupakan puncak yang tajam / sempit melainkan sedikit melebar
54
karena transisi rotasi berhimpit dengan transisi vibrasi. Oleh karena itu spektrum peresapan
inframerah disebut sebagai spektrum rotasi-vibrasi.
Cahaya tampak dan ultraviolet memiliki energi yang cukup untuk melakukan transisi
elektronik pada suatu molekul. Oleh karena transisi elektronik disertai oleh transisi-transisi
vibrasi dan rotasi, maka spektrum peresapan cahaya tampak dan ultraviolet merupakan puncak
yang lebih lebar (broad absorption bands) daripada spektrum peresapan inframerah. Spektrum
peresapan cahaya tampak dan ultraviolet disebut spektrum elektronik.
Molekul dengan struktur yang berbeda memiliki tingkat energi yang berbeda sehingga
spektrum peresapannya pun tidak sama. Hal inilah yang menjadi dasar analisa kualitatif suatu
senyawa (identifikasi senyawa). Banyaknya cahaya yang diserap pada panjang gelombang
tertentu sesuai dengan jumlah molekul yang ada. Hal inilah yang menentukan intensitas resapan
(banyak sedikitnya resapan) sehingga menjadi dasar analisa kuantitatif suatu senyawa.
D. HUKUM-HUKUM PERESAPAN CAHAYA
Penurunan intensitas cahaya setelah melalui zat peresap terutama disebabkan oleh
resapan dari zat tersebut. Selain itu, dapat pula disebabkan oleh pemantulan cahaya (reflektion)
pada permukaan sel yang digunakan, atau penghamburan cahaya (scattering) oleh partikel /
kotoran / serat – serat yang mungkin ada dalam larutan yang diperiksa. Sehubungan dengan hal
tersebut, maka pemantulan cahaya dapat dikoreksi dengan menggunakan blangko / referen yang
berisi pelarut yang digunakan, sedangkan penghamburan cahaya dicegah dengan menggunakan
larutan yang jernih. Bila tidak dicegah maka intensitas total dari sinar yang masuk terdiri dari:
Io = Iabsorpbed + Itransmitted + Ireflekted + Iscattered
Pada kondisi percobaan yang ideal, maka dua hal terakhir dapat diabaikan sehingga:
Io = Iabsorpbed + Itransmitted
Pada analisa kuantitatif, banyaknya cahaya yang diserap sesuai dengan jumlah zat
peresap. Hukum yang berkaitan dengan hal tersebut antara lain:
1. Hukum Lambert
Intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan tebal
zat peresap.
2. Hukum Beer
Intensitas sinar keluar menurun secara eksponensial sesuai dengan kenaikan
konsentrasi zat peresap.
3. Hukum Lambert – Beer
Hukum ini merupakan kombinasi dari kedua hukum di atas yang menyatakan
hubungan antara intensitas sinar masuk dan intensitas sinar keluar sebagai fungsi
dari tebal dan konsentrasi zat peresap:
A = abc
A = resapan (absorbance)
b = tebal larutan (cm)
a = daya resap (absorptivity)
c = konsentrasi (g/L)
55
SPEKTROFOTOMETRI UV – VISIBEL
A. PENDAHULUAN
Pada bidang farmasi, analisa spektrofotometri UV-cahaya tampak telah dikenal sebagai
metode utama baik untuk identifikasi, pemeriksaan kemurnian, ataupun penetapan kadar obat.
Selain dapat digunakan untuk analisa senyawa dalam kadar kecil, metode ini juga cepat,
sederhana, spesifik, sensitif, dan non-destruktif. Disamping untuk analisa kualitatif dan
kuantitatif, data resapan maksimum dari spektrum resapan yang diperoleh juga dapat membantu
dalam penetapan rumus bangun suatu senyawa.
Telah dinyatakan bahwa suatu molekul akan menyerap energi dari luar apabila energi
tersebut besarnya sama dengan energi yang dibutuhkan molekul tersebut untuk melakukan
transisi pada level energi yang lebih tinggi. Karena tiap molekul memiliki level energi yang
berbeda, maka energi yang dibutuhkan oleh senyawa yang berbeda juga tidak sama, yakni
tertentu jumlahnya (quantized energy) untuk molekul tertentu, menurut persamaan:
E=hc/λ
Jadi suatu molekul akan meresap cahaya dengan panjang gelombang tertentu dimana energi pada
panjang gelombang tersebut besarnya sama dengan energi yang dibutuhkan untuk melakukan
transisi elektronik, vibrasi, ataupun rotasi. Karena transisi elektronik ditentukan oleh konfigurasi
elektron dari molekul yang bersangkutan, dan transisi vibrasi rotasi ditentukan oleh gugus-gugus
fungsional dari suatu molekul, maka dapat diperoleh hubungan antara struktur molekul dengan
panjang gelombang. Molekul dengan struktur yang berbeda memiliki tingkat energi yang
berbeda, sehingga akan menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda, dengan
demikian spektrum peresapannya pun tidak sama. Hal inilah yang menjadi dasar analisa
kualitatif suatu senyawa (identifikasi senyawa). Transisi elektronik terjadi pada daerah
ultraviolet (200 – 400 nm) dan daerah cahaya tampak (400 – 800 nm). Karena transisi elektronik
suatu molekul diikuti oleh transisi energi vibrasi dan rotasi yang juga menyerap cahaya, maka
spektrum peresapan pada daerah uv dan visibel tidak menunjukkan puncak yang tajam/sempit
melainkan puncak yang melebar.
Intensitas cahaya yang diserap pada panjang gelombang tertentu tergantung pada jumlah
molekul atau kadar larutan zat peresap, sehingga menjadi dasar analisa kuantitatif suatu
senyawa, yang dapat dinyatakan melalui persamaan:
A = abc
B. PENYIMPANGAN HUKUM LAMBERT-BEER
Pada konsentrasi ideal (umumnya konsentrasi rendah), grafik hubungan antara resapan
dengan konsentrasi umumnya merupakan garis lurus / linier. Pada konsentrasi yang lebih tinggi,
kurva dapat membelok ke arah absis ataupun ordinat. Penyimpangan tersebut dapat disebabkan
oleh kondisi percobaan yang tidak ideal lagi, antara lain:
56
1. Cahaya tidak cukup monokromatis
2. Terdapat cahaya sampingan yang mengenai detektor
3. Kepekaan / sensitifitas detektor menurun
4. Intensitas sumber cahaya dan amplifier dari detektor berubah-ubah karena
tegangan yang tidak stabil
5. Disosiasi-asosiasi kesetimbangan kimia berubah, misalnya pada perubahan pH
larutan
6. Larutan berfluoresensi
7. Suhu larutan berubah selama pengukuran
Hukum Lambert-Beer hanya berlaku untuk cahaya monokromatis, yaitu cahaya yang memiliki
panjang gelombang tunggal. Dalam praktek, hal ini sulit untuk dipenuhi karena derajat
kemonokromatisan ditentukan oleh lebar celah yang digunakan. Makin kecil lebar celah maka
cahaya yang diperoleh makin monokromatis, namun intensitas cahaya yang mengenai detektor
juga makin kecil sehingga kepekaan berkurang. Oleh karena itu selalu dicari jalan tengah untuk
mendapatkan keakuratan dan kepekaan detektor.
Analisa kuantitatif sebaiknya dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu panjang
gelombang saat terjadi serapan maksimum, karena:
1. Pada resapan maksimum, perubahan resapan karena konsentrasi juga pada kondisi yang
maksimum sehingga memiliki kepekaan dan keakuratan yang tinggi.
2. Pada pita panjang gelombang ini, daya serap juga relatif konstan sehingga diperoleh
kurva kalibrasi yang linier (kurva b).
Jika panjang gelombang dipilih pada lereng puncak, misalnya λ2, maka daya resap akan berubah
sepanjang pita panjang gelombang tersebut. Pada panjang gelombang ini, hukum Lambert-Beer
tidak dipenuhi lagi sehingga kurva yang diperoleh tidak linier (kurva c).
a.
Spektrum Resapan suatu Senyawa pada 2 Konsentrasi (C dan ½ C)
b.
Kurva Kalibrasi Linier pada λ1 (λ maksimum)
c.
Kurva Kalibrasi non Linier pada λ2
Penyimpangan karena disosiasi-asosiasi dapat dijelaskan sebagai berikut: Jika
konsentrasi suatu asam lemah hendak ditetapkan secara spektrofotometri, maka kesetimbangan
asam dapat ditulis sbb:
HB
H+ + B57
Pada panjang gelombang maksimum, misalnya hanya anion B- yang melakukan resapan. Jika
pengukuran dilakukan pada medium alkali kuat maka asam lemah akan terdisosiasi sempurna
sehingga HB praktis tidak ada dalam larutan. Dengan demikian [HB] ~ [B-] dan kurva kalibrasi
merupakan kurva yang lurus. Apabila pengukuran dilakukan pada medium yang kurang alkalis,
maka disosiasi asam tidak berjalan sempurna, misalnya hanya 50% berdisosiasi, sehingga
kesetaraan [HB] dan [B-] praktis tidak dapat dipertahankan. Akibatnya hubungan antara resapan
dan konsentrasi menjadi non linier.
Perubahan suhu dapat menyebabkan pemuaian ataupun penyusutan larutan sehingga
merubah konsentrasi. Meningkatnya temperatur akan mengakibatkan penguapan terutama bila
digunakan pelarut yang mudah menguap. Pemanasan juga memicu terbentuknya gelembung gas
dari gas-gas yang diserap oleh larutan (umumnya dari udara). Gelembung gas yang menempel
pada dinding sel / kuvet, dapat menyebabkan kesalahan pada pengukuran.
