i AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. TERHADAP Streptococcus pyogenes ATCC 19615 SKRIPSI Diajukan untuk memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi Diajukan oleh: Muhadela Tiara Murtiwi NIM : 108114148 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2014 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Persetujuan Pembimbing AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. TERHADAP Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Skripsi yang diajukan oleh : Muhadela Tiara Murtiwi NIM : 108114148 Telah disetujui oleh Pembimbing Yohanes Dwiatmaka S. Si., M. Si. Tanggal.......................................... ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENGESAHAN SKRIPSI AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. TERHADAP Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Oleh : Muhadela Tiara Murtiwi NIM : 108114148 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal : ........................... Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan (Ipang Djunarko, M.Sc., Apt.) Panitia Penguji : Tanda tangan 1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. ................................. 2. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. ................................. 3. Dr. Erna Tri Wulandari M. Sc., Apt. ................................. iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Muhadela Tiara Murtiwi Nomor mahasiswa : 108114148 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul: AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. TERHADAP Streptococcus pyogenes ATCC 19615 beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : Yang menyatakan (Muhadela Tiara Murtiwi) iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PERNYATAAN KEASLIAN KARYA Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundangundangan yang berlaku. Yogyakarta, 20 Juli 2014 Penulis (Muhadela Tiara Murtiwi) v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Kupersembahkan karya ini untuk : Tuhan Yesus Kristus, kekasih jiwaku, motivator terbaikku dan pengharapanku, Kedua orangtua ku tercinta yang kasihnya terus tercurah, Malaikat-malaikat utusan Tuhan diduniaku, Masa lalu yang membuatku banyak belajar dan masa depan cerah yang penuh harapan, Almamaterku, dan Diriku. vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat, bimbingan dan kasih karuniaNya yang terus mengalir dalam pembuatan skripsi yang berjudul AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOL DAUN Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. TERHADAP Streptococcus pyogenes ATCC 19615 sehingga dapat terselesaikan dengan baik sebagai salah syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Farmasi (S. Farm). Penulis menyadari dalam pembuatan skripsi ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Ipang Djunarko M. Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 2. Bapak Yohanes Dwiatmaka M. Si. selaku Dosen Pembimbing yang dengan sabar membimbing, memberikan arahan, evaluasi dan saran dalam pembuatan dan penyelesaian skripsi. 3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan arahan, bimbingan dan saran dalam penyelesaian skripsi. 4. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari M. Sc., Apt.selaku Dosen Penguji yang telah memberikan arahan, bimbingan dan saran dalam penyelesaian skripsi 5. Ibu Maria Budi Jumpowati S. Si. yang dengan sabar memberi arahan, bimbingan, saran dan dukungan dalam pembuatan skripsi. 6. Segenap Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah banyak memberi ilmu, bimbingan dan arahan bagi penulis selama masa kuliah. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7. Pak Narto, Mas Dwi, Pak Mukminin, Pak Wagiran, Pak Parlan, Mas Andri dan segenap karyawan serta laboran yang telah memberi bimbingan dan arahan semenjak masa kuliah hingga membantu dalam penyusunan skripsi. 8. Kedua orang tua penulis yang terus memberikan motivasi, bimbingan, arahan, doa, dan dukungan yang tiada hentinya. 9. Kakak-kakakku Amelia Prasetyowati, Mudaningrum Riskiyani, Rendi Rismawan yang telah memberikan doa, semangat, serta dukungan. 10. Rio Yulianto, Rinda Meita P., Gabriela Indria P. S. K. W., Lydia Eryana P. H. E., Yosef Supriadi, Hayuningtyas P. dan Aang yang selalu memberi motivasi, semangat, dukungan, serta doa bagi penulis. 11. Maria Ajeng Listyorini yang telah memberi dukungan, semangat, bantuan, dan setia menjadi teman berbagi suka dan duka dalam penyusunan skripsi ini hingga dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. 12. Gilda Todingbua, Trifonia Rosa, Novianti Ekasari, Agnes Astri S., Christiana Desti dan teman-teman seperjuangan skripsi di laboratorium yang telah banyak berbagi dukungan, arahan serta semangat. 13. Teman-teman Farmasi angkatan 2010 khususnya kelas D dan FKK-B yang telah menghiasi hari-hari penulis selama masa perkuliahan. 14. PMK Apostolos yang telah menjadi keluarga dan memberi dukungan, semangat, doa serta melengkapi hari-hari penulis dengan sukacita dalam Tuhan. viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15. Pihak-pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah banyak memberikan kontribusi bagi penulis dalam masa kuliah dan penyusunan skripsi ini. Penulis menyadari masih banyak keterbatasan dalam diri penulis dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, saran dan kritik yang membangun sangat diharapkan dari berbagai pihak. Penulis berharap, skripsi ini dapat bermanfaat bagi sesama dan kemajuan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi. Penulis ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL........................................................................................... i PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................................... ii PENGESAHAN SKRIPSI .................................................................................. iii LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. v HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... vi PRAKATA .......................................................................................................... vii DAFTAR ISI ....................................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xvii INTISARI......................................................................................................... xviii ABSTRACT ..........................................................................................................xix BAB I. PENGANTAR ........................................................................................ 1 A. Latar Belakang ........................................................................................ 1 1. Perumusan masalah ........................................................................... 4 2. Keaslian penelitian ............................................................................ 4 3. Manfaat penelitian ............................................................................. 4 B. Tujuan Penelitian .................................................................................... 5 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA................................................................. 6 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI A. Tanaman Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. ...................................... 6 1. Taksonomi ........................................................................................ 6 2. Deskripsi........................................................................................... 7 3. Kandungan ....................................................................................... 7 B. Antimikroba ............................................................................................ 9 C. Bakteri Streptococcus pyogenes .............................................................. 11 D. Radang Tenggorokan .............................................................................. 13 E. Pengukuran Aktivitas Antibakteri ........................................................... 14 1. Metode difusi.................................................................................... 14 2. Metode dilusi .................................................................................... 15 F. Penyarian ................................................................................................. 15 1. Infundasi ............................................................................................ 17 2. Maserasi ............................................................................................ 17 3. Perkolasi ............................................................................................ 18 4. Soxhletasi .......................................................................................... 18 G. Senyawa Kimia Bahan Alam .................................................................. 19 1. Flavonoid .......................................................................................... 19 2. Tanin ................................................................................................. 20 3. Alkaloid ............................................................................................. 21 4. Saponin.............................................................................................. 21 H. Kromatografi Lapis Tipis ........................................................................ 22 I. Landasan Teori ........................................................................................ 24 J. Hipotesis .................................................................................................. 25 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 26 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................. 26 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ......................................... 26 1. Variabel penelitian ............................................................................ 26 2. Definisi operasional .......................................................................... 27 C. Bahan Penelitian...................................................................................... 27 D. Alat Penelitian ......................................................................................... 28 E. Tata Cara Penelitian ................................................................................ 28 1. Determinasi tanaman M. tanarius .................................................... 28 2. Pembuatan serbuk daun M. tanarius ................................................ 29 3. Pembuatan ekstrak etanol daun M. tanarius .................................... 29 4. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak daun M. tanarius ................ 30 5. Uji skrining fitokimia daun M. tanarius .......................................... 30 6. Uji antibakteri ................................................................................... 33 F. Analisis Hasil .......................................................................................... 36 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 38 A. Identifikasi Bahan Tanaman M. tanarius (L.) M. A. ............................. 38 B. Pengumpulan Bahan................................................................................ 39 C. Pengeringan Bahan dan Pembuatan Serbuk Daun M. tanarius .............. 39 D. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun M. tanarius ......................................... 41 E. Uji Fitokimia Daun M. tanarius .............................................................. 43 1. Uji pendahuluan ................................................................................ 