DESAIN PRIMER PCR IN SILICO UNTUK

Suparman. (2013). Desain Primer PCR in Silico untuk Amplifikasi Gen rbcL genus Mangifera
Jurnal
ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
DESAIN PRIMER PCR IN SILICO UNTUK
AMPLIFIKASI GEN rbcL PADA GENUS Mangifera
Suparman
Laboratorium Biologi FKIP Universitas Khairun, Ternate
[email protected]
ABSTRAK
Penelitian ini merupakan studi bioinformatika untuk mendapatkan sekuen primer gen rbcL pada genus
tanaman Mangifera. Gen rbcL merupakan gen barcode yang digunakan untuk identifikasi dan pembeda
antar jenis pada kelompok tumbuhan tingkat tinggi juga dapat digunakan untuk rekonstruksi
filogenentik tumbuhan. Metode yang digunakan dalam mendapatkan primer optimal ialah dengan cara
in silico yakni simulasi dengan computer menggunakan informasi website genebank yang menyediakan
berbagai gen. Desain primer gen rbcL dimulai dengan mengunduh sekuen DNA dari gen rbcL
Mangifera indica dari GenBank dan mengkopy dalam bentuk pasta sebagai acuan untuk mencari daerah
lestari. Primer dibuat dengan dua arah pembacaan DNA : forward (rbcL-F) dan primer reverse (rbcLR). Primer didesain dengan menggunakan software primer designer yakni Genamics Expression dan
selanjutnya primer dikonfirmasi secara insilico menggunakan perangkat lunak blast primer pada NCBI
untuk mengetahui posisi akurat penempelan primer pada gen rbcL secara bioinformatika. Primer gen
rbcL yang dihasilkan ialah CTTGGCAGCATTCCGAGTA untuk primer forward dan
TCACAAGCAGCAGCCAGTTC untuk primer reverse. Prediksi suhu optimal annealing ialah 61-64
derajat celsius. Produk PCR yang didapatkan sepanjang 1272 bp.
Kata kunci : Mangifera, primer rbcL, studi bioinformatika
Genus Mangifera merupakan salah satu
dari 70 genus dalam famili Anacardiaceae
(Judd, dkk. 2002), dan termasuk genus yang
memiliki anggota spesies terbesar, yakni 69
spesies yang telah diidentifikasi (Kostermans
dan Bompard, 1993). Kebanyakan dari spesies
tersebut tersebar di Pulau Kalimantan,
Sumatra, Jawa, dan Semenanjung Malaysia
(Mukerjee, 1953). Spesies dari genus
Mangifera yang dikenal umum adalah Mangga
(Mangifera indica). Mangga memiliki nilai
komersil sebagai buah konsumsi, karena itu
sebagian besar orang mengenal Mangifera
sebagai Mangga. Saat ini terdapat sekitar 1500
varietas Mangga (Krishnan, dkk. 2002). Anggota Mangifera lain seperti Mangifera
odorata (Kuweni), M. caesia (Binjai/wani), M.
foetida (Bacang/Limus) kurang dikenal,
padahal spesies-spesies tersebut dimanfaatkan
sebagai buah konsumsi di beberapa daerah,
seperti pada M. caesia yang dikonsumsi dan
telah teridentifikasi sebanyak 22 kultivar di
Bali (Rai, dkk. 2008). Spesies lain seperti M.
decandra (Konyot besi), M. dewildei (Berhul),
dan M. minor (Mangga liar) telah digunakan
sebagai sumber kayu dan bahan obat-obatan
karena mengandung zat Fitokimia, Fenol, dan
Terpenoid (Kostermans dan Bompard, 1993).
Semakin banyaknya spesies yang dikenal akan
semakin menambah pemanfaatannya.
Semua
spesies
anggota
genus
Mangifera diduga berasal dari satu nenek
moyang yang sama, tetapi Kostermans dan
Bompard
(1993),
menyatakan
bahwa
Mangifera diturunkan dari dua nenek moyang
yang berbeda. Perbedaan dugaan ini akan
menyebabkan keraguan dalam klasifikasi
Mangifera.
Menurut
Hidayat
(2011),
klasifikasi antar spesies dalam genus
163
Jurnal ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
Mangifera masih tidak stabil, hal ini
dikarenakan kompleksitas dari organ vegetatif
dan reproduktif genus tersebut. Klasifikasi
genus Mangifera berdasarkan morfologi oleh
Kostermans dan Bompar (1993) dibagi
menjadi dua subgenus yakni Mangifera dan
Limus.
sehingga
penggunaanya
akan
efektif
mengenali keragaman dalam semua tanaman.