Kesalahan fotometrik pada metode ini disebabkan oleh keakuratan metode fotometri
yang berkurang karena resapan yang terjadi terlalu tinggi atupun terlalu rendah. Pada resapan
yang terlalu rendah (konsentrasi larutan terlalu encer), maka intensitas sinar masuk dan sinar
keluar hampir sama sehingga tingkat kesalahan pengukuran akan menjadi besar karena yang
dideteksi adalah perbedaan dari kedua intensitas sinar tersebut. Pada resapan yang terlalu tinggi,
energi yang diteruskan terlalu kecil sehingga sulit untuk diukur secara akurat. Oleh karena itu,
untuk memperkecil kesalahan, larutan yang diperiksa sebaiknya memiliki harga transmitan
antara 15 %T atau A = 0,8 hingga 65 %T atau A = 0,2. Bila resapan terletak di luar daerah
tersebut, maka dapat diatasi dengan:

larutan yang diukur diencerkan / dipekatkan

gunakan sel dengan ketebalan yang sesuai

pilih panjang gelombang pengukuran yang sesuai
Dengan demikian larutan yang diukur dapat menghasilkan resapan dengan harga A antara 0,2 –
0,8 atau harga transmitan antara 15 %T – 65 %T. Namun hal tersebut tidak selalu berlaku untuk
setiap spektrofotometer. Umumnya pabrik mencantumkan pula kondisi %T atau A optimum
untuk spektrofotometer yang bersangkutan. Transmitan merupakan hasil bagi intensitas sinar
keluar dengan intensitas sinar yang masuk. Dengan demikian harga absorbance (A) merupakan
harga negatif logaritma dari transmitan
A = - log T
= log (1/T)
= log (100/T)
C. INSTRUMENTASI
Instrumen
yang
digunakan
untuk
mengukur
resapan
ataupun
emisi
radiasi
elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrometer. Apabila detektor yang
digunakan berupa lempeng fotografik atau filamen, maka alat ini disebut spektrograf. Bila
detektor yang digunakan berupa sel fotoelektris / fotolistrik maka disebut spektrofotometer.
58
Spektrometer yang dibuat hanya untuk pengukuran pada daerah cahaya tampak disebut
kolorimeter. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi:
1. Sumber tenaga radiasi
2. Monokromator
3. Sel peresap
4. Detektor
5. Rekorder atau pencatat
59
1. Sumber Cahaya / Radiasi
Sumber tenaga radiasi terdiri dari benda yang bila diberi tenaga listrik bertegangan tinggi
dapat memicu terjadinya eksitasi elektron ke level energi yang lebih tinggi (excited state). Ketika
elektron kembali ke level energi dasar (ground state) akan memancarkan radiasi. Sumber radiasi
yang ideal dapat menghasilkan spektrum kontinyu dengan intensitas yang seragam pada seluruh
rentang panjang gelombang yang digunakan yaitu 200 – 400 nm untuk spektrofotometer UV dan
400 – 800 nm untuk spektrofotometer visibel.
Sumber radiasi ultraviolet yang banyak digunakan adalah lampu hidrogen dan lampu
deuterium. Lampu tersebut terdiri dari sepasang elektroda yang terselubung dalam tabung gelas
dan berisi gas gidrogen atau deuterium pada tekanan rendah. Bila tegangan tinggi dikenakan
pada elektroda tersebut, maka akan terjadi pelepasan elektron yang kemudian elektron-elektron
tersebut merangsang eksitasi elektron lain dalam molekul gas ke tingkat energi yang lebih tinggi.
Bila elektron kembali ke tingkat dasar, mereka akan memancarkan radiasi secara kontinyu pada
daerah 180 – 350 nm. Sumber radiasi ultraviolet yang lain adalah lampu xenon namun tidak sestabil lampu hidrogen.
Sumber radiasi cahaya tampak sekaligus inframerah dekat adalah lampu wolfram atau
lampu filamen tungsten. Lampu ini menghasilkan radiasi kontinyu pada daerah 350 – 2500 nm.
2. Monokromator
Sumber radiasi yang umum digunakan berupa radiasi kontinyu pada daerah panjang
gelombang yang lebar. Pada spektrofotometer, radiasi yang polikromatis harus diubah menjadi
monokromatis, dengan alasan:
1. Resolusi dapat terjadi lebih sempurna
2. Sensitifitas / kepekaan meningkat karena pengukuran dapat dilakukan pada resapan
maksimum
3. Penyimpangan terhadap hukum Lambert-Beer dapat dicegah / diperkecil
Ada 2 alat yang dapat digunakan untuk mengurangi radiasi polikromatik menjadi monokromatik,
yaitu filter dan monokromator. Filter dibuat dari bahan khusus yang hanya meneruskan radiasi
pada daerah panjang gelombang tertentu dengan rentang 20 – 50 nm dan menyerap radiasi dari
panjang gelombang lain. Monokromator merupakan serangkaian alat optik yang dapat
menguraikan radiasi polikromatik menjadi panjang gelombang tunggalnya, dan memisahkan
panjang gelombang tersebut menjadi jalur yang sangat sempit, yaitu 35 – 0,1 nm.
3. Sel Peresap
Sampel yang diperiksa pada daerah UV dan visibel biasanya berupa gas atau larutan yang
dimasukkan ke dalam sel atau kuvet yang terbuat dari bahan transparan pada daerah pengukuran,
yaitu untuk daerah UV dari bahan quartz atau dari silika yang dilebur, sedangkan untuk daerah
visibel dari gelas biasa atau quartz. Kuvet untuk sampel gas memiliki panjang lintasan 0,1 – 100
60
nm, sedangkan untuk larutan memiliki panjang lintasan 1 – 10 cm. Sebelum digunakan, kuvet
harus dibersihkan dengan air kemudian dibilas dengan pelarut yang digunakan.
Kuvet harus diletakkan sedemikian rupa sehingga sinar masuk tegak lurus pada
permukaan kuvet. Bila sel miring maka terjadi kesalahan karena sebagian sinar dipantulkan atau
dibiaskan. Permukaan kuvet harus selalu pada posisi yang sama pada setiap pengukuran. Oleh
karena itu, kuvet persegi lebih menguntungkan daripada berbentuk silinder. Bila digunakan
kuvet berbentuk silinder, hendaknya ditandai agar permukaan yang sama selalu pada posisi yang
sama pula.
4. Detektor
Detektor yang digunakan dalam spektrofotometer UV-visibel disebut detektor fotolistrik /
fotoelektris, yaitu detektor yang dapat menyerap tenaga foton yang mengenainya, kemudian
mengubah tenaga tersebut menjadi arus listrik atau panas yang dapat diukur secara kuantitatif
(arus listrik yang dihasilkan sebanding dengan jumlah foton yang diserap). Kebanyakan detektor
menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan pencatat, sehingga menghasilkan sinyal
yang secara kuantitatif sesuai dengan tenaga cahaya yang mengenainya. Persyaratan yang harus
dipenuhi detektor antara lain: sensitivitas tinggi sehingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang
memiliki tingkatan rendah sekalipun, waktu respon yang singkat, stabilitas yang lama untuk
menjamin respon secara kuantitiatif, sinyal elektronik mudah diperjelas.
5. Pencatat / recorder
Sinyal yang dihasilkan detektor harus diubah ke bentuk yang dapat diinterpertasikan. Hal
tersebut dapat dilakukan menggunakan amplifier, ammeter, atau potensiometer. Agar dapat
diukur, pada umumnya sinyal detektor diperbesar menggunakan amplifier.
D. ANALISA KUALITATIF
Karakteristik resapan suatu senyawa di dalam pelarut tertentu yang berupa panjang
gelombang pada resapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi suatu senyawa. Panjang
gelombang pada resapan maksimum dapat diperoleh dari spektrum peresapan yang dihasilkan
oleh larutan zat yang diperiksa sepanjang daerah panjang gelombang tertentu, yang dihasilkan
oleh recorder. Apabila tidak terdapat recorder, maka resapan pada interval panjang gelombang
tertentu dicatat kemudian titik-titik yang merupakan hubungan antara resapan dan panjang
gelombang dihubungkan sehingga diperoleh spektrum peresapan. Spektrum peresapan yang
dibuat akan semakin akurat bila interval panjang gelombang setiap pencatatan dibuat semakin
kecil. Senyawa yang sama akan menghasilkan spektrum peresapan yang berbeda pada pelarut
yang berbeda.
Berdasarkan spektrum peresapan yang diperoleh, maka identifikasi senyawa dapat
dilakukan sebagai berikut:
61
1. Membandingkan λ maksimum. Panjang gelombang maksimum suatu senyawa dalam
pelarut tertentu dibandingkan dengan panjang gelombang maksimum senyawa baku
pembanding pada pelarut yang sama atau dengan data literatur.
2. Membandingkan resapan. Resapan yang dinyatakan dengan daya resap (a), daya resap
molar (ε), atau resapan jenis E (1%, 1 cm) dari larutan zat yang diperiksa dibandingkan
dengan data literatur atau senyawa baku pembanding.
3. Membandingkan harga resapan relatif, yaitu perbandingan resapan dari 2 panjang
gelombang resapan maksimum. Cara ini sangat berguna untuk mengetahui adanya
pengotor / impurities.
4. Membandingkan spektrum peresapan. Spektrum peresapan suatu senyawa dibandingkan
dengan senyawa baku pembanding.
Keempat hal tersebut di atas dilakukan pada waktu, cara dan kondisi percobaan yang sama,
yaitu: jenis pelarut, kadar larutan, tebal larutan dan pengaturan instrumen yang sama.
Faktor-faktor yang mempengaruhi spektrum peresapan:
1. Pelarut
Pengaruh pelarut terhadap spektrum peresapan tidak sama untuk setiap zat.
Umumnya pelarut non polar tidak terlalu berpengaruh terhadap spektrum peresapan,
sehingga spektrum peresapannya akan relatif sama. Sedangkan pelarut polar akan
mempengaruhi bentuk, intensitas, dan letak resapan maksimum, dimana pengaruh akan
makin besar bila polaritasnya makin tinggi. Pergeseran resapan ke arah panjang
gelombang yang lebih panjang disebut pergeseran batokromik / pergeseran merah.
Pergeseran resapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek disebut pergeseran
hipsokromik / pergeseran biru. Kenaikan dalam intensitas serapan disebut efek
hiperkromik, sedangkan penurunan dalam intensitas serapan disebut efek hipokromik.
Hal lain yang perlu diperhatikan yaitu adanya absorpsi pelarut yang digunakan di daerah
UV-Vis yang dikenal dengan istilah penggal UV atau UV cut off.
Pelarut yang digunakan pada spektrofotometri harus:
1. Mampu melarutkan cuplikan
2. Tidak berwarna dan mampu meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang
pemeriksaan
3. Tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya
4. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang dianalisis
5. Kemurnian tinggi dengan derajat untuk analisis
2. Kadar larutan
Makin tinggi kadar larutan maka intensitas resapan akan meningkat sehingga puncak
spektrum peresapan akan semakin tinggi. Namun kadang dengan kadar yang berbeda,
spektrum peresapan akan lain sama sekali karena pada kadar tertentu zat mengadakan
polimerisasi, dimana bentuk monomer dan polimer memiliki daerah resapan yang beda.