43 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2. Uji senyawa fenolik........................................................................... 44 3. Uji flavonoid ..................................................................................... 47 4. Uji tanin............................................................................................. 51 5. Uji alkaloid ........................................................................................ 52 6. Uji saponin ........................................................................................ 55 F. Identifikasi Bakteri Streptococcus pyogenes .......................................... 58 G. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap Bakteri S. pyogenes .................................................................. 59 H. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap Bakteri S. pyogenes ................................................................................. 67 I. Uji Penegasan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius dengan Streak Plate................................................................................. 69 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 71 A. Kesimpulan ............................................................................................. 71 B. Saran ........................................................................................................ 71 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 72 LAMPIRAN ........................................................................................................ 77 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 100 xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Perbedaan gejala radang tenggorokan yang disebabkan oleh infeksi bakteri dan virus ........................................................... 13 Tabel II. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak etanol daun M. tanarius .... 45 Tabel III. Hasil uji KLT flavanoid ekstrak etanol daun M. tanarius ............... 49 Tabel IV. Hasil pengukuran zona hambat dalam milimeter (mm) ................... 62 Tabel V. Hasil uji KHM dan KBM ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap S. pyogenes ........................................................................ 68 xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur senyawa yang terkandung dalam M. tanarius ................. 8 Gambar 2. Bakteri S. pyogenes pada transmission elektron microscopy (TEM) perbesaran 6.500X ......................................................................... 11 Gambar 3. Struktur senyawa flavonoid ........................................................... 20 Gambar 4. Tanaman (A) dan daun segar (B) M. tanarius ............................... 38 Gambar 5. Hasil uji pendahuluan serbuk daun M. tanarius ............................ 43 Gambar 6. Hasil uji tabung senyawa fenolik serbuk daun M. tanarius ........... 44 Gambar 7. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak etanol daun M. tanarius sebelum disemprot besi (III) klorida dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm ....................................................................... 45 Gambar 8. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak etanol daun M. tanarius setelah disemprot besi (III) klorida dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm ....................................................................... 46 Gambar 9. Reaksi pembentukan warna senyawa fenolik dengan besi (III) klorida ............................................................................................ 47 Gambar 10. Hasil uji tabung flavonoid serbuk daun M. tanarius ..................... 48 Gambar 11. Reaksi flavonoid dengan natrium hidroksida ................................ 48 Gambar 12. Hasil uji KLT senyawa flavonoid ekstrak etanol daun M. tanarius sebelum disemprot sitroborat ......................................................... 49 Gambar 13. Hasil uji KLT senyawa flavonoid ekstrak etanol daun M. tanarius setelah disemprot sitroborat ........................................................... 50 xv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 14. Perkiraan reaksi flavonoid dengan sitroborat ................................ 51 Gambar 15. Hasil uji tabung tanin serbuk daun M. tanarius ............................. 52 Gambar 16. Hasil uji tabung alkaloid golongan II dan III serbuk daun M. tanarius .................................................................................... 53 Gambar 17. Perkiraan reaksi uji Mayer ............................................................. 54 Gambar 18. Perkiraan reaksi uji Bouchardat ..................................................... 55 Gambar 19. Hasil uji tabung saponin serbuk daun M. tanarius ........................ 56 Gambar 20. Reaksi hidrolisis saponin dalam air ............................................... 56 Gambar 21. Media BAP sebelum perlakuan (A), hasil uji hemolisis saponin ekstrak etanol daun M. tanarius (B) ................................. 57 Gambar 22. Media Blood Agar Plate (BAP) sebelum distreak dengan bakteri (A), media BAP yang sudah distreak bakteri S. pyogenes diinkubasi selama 24 jam ............................................................... 58 Gambar 23. Bentuk koloni bakteri S. pyogenes yang ditanam dalam media BAP .......................................................................... 59 Gambar 24. Hasil uji difusi ekstrak daun M. tanarius terhadap S. pyogenes dengan metode difusi sumuran .................................. 61 Gambar 25. Diagram rata-rata diameter zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes ...................................... 65 Gambar 26. Hasil penegasan uji KHM dan KBM konsentrasi 3,5 % (A) dan 5 % (B) .......................................................................................... 69 xvi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi M. tanarius ................................. 78 Lampiran 2. Tanaman M. tanarius................................................................... 79 Lampiran 3. Ekstraksi Daun M. tanarius ......................................................... 80 Lampiran 4. Uji Kelarutan Ekstrak Etanol Daun M. tanarius ......................... 81 Lampiran 5. Seri Konsentrasi Ekstrak Ekstrak Etanol Daun M. tanarius ....... 82 Lampiran 6. Surat Keterangan Kultur Bakteri S. pyogenes ............................. 83 Lampiran 7. Kultur Bakteri S. pyogenes .......................................................... 84 Lampiran 8. Hasil Uji Potensi Antibakteri dengan Metode Difusi Sumuran .. 85 Lampiran 9. Tabel Hasil Pengukuran Zona Hambat Uji Difusi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap S. pyogenes ..................................... 89 Lampiran 10. Hasil Uji Normalitas Shapiro Wilk ............................................. 90 Lampiran 11. Hasil Uji Levene .......................................................................... 91 Lampiran 12. Hasil Uji Anava Satu Arah .......................................................... 91 Lampiran 13. Hasil Uji Varian ........................................................................... 91 Lampiran 14. Hasil Uji T Tidak Berpasangan ................................................... 94 Lampiran 15. Hasil Uji Dilusi Padat .................................................................. 97 Lampiran 16. Hasil Uji Penegasan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius .................................................................................. 99 xvii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI INTISARI Radang tenggorokan merupakan infeksi saluran pernapasan atas (ISPA) yang paling umum ditemui. Radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri Streptococcus pyogenes harus ditanggulangi karena dapat menyebabkan infeksi sistemik berbahaya. Daun Macaranga tanarius dapat digunakan sebagai tanaman obat karena memiliki aktivitas antibakteri sekaligus memiliki daya antiinflamasi. Senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri yang terkandung adalah flavonoid, tanin dan saponin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius dalam berbagai konsentrasi terhadap S. pyogenes. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni rancangan acak lengkap pola searah. Aktivitas antibakteri diukur dengan metode difusi sumuran, penentuan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) dilakukan dengan metode dilusi padat. Uji kualitatif kandungan kimia daun M. tanarius dilakukan dengan uji tabung dan kromatografi lapis tipis (KLT). Data diameter zona hambat dianalisis secara statistik menggunakan uji Shapiro-Wilk dan uji Levene kemudian dilanjutkan Uji Anava Satu Arah. Untuk mengetahui potensi antibakteri ekstrak daun M. tanarius dilakukan analisis dengan uji T tidak berpasangan. Data KHM dan KBM dianalisis dengan analisis deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. pyogenes dengan nilai KHM 3,5% dan KBM 5%. Kata kunci : Radang tenggorokan, daun Macaranga tanarius, Streptococcus pyogenes, aktivitas antibakteri, KHM, KBM, KLT. xviii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Strep throat is the most commonly encountered upper respiratory tract infection. Strep throat that caused by Streptococcus pyogenes bacteria must be overcome because it can cause dangerous systemic infection. Macaranga tanarius leaves able to be herbal medicine because have antibacterial activity and have anti-inflammation activity. Particular compound which has antibacterial activity in M. tanarius leaf are flavonoids, tannins and saponin. This study is aimed to examine the potential antibacterial of M. tanarius leaf ethanol extract at various concentration against S. pyogenes bacteria. This study including purely experimental study used complete randomized design study unidirectional pattern. Antibacterial activity measured by a method of well diffusion, the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) done with the solid dilution method. A qualitative test of chemical content of leaves M. tanarius done by thin layer chromatography (TLC). The inhibition zone diameter data are analyzed statistically by using Shapiro-Wilk test and Levene test and then continued by One Way Anava test. In order to examine the potential antibacterial of M. tanarius leaf extract, the researcher used unpaired T-test. The data of MIC and MBC are analyzed descriptively. The result of this study shows that the M. tanarius leaf etanol extract has antibacterial activity against S. pyogenes with MIC 3,5% and MBC 5%. Keywords : Strep throat, Macaranga tanarius leaf, Streptococcus pyogenes, antibacterial activity, MIC, MBC, TLC. xix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Masalah Penyakit infeksi menjadi salah satu masalah kesehatan manusia. Penyakit infeksi didefinisikan sebagai proses saat organisme (misalnya bakteri, virus dan jamur yang dapat menyebabkan penyakit) masuk ke dalam tubuh atau jaringan dan menyebabkan trauma atau kerusakan (Grace and Borley, 2007). Radang tenggorokan termasuk dalam infeksi saluran pernapasan atas (ISPA) yang paling umum ditemui dalam masalah kesehatan dengan insidensi 100 kasus per 1000 jiwa di dunia ini (Finch, Davey, Vilcox, and Irving, 2012). Pada tahun 2013, di Indonesia kasus ISPA memiliki prevalensi 25% (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2013). Radang tenggorokan biasanya disebabkan oleh virus dan bakteri. Menurut Cook and Zumla (2009) dari 100 kasus radang tenggorokan, 20 diantaranya disebabkan oleh bakteri Streptococcus pyogenes. Bakteri S. pyogenes termasuk dalam grup A hemolitik streptococcus, banyak terdapat pada saluran nafas bagian atas. Radang tenggorokan yang disebabkan oleh infeksi S. pyogenes ditandai dengan sakit tenggorokan, pembesaran tonsil yang disertai eksudat, rasa