Penggunaan marker rbcL pada analisis
filogenetik yang dipadukan dengan marker
lain diantara spesies dalam satu genus telah
dilakukan, seperti pada spesies anggota
Zygophyllum
family
Zygophyllaceae
(Bellstedt, dkk. 2008), Caragana family
Leguminoseae (Zhang, dkk. 2009) dan efektif
dalam memberikan informasi filogenetik
diantara spesies yang diuji. Gen rbcL
merupakan
salah
satu
gen
yang
direkomendasikan oleh Consortium Barcode
of Life (CBOL) pada tahun 2009 sebagai
marker molekuler barcode pada tanaman,
rekomendasi
ini
memerkuat
alasan
penggunaan rbcL dalam analisis filogenetik
dan kekerabatan tanaman.
Klasifikasi Mangifera berdasarkan
morfologi
mengindikasikan
keraguan
pengelompokan (Yonemori, dkk. 2002), hal
ini dapat dilihat pada uncertain position untuk
11 spesies yang telah diidentifikasi. Klasifikasi
oleh Hou (1978) dan Mukherjee (1953), M.
longipes dimasukan ke dalam genus
Mangifera, tetapi Kosterman dan Bompard
(1993) tidak mencantumkan nama jenis M.
longipes dalam genus Mangifera karena
dianggap sinonim dari M. laurina. Mangifera
odorata diduga merupakan hasil dari
persilangan antara M. indica dengan M.
foetida (Hou, 1978) tetapi Kosterman dan
Bompard (1993) menolak dugaan tersebut.
Oleh karena itu perlu alternatif selain
morfologi sebagai dasar klasifikasi sebagai
penguat klasifikasi yang telah ada.
Markah molekuler dapat dianalisis
menggunakan Polimerase Chain Reaction
yang dikenal dengan PCR yakni metode
perbanyakan DNA dengan tiga langkah utama
yakni denaturasi, annealing dan extensi.
Proses perbanyakn DNA mengikuti kaidah
pangkat dua. Proses PCR memerlukan primer,
yakni sederet sekuen DNA pendek sebagai
pengenal DNA target yang selanjutnya
memperpanjang dan memperbanyak DNA
target.
Penggunaan
marker
molekuler
menurut Li (1997), dinilai menyediakan
karakter yang lebih berlimpah dibandingkan
morfologi dan fisiologi, serta lebih cepat,
praktis, dan efisien dalam pengerjaan.
Sistematika molekuler dengan menggunakan
marker molekuler pada tanaman telah
digunakan secara luas sebagaimana pada
organisme lain dalam determinasi hubungan
filogenetik (Asahina, dkk. 2010). Pada
sistematika
Angiospermae
pendekatan
filogenetik dengan karakter molekuler telah
digunakan dan efektif dalam mengelompokan
takson yang belum terselesaikan oleh dengan
karakter fenetik (Reddy, 2009). Salah satu
marker molekuler yang banyak digunakan
dalam filogentik tumbuhan yakni rbcL. Gen
rbcL tanaman merupakan pengkode sub unit
besar riboluse-1,5-bisphosphate carboxylse
(RubisCo) yang berada di genom kloroplas
(Judd, dkk. 2001) dan merupakan gen yang
universal pada hampir semua tanaman,
Desain primer dapat dibuat dengan
menggunakan konstruksi secara insiliko
berbasis ilmu bioinformatika. Olah karena itu,
untuk keperluan isolasi sekuen gen rbcL dari
DNA Mangifera maka perlu di lakukan desain
primer untuk mengamplifikasi gen rbcl yang
dapat di gunakan untuk semua anggota genus
Mangifera. Penelitian ini adalah penelitian
awal pada penelitian filogenetik pada genus
mangifera untuk menjawab latarbelakang
penelitian.
METODE PENELITIAN
Desain primer gen rbcL.
Penelitian ini merupakan penelitian
berbasis in silico dalam mendesain primer
PCR
dengan
menggunakan
analisis
164
Suparman.
(2013). Desain Primer PCR in Silico untuk Amplifikasi Gen rbcL genus Mangifera
Jurnal ßIOêduKASI
ISSN : 2301-4678
Vol 2 No (1) September 2013
bioinformatika. Pengambilan dan pengolahan
data yang tersedia pada website penyedia gen
dan layanan pengolahan/analisis gen dan
DNA. Proses PCR (Polymerase Chain
Reaction) memerlukan sepasang primer
sebagai pemicu terbentuknya DNA baru yang
mirip gen target seperti proses replikasi DNA.