62
3. Tebal larutan
Larutan dengan kadar yang sama akan memberikan spektrum peresapan dengan
intensitas serapan yang berbeda bila diukur menggunakan sel yang berbeda. Makin tebal
sel maka intensitas serapan makin tinggi.
4. Lebar celah
Makin lebar celah maka sumber radiasi semakin mengarah ke polikromatis sehingga
intensitas serapan menurun dan resolusi dari puncak-puncak kurva tidak sempurna,
akibatnya pita spektrum peresapan akan makin melebar.
Spektrum Peresapan Metilparaben (Nipagin) dalam metanol
x = 0,15 mg%
y = 0,2 mg%
D. ANALISA KUANTITATIF
Analisa kuantitatif umumnya didasarkan pada hukum Lambert-Beer. Jika kondisi
percobaan memenuhi hukum tersebut, maka kurva kalibrasi yang menyatakan hubungan antara
absorbansi dan konsentrasi akan linier. Suatu senyawa memenuhi Hukum Lambert-Beer pada
batas-batas kadar tertentu pada panjang gelombang tertentu.
Prosedur analisa kuantitatif meliputi:
1. Penyiapan Sampel
Sampel umumnya berupa larutan zat dalam pelarut yang sesuai dan dapat sebagai hasil
ekstraksi atau eluat kromatografi. Penambahan sensitifitas dapat dilakukan melalui pembentukan
senyawa kompleks warna yang intensif ataupun pembentukan senyawa derivat (derivatisasi)
63
yang memiliki serapan pada daerah panjang gelombang tertentu. Pada pembentukan derivat atau
komplek yang berwarna perlu diperhatikan bahwa warna yang terjadi harus stabil, dan
pengukuran dilakukan pada rentang waktu tertentu dimana warna masih dalam kondisi stabil.
Hal yang harus diperhatikan pada penyiapan sampel adalah jenis pelarut dan kadar larutan.
Beberapa pelarut yang biasa digunakan pada spektrofotometri UV – visibel antara lain: air,
metanol, etanol, etil eter, kloroform, aseton, karbontetraklorida, benzena, dioksan, diklorometan.
Kadar larutan menentukan bentuk spektrum peresapan. Dalam monografi farmakope telah
ditentukan kadar larutan yang dapat menghasilkan serapan yang ideal. Namun bila belum
diketahui maka kadar larutan harus dibuat sedemikian rupa sehingga terletak pada daerah
optimum dimana kesalahan fotometrik dalam keadaan minimum, yaitu antara 15 %T atau A =
0,8 sampai 65 %T atau A = 0,2.
2. Pemilihan Panjang Gelombang Pengukuran
Pengukuran serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang tertentu, dimana panjang
gelombang maksimum berada pada interval tersebut.
3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Panjang gelombang maksimum ditentukan dengan membaca spektrum peresapan yang
dihasilkan dalam langkah kedua. Setelah panjang gelombang maksimum didapatkan, maka
pengukuran resapan untuk perhitungan kadar harus dilakukan pada panjang gelombang
maksimum.
3. Pengukuran Resapan
Pengukuran resapan dilakukan pada panjang gelombang maksimum. Pada setiap
pengukuran, resapan sampel harus selalu dibandingkan dengan serapan blangko, yaitu larutan
yang berisi pelarut dan pereaksi yang sama, dengan susunan dan jumlah yang sama seperti yang
digunakan untuk melarutkan atau mereaksikan senyawa uji. Blangko digunakan sebagai kontrol
atau koreksi resapan yang disebabkan oleh pelarut ataupun pereaksi yang digunakan, sehingga
data resapan yang diperoleh merupakan resapan senyawa sampel saja. Pada spektrofotometer
cahaya ganda (double beem), resapan yang terbaca langsung merupakan selisih resapan sampel
dengan resapan blangko. Pada spektrofotometer cahaya tunggal, harus dilakukan dua kali
pengukuran, yaitu pengukuran larutan sampel dan larutan blangko, kemudian harga resapan
dihitung dengan mengurangi resapan sampel dengan resapan blangko.
4. Perhitungan
a. Bila daya serap atau turunannya diketahui maka kadar senyawa uji dapat dihitung dengan
rumus :
A = abc
c=A/a
gram / liter
c=A/ε
grol / liter
64
c = A / E (1%, 1 cm) gram / 100 ml
Daya resap (a) merupakan ukuran kemampuan suatu zat untuk menyerap cahaya. Daya
resap molar (ε) merupakan resapan larutan zat 1 molar setebal 1 cm, sedangkan resapan
jenis (E) merupakan resapan larutan zat 1% seetebal 1 cm.
b. Bila digunakan zat pembanding yang kadar larutannya diketahui, maka kadar sampel
dapat dihitung dengan rumus:
As
Cs =
x Cp
Ap
Cs adalah kadar larutan sampel, Cp adalah kadar larutan pembanding, As adalah resapan
sampel, dan Ap adalah resapan larutan pembanding. Guna memperkecil penyimpangan
hukum Lambert-Beer, maka larutan pembanding dibuat dengan kadar sedemikian hingga
As mendekati atau bahkan relatif sama dengan Ap.
c. Kurva kalibrasi / Kurva baku
Kurva kalibrasi dibuat dari satu seri larutan pembanding / baku / standar, yang dibuat
dengan cara yang sama dengan larutan sampel. Seri kadar larutan baku hendaknya
memiliki resapan antara 0,2 – 0,8 dan larutan sampel juga memiliki resapan pada rentang
seri kadar larutan baku. Kurva kalibrasi atau kurva baku ini merupakan hubungan antara
konsentrasi dengan resapan / aborbance. Bila hukum Lambert-Beer dipenuhi maka kurva
kalibrasi berbentuk garis lurus atau linier. Dengan memasukkan harga masing-masing
konsentrasi dan resapan yang dihasilkan oleh tiap seri konsentrasi tersebut ke program
regresi linier (LR), maka dapat diperoleh harga A, B, dan r sehingga dapat disususn
persamaan regresi linier kurva baku sebagai berikut:
Y = B.X + A
Dengan demikian konsentrasi larutan sampel (X) dapat dicari dengan memasukkan harga
resapan yang dihasilkan sebagai Y. Nilai koefisien korelasi (r) merupakan parameter
linieritas / linearity kurva, dimana linieritas persamaan kurva baku semakin baik jika r
semakin mendekati ± 1. B (tangen α) merupakan harga kemiringan / slope kurva baku
sehingga menjadi parameter sensitivitas metode pengukuran. Apabila sudut (α) yang
dihasilkan slope kurva baku semakin mendekati 45o, maka metode pengukuran akan
semakin sensitif. Sedangkan A merupakan harga intersep kurva yaitu titik potong kurva
pada sumbu y. Semakin kecil harga A maka penyimpangan juga semakin kecil, sehingga
kurva ideal memiliki harga A = 0, dengan demikian apabila kurva diperpanjang maka
akan melalui titik (0,0).
65
E. TRANSISI ELEKTRONIK PADA SPEKTROFOTOMETRI UV – VIS
Setiap molekul memiliki sejumlah elektron yang menempati berbagai orbital molekul
secara berpasangan. Menurut Pauli, kedua elektron yang menempati orbital molekul dengan
berpasangan tersebut harus memiliki spin dengan arah berlawanan. Tingkat energi elektron yang
berpasangan dalam suatu molekul disebut tingkat energi elektron singlet. Tingkat energi elektron
singlet yang berada dalam keadaan dasar (singlet ground state) bila dikenai radiasi
elektromagnetik akan mengalami eksitasi (singlet exited state) ke tingkat energi yang lebih
tinggi. Setelah satu elektron tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi, maka akan mengalami
perubahan spin yang tidak lagi berpasangan terhadap satu elektron pasangannya yang masih
berada dalam keadaan dasar. Hal tersebut terjadi karena adanya konversi internal dan eksternal
(intersistem). Tingkat energi elektron yang spinnya sama (tidak berpasangan) dalam suatu
molekul disebut tingkat energi elektron triplet (triplet exited state). Notasi pasangan elektron
singlet dan pasangan elektron triplet dinyatakan sebagai berikut:
Diagram Energi Eksitasi Elektron
Life time adalah selang waktu tertentu suatu molekul mengalami eksitasi setelah
berinteraksi dengan radiasi elektromagnetik atau dapat dikatakan pula sebagai waktu yang
dibutuhkan untuk berada dalam keadaan tereksitasi. Setiap molekul memiliki life time yang
berbeda
sehingga
bentuk
spektrum
yang
diberikan
pada
spektrofotometri
UV-Vis,
spektrofluorometri, dan fosforimetri juga berbeda. Life time pada spektrofotometri UV-Vis (S0 –
S2 absorpsi), yaitu 10-14 – 10-10 detik. Life time pada fluoresensi (S0 – S1) 10-8 – 10-6 detik,
66
sedangkan fosforesensi (S0 – T1) berlangsung lebih dari 10-4 detik. Life time fluoresensi dan
fosforesensi lebih lama karena terjadinya konversi internal dan relaksasi vibrasi pada
spektrofluorometri, serta terjadinya konversi internal dan eksternal pada fosforimetri.
Interaksi Elektron π, σ, dan n dengan Radiasi Elektromagnetik
Ada 3 macam distribusi elektron dalam suatu senyawa organik secara umum, yaitu
orbital lektron pi (π), sigma (σ) dan elektron tidak berpasangan (n). Contoh: ketiga orbital
tersebut ada pada senyawa organik formaldehide

orbital elektron σ
x
orbital elektron π
*
orbital elektron n
Bila molekul dikenai radiasi elektromagnetik maka pertama hanya satu elektron dipromosikan ke
ke tingkat energi yang lebih tinggi, dimana orbitalnya disebut sebagai orbital anti ikatan / anti
bonding (*), dan elektron lain tidak terpengaruh. Selama elektron dalam keadaan tereksitasi
maka atom-atom dalam molekul tidak bergerak / diam dan hanya terjadi pergeseran elektron
saja. Elektron-elektron yang mengalami transisi energi elektronik pada saat terjadi resapan dapat
dibagi menjadi:

Eksitasi elektron σ→σ*
Eksitasi ini merupakan transisi energi terbesar yaitu pada daerah ultraviolet jauh / vakum
di bawah 210 nm, dan terjadi pada ikatan tunggal pada senyawa jenuh, contoh alkana.