perih, panas, dan rasa tidak enak badan. Penyebab radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri perlu ditanggulangi. Bila sakit tenggorokan disebabkan oleh S. pyogenes, maka terapi lengkap menjadi hal yang penting karena kasus infeksi streptococcal yang tidak ditangani dapat menyebabkan infeksi sistemik berbahaya seperti demam scarlet 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2 (penyakit jengkering), demam rheumatik, glomerulonefritis akut, dan sindrom streptococcal toxic (Madigan, et al., 2009). Untuk mengobati radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri digunakan antibiotik yaitu substansi organik yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya (Chinedum, 2005). Penggunaan antibiotik yang semakin meluas menyebabkan terjadinya resistensi bakteri. Oleh sebab itu, eksplorasi tanaman obat yang memiliki aktivitas antibakteri terus berkembang. Hal ini juga seiring dengan kecenderungan pengobatan masa kini yang kembali menggunakan bahan herbal karena lebih cenderung memiliki efek samping minimal dan mudah dijangkau oleh masyarakat. Tanaman obat secara alami memiliki daya perlindungan dari bakteri melalui metabolit sekunder yang dihasilkan. Diharapkan dengan melakukan eksplorasi tanaman yang ada disekitar, dapat ditemukan tanaman yang bermanfaat khususnya dalam melawan infeksi. Daun Macaranga tanarius belum banyak dieksplorasi sebagai tanaman obat. Selama ini daun M. tanarius biasa digunakan secara tradisional sebagai penyamak jala ikan, bahan membuat minuman, dan pewarna pada kerajinan tikar (World Agroforestry Centre, 2014). Dalam pemanfaatannya sebagai tanaman obat di masyarakat, akar M. tanarius digunakan sebagai antitusif dan melawan demam, sedangkan daunnya digunakan sebagai antiinflamasi (Lim, et al., 2009). Lim et al. (2009), dalam penelitiannya mengungkapkan bahwa ekstrak metanol 100% daun segar M. tanarius memiliki kemampuan menghambat bakteri Gram positif seperti Bacillus cereus, Micrococcus luteus, dan Staphylococcus aureus. Pada penelitian tersebut digunakan dosis sebesar 5 µg hingga 10 µg, sehingga memiliki potensi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 yang cukup tinggi untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, sedangkan pada bakteri Gram negatif tidak menunjukkan adanya penghambatan. Daun M. tanarius diketahui mengandung flavonoid yang memiliki aktivitas antibakteri (Kawakami et al., 2008; Matsunami et al., 2006; Matsunami, et al., 2009; Phomart, et al., 2005). Selain itu dalam penelitian Kurniawaty (2010), daun M. tanarius ditemukan memiliki daya antiinflamasi. Daun M. tanarius memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi obat radang tenggorokan karena memiliki aktivitas antibakteri dan daya antiinflamasi. Pada penelitian ini digunakan ekstrak etanol daun M. tanarius. Etanol dipilih sebagai penyari karena etanol telah dikenal sebagai pelarut yang mampu mengekstraksi komponen yang memiliki aktivitas antimikroba (Bala, Aitken, Fechner, Cusack, and Steadman, 2011). Etanol dapat melarutkan senyawa yang dituju seperti senyawa flavonoid (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). Penelitian ini ingin melihat potensi daun M. tanarius dalam melawan infeksi yang disebabkan S. pyogenes yang termasuk dalam bakteri Gram positif. Selain itu, juga dilakukan penentuan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) guna mengetahui konsentrasi terkecil yang dapat menghambat dan membunuh pertumbuhan bakteri S pyogenes. Nilai KHM dan KBM, dapat menentukan konsentrasi untuk pengobatan infeksi bakteri S. pyogenes. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4 1. Perumusan masalah Berdasakan latar belakang permasalahan diatas, muncul permasalahan sebagai berikut. a. Apakah ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. pyogenes? b. Berapakah KHM dan KBM ekstrak etanol M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes? 2. Keaslian penelitian Penelitian mengenai M. tanarius menunjukkan adanya aktivitas antioxidan, antiinflamasi dan antibakteri (Lim, et al., 2009). Penelitian mengenai daya antibakteri dilakukan dengan menggunakan ekstrak metanol 100% daun M. tanarius terhadap bakteri Gram positif (B. cereus, M. luteus, dan S. aureus) menunjukkan aktivitas penghambatan pada dosis 5 µg hingga 10 µg, sedangkan pada Gram negatif tidak menunjukkan aktivitas penghambatan. Penelitian mengenai aktivitas antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes sejauh pengetahuan peneliti belum pernah dilakukan. 3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis. Penelitian ini diharapkan mampu menambah pengetahuan mengenai potensi daun M. tanarius sebagai sumber antibakteri terhadap bakteri S. pyogenes. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 5 b. Manfaat metodologis, Penelitian ini diharapkan mampu menambah pengetahuan mengenai metode yang tepat dalam pengujian aktivitas antibakteri daun M. tanarius terhadap S. pyogenes. c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi kepada masyarakat mengenai manfaat daun M. tanarius dalam pengobatan radang tenggorokan. B. Tujuan Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut. 1. Mengetahui potensi ekstrak etanol M. tanarius sebagai antibakteri. 2. Mengetahui KHM dan KBM ekstrak etanol M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Macaranga tanarius 1. Taksonomi Klasifikasi Macaranga tanarius berdasarkan International Taxonomy Integrated System (ITIS) (2011): Kerajaan : Plantae Subkerajaan : Viridaeplantae Divisi : Tracheophyta Subdivisi : Spermatophytina Kelas : Magnoliopsida Superordo : Rosanae Ordo : Malpighiales Famili : Euphorbiaceae Genus : Macaranga Thouars Spesies : Macaranga tanarius (L.) Mull. Arg. Menurut World Agroforestry Centre (2014), M. tanarius memiliki sinonim dan nama umum. Sinonim : Macaranga molliuscula Kurz., Macaranga tomentosa Druce, Mappa tanarius Blume Nama Umum : parasol leaf tree, hairy mahang (Inggris), binunga, himindang, kuyonon (Filipina), mapu (Batak), mara 6 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 7 (Sunda), tutup ancur (Jawa), ka-lo (Malay), kundoh, mahang puteh, tampu hu chang lek, ka-lo, lo khao, mek pang (Thailand), hach dâu nam (Vietnam). 2. Deskripsi M. tanarius memiliki ukuran pohon kecil hingga medium dengan tinggi 20 meter. Ukuran batang tebal, berwarna hijau tua ketika muda. Daun berselang-seling, permukaan berbulu halus, suborbicular, berukuran 8-32 x 528 cm, berbentuk lingkaran pada dasar dan tajam pada ujungnya, sedikit berlekuk, tangkai daun memiliki panjang 6-27 cm. Bunga berwarna hijau, bunga jantan benang sari berbentuk jarum, bunga betina berkelompok, dengan jaringan glandular, dua sel telur dan dua stigma besar. Buahnya berbentuk kapsul bikokus diameter 1 cm, dengan duri lembut yang panjang, berwarna kuning, biji berdiameter 5 mm (World Agroforest Centre, 2014). 3. Kandungan Kandungan kimia yang terdapat dalam daun M. tanarius sudah banyak diteliti. Berdasarkan isolasi dan penelitian, kandungan kimia yang ditemukan dalam daun M. tanarius antara lain flavonoid, glikosida dan terpenoid. Penelitian yang dilakukan oleh Kawakami et al., (2008) menememukan flavonoid yang berupa sembilan prenylflavanon dan sebuah diterpen. Sembilan prenylflavanon tersebut antara lain macaflavanone A, macaflavanone B, macaflavanone C, macaflavanone D, macaflavanone E, macaflavanone F, macaflavanone G, tanariflavanone B, dan nymphaeol C, sedangkan diterpen yang dimaksud adalah kolavenol. Terdapat tiga komponen baru ditemukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8 dalam daun M. tanarius yang juga merupakan golongan flavonoid antara lain tanariflavanone B, tanariflavanone C, dan tanariflavanone D. Selain itu juga terdapat kandungan flavonoid seperti nymphaeol A, nymphaeol B, dan nymphaeol C. Kandungan terpenoid antara lain blumenol A (vomifoliol), blumenol B (7,8- dihydrovomifoliol), dan annuionone E dalam daun M. tanarius (Phomart, et al., 2005). Glikosida yang ditemukan adalah macarangioside A, macarangioside B, macarangioside C, dan macarangioside D (Matsunami, et al., 2006; Matsunami, et al., 2009). Komponen lainnya yang ditemukan tanarifuranonol, mallophenol G, lauroside E, metil brevifolin karboksilat, hiperin dan isoquercitrin. Beberapa struktur senyawa yang terkandung dalam M. tanarius (Gambar 1). macaflavanone A nymphaeol C lauroside E tanarifuranonol Gambar 1. Struktur senyawa yang terkandung dalam M. tanarius (Matsunami, et al., 2006; Kawakami et al., 2008; Phomart, et al., 2005) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 9 B. Antimikroba Agen antimikroba adalah bahan kimia sintetis atau alami yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Aktivitas antimikroba adalah kadar terkecil yang dibutuhkan oleh agen antimikroba untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Nilai dari aktivitas tersebut disebut Kadar Hambat Minimum (KHM) (Madigan, et al., 2009). Antibiotik adalah substansi organik yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau membunuh mikroorganisme lainnya (Ibezim, 2005). Agen antimikroba diklasifikasikan sebagai bakteriostatik, bakterisid, dan bakteriolisis bergantung dari efek yang ditimbulkan terhadap kultur bakteri. Bakteriostatik biasanya menghambat sintesis protein dan berikatan dengan ribosom bakteri. Banyak antibiotik bekerja dengan mekanisme tersebut. Sedangkan agen bakteriosid akan berikatan kuat dengan target dan tidak hilang bila diencerkan, membunuh bakteri tanpa merusak sel. Agen bakteriosid biasanya juga merupakan bakteriolisis, membunuh dengan melisiskan sel dan melepaskan komponen sitoplasma. Agen bakteroilisis termasuk pula antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel seperti penisilin dan bahan kimia seperti detergen yang dapat memecahkan membran sitoplasma bakteri. Bakteri Gram positif dan Gram negatif memiliki perbedaan dalam hal kerentanan terhadap antibiotik. Pada umumnya bakteri Gram positif dapat dipengaruhi, sedangkan bakteri Gram negatif mudah resisten (Madigan, et al., 2009). Hanya kurang dari satu persen dari ribuan antibiotik digunakan secara klinis. Hal ini disebabkan karena toksisitas atau kurangnya kemampuan uptake host. Namun antibiotik alami PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 dapat digunakan dan dimodifikasi untuk meningkatkan efikasi (Madigan, et al., 2009). Golongan fenol diketahui memiliki aktivitas antimikroba yang bersifat bakterisid. Senyawa turunan fenol yang dikenal sebagai senyawa fenolik mengandung molekul fenol yang secara kimiawi telah diubah untuk mengurangi kemampuan mengiritasi kulit dan meningkatkan aktivitas antibakterinya. Aktivitas antimikroba senyawa fenolik adalah dengan merusak lipid pada membran plasma mikroorganisme, sehingga menyebabkan isi sel keluar (Pratiwi, 2008). Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri yang menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom dan lisosom. Aktivitas antibakteri dari flavonoid juga dilakukan dengan pengurangan fluiditas membran pada sel bakteri dan penghambatan metabolisme energi pada bakteri (Cushnie and Lamb, 2005). Mekanisme antimikroba dari tanin yaitu, (i) zat astringent pada tanin dapat menginduksi kompleksasi dengan enzim dan substrat, berbagai enzim mikrobial mengalami penghambatan ketika dicampur dengan tanin, (ii) toksisitas tanin erat kaitannya dengan aksi pada membran mikroorganisme, dan (iii) kompleksasi logam ion pada tanin dapat merusak membran sitoplasma dari bakteri (Akiyama, et al., 2001). Terpenoid memiliki mekanisme antibakteri dengan bereaksi dengan porin (protein transmembran) pada membran luar dinding sel bakteri, membentuk ikatan polimer yang kuat sehingga mengakibatkan rusaknya porin. Rusaknya porin yang merupakan pintu keluar masuknya senyawa akan mengurangi permeabilitas dinding sel bakteri yang akan mengakibatkan sel bakteri akan kekurangan nutrisi, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 11 sehingga pertumbuhan bakteri terhambat atau mati (Cowan, 1999). Saponin memiliki sifat seperti deterjen dan mungkin meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri tanpa menghancurkan bakteri tersebut. Hal ini memfasilitasi masuknya zat antibakteri melalui membran dinding sel bakteri. Saponin dapat mengganggu permeabilitas pada lapisan terluar membran (Arabski et al., 2012). Minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri dengan mengganggu proses terbentuknya membran atau dinding sel, membran atau dinding sel tidak terbentuk atau terbentuk tidak sempurna, sehingga tekanan osmosis sel terganggu dan mikroba mati (Sitepu, Suada dan Susrama, 2012). C. Bakteri Streptococcus pyogenes Taksonomi bakteri S. pyogenes menurut Bergey’sManual of Determinatve Biology : Kerajaan : Bacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Lactobacillales Famili : Streptococcaceae Genus : Streptococcus Spesies : Streptococcus pyogenes Gambar 2. Bakteri S. pyogenes pada transmission electron microscopy (TEM) perbesaran 6.500X (Todar, 2012) S. pyogenes memiliki sel bulat atau lonjong, garis tengah kurang dari 2 μm, berpasangan atau berantai, anggota rantai sering memberikan gambaran diplokokus (Jawetz, Melnick and Adelbergha, 1984). Panjang rantai PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 12 Streptococcus berbeda-beda, pada perbenihan cair rantai dapat panjang dan umumnya tidak bergerak. Koloni streptococcus kecil, bening, buat, dengan garis tengah kurang dari 1 mm dan cembung. Pada koloni dapat ditemukan bentuk koloni mukoid, licin atau mengkilap dan bentuk kasar atau tidak mengkilap. Streptococcus hemolitik β golongan A berwarna putih kelabu pada media agar darah. Membentuk koloni permukaan keruh, keras kering (Bonang dan Koeswardono, 1982). S. pyogenes merupakan bakteri Gram positif dan metabolisme anaerob. Suhu optimum pertumbuhan 37˚C dan merupakan bakteri fakultatif anaerob (Bonang dan Koeswardono, 1982). S. pyogenes memproduksi protein resisten panas dan resisten asam yang disebut protein M. Protein ini terdapat pada permukaan sel dan pada fimbria. Protein M memperantarai perlekatan bakteri pada sel epitel inang dan membantu bakteri bertahan pada proses fagositosis sel darah putih. Imunitas terhadap S. pyogenes bergantung pada produksi antibodi tubuh yang spesifik terhadap protein M (Pratiwi, 2009). Streptococus pyogenes adalah bakteri patogen utama manusia yang berkaitan dengan invasi lokal atau sistemik dan gangguan imunologik (Jawetza, dkk., 1984). Faktor virulensi utama dari Streptococus pyogenes menyebabkan infeksi serius antara lain, faringitis, infeksi saluran pernafasan, infeksi kulit (impetigo dan erysipelas) dan jarigan, endokarditis, meningitis, sepsis dan arthritis (Murray, et al., 1999). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 13 D. Radang Tenggorokan Pada saluran nafas bagian atas, bakteri banyak tumbuh dalam lingkungan yang mengandung sekresi dari membran mukosa. Bakteri secara terus menerus memasuki saluran nafas bagian atas melalui udara yang terhirup namun seringkali terjebak dalam saluran dan sekret hidung. Mikroorganisme yang sering ditemukan antara lain staphylococci, streptococci, diptherioid bacilus, dan kokus Gram negatif (Madigan, et al., 2009). Sakit tenggorokan merupakan infeksi saluran nafas bagian atas yang umumnya disebabkan oleh infeksi virus dan bakteri. Gold standar untuk mengetahui penyebab radang tenggorokan adalah dengan melakukan tes kultur tenggorokan pasien. Bakteri yang biasa ditemukan dalam kultur usap tenggorokan pasien adalah bakteri S. pyogenes (Finch, et al., 2012). Terdapat beberapa perbedaan gejala radang tenggorokan yang disebabkan oleh infeksi bakteri dan oleh virus dalam Tabel I. Tabel I. Perbedaan gejala radag tenggorokan yang disebabkan oleh infeksi bakteri dan virus (Cook dan Zumla 2009) Ciri Onset Tenggorokan Infeksi Bakteri Tiba-tiba Sangat sakit Mata dan Hidung Tidak terganggu Tonsil Membesar dan perih, merah, dan mengeluarkan eksudat Infeksi Virus Bertahap Kurang nyaman Mata merah dan mengeluarkan ingus Tidak membesar, merah, terdapat vesikel dan ulser S. pyogenes termasuk dalam streptokokus β-hemolitik grup A. Streptokokus golongan A yang virulen, melekat pada epitel faring dengan pertolongan asam lipoteikoat yang menutupi fili permukaan. Pada bayi dan anak kecil penyakit ini muncul sebagai nasofaringitis subakut dengan sekret serosa PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 14 encer dan demam ringan, infeksi ini cenderung meluas ke telinga tengah, mastoid, dan selaput otak (Jawetz, Melnick and Adelberghb, 1995). Kebanyakan isolat biasanya memproduksi toksin yang dapat melisiskan sel darah merah pada kultur media, kondisi ini disebut β-hemolitik. Penyakit ini biasa ditandai dengan sakit tenggorokan, pembesaran tonsil yang disertai eksudat, rasa perih, panas, dan rasa tidak enak badan (Madigan, et al., 2009). E. Pengukuran Aktivitas Antibakteri Aktivitas antimikroba diukur secara invitro untuk menentukan potensi zat antimikroba dalam larutan, konsentrasinya dalam cairan tubuh dan jaringan, dan kepekaan terhadap obat pada konsentrasi tertentu. Penentuan nilai-nilai ini dapat dilakukan dengan dua metode utama yaitu metode difusi dan metode dilusi (pengenceran) (Jawetzb, dkk., 1995). 1. Metode difusi Cakram kertas saring, cawan yang berliang renik atau silinder tak beralas, yang mengandung obat pada jumlah tertentu ditempatkan pada media yang telah ditanami mikroorganisme. Setelah diinkubasi, garis tengah daerah hambatan jernih yang mengelilingi cakram dianggap sebagai zona hambat (Jawetzb, dkk., 1995). Metode difusi dengan cakram didasarkan pada proses difusi senyawa dari disk yang berisi obat ke lempeng agar. Ketika antibiotik diletakkan pada lubang sumuran atau disk pada lempeng agar, obat mulai berdifusi dengan segera. Tes menggunakan cakram memiliki sejarah yang panjang, dan telah dikembangkan salah satunya dengan meode sumuran. Cara PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 15 yang bervariasi menyebabkan metode ini menjadi populer, disamping harganya yang lebih murah dibanding metode lain. Hal ini menimbulkan berbagai variasi di seluruh dunia. Tidak seperti metode dilusi, nilai KHM tidak dapat ditentukan akan tetapi zona jernih perlu dibandingkan dengan nilai KHM strain yang sama untuk mendeterminasikan zona jernih mana yang mungkin merupakan nilai KHM dan kategori kerentanan (Lorian, 2005). 2. Metode dilusi Terdapat dua macam metode dilusi yaitu dilusi padat dan dilusi cair. Kedua metode ini memiliki prinsip yang sama, yang membedakan hanyalah media yang digunakan (Pratiwi, 2008). Sejumlah obat antmikroba tertentu dibuat beberapa seri pengenceran dicampurkan pada media cair atau padat kemudian media ditanami bakteri uji dan diinkubasi (Jawetz b, dkk., 1995). Penentuan KHM pada metode dilusi padat ditetapkan dari larutan uji dengan kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroa uji. Konsentrasi larutan uji yang telah ditetapkan sebagai KHM dikultur ulang pada media baru dan diinkubasi selama 18-24 jam, jika media tersebut tidak terdapat pertumbuhan mikroba setelah inkubasi maka ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008). F. Penyarian Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Penyarian merupakan peristiwa perpindahan masa, zat aktif yang semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 16 terjadi larutan zat aktif dalam cairan penyari tersebut. Simplisia yang disari mengandung zat aktif yang yang dapat larut dan tidak dapat larut. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian dalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan cairan penyari makin luas, dengan demikian maka makin halus serbuk simplisia seharusnya makin baik penyariannya. Dalam penyarian, serbuk simplisia harus dibuat sehalus mungkin dan dijaga agar selnya tidak pecah. Namun simplisia yang terlalu halus akan memberikan kesulitan pada proses penyarian (pada metode ekstraksi perkolasi) dan penyaringan (butir-butir halus membentuk suspensi yang sulit dipisahkan). Pembasahan serbuk sebelum dilakukan penyarian dimaksudkan memberikan kesempatan sebesar-besarnya kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori dalam simplisia sehingga mempermudah peyarian. Cairan penyari harus dapat mencapai seluruh serbuk dan secara terus menerus mendesak larutan yang memiliki konsentrasi lebih tinggi keluar. Oleh karena itu, perlu diperhatikan kriteria dalam pemilihan penyari antara lain stabil secara fisika dan kimia, netral, tidak mudah menguap dan terbakar, selektif (hanya menarik zat berkhasiat), tidak mempengaruhi zat berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). Etanol telah dikenal sebagai pelarut yang mampu mengekstraksi komponen yang memiliki aktivitas antimikroba (Bala et al., 2011). Etanol dapat melarutkan alkaloida basa, minyak atsiri, glikosida, kurkumin, kumarin, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 17 antrakinon, flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Untuk meningkatkan penyarian biasanya digunakan campuran etanol dan air namun hal ini bergantung bahan yang akan disari. Etanol dapat dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih selektif, kapang dan bakteri sulit tumbuh dalam etanol dengan konsentrasi lebih dari 20%, tidak beracun, netral, absorbsi baik, etanol dapat bercampur dengan baik pada segala perbandingan, dan pemanasan yang diperlukan dalam proses pemekatan lebih sedikit (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). Cara penyarian dibedakan menjadi : 1. Infundasi Infus adalah sediaan cari yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 90° C selama 15 menit. Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan utuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air. Penyarian yang dilakukan dengan infundasi menyebabkan sari yang dihasilkan tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Selain itu, sari yang diperoleh tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). 2. Maserasi Maserasi adalah proses perendaman serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk simplisia yang mengandung zat aktif mudah larut, tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari, tidak mengandung benzoin, dan lain-lain. Keuntungan cara penyarian maserasi adalah peralatan sederhana dan mudah dikerjakan, sedangkan kerugiannya adalah pengerjaannya lama dan penyarian kurang sempurna. Pada PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 18 penyarian dengan cara maserasi perlu dilakukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi larutan diluar butir serbuk simplisia sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya derajat perbedaan konsentrasi yang sekecilkecilnya antara larutan dalam sel dengan larutan diluar sel (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). 3. Perkolasi Cara penyarian dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Serbuk simplisia yang ditempatkan dalam bejana silinder diberi sekat berpori pada bagian bawah. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk, cairan penyari akan melarutkan zat aktif hingga keadaan jenuh. Didiamkan selama 24 jam, setelah itu kran dibuka dan diatur kecepatan tetesannya agar penyarian berjalan sempurna. Pada penentuan akhir perkolasi dapat dilakukan pemeriksaan zat aktif secara kualitatif pada perkolat terakhir (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). 