1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mycobacterium

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri patogen penyebab tuberkulosis.
Secara umum penyebaran bakteri ini melalui inhalasi, yaitu udara yang tercemar
oleh penderita yang terinfeksi, terhirup oleh orang yang tidak terinfeksi.
Pada tahun 2007, beberapa negara dengan prevalensi tertinggi, dari dua juta
kasus adalah Cina (1,3 juta), Indonesia (530.000), Nigeria (460.000), dan Afrika
Selatan (460.000) (Donald dan van Helden, 2009.).
Masalah besar yang timbul saat ini pada penderita tuberkulosis adalah
terjadinya resistensi terhadap beberapa Obat Anti Tuberculosis (OAT). Badan
kesehatan dunia (World Health Organization ;WHO) bahkan telah mendefinisikan
adanya multi-drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB) yaitu jenis M.
tuberculosis yang resisten terhadap pengobatan standar enam bulan dengan OAT
lini pertama dalam suatu regimen kombinasi obat. Biasanya resistensi setidaknya
terhadap rifampisin dan Isoniazid (INH), sudah dikategorikan sebagai kejadian
MDR-TB (Thomas, 2008).
Laporan tentang resistensi OAT di dunia berdasarkan informasi yang
dikumpulkan WHO antara tahun 2002-2006 pada 90.000 pasien di 81 negara,
menyatakan bahwa saat ini tidak hanya terjadi MDR tetapi juga fenomena yang
disebut extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB). XDR-TB adalah suatu
bentuk TB yang disebabkan oleh resistensi bakteri terhadap hampir semua OAT
yang efektif (misalnya MDR-TB dengan tambahan resistensi terhadap golongan
1
2
fluoroquinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua seperti amikacin,
kanamycin atau capreomycin). Fenomena ini oleh WHO telah tercatat terjadi di 45
negara (Thomas, 2008).
Berdasarkan analisis data hasil survey, WHO memperkirakan terdapat hampir
setengah juta kasus MDR-TB baru, kira-kira 5 % dari 9.000.000 kasus TB, di
seluruh dunia setiap tahunnya. Angka tertinggi tercatat di Baku, ibukota
Azerbaijan, di mana hampir seperempat dari seluruh kasus TB baru (22,3 %)
dilaporkan mengalami MDR. Proporsi MDR-TB di antara kasus TB baru dunia
adalah 19,4% di Moldova,16% di Donetsk, Ukraina, 15% di Tomsk Oblast,
Federasi Rusia, dan 14,8% di Tashkent, Uzbekistan. Angka ini menunjukkan
tingkat-tingkat tertinggi dari resistensi OAT yang disebarluaskan oleh WHO
tahun 2004. Beberapa penelitian di Cina juga menyebutkan bahwa kejadian MDRTB sudah menyebar di negara tersebut (Thomas, 2008).
Analisis pada ±500 strain M. tuberculosis dari berbagai penjuru dunia
menemukan bahwa 96% isolat yang resisten Rifampisin (RMP) memiliki mutasi
di segmen 81-bp gen rpoB, suatu house-keeping gene yang menyandi sub-unitbeta dari RNA polimerase dan mampu menghalangi hibridisasi nukleotida
pertama untuk mengaktifkan polymerase sehingga menghalangi sintesis mRNA.
Mutasi ini tidak ditemukan pada organisme yang rentan (susceptible). Sebagian
besar mutasi missense penyebab resistensi RMP terjadi pada kodon 513, 526, atau
531 dari gen rpoB, dan sebagian kecil pada posisi 514 atau 533. Diperkirakan
90% isolat resisten RMP juga resisten terhadap isoniazid, sehingga resistensi
terhadap RMP dianggap mewakili (surrogate) terjadinya MDR (Rosilawati,2007 ;
Syaifudin,2007).
3
Terjadinya mutasi pada suatu gen, akan menyebabkan terekspresinya protein
mutan yang berbeda dengan wild type. Pengetahuan tentang ekspresi protein
mutan, penting untuk diketahui berkaitan dengan fungsi protein terutama sebagai
enzim dan pengembangan pemanfaatan protein tersebut. Apabila mutasi terjadi
pada situs aktif enzim, maka protein tersebut tidak akan dapat berfungsi
sebagaimana mestinya dan merugikan patogen. Dengan menggunakan teknik
Deoxyribonucleic Acid (DNA) rekombinan, protein yang terekspresi dapat
dipelajari dan dimanfaatkan untuk berbagai keperluan, di antaranya untuk
produksi enzim, pembuatan vaksin, dan imunoassay (Whitford,2005).
Analisis proteomik terhadap M.tuberculosis dimulai dengan diproduksinya
tuberkulin sebagai reagen diagnostik dan penambahan komponen protein untuk
mendapatkan protein murni. Penelitian-penelitian berikutnya, sebagian besar
dilakukan untuk mengidentifikasi protein-protein antigen M.tuberculosis (Belisi
et.al., 2005). Hingga saat ini analisis protein yang berfungsi secara fisiologik telah
banyak dilakukan, akan tetapi belum banyak yang mempelajari protein yang
terekspresi pada patogen yang resisten. Oleh karenanya, penelitian terhadap
ekspresi protein dari gen M.tuberculosis yang bertanggung jawab terhadap
resisten rifampisin, yaitu protein RpoB, menjadi menarik dan penting untuk
dilakukan. Hal tersebut dilakukan dengan cara merekombinasi gen resisten ke
dalam plasmid vektor ekspresi dan ditransformasi ke dalam sel kompeten agar
protein dapat diproduksi. Analisis terhadap asam aminonya akan memberi
informasi proteomik yang bermanfaat. Analisis asam amino dapat pula diprediksi
dari urutan nukleotida.