Eksitasi elektron π→π*
Elektron-elektron ini membentuk ikatan rangkap dua dan tiga (alkena dan alkuna) yang
merupakan pertautan / overlap orbital p yang sejajar dari 2 atom. Posisi resapan adalah
sekitar 180 – 200 nm yang ditandai dengan intensitas resapan yang kuat.

Eksitasi elektron n→π*
Transisi ini merupakan transisi energi terendah yaitu pada daerah sekitar 280 nm yang
ditandai dengan intensitas resapan yang rendah. Bila elektron valensi pada atom O, N, S,
atau halogen berupa pasangan elektron bebas (lone pairs electron) yang tidak membentuk
ikatan (nonbonding electron), maka transisi elektronik yang terjadi yaitu transisi n→π*.
Pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsional yang
memiliki pasangan elektron bebas yang melekat pada kromofor, seperti –OH, O-NH2, OCH3 yang memberikan transisi n→σ*.
Peresapan radiasi ultraviolet dan visibel, memungkinkan terjadinya transisi n→π*, π→π*, n→σ*,
σ→σ*, dimana dalam urutan tersebut energi yang diserap semakin besar seperti terlihat pada
diagram di bawah. Kebolehjadian transisi ΔE yang paling mungkin akan terjadi yaitu pada
transisi satu elektron dari orbital molekul terisi yang paling tinggi ke orbital tak terisi yang
terendah. Namun tidak semua transisi dari orbital terisi ke orbital tak terisi dapat terjadi. Transisi
67
yang forbidden kebolehjadian transisinya rendah sehingga intensitas jalur serapannya pun
rendah, ini terjadi pada transisi n→π*.
Spektra Ultraviolet danVisibel
Suatu molekul sederhana apabila dikenai radiasi elektromagnetik akan menyerap radiasi
elektromagnetik yang energinya sesuai. Bila pada molekul tersebut hanya terjadi transisi
elektronik satu macam gugus, maka spektrum yang terbentuk berupa garis. Namun pada
kenyataannya, spektrum UV-Vis tidak berupa garis spektrum melainkan pita spektrum.
Terbentuknya pita spectrum tersebut disebabkan transsi energi yang tak sejenis akibat terjadinya
transisi elektronik lebih dari satu macam pada gugus molekul yang kompleks. Terjadinya dua
atau lebih pita spektrum UV-Vis diberikan oleh molekul dengan struktur yang lebih kompleks
karena terjadi beberapa macam transisi. Terbentuknya pita spektrum UV-Vis, selain disebabkan
karena tumpang tindih transisi energi elektronik dengan energi yang lain (rotasi dan vibrasi),
juga disebabkan adanya faktor lain seperti pelarut, dimana pelarut dapat mengurangi kebebasan
transisi elektronik pada molekul yang dikenai radiasi elektromagnetik.
Diagram Orbital Molekul dan Level Energi Elektronik
Dalam alkena sederhana, sejumlah transisi terjadi, namun transisi tenaga yang paling
rendah adalah yang paling penting, yaitu transisi π→π*, yang mengakibatkan serapan sekitar 170
– 190 nm dalam alkena tak terkonjugasi. Dalam keton alifatik jenuh, transisi tenaga paling
rendah melibatkan elektron-elektron bebas pada oksigen, dimana satu dari antaranya
dipromosikan ke orbital π* sehingga terjadi transisi n→π* (forbidden) dengan intensitas rendah.
Dua transisi lain yaitu n→σ*dan π→π* dimana keduanya memiliki intensitas yang kuat. Karena
elektron dalam molekul memiliki tenaga yang tidak sama, maka besarnya tenaga yang diserap
dalam proses eksitasi dapat mengakibatkan terjadinya satu atau lebih transisi.
Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi ultraviolet
dan visibel. Dengan demikian kromofor inilah yang bertanggung jawab terhadap terjadinya
68
resapan radiasi ultraviolet dan visibel, dan dianggap sebagai pembentuk warna. Resapan dari dua
atau lebih kromofor bila dipisahkan oleh lebih dari satu ikatan tunggal (tak terkonjugasi)
biasanya aditif, namun bila kromofor terkonjugasi (dipisahkan oleh satu ikatan tunggal) akan
terjadi perubahan yang nyata yaitu pergeseran batokromik yang disertai efek hiperkromik.
Kromofor-kromofor tak terkonjugasi sederhana yang banyak dijumpai dapat dilihat dalam daftar
berikut:
Auksokrom merupakan gugus fungsional yang memiliki pasangan elektron bebas yang
bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri
khas dari auksokrom yaitu heteroatom (contoh: -OCH3, -Cl, -OH, NH2) yang langsung terikat
pada kromofor. Substitusi auksokrom pada sisitem kromofor akan mengakibatkan pergeseran
batokromik yang disertai efek hiperkromik.
69
ATOM DAN MOLEKUL
A. STRUKTUR ELEKTRON DARI ATOM
Setiap kulit berhubungan dengan sejumlah energi tertentu. Semakin dekat elektron ke inti
maka semakin rendah energinya karena akan semakin tertarik oleh proton dalam inti, sehingga
dalam reaksi kimia semakin sukar berpindah. Kulit elektron yang terdekat ke inti adalah kulit
yang terendah energinya, dan elektron dalam kulit ini dikatakan berada pada tingkat energi
pertama, sedangkan elektron dalam kulit kedua, yaitu pada tingkat energi kedua memiliki energi
yang lebih tinggi.
Dalam tingkatan energi utama (kulit elektron) terdapat sub tingkat energi yang diberi
nama sesuai dengan penampilan garis-garis spectra dari elektron yang dieksitasikan yaitu s
(sharp, tajam), p (principal, utama), d (diffuse, kabur), f (fundamental, dasar). Elektron dalam
sub tingkat s lebih dekat ke inti daripada sub tingkat p, elektron dalam sub tingkat p lebih dekat
ke inti daripada sub tingkat d, elektron dalam sub tingkat d lebih dekat ke inti daripada sub
tingkat f. Banyaknya elektron yang dapat menghuni sub tingkat energi tidak sama, yaitu s : 2, p :
6, d : 10, f :14. Sub tingkat energi dibagi menjadi ruangan-ruangan yang disebut orbital atom.
Orbital atom adalah bagian dari ruang dimana kebolehjadian ditemukannya elektron adalah
tinggi (90 – 95%). Tiap orbital dapat dihuni maksimum oleh 2 elektron. Sub tingkat s terdiri dari
1 orbital s, subtingkat p terdiri dari 3 orbital p, subtingkat d terdiri dari 5 orbital d, sub tingkat f
terdiri dari 7 orbital f. Elektron mengisi orbital dari tingkat energi rendah ke tingkat energi yang
lebih tinggi (asas Aufbau), seperti terlihat dalam gambar berikut:
Berdasarkan nomor atom, maka dapat disusun konfigurasi elektron seperti contoh berikut:
70
B. IKATAN ANTAR ATOM
Ikatan Ion dan Kovalen
Karena struktur elektron berbeda-beda maka, atom dapat terikat menjadi molekul dengan
berbagai cara, seperti:
1. Ikatan ion, yaitu ikatan yang terbentuk dari perpindahan elektron dari satu atom ke atom
lain karena adanya tarikan elektrostatika antara ion-ion yang berlawanan muatan. Satu
atom akan memberikan satu atau lebih elektron terluarnya ke atom lain. Atom yang
kehilangan elektron menjadi ion positif (kation) dan atom yang mendapat elektron
menjadi ion negatif (anion).
2. Ikatan kovalen, yaitu ikatan yang terbentuk dari pemakaian bersama sepasang elektron
oleh 2 atom. Elektron yang digunakan dihasilkan dari penggabungan orbital atom
menjadi orbital yang saling digunakan yang kemudian disebut sebagai orbital molekul.
Atom membuat pasangan elektron untuk mencapai konfigurasi elektron gas mulia (aturan
oktet) yaitu 2 elektron valensi (konfigurasi helium) untuk hydrogen dan 8 elektron
valensi untuk atom lain. Penggunaan bersama sepasang elektron antara 2 atom disebut
ikatan tunggal. Dua atom dapat membagi 2 atau 3 pasang elektron sehingga disebut
ikatan rangkap dan ikatan ganda tiga.
Bilamana atom membentuk ikatan ion atau ikatan kovalen? Ikatan ion terbentuk bila
perbedaan kelektronegatifan antara 2 atom adalah besar (±1,7). Keelektronegatifan adalah
ukuran kemampuan atom untuk menarik elektron valensi (elektron pada kulit terluar yang
digunakan untuk ikatan). Kelektronegatifan dipengaruhi oleh jumlah proton dalam inti dan
jumlah kulit yang mengandung elektron. Makin besar jumlah proton maka makin besar muatan
inti positif sehingga tarikannya terhadap elektron valensi meningkat. Oleh karena itu dari kiri ke
kanan keelektronegatifan dalam satu periode susunan berkala semakin meningkat. Tarikan antar
partikel yang berlawanan muatan semakin meningkat dengan berkurangnya jarak antar partikel,
sehingga keelektronegatifan semakin meningkat dari bawah ke atas dalam satu golongan susunan
berkala karena elektron valensi makin dekat ke inti. Misalnya atom Natrium (keelektronegatifan
0,9) dengan mudah akan melepaskan elektron valensi kepada atom klor (keelektronegatifan 3,0)
Beda kelektronegatifan antara 2 atom karbon adalah nol, antara karbon dan hydrogen
hanya 0,4, antara karbon dan klor 0,5. Karbon memiliki keelektronegatifan 2,5, yaitu tengahtengah antara keelektronegatifan yang luar biasa tinggi dan keelektronegatifan yang luar biasa
rendah, sehingga karbon hampir tak membentuk ikatan ion dengan unsur lain. Karbon
membentuk ikatan ion dengan atom karbon lain atau dengan atom dari unsur lain.
71
Ikatan Kovalen Polar dan Nonpolar
Atom dengan keelektronegatifan yang sama atau hampir sama akan membentuk ikatan
kovalen yang memiliki tarikan yang sama atau hampir sama terhadap elektron ikatannya. Jenis
ikatan kovalen ini disebut sebagai ikatan kovalen nonpolar, contoh ikatan karbon-karbon, ikatan
karbon hydrogen.