4. Soxhletasi Penggabungan proses menghasilkan ekstrak cair dan dilanjutkan proses penguapan. Uap cairan penyari naik ke atas melalui pipa samping kemudian didinginkan kembali oleh pendingin tegak. Cairan turun ke labu melalui tabung yang berisi serbuk simplisia. Cairan penyari turun melarutkan zat aktif serbuk simplisia. Cara ini menguntungkan karena uap panas tidak melalui serbuk simplisia tapi melalui pipa samping. Kelemahan cara ini larutan dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 19 kurang cocok. Selain itu, cairan penyari dididihkan terus menerus sehingga penyari harus murni atau campuran azeotrop (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). Pengeringan dengan tangas air merupakan pengeringan yang sederhana. Kerugiannya cairan penyari tidak dapat ditampung kembali. Pemekatan cairan mula-mula dapat dilakukan dengan pemanasan agak cepat di dalam tangas air. Bila dikehendaki untuk menghasilkan ekstrak kental atau ekstrak kering maka pemanasan dapat diteruskan. Pemanasan harus dilakukan dengan pengontrolan suhu (50-60˚C), agar zat aktifnya tidak rusak (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). G. Senyawa Kimia Bahan Alam Senyawa kimia tanaman bermolekul kecil banyak dijumpai dalam semua tanaman dan terdapat kelompok senyawa kimia khas dalam tanaman tertentu. Senyawa kimia tanaman yang jumlahnya paling banyak adalah senyawa bermolekul kecil yang penyebarannya terbatas, selanjutnya disebut sebagai metabolit sekunder (Sirait, 2007). 1. Flavonoid Flavonoid merupakan golongan terbesar senyawa fenol alam. Hampir 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tumbuhan diubah menjadi flavoniod. Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih atau suatu gula sehingga akan larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air. Adanya gula yang terikat pada flavonoid cenderung PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 20 menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Flavonoid merupakan salah satu metabolit sekunder, kemungkinan keberadaannya dalam daun dipengaruhi oleh adanya proses fotosintesis sehingga daun muda belum terlalu banyak mengandung flavonoid. Flovonoid tersusun dari dua cincin aromatis yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga dengan susunan C6-C3-C6 (Markham, 1988). Dalam tumbuhan, flavonoid terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid yang mungkin terdapat pada satu tumbuhan dalam bentuk kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Gambar 3. Struktur senyawa flavonoid (Markham, 1988) 2. Tanin Tanin tersebar luas dalam tumbuhan berpembuluh. Tanin dapat bereaksi dengan protein membentuk kopolimer mantap yang tidak larut air. Secara kimia terdapat dua jenis utama tanin yaitu tanin terkondensasi dan tanin terhidrolisiskan. Tanin terkondensasi hampir tersebar pada seluruh tumbuhan angiospermae sementara tanin terhidrolisis penyebarannya hanya terbatas pada tumbuhan berkeping dua (Harborne, 1987). Semakin murni tanin, kelarutannya semakin kurang dalam air dan makin mudah diperoleh dalam bentuk kristal. Larutan tanin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan asam mineral PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 21 atau garam. Selain itu, tanin memiliki kemampuan mengendapkan protein yang menyebabkan sering terjadinya reaksi dengan enzim. Asam gallat merupakan asam fenolat yang sering ditemukan dalam tanin (Robinson, 1995). 3. Alkaloid Alkaloid adalah senyawa kimia tanaman hasil metabolit sekunder yang terbentuk berdasarkan prinsip pembentukan campuran. Pembentukan alkaloid dapat ditemukan pada bagian daun, akar, getah dan kuncup muda. Kebanyakan alkaloid adalah zat kristal yang berikatan dengan asam untuk membentuk garam. Pada tanaman, alkaloid terdapat dalam keadaan bebas sebagai garam atau N-oksida. Umumnya alkaloid larut dalam air jika berupa garam sedangkan bentuk bebas atau basanya mudah larut dalam pelarut organik dan sukar larut dalam air (Sirait, 2007). 4. Saponin Terpenoid dapat dipilah menjadi sekurangnya empat golongan senyawa yaitu triterpena sebenarnya, steroid, saponin, dan glikosida jantung. Saponin dan glikosida jantung sebenarnya triterpena atau steroid yang terdapat sebagai glikosida. Saponin adalah glikosida triterpena dan sterol yang terdapat dalam banyak tumbuhan. Saponin merupakan senyawa aktif permukaan, bersifat seperti sabun, dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah (Harborne, 1987). Kedua jenis saponin tersebut larut dalam air dan etanol tetapi tidak larut dalam eter (Robinson, 1995). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 22 H. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar. Pada kromatografi lapis tipis fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh pengembangan secara menaik (ascending) atau gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending). Mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi (Ganjar dan Rohman, 2007). Pemisahan yang optimal akan diperoleh jika menotolkan bercak sekecil dan sesempit mungkin, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak menyebar dan puncak ganda. Pemisahan kromatografi planar umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf (Ganjar dan Rohman, 2007). Rf merupakan ciri senyawa yang terulangkan. Bilangan Rf terdefinisaikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh garis depan pengembang yang diukur dari garis awal. Oleh sebab itu, bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1 (Markham, 1988). 𝑅𝑓 = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑝𝑢𝑠𝑎𝑡 𝑏𝑒𝑟𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘 (Ganjar dan Rohman, 2007). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 23 Angka Rf berkisar antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal. Selain itu juga terdapat hRf, yaitu angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai antara 0 – 100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang agak menyimpang atau secara umum menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (Stahl 1985). Bercak pemisahan pada KLT umumnya tidak berwarna, berbagai cara dapat dilakukan untuk mendeteksi bercak. Cara kimia dapat dilakukan dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika dapat dilakukan dengan fluorosensi sinar ultraviolet. Lampu ultraviolet dapat dipasang pada panjang gelombang 254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak gelap atau bercak yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluorosensi seragam (Ganjar dan Rohman, 2007). Hasil positif dalam identifikasi senyawa fenolik yang ditandai timbulnya noda berwarna hitam setelah plat KLT disemprot pereaksi besi (III) klorida (Marliana, 2007). Menurut Schneider (cit., Meiyanto, dkk., 2011), hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan bercak warna kuning setelah disemprot sitroborat pada sinar tampak. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 24 I. Landasan Teori Radang tenggorokan termasuk ISPA yang cukup sering ditemui di masyarakat. Radang tenggorokan dapat disebabkan oleh virus dan bakteri. Radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri harus ditangani dengan tepat karena infeksi streptococcal dapat menyebabkan infeksi sistemik yang berbahaya. Bakteri yang biasa ditemui dalam kultur tenggorokan penderita radang tenggorokan adalah S. pyogenes yang termasuk dalam grup A streptococcus dan merupakan bakteri Gram positif . Daun M. tanarius telah lama digunakan sebagai agen antiinflamasi. Menurut penelitian, daun M. tanarius dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif, namun tidak menunjukkan penghambatan terhadap bakteri Gram negatif. Kandungan daun M. tanarius yang merupakan turunan dari flavonoid memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri yang menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom dan lisosom. Aktivitas antibakteri dari flavonoid juga dilakukan dengan pengurangan fluiditas membran pada sel bakteri dan penghambatan metabolisme energi pada bakteri. Etanol dipilih sebagai penyari karena dapat menarik senyawa antibakteri yang dituju seperti flavonoid. Flavonoid bersifat polar sehingga campuran etanol dengan air yang juga bersifat polar dapat digunakan untuk menarik flavonoid dalam daun M. tanarius. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antibakteri daun M. tanarius terhadap S. pyogenes. Selain itu juga dilakukan penentuan nilai KHM PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 25 dan KBM untuk mengetahui konsentrasi yang dapat digunakan dalam menghambat dan membunuh bakteri. Diharapkan dari penelitian ini daun M. tanarius yang kurang dimanfaatkan sebagai tanaman obat dapat dikembangkan sebagai antibakteri. Hal ini dapat melengkapi kegunaan daun M. tanarius yang sudah lama digunakan sebagai agen antiinflamasi sehingga dapat digunakan mengobati radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri S. pyogenes. J. Hipotesis Hipotesis dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki aktivitas antibakteri terhadap S. pyogenes, serta nilai KHM dan KBM dari ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap S. pyogenes dapat ditentukan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian a. Variabel bebas. Konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80%. b. Variabel tergantung. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol M. tanarius yang dilihat dari diameter zona hambat dalam milimeter (mm). c. Variabel pengacau terkendali. Asal daun M. tanarius, waktu inkubasi, suhu inkubasi. d. Variabel pengacau tak terkendali. Suhu pengeringan simplisia, tetesan embun saat inkubasi. 26 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 27 2. Definisi operasional a. Ekstrak etanol daun M. tanarius. Ekstrak serbuk daun M. tanarius yang disari menggunakan etanol 70% dan dihilangkan pelarutnya dengan pemanasan di atas penangas air pada suhu 50-60˚C hingga kental lalu ditimbang hingga bobot tetap dan disimpan pada suhu 4˚C. b. Zona hambat. Daerah jernih di sekitar lubang sumuran yang telah diteteskan ekstrak etanol daun M. tanarius yang menandakan tidak terdapat pertumbuhan bakteri dinyatakan dalam milimeter (mm). c. Aktivitas antibakteri. Kemampuan ekstrak etanol daun M. tanarius untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri S. pyogenes yang dibandingkan dengan kontrol negatif. d. Kontrol negatif. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol daun M. tanarius ketika diteteskan dalam media yaitu aquadest steril, hasilnya akan digunakan sebagai pembanding. e. Kontrol positif. Suspensi antibiotik Amoxicilin dengan konsentrasi 25 mg/mL yang telah terbukti mampu menghambat maupun membunuh pertumbuhan bakteri S. pyogenes yang hasilnya digunakan sebagai pembanding ekstrak etanol daun M. tanarius. C. Bahan Penelitian Daun M. tanarius yang diperoleh dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang dipanen pada bulan Juli 2013. Media Nutrient Agar (NA) (Oxoid), Nutrient Broth (NB) (Oxoid), Blood Agar Plate (BAP) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 28 Larutan Mac Farland 0,5, kultur murni S. pyogenes ATCC 19615 yang diperoleh dari Balai Kesehatan, Yogyakarta (EQAM Belgia). Etanol 70% (teknis), aquadest steril, suspensi antibiotik Amoxicilin (Indofarma). Kalium hidroksida LP, natrium hidroksida, asam klorida, natrium klorida 2%, gelatin 1%, Bourchadat LP, dan Mayer LP. Silika gel 60F254, asam asetat, air, etil asetat, asam formiat, toluene, rutin, asam gallat, besi (III) klorida, dan sitroborat. D. Alat Penelitian Alat-alat gelas (Pyrex), pipet ukur (Pyrex), aluminium foil, mikropipet, neraca analitik (Mettler Toledo), cawan petri (Pyrex), cawan porselen, grinder, kulkas, oven (Memmert), Microbiological Safety Cabinet (MSC), inkubator, autoklaf, jarum ose, batang pengaduk, stirer, hot plate, sendok, bunsen, pelubang sumuran, mikropipet, pipet tetes, tabung reaksi, gelas arloji, labu ukur. Penangas air (Memmert), drying box, mesin penyerbuk, ayakan nomor 40, corong, corong Buchner, rotarry vaccum evaporator (Buchi), UV cabinet, chamber. E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Macaranga tanarius Dilakukan pengamatan terhadap pohon dan bagian tanaman seperti daun, batang, buah dan bunga. Bagian tanaman tersebut dicocokkan dengan ciri morfologi tanaman Macaranga tanarius yang terdapat pada buku Flora of Java Jilid I mengikuti panduan determinasi tanaman. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 29 2. Pembuatan serbuk daun M. tanarius Daun M. tanarius sebanyak 500 g dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dibawah sinar matahari ditutup dengan kain hitam selama satu hari. Pengeringan dilanjutkan dalam oven pada suhu 40-50˚C selama satu hari (hingga dapat hancur ketika diremas), dibuat serbuk dengan grinder dan diayak pada ayakan nomor mesh 40. 3. Pembuatan ekstrak etanol daun M. tanarius Serbuk daun M. tanarius sebanyak 30 g diekstraksi secara maserasi menggunakan 300 mL etanol 70% selama lima hari ditempat gelap dan terlindung dari cahaya. Selama roses maserasi dilakukan penggojogan setiap 24 jam sekali untuk meratakan penyarian. Setelah maserasi selama lima hari kemudian filtrat dipisahkan dan dilakukan remaserasi selama dua hari dengan penambahan penyari yang baru dengan perbandingan yang sama (Badan POM RI, 2010). Filtrat disimpan dalam kulkas bersuhu 4°C dan dicampur dengan filtrat hasil remaserasi. Hasil ekstraksi dipisahkan antara filtrat dengan serbuk menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner yang terhubung dengan vaccum. Filtrat hasil maserasi dan remaserasi yang telah dicampur kemudian dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator hingga tidak ada penyari yang menetes pada alat. Filtrat yang pekat tersebut dikumpulkan pada cawan porselen dan diuapkan diatas waterbath untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental ditimbang hingga bobot tetap untuk memastikan pelarut benar-benar hilang. Ekstrak disimpan dalam kulkas bersuhu 4˚C hingga digunakan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 30 4. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak daun M. tanarius Variasi konsentrasi ekstrak daun M. tanarius dibuat dengan melarutkan ekstrak dengan aquadest steril hingga konsentrasi yang ingin diperoleh. Ekstrak dibuat dalam konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80% (50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL, 400 mg/mL, dan 800 mg/mL). 5. Uji skrining fitokimia daun M. tanarius Skrinning fitokimia daun M. tanarius dilakukan terhadap senyawa fenolik, flavonoid, tanin, alkaloid, dan saponin. a. Uji pendahuluan. Uji pendahuluan dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak 2 gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 mL aquadest, kemudian dipanaskan selama 30 menit diatas penangas air dan disaring. Filtrat diamati, bila muncul larutan kuning kemerahan menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor (flavonoida dan antrakinon). Kemudian dengan penambahan larutan kalium hidroksida LP 3 tetes maka warna larutan akan menjadi lebih intensif (Herlianawati, 2007). b. Uji senyawa fenolik. Uji kandungan senyawa fenolik dilakukan dengan uji tabung dan ditegaskan dengan uji KLT. Pada uji tabung, sebanyak 2 gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 mL aquadest, kemudian dipanaskan selama 10 menit diatas penangas air. Disaring panas-panas lalu didinginkan, kemudian filtrat ditambahkan 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadinya warna hijau-biru menunjukkan adanya senyawa fenolik (Harborne, 1987). Pada uji KLT, chamber tempat pemisahan dijenuhkan dengan menggunakan fase gerak yang akan digunakan. Uji kandungan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 31 senyawa fenolik dilakukan dengan menggunakan plat KLT silika gel 60F254 dan fase gerak etil asetat : asam formiat : toluene : air (6 : 1,5 : 2 : 1). Pembanding yang digunakan adalah asam gallat yang dibuat dengan melarutkan 10 mg asam galat dalam 1 mL etanol. Plat KLT ditotol dengan ekstrak etanol daun M. tanarius dalam konsentrasi 10%, dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun M. tanarius sebanyak 1 gram dan dilarutkan dalam etanol 70% hingga 10 mL. Senyawa dielusi hingga mencapai batas (8 cm) dalam fase gerak. Setelah proses elusi selesai, plat diangin-anginkan agar fase gerak menguap dan diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm (Wagner, Bladt, and Zgainski, 1984). Untuk senyawa fenolik dilakukan deteksi dengan besi (III) klorida dan hasil positif berupa bercak berwarna hitam (Marliana, 2007). c. Uji flavonoid. Uji kandungan flavonoid dilakukan dengan uji tabung dan ditegaskan dengan uji KLT. Pada uji tabung, sebanyak 0,2 g serbuk dilarutkan ke dalam natrium hidroksida akan terjadi pembentukan intensitas warna kuning. Pada penambahan asam klorida terjadi perubahan intensitas warna kuning menunjukkan adanya flavonoid (Wibowo, 2013). Uji KLT flavonoid digunakan fase diam silika gel 60F254 dan fase gerak etil asetat asam formiat - asam asetat - air (100 : 11 : 11 : 27). Pembanding yang digunakan adalah rutin yang dibuat dengan melarutkan 10 mg rutin dalam 1 mL etanol. Plat KLT ditotol dengan ekstrak etanol daun M. tanarius dalam konsentrasi 10%, dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun M. tanarius sebanyak 1 gram dan dilarutkan dalam etanol 70% hingga 10 mL. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 32 Senyawa dielusi hingga mencapai batas (8 cm) dalam fase gerak. Setelah proses elusi selesai, plat diangin-anginkan agar fase gerak menguap dan diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm (Wagner, Bladt, and Zgainski, 1984). Hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan bercak warna kuning atau kuning coklat setelah disemprot sitroborat (Schneider cit., Meiyanto, dkk., 2011). d. Uji tanin. Uji kandungan tanin dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak 2 gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 ml aquadest, kemudian dipanaskan selama 30 menit diatas penangas air dan disaring. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan natrium klorida 2% sebanyak 1 mL. Bila terjadi endapan atau suspense, disaring menggunakan kertas saring. larutan gelatin 1% ditambahkan sebanyak 5 mL, bila terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin (Marliana, 2005). e. Uji alkaloid. Uji kandungan alkaloid dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak 500 mg serbuk daun M. tanarius ditambahkan 1 mL asam klorida 2N dan 9 mL. Dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan 2 tetes Bourchadat LP. Bila terdapat endapan maka menunjukkan alkaloid golongan II. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan 2 tetes Mayer LP. Bila filtrat membentuk endapan, maka menunjukkan adanya kandungan alkaloid golongan III (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 33 f. Uji saponin. Uji kandungan saponin dilakukan dengan uji tabung dan uji hemolisis. Pada uji tabung, serbuk daun M. tanarius dimasukkan sebanyak 0,5 g dalam tabung reaksi. Ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan dan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya buih selama ± 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2N buih tidak hilang menunjukkan positif adanya saponin (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995). Untuk memastikan kandungan saponin dalam daun M. tanarius dilakukan uji hemolisis. Sebanyak 40 µL ekstrak etanol daun M. tanarius yang dilarutkan dalam aquadest diteteskan dalam lubang sumuran pada media BAP. Didiamkan selama satu hari kemudian diamati hasilnya. Bila area sekitar lubang sumuran berubah warna menjadi kuning artinya terjadi proses hemolisis dan menunjukkan adanya kandungan saponin dalam ekstrak daun M. tanarius. 6. Uji antibakteri a. Pembuatan suspensi bakteri S. pyogenes. Kultur murni bakteri S. pyogenes yang didapatkan dari Balai Kesehatan Yogyakarta diambil sebanyak satu ose, di kultur pada media NB dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, dibuat suspensi bakteri uji yang kekeruhannya disetarakan dengan larutan Mac Farland 0,5 untuk mendapatkan kepadatan populasi bakteri 1,5 x 108 CFU. b. Pembuatan suspensi antibiotik sebagai kontrol positif. Antibiotik Amoxicilin dry syrup dilarutkan dalam aquadest steril hingga mendapatkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 34 konsentrasi 25 mg/mL. Di-vortex hingga homogen terutama saat sebelum digunakan. c. Pembuatan sumuran pada media NA. Media NA dituangkan dalam petri kemudian didiamkan hingga memadat (sebagai base layer). Media NA yang masih dalam bentuk cair diinokulasi dengan suspensi bakteri uji secara pour plate, dituang dalam cawan petri yang telah terdapat base layer dan didiamkan hingga memadat (sebagai seed layer). Dengan menggunakan pelubang sumuran, media yang telah memadat tersebut dibuat lubanglubang sumuran pada seed layer namun tidak menembus base layer. Jumlah lubang yang dibuat sesuai dengan seri konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius, kontrol negatif dan kontrol positif. d. Uji daya antibakteri secara difusi sumuran. Pada lubang-lubang sumuran, diberikan ekstrak yang telah dilarutkan dalam aquadest steril dengan variasi konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80% (50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL, 400 mg/mL, dan 800 mg/mL) sebanyak 40 µL. Kontrol positif yaitu suspensi antibiotik Amoxicilin dan kontrol negatif yaitu aquadest steril sebagai pelarut ekstrak diberikan dalam lubang sumuran. Dilakukan inkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, setelah waktu inkubasi diamati hasilnya. e. Penentuan KHM dan KBM dengan matode dilusi padat. Pada pengamatan hasil, dilihat zona hambat yang terbentuk disekitar sumuran. Setelah mendapatkan zona hambat, range konsentrasi zona hambat digunakan untuk menentukan KHM dan KBM dengan metode dilusi padat. Variasi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 35 konsentrasi dilusi padat dibuat berdasarkan konsentrasi terkecil yang masih memberikan zona hambat dari uji potensi antibakeri. Suspensi bakteri uji dan ekstrak yang telah dilarutkan sesuai variasi konsentrasi diinokulasikan secara pour plate dalam media NA dengan perbandingan suspensi bakteri : ekstrak (1 : 1). Diinkubasi dalam suhu 37˚C selama 24 jam. Hasil inkubasi dilakukan penegasan hasil dengan melakukan streak pada media NA dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Pada hasil streak diamati berdasarkan kekeruhan pertumbuhan bakteri pada media. Media yang jernih tidak adanya pertumbuhan bakteri diberi notasi -, media yang keruh diberi notasi ++, dan sangat keruh +++. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri selanjutnya dilakukan uji penegasan. f. Uji penegasan. Media yang jernih dipilih dua konsentrasi terkecil untuk selanjutnya dilakukan uji penegasan. Permukaan media digores dengan ose, kemudian digoreskan pada media yang masih steril. Adanya pertumbuhan bakteri pada bekas goresan menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri sedangkan tidak adanya pertumbuhan bakteri menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi kemampuan membunuh pertumbuhan bekteri. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM, sedangkan konsentrasi terkecil yang menunjukkan pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM. masih adanya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 36 F. Analisis Hasil Data dari hasil penelitian ini berupa data diameter zona hambat, data nilai KHM dan KBM, dan data hasil uji KLT. Data diameter zona hambat dianalisis secara statistik menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui data memiliki distribusi normal atau tidak. Data dinyatakan terdistribusi normal bila nilai p>0,05. Dilakukan uji Levene untuk mengetaui variasi data. Bila data terdistribusi normal dan variasi data homogen dilanjutkan uji Anava Satu Arah untuk mengetahui paling tidak terdapat dua kelompok data yang memiliki perbedaan bermakna dengan nilai p<0,05. Untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan maka dilakukan uji T tidak berpasangan untuk mengetahui pada variasi konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius berapa terdapat perbedaan bermakna dengan kontrol negatif dan kontrol positif maupun antar variasi konsentrasi. Data KHM dan KBM dianalisis dengan analisis deskriptif berdasarkan kekeruhan pertumbuhan bakteri yang dibandingkan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Selanjutnya dilakukan uji penegasan KHM dan KBM dengan streak plate untuk menentukan nilai KHM dan KBM. Data hasil uji kualitatif kandungan kimia daun M. tanarius dilakukan dengan mengamati bercak yang tampak pada KLT secara visual dibawah lampu UV 254 nm dan 365 nm. Bercak pada kromatogram dihitung Retardation factor (Rf) dengan rumus: 𝑅𝑓 = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑝𝑢𝑠𝑎𝑡 𝑏𝑒𝑟𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘 (Ganjar dan Rohman, 2007). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 37 Warna bercak dan harga Rf sampel dibandingkan dengan standar pembanding. Bila warna bercak dan harga Rf mendekati pembanding, menunjukkan komponen senyawa kimia sampel sama dengan pembanding. standar PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Identifikasi Bahan Tanaman Macaranga tanarius (L.) M. A. Penelitian ini menggunakan daun Macaranga tanarius (L.) M. A. yang berasal dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Identifikasi bahan tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini. Identifikasi dilakukan dengan mencocokkan ciri morfologi tanaman seperti daun, batang, bunga dan buah menurut pustaka acuan yaitu Backer, C. A. and Bakhuizen van den Brink, (1983). A B Gambar 4. Tanaman (A) dan daun segar (B) M. tanarius Berdasarkan hasil determinasi tanaman didapatkan hasil bahwa benar tanaman yang digunakan merupakan tanaman Macaranga tanarius (L.) M. A. (Lampiran 1). 38 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 39 B. Pengumpulan Bahan Daun M. tanarius yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang dipetik dalam kondisi segar pada bulan Juli-Agustus 2013. Dipilih daun yang berwarna hijau segar agar didapatkan kandungan senyawa yang optimal. Daun yang diambil berada di tengah batang, tidak terlalu atas agar tidak terlalu muda dan tidak terlalu bawah agar tidak terdapat daun yang terlalu tua. Daun yang masih muda dimungkinkan kandungan senyawa didalamnya belum optimal, sedangkan daun yang terlalu tua dikhawatirkan kandungan senyawa yang terdapat didalamnya sudah mulai berkurang (Departeman Kesehatan Republik Indonesia, 1985). Selain itu dipilih daun yang terbebas dari hama, serangga maupun pengotor agar toksin yang dihasilkan tidak mempengaruhi hasil dari penelitian ini. Daun yang didapatkan kemudian disortir untuk mendapatkan daun yang sesuai dengan kriteria. Daun dicuci dibawah air mengalir agar kotoran tidak lagi menempel pada daun selanjutnya daun yang telah dibersihkan siap untuk dikeringkan. C. Pengeringan Bahan dan Pembuatan Serbuk Daun M. tanarius Pengeringan bahan daun M. tanarius bertujuan untuk mengurangi kadar air agar terhindar dari pertumbuhan mikroba yang dapat menyebabkan rusaknya simplisia dalam proses penyimpanan. Pengeringan juga bertujuan menginaktifkan enzim-enzim yang terkandung dalam tumbuhan. Hal ini untuk mencegah peruraian senyawa kimia oleh enzim-enzim tersebut (Departeman Kesehatan Republik Indonesia, 1985). Pengeringan daun M. tanarius dilakukan dibawah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 40 sinar matahari dengan ditutup kain berwarna hitam. Pengeringan dilanjutkan dalam oven suhu 36˚C hingga daun dapat hancur ketika diremas. Pengeringan dengan oven dapat mengatur suhu, kelembaban dan aliran udara dalam proses pengeringan simplisia. Hal ini agar simplisia yang didapatkan dapat kering lebih merata dengan waktu lebih cepat tanpa bergantung cuaca sehingga simplisia yang didapatkan pun dapat memiliki mutu lebih baik. Daun yang mudah hancur ketika diremas menandakan daun sudah kering dan siap untuk masuk ke tahap berikutnya yaitu penyerbukan. Setelah proses pengeringan, didapatkan 529 g daun kering dari 1,51 kg daun segar. Daun dibuat serbuk dengan alat grinder. Sebelum masuk grinder daun lebih dulu diremas untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil sehingga mempermudah proses penyerbukan. Hasil dari penyerbukan dikumpulkan dan diayak dengan pengayak nomor mesh 40. Penyerbukan dan pengayakan bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga permukaan yang kontak dengan penyari akan semakin luas. Hal ini agar kandungan kimia yang terlarut dalam penyari dapat lebih banyak. Serbuk yang terlalu halus dapat mempersulit proses penyarian dan penyarian (Departeman Kesehatan Republik Indonesia, 1985). Oleh karena itu digunakan pengayak dengan nomor mesh 40 untuk mendapatkan serbuk yang sesuai. Serbuk yang didapatkan disimpan dalam wadah tertutup rapat dan kedap udara hingga akan digunakan agar terhindar dari pengotor maupun pertumbuhan bakteri dan jamur. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 41 D. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun M. tanarius Metode yang dipilih dalam ekstraksi adalah maserasi. Maserasi dipilih karena dalam pembuatan ekstrak mengikuti ketentuan Farmakope Herbal Indonesia yaitu membuat ekstrak dari serbuk sering simplisia dengan metode maserasi menggunakan pelarut yang sesuai (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2009). Ekstraksi menggunakan metode maserasi lebih sederhana, tidak terlalu banyak menggunakan pelarut dan karena tidak menggunakan proses pemanasan maka zat aktif didalamnya dapat terjaga. Digunakan pelarut etanol 70% yang dapat menyari sebagian besar metabolit sekunder yang terkandung dalam serbuk simplisia (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1985). Perbandingan serbuk dengan penyari yang digunakan 1 : 10. Etanol 70% sangat efektif dalam menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal (Voight, 1995). Etanol telah dikenal sebagai pelarut yang mampu mengekstraksi komponen yang memiliki aktivitas antimikroba (Bala, et al., 2011). Etanol dapat melarutkan komponen antimikroba dalam daun M. tanarius seperti senyawa fenolik, flavonoid, tanin, dan saponin (Harborne, 1987). Maserasi (macerase = mengairi, melunakkan) adalah cara ekstraksi yang paling sederhana. Bahan simplisia yang telah dihaluskan disatukan dengan bahan pengekstraksi. Selanjutnya rendaman tersebut disimpan terlindung dari cahaya langsung untuk mencegah reaksi dikatalisis cahaya atau perubahan warna. Pemilihan waktu lamanya maserasi dapat berbeda-beda, namun waktu lima hari dirasa memadai untuk memungkinkan berlangsungnya proses dasar maserasi. Prinsip maserasi adalah pelarutan bahan kandungan simpilisia dari sel yang sudah PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42 rusak dan difusi bahan kandungan dari sel yang masih utuh. Maserasi selesai berarti keseimbangan antara bahan yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan yang masuk dalam cairan telah tercapai, maka proses difusi akan segera berakhir. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (± tiga kali sehari) agar keseimbangan konsentrasi bahan ekstraktif yang lebih cepat dalam cairan. Keadaan diam selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif. Secara teoritis, pada suatu maserasi tidak memungkinkan ekstraksi absolute. Semakin besar perbandingan simplisia dengan pelarut maka semakin banyak hasil yang diperoleh (Voight, 1995). Ekstrak kental ditimbang hingga bobot tetap untuk memastikan pelarut benar-benar hilang. Penimbangan dinyatakan sudah mencapai bobot tetap apabila perbedaan dua kali penimbangan berturut-turut setelah dikeringkan selama 1 jam tidak lebih dari 0,25% atau perbedaan penimbangan seperti tersebut diatas tidak melebihi 0,5 mg pada penimbangan dengan timbangan analitik (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2009). Pada proses maserasi dilakukan replikasi tiga kali, dengan jumlah serbuk yang sama, yaitu 30 g dan pelarut etanol 70% dengan perbandingan yang sama serta perlakuan yang sama. Didapatkan ekstrak sebanyak 5,29 g; 5 g; dan 4,71 g yang selanjutnya masing – masing dibuat seri konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80% (50 mg/mL, 100 mg/mL, 200 mg/mL, 400 mg/mL, dan 800 mg/mL). Berdasarkan hasil tersebut, rendemen yang didapatkan 16,7%. Ekstrak tersebut digunakan untuk uji potensi antibakteri, uji KHM KBM dan uji kualitatif kromatografi lapis tipis (KLT). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 43 E. Uji Fitokimia Daun M. tanarius Pada penelitian ini dilakukan uji fitokimia daun M. tanarius untuk mengetahui kandungan senyawa yang terdapat dalam daun M. tanarius. Berdasarkan penelitian skrining fitokimia yang dilakukan sebelumnya, pada daun M. tanarius terdapat kandungan turunan flavonoid yang memiliki aktivitas antibakteri. Pada skrining fitokimia ini dilakukan uji tabung dan uji KLT. 1. Uji pendahuluan Uji pendahuluan dilakukan untuk mengetahui apakah senyawa yang terkandung dalam daun M. tanarius memiliki gugus kromofor atau gugus hidrofilik. Berdasarkan hasil uji tabung didapatkan larutan kemerahan yang dengan penambahan KOH LP warna menjadi lebih intensif (Gambar 5). Hal ini menunjukkan dalam daun M. tanarius terdapat gugus kromofor seperti flavonoid, antrakinon, dan lainnya atau gugus hidrofilik seperti gula, asam fenolat, dan lainnya (Herlianawati, 2007). Filtrat penambahan KOH LP Gambar 5. Hasil uji pendahuluan serbuk daun M. tanarius PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 44 2. Uji senyawa fenolik Senyawa fenolik merupakan senyawa yang larut air sehingga untuk melarutkannya dilakukan pemanasan dengan air. Filtrat M. tanarius ditambahkan 3 tetes besi (III) klorida. Terjadi warna hijau-biru menunjukkan adanya senyawa fenolik. Berdasarkan hasil uji tabung didapatkan warna biru gelap (kehitaman) setelah penambahan besi (III) klorida (Gambar 6). Hal ini menunjukan adanya kandungan senyawa fenolik dalam daun M. tanarius. Filtrat penambahan besi (III) klorida Gambar 6. Hasil uji tabung senyawa fenolik serbuk daun M. tanarius Untuk memastikan kandungan senyawa fenolik, dilakukan uji KLT terhadap ekstrak etanol daun M. tanarius. Uji kandungan senyawa fenolik dilakukan dengan menggunakan plat KLT silika gel 60F254 dan fase gerak etil asetat : asam formiat : toluene : air (6 : 1,5 : 2 : 1). Standar yang digunakan adalah asam gallat. Plat KLT ditotol dengan ekstrak etanol daun M. tanarius yang dilarutkan dalam etanol 70% menggunakan pipa kapiler. Senyawa dielusi hingga mencapai batas (8 cm) dalam fase gerak. Setelah elusi diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm. Untuk senyawa fenolik, pendeteksian digunakan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 45 pereaksi besi (III) klorida yang menunjukkan hasil positif bila berwarna hitam (Marliana, 2007) (Tabel II). Tabel II. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak daun M. tanarius Senyawa Uji Hasil Rf Asam Gallat 0,80 Sampel 0,71 Sebelum Disemprot Sinar UV UV 365 Tampak 254 Coklat Ungu ungu muda kebiruan Coklat Ungu ungu muda kebiruan Setelah Disemprot Sinar UV UV 365 Tampak 254 Hitam Ungu ungu kelabu kebiruan Hitam Ungu ungu kelabu kebiruan Gambar 7. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak daun M. tanarius sebelum disemprot pereaksi besi (III) klorida dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm Keterangan : S : Sampel P : Senyawa pembanding PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 46 Gambar 8. Hasil uji KLT senyawa fenolik ekstrak daun M. tanarius setelah disemprot pereaksi besi (III) klorida dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm Keterangan : S : Sampel P : Senyawa pembanding Berdasarkan hasil KLT, didapatkan nilai Rf senyawa pembanding asam gallat 0,80 dan sampel 0,87. Bercak yang diperoleh pada pembanding dan sampel berwarna coklat muda. Pada UV 254 nm pembanding dan sampel menghasilkan bercak berwarna ungu, sedangkan pada UV 365 nm keduanya berwarna ungu kebiruan. Setelah penyemprotan dengan besi (III) klorida didapatkan bercak hitam kelabu pada pembanding dan sampel. Pada UV 254 nm pembanding dan sampel menghasilkan warna ungu sedangkan pada UV 365 nm keduanya berwarna ungu kebiruan. Nilai Rf yang mendekati dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 47 karakterisasi senyawa yang serupa menunjukkan hasil positif. Hal ini menunjukkan sampel memiliki senyawa fenolik. Reaksi warna yang terjadi ketika senyawa fenolik direaksikan dengan besi (III) klorida. Gambar 9. Reaksi pembentukan warna pada senyawa fenolik dengan besi (III) klorida (Herlianawati, 2007). 