Berikut gambaran proses pembentukan
gen target saat amplifikasi, jumlah molekul
DNA double stranded yang dihasilkan sesuai
dengan hitungan pangkat dua dari siklus
amplifikasi yang dilakukan.
Jumlah siklus
Jumlah target
M
o
l
e
k
u
l
D
N
A
y
a
n
g
Gambar 1. Gambaran proses PCR dan amplifikasi gen
target serta penambahan jumlah fragment
sejalan
dengan
panambahan
siklus
(Primerose, Twyman and Old : 2003)
Gambar 2. Prinsip umum dan proses PCR (Handoyo
dan Rudiretna, 2001)
Desain primer gen rbcL dimulai
dengan mengunduh sekuen DNA dari gen
rbcL Mangifera indica yang tersedia di
GenBank. Gen dicopy dalam bentuk pasta dan
dijadikan acuan untuk mencari daerah lestari.
Primer yang dibuat yakni primer untuk dua
arah pembacaan DNA yakni primer forward
(rbcL-F) dan primer reverse (rbcL -R). Desain
165
Jurnal ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
primer dibuat dengan ketentuan persen GC
dari masing-masing primer harus di atas 50%,
perbedaan suhu mealting antara kedua primer
maksimal 4ºC. Panjang masing-masing primer
berkisar antara 15 basa sampai 25 basa. Desain
primer juga harus menghindari struktur
sekunder dan primer dimer (Claverie dan
Notredame, 2007).
Sekuen gen rbcL yang didapatkan
berdasarkan primer pada Tabel 2 yakni berupa
sekuen parsial gen rbcL yang berjumlah 1272
basa dare 1460 basa untuk total gen rbcL).
Penggunaan sekuen parsial pada gen rbcL
dalam filogenetik tanaman diantarnya
digunakan oleh beberapa peneliti, diantaranya
oleh Asahina, dkk. (2009), Barrachlough, dkk.
(1996), Duvall, dkk. (1993), Reddy (2009),
dan Setoguchi dkk. (1998).
Primer diharapkan dapat menempel
pada bagian ujung kedua pasangan basa gen
rbcL, sehingga menghasilkan panjang gen
hasil amplifikasi yang maksimal, setelah
mengikuti aturan tersebut, selanjutnya primer
didesain dengan menggunakan software
primer designer yakni Genamics Expression
dan selanjutnya primer dapat di ujicoba atau
dikonfirmasi secara insilico menggunakan
perangkat lunak blast primer pada NCBI
untuk mengetahui posisi akurat penempelan
primer pada gen rbcL secara bioinformatika.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
DNA templet/cetakan yang dijadikan
acuan merupakan sekuen gen rbcL yang
terdapat di NCBI bersumber dari Aguilar and
Sosa (2004). Desain primer yang dilakukan
menghasilkan beberapa pasangan primer (F
dan R) sebagai berikut :
Tabel 1. Primer hasil yang didapat menggunakan software genamic expression, terdiri dari enam
pasang primer.