Pada senyawa kovalen H2O, HCl, CH3OH, satu atom memiliki keelektronegatifan yang lebih
besar daripada yang lain. Semakin elektronegatif suatu atom, maka semakin besar tarikannya
terhadap elektron valensinya. Meskipun tarikannya tidak cukup untuk memecah atom menjadi
ion, namun cukup untuk membuat atom memiliki bagian rapat elektron yang lebih besar.
Hasilnya adalah ikatan kovalen polar, suatu ikatan kovalen dengan distribusi rapat elektron yang
tidak merata. Distribusi elektron dalam molekul polar dapat dilambangkan oleh muatan parsial:
δ+ (parsial positif) dan δ- (parsial negatif)
Momen Ikatan
Bila ikatan polar seperti pada ikatan O-H dibiarkan dalam medan listrik, maka ikatan
akan mengalami sejumlah gaya balik tertentu yang akan membebaskan ikatan dalam medan.
Ikatan yang lebih polar mengalami gaya yang lebih besar daripada ikatan yang kurang polar.
Momen ikatan, suatu ukuran kepolaran ikatan, dapat dihitung dari nilai gaya yang dialami.
momen ikatan bervariasi, mulai dari 0 Debye untuk ikatan non polar seperti H-H sampai 3-4
Debye untuk ikatan yang sangat polar.
Momen Dipol
Momen dipol μ adalah jumlah vektor dari momen ikatan dalam molekul. Karena adisi
vektor menyangkut besarnya momen ikatan sekaligus arah, maka momen dipol merupakan
ukuran kepolaran molekul secara keseluruhan, contoh momen dipol CCl4 adalah 0 meskipun tiap
ikatan C-Cl memiliki momen ikatan 1,46 D. Hal tersebut terjadi karena molekul CCl4 sekeliling
72
atom pusat, sehingga momen ikatannya saling meniadakan (jumlah vektror nol). Momen ikatan
molekul air tidak saling meniadakan karena molekul air tidak simetrik sekeliling oksigen.
Antaraksi Dipol-dipol
Adanya antaraksi dipol-dipol maka molekul saling tarik-menarik dan tolak-menolak:
tarik-menarik antara muatan yang berlainan tanda dan tolak-menolak antara muatan yang sama
tanda. Molekul nonpolar saling ditarik oleh antaraksi dipol-dipol yang lemah yang disebut gaya
London. Gaya London timbul dari dipol yang diinduksi dalam satu molekul oleh molekul lain.
Dalam hal ini. elektron dari satu molekul ditarik ke inti dari molekul kedua secara lemah, maka
elektron dari molekul kedua ditolak oleh elektron dari molekul pertama. Hasilnya adalah
distribusi elektron yang tidak merata dan suatu dipol terinduksi.
Antaraksi berbagai dipol (tarikan dan tolakan) secara kolektif disebut gaya Van der Waals. Jarak
antar atom ataupun molekul dimana gaya memiliki kekuatan terbesar disebut sebgai jari-jari Van
der Waals. Bila 2 atom saling mendekat lebih dekat dari jari-jari Van der Waals, maka timbul
tolakan. Bila jarak kedua molekul lebih besar dari jari-jari Van der Waals maka gaya tarik
berkurang.
Molekul rantai kontinu seperti CH3CH2CH2CH2CH3 dapat meluruskan molekulmolekulnya menurut rantai yang berliku-liku (zig-zag), sehingga memungkinkan atom dari
berbagai molekul menempati kedudukan yang sesuai dengan jari-jari Van der Waals. Sedangkan
molekul bercabang tidak dapat saling mendekati cukup dekat bagi semua atomnya untuk
mencapai jari – jari Van der Waals secara optimal. Oleh karena itu, senyawa rantai kontinu
memiliki titik didih yang lebih tinggi daripada senyawa rantai bercabang meskipun memiliki
struktur dan berat molekul yang sama, karena senyawa rantai kontinu memerlukan energi yang
lebih besar untuk mengatasi tarikan Van der Waals.
73
Ikatan Hidrogen
Jenis antaraksi dipol-dipol yang teristimewa kuat terjadi antara molekul yang
mengandung atom hidrogen yang terikat pada nitrogen, oksigen, atau fluor yang masing-masing
adalah elektronegatif dan memiliki pasangan elektron bebas. Atom hidrogen yang parsial positif
dari satu molekul ditarik oleh pasangan elektron bebas dari atom molekul lain yang
elektronegatif. Tarikan tersebut disebut ikatan hidrogen.
Senyawa ataupun gugus yang mengandung karbon dan hidrogen tidak dapat mengalami ikatan
hidrogen, contoh CH4 (metana) tidak dapat mengalami ikatan hidrogen karena atom karbon
dalam CH4 tidak memiliki pasangan elektron bebas untuk menarik atom hidrogen sehingga tidak
memiliki H yang parsial positif.
Kekuatan ikatan hidrogen tidak sama, contoh ikatan hidrogen O – – HO lebih kuat dari
N – – HN karena oksigen lebih elektronegatif daripada nitrogen sehingga gugus O–H lebih polar
dan memiliki H yang lebih positif. H yang lebih positif akan lebih kuat tertarik pada pusat
negatif.
Ikatan hidrogen juga dapat terbentuk antara 2 senyawa yang berbeda, contoh antara CH3OH dan
H2O. Dalam hal ini sering terdapat lebih dari satu kemungkinan terjadinya ikatan hidrogen.
Dalam campuran senyawa tersebut, ikatan hidrogen dapat pula terbentuk antara 2 molekul H2O
dan antara 2 molekul CH3OH.
ORBITAL DAN PERANANNYA DALAM IKATAN KOVALEN
A. ORBITAL IKATAN DAN ORBITAL ANTI IKATAN
Bila 2 gelombang yang sefase saling tumpang tindih, maka akan saling memperkuat. Bila
sepasang gelombang yang tumpang tindih keluar fase maka akan saling mengganggu atau
berinterferensi. Satu orbital atom dapat bertumpang tindih dengan orbital atom lain. Bila yang
74
bertumpang tindih sefase, maka akan terjadi perkuatan dan terbentuk orbital molekul ikatan.
Tumpang tindih orbital yang keluar fase menghasilkan interferensi menuju ke orbital anti ikatan.
Pada 2 atom hidrogen yang terisolir, masing-masing memiliki satu elektron dalam orbital
atom 1s. Bila kedua atom mulai membentuk ikatan, orbital atom akan melebur dan bertumpang
tindih untuk saling memperkuat dan membentuk orbital molekul ikatan. Orbital molekul ini
mencakup kedua inti hidrogen dan mengandung sepasang elektron (masing-masing dari satu
atom H), dimana kedua elektron tersebut tertarik sama kuat ke kedua inti. Karena rapat elektron
antara inti yang berikatan adalah tinggi, maka tolak menolak antara inti dikurangi dan terbentuk
ikatan kovalen dalam molekul H2.
Bila 2 gelombang berlawanan fase, maka akan saling berinterferensi. Interferensi dari 2
orbital atom yang keluar fase dari 2 atom H akan menghasilkan orbital molekul dengan simpul
antara inti yang disebut orbital anti ikatan (* artinya anti ikatan). Dalam orbital molekul ini,
kebolehjadian menemukan elektron antara inti sangat rendah. Oleh karena itu, orbital molekul ini
menimbulkan sistem dimana kedua inti tak dilindungi oleh sepasang elektron dan intinya saling
tolak-menolak. Karena adanya tolakan inti, maka sistem ini energinya lebih tinggi daripada
sistem 2 atom H yang terisolir / mandiri.
75
Demikian pula dengan pembentukan orbital molekul dari molekul F2, yang masing-masing
memiliki konfigurasi 1s2 2s2 2px2 2py2 2pz1. Masing-masing atom F memiliki 1 orbital p setengah
terisi yaitu 2pz. Orbital 2pz dari masing-masing atom F akan bertumpang tindih pada sumbu x
dengan arah adu kepala sehingga masing-masing orbital dapat terisi 2 elektron dengan spin
berlawanan. Dengan demikian terbentuklah satu orbital molekul yang mencakup 2 elektron
orbital 2pz dan kedua inti.
Pada molekul HF, tumpang tindihnya terdiri dari satu orbital 1s setengah terisi dari atom
H dan satu orbital 2p setengah terisi dari atom F.
B. IKATAN SIGMA (σ)
Dalam H2, F2, dan HF, orbital molekul yang dibentuk disebut orbital sigma, yaitu orbital
molekul yang simetris di sekitar garis yang menghubungkan kedua inti, sehingga rapat elektron
berada di daerah bonding antara kedua inti. Ikatan yang terjadi disebut sebagai ikatan sigma (σ).
C. IKATAN PI (π)
Selain adu kepala, orbital p yang setengah terisi memiliki cara lain dalam bertumpang
tindih untuk membentuk orbital ikatan. Jika kedua orbital p terletak tegak lurus pada garis yang
menghubungkan kedua inti, maka orbital p akan bertumpang tindih secara adu sisi.sehingga
terbentuk awan elektron yang terletak di atas dan di bawah kedua inti. Orbital molekul yang
terbentuk ini disebut orbital pi, dan ikatan kovalen ini disebut ikatan pi (π).
Ikatan pi terdapat dalam molekul yang memiliki 2 atom yang dihubungkan oleh ikatan
rangkap atau ganda tiga, dimana ikatan tersebut juga sekaligus mengandung ikatan sigma. Ikatan
sigma memiliki tumpang tindih yang lebih besar dan ikatannya lebih kuat, sedangkan ikatan pi
tumpang tindihnya lebih kecil sehingga ikatannya lebih lemah.