4
Proses rekombinasi DNA antara gen sisipan dengan plasmid merupakan
tahapan yang relatif sulit. Kesulitan yang paling sering terjadi, berkaitan dengan
sekuen gen asing yang harus diinsersi, dan adanya keterbatasan dari sel inang
yang digunakan untuk sintesis protein (Brown, 1999; Brown, 2004).
Rekonstruksi plasmid merupakan salah satu teknologi DNA rekombinan yang
banyak digunakan untuk mempelajari gen dan hasil ekspresinya. Berbagai gen
dapat dipelajari dengan menggunakan teknik ini, salah satunya yaitu gen yang
bertanggung jawab terhadap terjadinya resistensi pada patogen.
Terdapat berbagai macam sistem plasmid yang dapat digunakan untuk
melakukan rekombinasi DNA. Sistem plasmid pET merupakan sistem plasmid
yang banyak digunakan untuk keperluan kloning maupun sebagai vektor ekspresi.
Secara umum, vektor pET adalah plasmid bakteri yang didesain agar produksi
protein yang diinginkan berlangsung cepat, ketika sistem ini diaktivasi. Plasmid
ini mengandung beberapa elemen penting, yaitu gen lacI yang mengkode protein
represor lac, promoter T7 yang hanya spesifik untuk T7 RNA polymerase
(bukan RNA polymerase bakteri) dan juga tidak terjadi di sembarang tempat pada
genom prokaryot, operator lac yang dapat menghalangi transkripsi, sebuah
polylinker, f1 origin of replication (sehingga suatu plasmid untai tunggal dapat
diproduksi ketika diinfeksi dengan M13 helper phage), dan gen resisten
antibiotika sebagai marka (Blaber, 1998).
Sistem plasmid pET-28a merupakan salah satu dari kelompok vektor pET
yang telah mengalami berbagai modifikasi untuk mempermudah teknologi
rekombinan DNA. Beberapa modifikasi yang dilakukan untuk sistem pET-28a
5
adalah, adanya multiple cloning site (MCS) dengan pilihan situs restriksi yang
lebih beragam menggantikan polylinker, digantinya marka resistensi ampisilin
dengan kanamisin, sehingga seleksi dapat lebih spesifik, serta adanya penanda His
untuk keperluan purifikasi protein. Sebagai vektor kloning, sistem pET-28a
mampu menggandakan dirinya hingga 40 copy pada sel kompeten yang sesuai
(Novagen, 2003).
Pada penelitian ini akan dilakukan rekonstruksi plasmid pET 28-a, dengan
menginsersikan fragmen gen pada daerah MCS dan memilih dua situs pengenal
enzim restriksi yang berbeda untuk ketepatan insersi. Rekonstruksi plasmid
dilakukan untuk mempelajari mutasi yang terjadi pada urutan nukleotida dari
fragmen gen rpoB dari M.Tuberculosis yang resisten rifampisin, dengan cara
mengeksplorasi perbedaan asam amino yang menyusun protein mutan tersebut
dengan wild type. Urutan nukleotida dan prediksi urutan asam amino dari
M.tuberculosis wild type diunduh dari data base yang ada pada URL
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Perbandingan homologinya akan menunjukkan
kesesuaian antara sekuen nukleotida mutan dengan wild type.
1.2 RumusanMasalah
Dari latar belakang tersebut di atas, maka dapat disusun beberapa rumusan
masalah sebagai berikut:
1. Apakah gen mutan rpoB isolat
Multi Drug Resistance M.tuberculosis
dapat diinsersikan ke dalam sistem plasmid pET-28-a?
6
2. Apakah terdapat perbedaan sekuen asam amino prediktif dari gen mutan
rpoB Multi Drug Resistance M.tuberculosis dengan urutan asam amino
protein wild type?
1.3 TujuanPenelitian
A. TujuanUmum
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi vektor yang
mengandung gen rpoB yang resisten terhadap rifampisin, mengetahui informasi
genetik prediktif pada tingkat protein serta mekanisme resistensi obat anti
tuberculosis (OAT) lini pertama pada M.tuberculosis.
B. TujuanKhusus
Penelitian ini bertujuan untuk :
1. Menginsersikan gen mutan rpoB dari Multi-drug resistance M.tuberculosis
ke dalam plasmid vektor kloning, yaitu sistem pET 28-a
2. Mengetahui mutasi yang terjadi gen rpoB Multi-drug resistance
M.tuberculosis dengan membandingkan sekuen prediktif asam aminonya
dengan data base wild type
1.4 Manfaat penelitian
A. Manfaat keilmuan
Penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut :
1. Menambah khazanah ilmu pengetahuan tentang mekanisme terjadinya
resistensi terhadap Rifampisin oleh adanya mutasi gen rpoB pada isolate
Multi –drug resistance M.tuberculosis.
7
2. Menambah wawasan keilmuan tentang sekuen gen rpoB M.tuberculosis
yang resisten terhadap Rifampisin.sebagai marka MDR-TB
B. Manfaat praktis
Secara praktis hasil rekonstruksi plasmid dari penelitian ini akan dapat
digunakan untuk penelitian-penelitian bioteknologi lain yang ingin menggunakan
marka resistensi terhadap Rifampisin. Selain hal tersebut, enzim yang dihasilkan
dapat dipergunakan untuk keperluan mempelajari aktivitas enzim di laboratorium.