No
Panjang
Panjang
Produk
GC
basa
basa
%
Primer
F
1
R
F
2
R
F
3
R
F
4
R
F
5
R
F
6
R
CTTGGCAGCA
TTCCGAGTA
TCACAAGCAG
CAGCCAGTTCA
AAAGCCCTGC
GCGCTCTACG
GCTACGGAAC
CCGGCGCATT
AAAGCCCTGC
GCGCTCTACG
ACGGAACCC
GGCGCATTTCC
AGTTCCACC
CGAGGAAGCA
AAGCAGCAGC
CAGTTCAGGAC
AAAGCCCTGC
GCGCTCTACG
AAGCAGCAGC
CAGTTCAGGAC
CTTGGCAGC
ATTCCGAGTA
TCACAAGCAG
CAGCCAGTTC
19
52.63
1272
21
52.38
20
65
875
20
65
20
65
872
20
65
19
57.89
1235
21
57.14
20
65
875
21
57.14
19
52.63
1272
20
52.38
166
Tm*
o
C
51.82 /
63.9
56.9/
69.45
60.11 /
72.52
60.11 /
73.87
60.11 /
72.52
60.3 /
75.76
54.92 /
67.05
57.31 /
67.14
60.11 /
72.52
57.31 /
67.14
51.82 /
63.9
55.4 /
66.73
Struktur
Sekunder
Dimer
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Lemah
Tidak
MODERATE
Tidak
Lemah
Tidak
MODERATE
Tidak
MODERATE
Tidak
Tidak
Tidak
WEAK
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Jumlah
hasil
Blast
>475
>500
>500
>500
>500
>475
Suparman. (2013). Desain Primer PCR in Silico untuk Amplifikasi Gen rbcL genus Mangifera
Jurnal
ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
Tabel 2. Sepasang primer terbaik hasil desain primer gen rbcL setelah dikonfirmasi dengan blast
primer NCBI
Basa
Panjang
Produk
Basa
CTTGGCAGCATTCCGAGTA
19
TCACAAGCAGCAGCCAGTTC
20
Primer
Forward
(rbcL-F)
Reverse
(rbcL-R)
ukuran
Berdasarkan primer yang didesain
dengan metode insiliko, maka profil suhu
prediksi amplifikasi gen rbcL untuk PCR dari
genom daun tanaman Mangifera diperkirakan
sebagai berikut:
GC
Tm
Struktur
Sekunder
Dimer
%
o
1272
53
64
NONE
NO
1272
52
67
NONE
NO
C
Struktur sekunder meliputi; 1).
Hairpins : terbentuknya struktur loop/hairpin
pada primer sebaiknya dihindari, namun
sangat sulit untuk memperoleh primer tanpa
memiliki struktur hairpin. Hairpin pada ujung
3' dengan ΔG (energi yang dipelukan untuk
memecah struktur hairpin) = -2 kcal/mol dan
hairpin internal dengan ΔG = -3 kcal/mol
masih dapat ditoleransi; 2). Self Dimer :
primer dapat berikatan dengan primer lainnya
yang sejenis disebut dengan self-dimer. selfdimer pada ujung 3' dengan ΔG = -5 kcal/mol
dan self- dimer pada bagian internal dengan
ΔG= -6 kcal/mol masih dapat ditoleransi. 3).
Cross Dimer : Primer dapat beriktan dengan
primer pasangannya (reverse dan forward)
sehingga disebut cross dimmers. Cross
dimmer re homologous. Optimally a 3' end
cross dimer with a ΔG of - 5 kcal/mol and an
internal cross dimer pada ujung 3' dengan ΔG
= -5 kcal/mol dan self- dimer pada bagian
internal dengan ΔG= -6 kcal/mol masih dapat
ditoleransi.
Gambar 3. Hasil Rekayasa Desain Profil Suhu
Penempelan Primer rbcL Pada Gen
Target
Pembahasan
Primer hasil desain secara insilico
terdapat enam pasang yang direkomendasikan.
Pada empat pasang primer tersebut terdapat
struktur
sekunder
yang
diprediksikan
terbentuk pada saat proses amplifikasi pada
saat PCR, yakni pasangan primer 2, 3,4 dan 5.
Struktur sekunder dapat menggangu proses
amplifikasi, sehingga gen rbcL yang
teramplifikasi tidak sempurna dan primer tidak
menempal pada DNA templet. Pada dasarnya
adabbeerapa yang harus dihindari dalam
mendesain primer PCR yakni : struktur
sekunder dan pengulangan basa.
Pengulangan basa/repeats : primer
sebaiknya tidak memiliki urutan pengulangan
dari 2 basa dan maksimum pengulangan 2
basa sebanyak 4 kali masih dapat di toleransi.
Misalnya ATATATAT. Primer juga sebaiknya
tidak memiliki urutan basa yang di ulang terus
menerus. Pengulangan basa berurutan sampai
4 kali masih dapat di toleransi. Misalnya
AGCGGGGGATGGGG memiliki urutan basa
G diulang 5 kali berturut-turut.
Secara manual, suhu annealing
optimum sangat mempengaruhi hasil pcr. Ta
Opt ini dapat dihitung dengan cara Ta Opt =
167
Jurnal ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of product) –
25.
Hasil desain primer gen rbcL ini, pada
penelitian selanjutnya akan diguanakan untuk
rekonstruksi
pohon
filogenetik
genus
Mangifera. Sehingga akan di isolasi genom
dare beberapa sampel tanaman dare genus
mangifera sesuai yang tersedia dan telah
diidentifikasi di laboratorium. Langkah
selanutnya akan di analisis kekerabatan antar
jenis dare genus mangifera. Hal ini sesuai
dengan latar belakang penelitian yang
digambarkan
oleh
penulis
mengenai
ketidakjelasan pengelompokan dari anggota
genus mangifera.