Ikatan Sigma
Ikatan Pi
D. ORBITAL HIBRIDA KARBON
Karbon memiliki 2 elektron dalam orbital 1s, sehingga orbital 1s merupakan orbital terisi
yang tidak digunakan untuk membentuk ikatan. Keempat elektron pada tingkat energi kedua
(kulit kedua) merupakan elektron valensinya, yaitu elektron pada kulit terluar yang digunakan
untuk membentuk ikatan yang terdiri dari satu orbital 2s dan tiga orbital 2p. Namun karbon tidak
76
menggunakan keempat orbital dalam keadaan murninya untuk ikatan, melainkan bercampur atau
berhibridisasi. Terdapat 3 cara hibridisasi atom karbon untuk membentuk ikatan, yaitu:
1. Hibridisasi sp3
Digunakan bila karbon membentuk 4 ikatan tunggal, contoh:
Dalam CH4 karbon memiliki ikatan kovalen terhadap hidrogen yang ekuivalen. Hal ini
membuktikan bahwa karbon tidak membentuk ikatan dari satu orbital s dan tiga orbital p, karena
jika demikian keempat ikikatan C – H tidak akan ekuivalen. Keempat ikatan karbon tersebut
terjadi dari hibridisasi lengkap keempat orbital atomnya (satu orbital 2s dan tiga orbital 2p)
sehingga terbentuk orbital sp3 yang akuivalen. Agar hal tersebut terjadi maka satu dari elektron
2s harus dieksitasikan ke orbital 2p yang kosong sehingga terbentuk empat orbital sp3 yang
masing-masing mengandung satu elektron untuk ikatan. Keempat orbital sp3 yang terbentuk
memiliki energi yang sama, agak lebih tinggi dari energi orbital 2s namun agak lebih rendah dari
orbital 2p.
Orbital sp3 berupa pencampuran orbital 2s dan 2p sehingga ada cuping besar dan cuping kecil
dengan simpul pada inti. Ikatan atom karbon sp3 terjadi dari tumpang tindih masing-masing
orbital sp3 dengan empat orbital atom lain. Dalam metana masing-masing orbital sp3 dari karbon
bertumpang tindih dengan orbital 1s dari hidrogen dan ikatan yang terbentuk berupa ikatan
sigma.
Demikian pula dalam etana (CH3–CH3), tiga orbital sp3 dari masing-masing atom C
bertumpang tindih dengan orbital 1s atom H dan satu orbital sp3 sisanya bertumpang tindih
dengan orbital sp3 atom karbon yang lain.
77
2. Hibridisasi sp2
Digunakan bila karbon membentuk ikatan rangkap, contoh:
Untuk membentuk orbital sp2, karbon menghibridisasikan orbital 2s nya hanya dengan dua
orbital 2p, dan satu orbital p pada atom karbon tetap tidak terhibridisasi, sehingga terbentuk 3
orbital sp2 dan satu orbital 2p yang tak terhibridisasi.
Dalam etilena (CH2=CH2), dua orbital sp3 dari masing-masing atom C bertumpang tindih dengan
orbital 1s atom H dan satu orbital sp3 sisanya bertumpang tindih dengan orbital sp3 atom karbon
yang lain, dimana ketiganya membentuk ikatan sigma. Sedangkan satu orbital 2p yang tak
terhibridisasi dari atom C akan bertumpang tindih secara adu sisi dengan orbital 2p tak
terhibridisasi atom C lain dan membentuk ikatan pi.
3. Hibridisasi sp
Digunakan bila karbon membentuk ikatan ganda tiga atau ikatan rangkap terakumulasi
(dua ikatan rangkap terhadap satu karbon tunggal), contoh:
78
Untuk membentuk orbital sp, karbon menghibridisasikan orbital 2s nya hanya dengan satu
orbital 2p, dan dua orbital p pada atom karbon tetap tidak terhibridisasi, sehingga terbentuk 2
orbital hibrida sp dan dua orbital 2p yang tak terhibridisasi.
Dalam asetilena, kedua atom C dihubungkan oleh ikatan sigma sp–sp dan masing-masing karbon
juga terikat terhadap atom H oleh ikatan sigma sp–s. Sedangkan kedua orbital 2p yang tak
terhibridisasi dari satu karbon akan bertumpang tindih dengan dua orbital 2p atom karbon yang
lain, sehingga terbentuk 2 ikatan pi. Dengan demikian ikatan rangkap tiga terdiri dari satu ikatan
sigma dan dua ikatan pi.
POTENSIOMETRI
A. PENDAHULUAN
Reaksi-reaksi kimia yang melibatkan transfer elektron (pelepasan atau penangkapan
elektron) dari satu spesies ke spesies lain merupakan dasar dari kimia elektroanalitik /
elektrokimia. Hal tersebut umumnya berlangsung dalam suatu sistem yang terdiri dari elektrolit
79
dan sepasang elektroda (electrochemical cell). Berdasarkan unit listrik yang dipelajari untuk
menyatakan konsentrasi, maka dalam elektrokimia dikenal beberapa macam teknik seperti:
Unit Listrik yang Diamati
Teknik
Volt / pH vs ml titran
Potensiometri
Ampere vs ml titran
Amperometri
Tahanan
Konduktimetri
Coulomb
Coulometri
Amper vs volt
Polarografi
Pertambahan berat elektroda
Elektrogravimetri
Volt vs waktu
Chronopotensiometri
Hilang timbulnya arus
Dead stop end point
Pada bidang farmasi, teknik yang sering digunakan yaitu: potensiometri, polarografi, dan dead
stop end point. Metode elektrometrik bersifat sensitif, selektif, dan akurat. Kesensitifan metode
ini dapat sampai di bawah 10-10 molar. Karena selektif maka pemisahan sampel atau sample
pretreatment dapat dikurangi sehingga waktu analisis bisa lebih singkat. Selain itu, remote
control, in-line instalation dan automation dapat dilakukan dengan cara ini.
Potensiometri merupakan cabang dari elektrokimia yang mempelajari atau mengukur
potensial elektroda untuk menyatakan konsentrasi. Titrasi potensiometri dapat digunakan untuk
penetapan kadar larutan dimana indikator visual tidak dapat digunakan, misalnya larutan yang
sangat encer dan untuk larutan berwarna.
B. POTENSIAL ELEKTRODA
Pada sistem redoks (reduksi oksidasi) terjadi transfer elektron, baik berupa pelepasan
elektron (oksidasi) ataupun penangkapan elektron (reduksi) yang terjadi secara bersamaan.
Oksidator dipahami sebagai senyawa yang mampu mengoksidasi senyawa lain, sedangkan
dirinya sendiri mengalami reduksi sehingga terjadi penurunan bilangan oksidasi (biloks).
Reduktor dipahami sebagai senyawa yang mampu mereduksi senyawa lain, sedangkan dirinya
sendiri mengalami oksidasi sehingga terjadi kenaikan biloks. Bilangan oksidasi merupakan
bilangan yang menyatakan banyaknya muatan listrik suatu unsur di dalam persenyawaan,
misalnya:
Unsur bebas
biloks = 0
H dalam persenyawaan
biloks = +1
O dalam persenyawaan
biloks = -2
Logam alkali (gol A)
biloks = +1
Alkali tanah (gol B)
biloks = +2
Jumlah biloks unsur-unsur dalam persenyawaan = 0
80
Pada sistem redoks selalu terjadi kesetimbangan antara oksidator dan reduktor, seperti
digambarkan reaksi berikut:
red
oks + ne
Berdasarkan pemahaman tersebut, maka reaksi di atas dapat dituliskan dalam 2 reaksi paro:
→ oks + ne
Oksidasi :
red
Reduksi
oks + ne →
:
red
Bila sebuah elektroda dicelupkan ke dalam sistem tersebut, maka dapat terjadi 2 kemungkinan:
1. Bila sistem merupakan oksidator maka elektroda akan teroksidasi (melepaskan elektron)
sehingga bermuatan positif.
2. Bila sistem merupakan reduktor maka elektroda akan tereduksi (menangkap elektron)
sehingga bermuatan negatif.
Besarnya potensial yang terjadi merupakan ukuran kemampuan atau potensi sifat oksidator
reduktor dari sistem tersebut, yang dinyatakan dalam harga potensial reduksi / potensial
elektroda (E).
Permasalahannya, harga E yang sesungguhnya dari suatu reaksi reduksi tidak dapat
dihitung, sebab tidak ada reaksi reduksi yang berlangsung tanpa disertai reaksi oksidasi sehingga
reaksi reduksi hanya merupakan setengah reaksi dari pasangan reaksi oksidasi. Oleh sebab itu
harga E yang digunakan adalah harga E relatif yang dibandingkan terhadap elektroda standar,
sehingga harga E lebih tepat disebut harga Eo yaitu potensial reduksi standar atau potensial
elektroda standar.
Standar yang digunakan dalam menentukan harga Eo adalah elektroda hidrogen. Gas
hidrogen murni dialirkan pada elektroda platina yang tercelup dalam larutan asam (H+), maka
pada permukaan platina akan terjadi kesetimbangan :
2H+ + 2e === H2
Harga Eo dari reaksi tersebut adalah nol volt, sehingga harga Eo dari semua reaksi reduksi adalah
harga E relatif yang dibandingkan terhadap Eo hidrogen.
Semakin besar harga potensial reduksi standar (Eo) maka potensi atau kemampuan suatu
unsur untuk mengalami reduksi semakin besar, yang artinya sifat oksidatornya semakin kuat.
Demikian pula sebaliknya. Sistem yang harga Eonya lebih besar dapat mengoksidasi sistem yang
Eonya lebih kecil.
C. ELEKTRODA
Elektroda dapat dibagi menjadi 2 golongan, yaitu reference elektrode atau elektroda
standar dan indicator elektrode. Elektroda standar memiliki harga potensial yang konstan tidak
dipengaruhi oleh kondisi larutan, sedangkan elektroda indikator harga potensialnya berubahubah sesuai dengan konsentrasi larutan. Masing-masing elektroda tersebut merupakan sistem
setengah sel sehingga tidak dapat digunakan sendiri-sendiri.
81
Potensial suatu larutan ditentukan oleh: Ecell = Eind + Eref + Ej
dimana Ecell, Eind, Eref, Ej masing-masing adalah harga potensial sel, elektroda indikator,
elektroda standar, dan liquid junktion potential yaitu potensial pada bidang batas dua larutan.
Pada sistem yang baik harga Eref konstan dan harga Ej juga konstan bahkan sangat kecil sehingga
harga Ej seringkali diabaikan. Oleh karena itu, potensial yang ditunjukkan oleh elektroda
indikator dapat memberikan informasi tentang konsentrasi zat uji tertentu dalam suatu larutan.
Elektroda standar / rujukan
1. Elektroda hidrogen. Semua potensial elektroda merupakan harga relatif terhadap
potensial elektroda hidogen standar, sehingga elektroda hidrogen merupakan elektroda
rujukan primer. Meskipun elektroda hidrogen merupakan elektroda rujukan primer,
namun dalam praktek banyak digunakan elektroda standar lain untuk kebanyakan
maksud, elektroda yang dapat dipasang permanen sehingga tersedia untuk penggunaan
yang mendadak. Dengan demikian pemasangan seksama termasuk pemurnian gas yag
diperlukan dalam menyusun elektroda hidrogen dapat dihindari. Bila digunakan sebagai
elektroda standar, elektroda hidrogen bekerja dalam larutan yang mengandung ion
hidrogen pada aktivitas yang konstan yang biasanya didasarkan pada asam klorida. Selain
itu gas hidrogen harus bertekanan 1 atm.
Elektoda Hidrogen
Elektroda Kalomel
2. Elektroda kalomel. Elektroda standar yang paling banyak digunakan adalah elektroda
kalomel karena mudah dibuat dan harga potensial yang konstan. Potensial elektroda
tergantung pada konsentrasi KCl yang ada di dalamnya, yaitu 0,1 N; 1 N; atau jenuh,
namun yang banyak dipilih untuk suatu pekerjaan rutin adalah yang jenuh. Larutan
kalium klorida harus dijenuhi oleh kalomel (merkurium (I) klorida). Potensial elektroda
kalomel pada 25 oC relatif terhadap elektroda hidogen normal (standar) untuk 0,1 N; 1
N; dan jenuh masing-masing adalah 0,3371; 0,2846; dan 0,2458 volt.
3. Elektroda perak-perak klorida . Elektroda ini barangkali nomor dua pentingnya setelah
elektroda kalomel. Silver-silver chlorida elektrode terdiri dari kawat perak atau kawat
platinum yang dilapis perak, kemudian disalut secara elektrolisis dengan lapisan tipis
perak klorida. Kawat tersebut tercelup di dalam larutan KCl yang telah diketahui
82
konsentrasinya. Potensial elektroda perak-perak klorida pada 25 oC relatif terhadap
elektroda hidogen normal (satandar) masing-masing adalah 0,29 dan 0,199 volt untuk
konsentrasi larutan KCl 0,1 M dan jenuh.
4. Elektroda merkuri sulfat. Susunannya hampir sama dengan elektroda kalomel namun
menggunakan larutan raksa (I) sulfat jenuh dalam asam sulfat 0,1N. Elektroda ini dapat
digunakan untuk larutan yang mengandung ion-ion perak dan timbal.
Elektroda indikator
1. Elektroda hidrogen. Selain fungsinya sebagai elektroda standar, elektroda hidrogen dapat
digunakan sebagai elektroda indikator untuk mengukur konsentrasi ion hidrogen ataupun
pH larutan sehingga dapat digunakan untuk titrasi potensiometri asam-basa. Elektroda
hidrogen tidak dapat digunakan dalam larutan yang mengandung oksidator, seperti ion
permanganat, nitrat, serium (IV), dan besi (II), ataupun reduktor seperti senyawa organik
tak jenuh, sulfida, sulfit, arsen. Elektroda hidrogen juga tak memuaskan apabila terdapat
garam logam mulia seperti tembaga, perak, emas, dan dalam larutan yang mengandung
garam timbel, kadmium, dan talium. Elektroda hirogen juga memiliki beberapa
keunggulan antara lain, merupakan elektroda mendasar dimana semua pengukuran pH
pada akhirnya akan dibandingkan, dapat digunakan pada semua rentang pH, tidak
menunjukkan sesatan garam. Namun dalam praktek penggunaan elektroda lain sebagai
elektroda indikator lebih disukai. Elektroda alternatif yang peka akan ion hidrogen antara
lain elektroda kuinhidron, elektroda stibium, elektroda gelas.
2. Elektroda stibium. Elektroda stibium sebenarnya merupakan elektroda stibium-stibium
trioksida. Elektroda ini tidak mudah terkontaminasi / teracuni, sederhana penggunaannya
dan
kuat
sehingga
digunakan
untuk
merekam
atau
mengawasi
pH
secara
berkesinambungan. Namun elektroda ini tidak dapat digunakan jika terdapat oksidator
kuat dan zat pengompleks, di dalam larutan dengan pH di bawah 3, ataupun adanya
logam yang lebih mulia dari stibium. Pada bidang analisis penggunaannya terbatas, tetapi
penting dalam industri karena memiliki sifat dasar sederhana dan tahan terhadap
kekasaran.
3. Elektroda kuinhidron. Elektroda kuinhidron sensitive terhadap hydrogen, dan relatif
paling murah. Elektroda ini terdiri dari sama banyak molar kuinon dan hidrokinon, serta
kawat platina. Elektroda kuinhidron tidak dapat digunakan untuk pengukuran pH di atas
8 ataupun larutan yang mengandung oksidator reduktor kuat.
4. Elektroda gelas / kaca. Elektroda kaca merupakan elektroda peka ion hidrogen yang
paling luas penggunaannya. Penggunaannya didasarkan pada suatu fakta bahwa bila
suatu selaput kaca dibenamkan dalam suatu larutan, maka akan terjadi suatu potensial
yang merupakan fungsi linier dari konsentrasi ion hidrogen larutan tersebut. Bagian
83
ujungnya terbuat dari gelembung gelas yang sangat tipis dan sensitif terhadap perubahan
pH larutan dengan penataan dasar seperti pada gambar berikut:
Elektroda Gelas
Bola B dibenamkan dalam larutan yang konsentrasi ion hidrogennya akan diukur. Kontak
listrik akan terjadi dengan mengisi bola tersebut dengan larutan asam klorida (0,1 M)
kemudian membenamkan elektroda perak-perak klorida. Apabila konsentrasi larutan HCl
konstan maka potensial elektroda perak-perak klorida juga konstan. Demikian pula
dengan potensial elektroda antara larutan HCl dan permukaan dalam bola kaca. Satusatunya potensial yang dapat berubah adalah potensial antara permukaan luar bola kaca
dan larutan uji yang dicelupi elektroda tersebut, sehingga potensial keseluruhan elektroda
tergantung pada konsentrasi ion hidrogen dalam larutan uji. Oleh karena itu, untuk
memastikan bahwa konsentrasi asam klorida di dalam bola tetap konstan maka ujung atas
elektroda harus dikedapkan dengan melelehkan kaca seperti dilukiskan pada gambar b.
Elektroda kaca memiliki respon yang cepat, tidak dipengaruhi oleh oksidator kuat
ataupun reduktor kuat, gas terlarut, warna larutan, koloid, media kental, larutan garam
kecuali garam natrium, dan dengan adanya protein ataupun senyawa serupa yang dapat
mengganggu elektroda lain. Elektroda kaca dapat pula disesuaikan untuk pengukuran
larutan yang volumenya kecil. Sifat dasar dari bahan kaca / gelas yang digunakan untuk
membuat elektroda ini sangatlah penting. Hardglass seperti Pyrex tidak sesuai, sehingga
harus digunakan jenis yang lunak (softglass) yang responsif terhadap pH. Elektroda gelas
dari soda-kapur (Corning glass 015) memiliki respon linier pada rentang pH 1 – 9, namun
dalam larutan berbasa tinggi mudah mengalami sesatan basa dan cenderung memberikan
harga pH yang lebih rendah. Sesatan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi ion
logam alkali dalam larutan, namun sesatan berkurang dalam larutan yang mengandung
ion litium, kalium, barium, atau kalsium. Oleh karena itu, sesatan basa diatasi dengan
84
mengganti kandungan natrium kaca dengan litium elektroda gelas dari litium-silika dapat
digunakan pada hampir seluruh rentang pH. Elektroda gelas mudah pecah dan goresan
pada gelembungnya dapat mempengaruhi kerjanya. Sebelum melakukan pengukuran,
elektroda gelas hendaknya dicuci baik-baik dengan akuades setiap setelah pengukuran,
kemudian dibilas dengan larutan uji. Elektroda kaca tidak boleh dibiarkan kering, kecuali
selama penyimpanan dalam waktu panjang dan akan kembali ke kondisi responnya bila
dicelup dalam akuades minimal 12 jam sebelum digunakan. Pada 25 oC, bila dicelupkan
dalam suatu larutan maka potensial elektroda kaca dinyatakan dengan persamaan:
E = k + 0,0592 pH
K merupakan suatu tetapan yang dikenal dengan potensial asimetri, yang harganya
tergantung pada sifat dasar kaca (kualitas, tebal kaca), komposisi larutan dalam elektroda,
ataupun usia elektroda. Dengan demikian tidak dapat diberikan nilai konstan pada k,
sehingga elektroda gelas harus seringkali distandarisasi dengan membenamnya dalam
larutan yang aktivitas ion hidrogennya telah diketahui (larutan buffer). Elektroda standar
yang paling lazim digunakan sebagai kombinasinya dalam mengukur konsentrasi ion
hidrogen adalah elektroda kalomel, sehingga akan dihasilkan sel:
Ag, AgCl(s) | HCl (0,1 M) | kaca | larutan uji | KCl (jenuh), Hg2Cl2(s) | Hg
Pada elektroda kombinasi, elektroda kaca dan elektroda kalomel jenuh digabung menjadi
satu satuan tuggal, sehingga diperoleh instrumen yang lebih kokoh dan terhindar dari
kerepotan membenamkan kedua komponen secara terpisah.
D. INSTRUMENTASI
Potensiometer (konvensional)
Alat ini digunakan untuk penetapan potensial suatu sel. Sebelum digunakan sel kerja
harus dirangkai pada instrumen tersebut selama 20-30 menit, dimana selama waktu ini
kumparan-kumparan tahanan pada instrumen akan menghangat dan diperlukan waktu
secukupnya untuk mencapai kesetimbangan termal. Kemudian sel standar dimasukkan pada
rangkaian dan ditetapkan titik ke titik keberimbangan pada kawat geser potensiometer.
Potensiometer Tinsley pembacaan langsung dalam volt, sehingga hlangkah tersebut dilakukan
dengan cara memutar saklar selektor ke posisi calibrate dan reostat penyetimbang disesuaikan
hingga galvanometer tidak lagi menunjukkan simpangan. Saat mulai operasi standarisasi, saklar
kepekaan galvanometer diatur pada tingkat kepekaan terendah kemudian bertahap dinaikkan
hingga makin mendekati titik keberimbangan. Langkah tersebut dilakukan dengan cara memutar
saklar selektor dari posisi 1 ke posisi 2 tergantung pada pasangan ujung mana sel itu
dihubungkan. Saat mendekati titik berimbang, kepekaan galvanometer ditingkatkan hingga
tercapai kepekaan maksimum. Kemudian sel standar diganti dengan sel uji.