PRIMER HASIL PEMBUATAN
HASIL PENEMPELAN
Gambar 4. Penggambaran penempelan sekuen primer
pada sekuen gen target.
PANJANG BASA HASIL PCR, SUHU
OPTIMAL
Hasil desain primer gen rbcL akan
berguna dalam isolasi gen dan amplifikasi
melalui proses PCR gen rbcL. Hasil tersebut
selanjutnya akan digunakan untk analisis
filogenetik yang dapat memberikan informasi
kekerabatan berdasarkan urutan DNA gen
rbcL. Hal ini tentu membutuhkan keakuratan
dalam mendesain dan menghasilkan primer
gen rbcL sehingga menghasilkan produk PCR
yang akurat.
Panjang basa produk hasil PCR ialah
1272 bp. Panjang basa produk DNA target gen
rbcL yang dihasilkan merupakan gen parsial
yakni hanya 1272 bp dari 1460 bp gen rbcL.
Ini merupakan hasil terpanjang dibandingkan
dengan primer lainnya. Suhu annelaing
optimal ialah diprediksikan antara 61 sampai
64 derajat celsius. Gen parsial dapat
digunakan untuk identifikasi tanaman,
rekonstruksi pohon filogenetik dan uji
taksonomi tumbuhan.
KESIMPULAN
Primer gen rbcL yang optimal ialah
CTTGGCAGCATTCCGAGTA untuk primer
forward dan TCACAAGCAGCAGCCAGTTC
untuk primer reverse. Suhu optimal berdasarkan
perhitungan DNA calculator ialah 61-64 derajat
celsius. Produk PCR yang didapatkan sepanjang
1272 bp.
Gen rbcL merupakan gen yang
moderate conserve artinya memliki kelestarian
gen yang cukup kuat tetapi jika dibandingkan
dengan gen conserve lain, tidak terlalu kuat
sehingga dapat di gunakan untuk identifikasi
dan membedakan jenis dari tumbuhan. Sekuen
DNA barkode memegang peran tambahan
yang penting dalam alur kerja taksonomi
sehingga barkoding DNA tidak dapat
tergantikan untuk analisis taksonomi yang
menyeluruh (Hajibabaei, et al. 2007)
DAFTAR PUSTAKA
Aguilar, C.J. and Sosa,V. 2004. The evolution
of toxic phenolic compounds in a group
of Anacardiaceae genera. Taxon Journal
53
(2),
p:357-364,
www.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/45
935396 diakses : 15 Agustus 2010.
Asahina, H., Shinozaki, J., Masuda, K.,
Morimitsu, Y., dan Satake, M. 2010.
Identification of medicinal Dendrobium
species by phylogenetic analyses using
mat K and rbcL sequences. The
Japanese Society of Pharmacognosy and
Springer. J Nat Med, 64, p:133–138.
Sekuen DNA dari beberapa jenis
tumbuhan atau dari beberapa speciemen dapat
digunakan untuk rekonstruksi dan analisis
filogenetika. Filogenetika merupakan satua
bagian yang penting dalam analisis taksonomi
yang menyeluruh, karena menyediakan
informasi kekerabatan berdasarkan sejarah
evolusi gen dan jenis dari masing-masing
sampel.
168
Suparman. (2013). Desain Primer PCR in Silico untuk Amplifikasi Gen rbcL genus Mangifera
Jurnal
ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
Barrachlough, T.G., Harvey, P.H., dan Nee, S.
(1996) : Rate of rbcL gene sequences
evolution and species diversification in
flowering plants (Angiospermae). The
Royal Society. Proc. R. Soc. Lond. B
263, 589-591.
Bellstedt, D.U., van Zyl, L., Marais, E.M.,
Bytebier, B., de Villiers, C.A.,
Makwarela, A.M., dan Dreyer, L.L.
(2008) : Phylogenetic relationships,
character evolution and biogeography of
Southern
African
members
of
Zygophyllum (Zygophyllaceae) based on
three plastid regions. Molecular
Phylogenetics and Evolution 47 : 932–
949. Elsevier Inc
Claverie, J.M., dan Notredame, C. (2007) :
Bioinformatics for Dummies 2nd
edition.Wiley
Publishing,
Inc.
Indianapolis.
Duvall, M.R., Learn, G.H., Eguiarte, L.E., Jr.,
dan Clegg, M.T., (1993) : Phylogenetic
analysis of rbcL sequences identifies
Acorus calamus as the primal extant
monocotyledon, Proc. Natl. Acad. Sci
(90): 4641-4644.
Hajibabaei, M., Singer, G.A.C., Hebert, P.D.N
dan Hickey, D.A. 2007. DNA barcoding:
how
it
complements
taxonomy,
molecular phylogenetics and population
genetics. Trends in Genetic.
Handoyo, D., dan Rudiretna A. 2001. Prinsip
Umum dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (Pcr).Unitas, Vol. 9, No.
1, p: 17-29.
Hidayat, T., dan Pancoro, A. 2001. Molecular
Phylogenetic Study of Anacardiaceae
Based on Variation of the Internal
Transcribed Spacer Region Sequences.
Hayati, Vol. 8, No.4, p : 98-l0l
Hidayat, T., Pancoro, A., Kusumawaty, D.,
dan Eiadthong, W. 2011. Molecular
Diversification and Phylogeny of
Mangifera (Anacardiaceae) in Indonesia
and Thailand. Proceeding of the
International Conference on Advanced
Science, Engineering and information
Technology : 88-91, Putrajaya, Malaysia.
ISSN : 2301-4678
Hou, D. 1978. Anacardiaceae (revisions).
Flora Malesiana, Series I, 8(3), p: 395548.
Jena, R.C., Samal, K.C. and Das, B.K. 2010.
Opimization of DNA isolation and PCR
protocol for RAPD analysis of
Mangifera indica L. Journal of
Agricultural Technology, Vol. 6(3), p:
559-571.
Judd, W.S., Campbel, C.S., Kellog, E. A.,
Stevens, P. F., dan Donoghue, M. J.
2002. Plant Systematics : Phylogenetic
Approach,
2nd
edition.
Sinauer
Associates, Inc. Publisher, Sunderland,
Massachusets-USA.
Kostermans, A. J. G. H., dan Bompard, J. M.
1993. The manggoes : Their Bothany,
Nomenclature,
Horticulture
and
Utilization. IBPGR Academic Press.
Harcourte Brace & Company. London.
Krishnan, A.G., Nailwal, T.K., Shukla, A.,
Pant, R.C. 2009. Mango (Mangifera
indica L.) Malformation an unsolved
mystery.
Researcher
1(5).
[http:/www/scienpub.net/researcher]
akses : 9 Maret 2011.
Li, W., dan Graur, D. 1991. Fundamental of
Molecular
Evolution.
Sinauer
Associates, Inc.
Mukherjee, S.K. 1953. Origin, Distribution,
and Phylogenetic affinity of the species
of Mangifera L. Journal of the Linnean
Society, Botany. LV, p: 65-83.
Primerose, S.B., Twiman, R.M., Old., R.W.
2003. Principles of gene manipulation
(six edition). Balckwell scince ltd.
Rai, I.N., Wijana, G. dan Semarajaya, C.G.A.
2008. Identifikasi Variabilitas Genetik
Wani Bali (Mangifera caesia Jack.)
dengan Analisis Penanda RAPD. Jurnal
Hortikultura, 18(2), p: 125-134.
Reddy, B.U. 2009. Molecular phylogeny of
Angiospermic plant families using rbcL
gene Sequences. International Journal
of Bioinformatics Research, 1(2) : pp27-36.
Setoguchi, H., Osawa, T.A., Pintaud, J.C.,
Jaffre, T. dan Veillon, J.M. 1998.
169
Jurnal ßIOêduKASI
Vol 2 No (1) September 2013
ISSN : 2301-4678
Phylogenetic
Relationships
within
Araucariaceae Based on rbcL Gene
Sequences. American Journal of Botany
85(11), p: 1507–1516.
Yonemori, K., Honso, C., Kanzaki, S.,
Wiadthong, W., dan Sugiura, A. 2002.
Phylogentic relathionship of mangifera
species revealed by ITS sequences of
nuclear ribosomal DNA and a possibility
of their hybrid origin. Plant Syst. Evol.
231, p: 59-75.
Zhang, M., Fritsch, P.W., dan Cruz, B.C.
2009.
Phylogeny
of
Caragana
(Fabaceae) based on DNA sequence data
from rbcL, trnS–trnG, and ITS. Journal
Molecular Phylogenetics and Evolution
50, p: 547–559.
170