Pada banyak kerja analitik, pengukuran potensial sel disederhanakan menggunakan mili
voltmeter zat padat, seperti pH meter, sehingga potensial diperoleh dengan segera melalui suatu
85
pembacaan tunggal tanpa proses penyetimbangan yang memakan waktu seperti yang dilakukan
pada potensiometer konvensional.
pH Meter
Mengingat tingginya tahanan elektroda gelas, maka potensiometer biasa tidak dapat
digunakan untuk mengukur potensial sel dengan elektroda gelas. Kemudian dirancang suatu
voltmeter elektronis yang dirancang untuk sistem elektroda gelas. Elektroda gelas digunakan
untuk mengukur pH suatu larutan, sehingga instrumen tersebut dikenal sebagai pH meter. Ada 2
tipe pH meter, yaitu:
1. Potentiometric pH meter (pH meter bertipe potensiometer)
Tipe ini menggunakan potensiometer sirkuit konvensional dimana galvanometer
diganti dengan tahanan tinggi. Ketidakseimbangan antara potensiometer dan sel sirkuit
akan menghasilkan penurunan potensial sepanjang tahanan tersebut. Hal tersebut
diperbesar dengan suatu elektronik sirkuit sehingga terbaca pada skala. Bila potensial
dari potensiometer dan sel tepat sama, maka tidak ada arus ataupun penurunan potensial
sepanjang tahanan sehingga skala menunjukkan angka nol. Dalam hal ini, amplifier
circuit hanya berfungsi untuk mendeteksi titik keseimbangan dari potensiometer.
Potensiometer
2. Direct reading pH meter (pembacaan langsung)
Tipe ini tidak menggunakan potensiometer sirkuit melainkan sebuah vacuum tube
voltmeter atau suatu transistor analog. Potensial dari sel diteruskan melalui tahanan yang
tinggi ke dalam input dari instrumen dan pH ataupun potensial larutan langsung dibaca
pada sebuah skala setelah signal diperbesar oleh amplifier. Persyaratan elektronis tipe ini
lebih komplek karena hubungan antar input voltage dengan penyimpangan jarum skala
harus benar-benar linier. Keuntungan penggunaan tipe ini yaitu bahwa grafik hubungan
antara pH dan waktu dapat dilukiskan pada kertas grafik dengan recorder. Bila tipe ini
dikombinasi dengan recorder maka dapat digunakan untuk membuat kurva netralisasi
86
selama titrasi atau dengan menggunakan servemecanism dapat digunakan untuk
mengontrol proses industri.
Persamaan dasar suatu pH meter menyatakan bahwa 1 unit pH setara dengan 59 mV pada suhu
25oC. Oleh karena itu, meter yang sama dapat digunakan untuk dua skala yaitu mV dan pH.
Diagram skematis basic circuit dari pH meter adalah sebagai berikut:
pH meter tipe pembacaan langsung sekarang telah menjadi standar, bahkan tipe termodernnya
menggunakan voltmeter digital, yang skalanya diubah sehingga langsung menunjukkan nilai pH,
seperti pada gambar berikut:
Elektroda gelas memiliki potensial asimetri yang tidak memungkinkan menghubungkan
langsung potensial elektroda terukur dengan pH larutan. Oleh karena itu, elektroda perlu
dikalibrasi terlebih dahulu. Kalibrasi dilakukan dengan mengoperasikan 2 tombol, yaitu tombol
kalibrasi nol dan tombol pengontrol suhu. Tombol kalibrasi nol digunakan untuk mengubah pH
yang ditunjukkan pH meter sehingga sesuai dengan pH buffer standar yang digunakan.
Persamaan Nernst menunjukkan bahwa potensial elektroda gelas untuk suatu nilai pH tertentu
tergantung pada suhu larutan. Tombol pengontrol suhu digunakan untuk mengubah faktor 0,0592
sehingga skala pengukur dapat disesuaikan agar berpadanan dengan suhu larutan yang sedang
diuji. Kalibrasi dilakukan dengan langkah sebagai berikut:
87
1. Mula-mula alat dikalibrasi dengan buffer pH 7, yaitu dengan mengatur jarum skala pada
pH meter menjadi sedemikian rupa sehingga skala pada pH 7 sama dengan 0 mV dan
tidak tergantung pada suhu, menggunakan tombol kalibrasi nol sehingga jarum
menunjukkan angka 7 pada skala pH dan 0 pada skala mV. Pada pH meter digital seperti
di atas, setelah elektroda dibenamkan dalam larutan buffer pH 7 maka tombol kalibrasi
nol dioperasikan agar angka yang muncul sesuai dengan nilai pH dari buffer standar yang
digunakan yaitu 7.
2. Kalibrasi dilanjutkan dengan buffer pH 4 atau 10 dengan mengoperasikan tombol
pengontrol suhu. Setelah elektroda dibenamkan dalam larutan buffer pH 4 atau 10 maka
tombol pengontrol suhu dioperasikan agar angka yang muncul pada alat sesuai dengan
nilai pH dari buffer standar yang digunakan yaitu 4 atau 10. Langkah ini bertujuan untuk
mengatur kemiringan / slope kurva sehingga diperoleh hubungan linier yang tepat antara
pH dan mV. Oleh karena itu tombol pengontrol suhu disebut juga tombol slope kontrol /
pengendali lereng. Apabila kurva mampu menunjukkan hubungan yang linier antara pH
dan mV maka persamaan dasar pH meter dapat dicapai yaitu 1 unit pH setara dengan 59
mV pada suhu 25oC. Dengan demikian apabila ditarik suatu garis lurus yang memotong
kurva maka pada pH 4 kurva akan merujuk pada +177 mV dan pada pH 10 kurva akan
merujuk pada -177 mV, karena dari pH 7 ke pH 4 dan 10 terdapat selisih 3 unit pH.
Setelah dikalibrasi, pH meter akan memberikan pembacaan yang tepat untuk semua nilai pH
yang terletak pada rentang pH larutan buffer yang digunakan. Kurva yang diperoleh setelah
dilakukan kalibrasi adalah sebagai berikut:
Tombol Kalibrasi Nol
Tombol Pengontrol Suhu
E. PENENTUAN TITIK EKIVALEN DAN PERHITUNGAN KADAR
Titrasi potensiometri umumnya lebih disukai menggunakan direct reading pH meter
karena dapat membaca pH atau mV terus menerus selama titrasi. Pada titrasi potensiometri,
elektroda indikator yang digunakan harus sesuai dengan jenis titrasi yang dilakukan, misalnya
elektroda gelas untuk titrasi asam basa, elektroda platina untuk titrasi redoks, dll. Harga potensial
yang sesungguhnya dari elektroda standar tidak perlu diketahui asal harganya konstan selama
titrasi, karena yang diukur adalah perbedaan potensialnya dengan potensial elektroda indikator
yang senantiasa berubah sesuai dengan perubahan konsentrasi ion / potensial larutan.
88
Titrasi dilakukan dengan mencelupkan pasangan elektroda ke dalam titrat, kemudian
perbedaan potensial antara kedua elektroda atau pH larutan pada awal titrasi diukur. Titran
kemudian ditambahkan ke dalam titrat yang terus diaduk dengan stirer magnetig, dan pada setiap
penambahan sejumlah volume titran (misalnya setiap 1,0 ml titran), harga pH atau mV dicatat.
Pendekatan titik ekivalen terjadi saat perubahan harga pH atau mV relatif cepat, oleh karena itu
saat mendekati titik ekivalen maka penambahan titran harus sekecil mungkin dan konstan,
misalnya tiap 0,05 – 0,10 ml. Setelah tiap penambahan titran, maka perlu didiamkan beberapa
saat untuk memberikan kesempatan pada elektroda indikator untuk mencapai potensial yang
stabil yang ditandai dengan perubahan harga pH atau mV yang hanya berkisar 1 – 2 unit. Titik
ekivalen akan tercapai saat terjadi perubahan potensial atau pH yang mendadak yang kemudian
dihubungkan dengan volume titran yang digunakan. Titik ekivalen dapat ditentukan dengan
kurva ataupun perhitungan.
Penentuan titik ekivalen dapat dilakukan dengan membuat kuva hubungan antara pH atau
mV sebagai ordinat dan ml titran sebagai absis, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:
Cara tersebut disebut cara analisis penempatan titik ekivalen. Namun penentuan tersebut kurang
teliti dan banyak kesalahannya. Hasil yang lebih baik dapat diperoleh dengan cara derivatif.
Derivatif pertama dilakukan dengan membuat kurva ΔpH / ΔV atau ΔmV / ΔV terhadap ml
titran, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:
Derivatif kedua dilakukan dengan membuat kurva Δ2pH / ΔV2 atau Δ2mV / ΔV2 terhadap ml
titran, sehingga akan diperoleh kurva sebagai berikut:
Penentuan titik ekivalen secara perhitungan dapat digambarkan dengan cara berikut:
V
A
pH
K
ΔV
ΔpH
ΔpH / ΔV
Δ2pH / ΔV2
89
A’
B
L’
M ' L'
M’
B'
C*
2
N ' M '
N
C'
D’
E
2
N’
2
O ' N '
D' 2
F
O’
P
Q
P'O'
2 pH / V 2 
F’
P’
pH 2  pH1
V 2
atau
C * B *
B'
atau
D * C *
C'
→X
E * D *
D'
→Y
atau
atau
F * E *
E'
E*
D'
G
B *A*
A'
D*
O
E’
atau
B*
M
C’
D
L' K '
A*
A'
B’
C
K’
L
F*
atau
2
dst...
 pH   pH 
 V    V 

2 
1
2
2
 pH / V 
V

pH
pH 1
2
2 pH / V 2 

2
V
V 2
pH 2  pH 1
2 pH / V 2 
V 2
 X

  B' ml
Volume ekivalen = C  
 X Y 


Volume ekivalen merupakan volume titran yang dibutuhkan untuk mencapai titik
ekivalen, dimana jumlah ekivalen titran = jumlah ekivalen titrat.
90