3. Uji flavonoid Serbuk daun M. tanarius dilarutkan dalam natrium hidroksida. Bila terjadi pembentukan intensitas warna kuning dan dengan penambahan asam klorida intensitas warna kuning berubah, menunjukkan adanya flavonoid. Hasil dari uji tabung terhadap kandungan flavonoid menunjukkan terjadi intensitas warna kuning setelah dilarutkan natium hidroksida dan dengan penambahan asam klorida terjadi perubahan intensitas warna (Gambar 10). Hal ini menunjukkan adanya kandungan flavonoid dalam daun M. tanarius. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 48 Penambahan natrium hidroksida penambahan asam klorida Gambar 10. Hasil uji tabung flavonoid serbuk daun M. tanarius Reaksi antara flavonoid dengan natrium hidroksida akan membentuk kinoid yang berwarna kemerahan dan dengan penambahan akan kembali seperti semula. Gambar 11. Reaksi flavonoid dengan natrium hidroksida Untuk memastikan kandungan flavonoid, dilakukan KLT terhadap ekstrak etanol daun M. tanarius. Fase diam yang digunakan silika gel 60F254 dan fase gerak etil asetat - asam formiat - asam asetat - air (100 : 11 : 11 : 27). Identifikasi flavonoid dilakukan dengan senyawa pembanding rutin (kuersetin3-rutinosida) yang merupakan glikosida flavonol karena merupakan jenis flavonoid yang paling sering dijumpai pada pemeriksaan flavonoid, banyak terdapat dalam tumbuhan dan tersebar luas dalam pigmen tanaman (Harborne, 1987). Senyawa dielusi hingga mencapai batas (8 cm) dalam fase gerak. Setelah proses elusi selesai, diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm. Menurut PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 49 Schneider (cit., Meiyanto, dkk., 2011), hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan bercak warna kuning setelah disemprot sitroborat pada sinar tampak (Tabel III). Tabel III. Hasil uji KLT flavonoid ekstrak daun M. tanarius Senyawa Uji Hasil Rf Rutin 0,97 Sampel 0,41 Sebelum Disemprot Sinar UV 254 UV 365 Tampak Kuning Ungu Ungu muda kebiruan Kuning Ungu Ungu muda kebiruan Setelah Disemprot Sinar UV UV 365 Tampak 254 Kuning Ungu ungu kecoklatan kebiruan Kuning Ungu ungu kecoklatan kebiruan Gambar 12. Hasil uji KLT flavonoid ekstrak daun M. tanarius sebelum disemprot pereaksi sitroborat dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm Keterangan : S : Sampel P : Senyawa pembanding PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 50 Gambar 13. Hasil uji KLT flavonoid ekstrak daun M. tanarius setelah disemprot pereaksi sitroborat dilihat pada sinar tampak, UV 254 dan 365 nm Keterangan : S : Sampel P : Senyawa pembanding Berdasarkan hasil KLT, didapatkan nilai Rf senyawa pembanding rutin 0,97 dan sampel 0,41. Bercak yang diperoleh pada pembanding dan sampel berwarna kuning muda. Pada UV 254 nm pembanding dan sampel menghasilkan bercak berwarna ungu, sedangkan pada UV 365 nm keduanya berwarna ungu kebiruan. Setelah penyemprotan dengan sitroborat didapatkan bercak berwarna kuning kecoklatan pada pembanding dan sampel. Pada UV 254 nm pembanding dan sampel menghasilkan warna ungu sedangkan pada UV 365 nm keduanya berwarna ungu kebiruan. Nilai Rf yang didapatkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 51 cukup jauh, hal ini dapat dikarenakan fase gerak yang digunakan merupakan campuran senyawa semipolar dan polar. Setelah dilakukan elusi, sampel diduga merupakan senyawa semipolar karena memiliki nilai Rf yang cukup jauh dengan pembanding yang bersifat polar. Rutin merupakan glikosida flavonoid yang bersifat polar sedangkan sampel diduga merupakan aglikon flavonoid yang bersifat lebih semipolar. Pendeteksian menggunakan sitroborat menunjukkan warna bercak yang serupa antara sampel dengan pembanding yaitu berwarna kuning kecoklatan. Sampel dapat dikatakan mengandung flavonoid, namun memiliki jenis yang berbeda dengan pembanding. Penampak noda asam sitroborat dengan flavonoid diduga membentuk ikatan pada kedudukan lain ketika dilakukan pemanasan. Reaksi yang terjadi antara sitroborat dan flavonoid belum diketahui secara pasti (Daniel, 2010). Gambar 14. Perkiraan reaksi flavonoid dengan sitroborat (Mulyani dan Laksana, 2011) 4. Uji tanin Serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 mL aquadest, disaring lalu sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan natrium klorida 2% (1 mL). Bila terjadi endapan atau suspensi kemudian disaring. Filtrat hasil penyaringan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 52 ditambahkan larutan gelatin 1% sebanyak 5 mL, bila terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin. Berdasarkan hasil uji tabung, didapatkan adanya endapan atau suspensi setelah penambahan natrium klorida 2%. Setelah disaring dan ditambahkan gelatin 1% juga terdapat endapan (Gambar 15). Hal ini menunjukkan adanya kandungan tanin dalam daun M. tanarius. Hal ini didukung dengan hasil KLT senyawa fenolik yang menunjukkan hasil positif karena tanin juga merupakan senyawa fenolik. Filtrat Penambahan natrium klorida 2% Penambahan gelatin 1% Gambar 15. Hasil uji tabung tanin serbuk daun M. tanarius Adanya tanin akan mengendapkan protein pada gelatin. Tanin bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam air. Reaksi ini lebih sensitif dengan penambahan natrium klorida untuk mempertinggi penggaraman dari tanin-gelatin (Marliana, Suryanti, dan Suyono, 2005). 5. Uji alkaloid Serbuk daun M. tanarius ditambahkan 1 mL asam klorida 2N dan 9 mL air. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 53 2 tetes Bourchadat LP. Bila terdapat endapan maka menunjukkan alkaloid golongan II. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan 2 tetes Mayer LP membentuk endapan maka menunjukkan alkaloid golongan III. Berdasarkan hasil uji tabung tidak didapatkan endapan setelah filtrat ditetesi dengan Bourchadat LP, begitu pula pada penambahan Mayer LP tidak didapatkan adanya endapan (Gambar 16). Hal ini menunjukkan tidak terdapat kandungan alkaloid golongan II dan golongan III. Golongan II Filtrat penambahan Bourchadat LP tidak ada endapan Golongan III Penambahan Mayer LP tidak ada endapan putih Gambar 16. Hasil uji tabung alkaloid golongan II dan III serbuk daun M. tanarius PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 54 Hasil positif alkaloid golongan III dengan pereaksi Mayer ditandai dengan terbentuknya endapan putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah kompleks kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Mayer LP, larutan merkurium (II) klorida ditambah kalium iodida akan bereaksi membentuk endapan merah merkurium (II) iodida. Jika kalium iodida yang ditambahkan berlebih maka akan terbentuk kalium tetraiodomerkurat (II) (Svehla cit., Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005). Alkaloid mengandung atom nitrogen yang mempunyai pasangan elektron bebas sehingga dapat digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan ion logam (McMurry, cit., Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005). Pada uji alkaloid dengan pereaksi Mayer, diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodomerkurat (II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005). Gambar 17. Perkiraan reaksi uji Mayer (Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005) Hasil positif alkaloid pada uji Bouchardat ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda sampai kuning. Diperkirakan endapan tersebut adalah kalium-alkaloid. Pada pembuatan pereaksi Bouchardat LP, iodin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 55 bereaksi dengan ion I- dari kalium iodida menghasilkan ion I3- yang berwarna coklat. Pada uji Bouchardat, ion logam K+ akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan nitrogen pada alkaloid, membentuk kompleks kaliumalkaloid yang mengendap (Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005). Gambar 18. Perkiraan reaksi uji Bouchardat (Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005) 6. Uji saponin Daun M. tanarius sebanyak 2 gram ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan dan dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Dilakukan perbandingan dengan lerak yang sudah diketahui pasti memiliki saponin dengan perlakuan yang sama. Terbentuknya buih selama ±10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan pada penambahan satu tetes asam klorida 2N buih tidak hilang maka menunjukkan positif adanya saponin. Berdasarkan hasil uji tabung, didapatkan buih yang bertahan ± 10 menit dengan tinggi lebih dari 3 cm pada daun M. tanarius dan dengan penambahan kalium hidroksida buih tidak mengalami perubahan (Gambar 19). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 56 Setelah penggojogan setelah didiamkan 10 menit dan ditambah KOH Gambar 19. Hasil uji saponin serbuk daun M. tanarius Timbulnya busa pada uji saponin menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya (Rusdi, cit., Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005). Gambar 20. Reaksi hidrolisis saponin dalam air (Marliana, Suryanti, dan Suyono 2005) Untuk memastikan kandungan saponin dalam ekstrak etanol daun M. tanarius, dilakukan uji hemolisis menggunakan media BAP. Ekstrak diteteskan dalam lubang sumuran dan setelah didiamkan selama 24 jam terlihat area PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 57 sekitar lubang sumuran pada setiap konsentrasi berubah warna menjadi kuning (Gambar 21). Hal ini disebabkan karena saponin memiliki kemampuan hemolisis (melisiskan sel darah merah) (Zhang cit., Pranoto, Ma’ruf, dan Pringgenies, 2012). Saponin dapat membentuk kompleks dengan sterol membran eritrosit, sehingga menyebabkan peningkatan permeabilitas dan selanjutnya kehilangan hemoglobin (Wang, et al., 2007). A B Gambar 21. Media BAP sebelum perlakuan (A), hasil uji hemolisis saponin ekstrak etanol daun M. tanarius (B) Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang kuat dan menimbulkan busa bila dikocok dalam air. Pada konsentrasi yang rendah, sering menyebabkan hemolisis pada sel darah merah (Robinson, 1991). Berdasarkan hasil uji tabung, didapatkan busa ketika serbuk di kocok dengan air. Selain itu, ketika ekstrak etanol daun M. tanarius diteteskan pada media BAP terjadi hemolisis. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat kandungan saponin dalam daun M. tanarius. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 58 F. Identifikasi Bakteri Streptococcus pyogenes Kultur bakteri Streptococcus pyogenes berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta (Lampiran 6). Untuk memastikan kebenaran bakteri yang didapatkan, dilakukan identifikasi secara sederhana dengan melakukan streak plate pada media BAP. S. pyogenes termasuk dalam grup A hemolitik streptococcus. Bakteri ini memiliki kemampuan homolisis sehingga identifikasi dilakukan dengan media BAP untuk melihat kemampuan hemolisis. Streptococcus memiliki bentuk kokus berantai, anggota rantai sering memberikan gambaran diplokokus (Jawetz, Melnick and Adelbergha, 1984). Koloni streptococcus kecil, bening, bulat, dengan garis tengah kurang dari 1 mm dan cembung. Pada koloni dapat ditemukan bentuk koloni mukoid, licin atau mengkilap dan bentuk kasar atau tidak mengkilap. Streptococcus grup A β-hemolitik berwarna putih kelabu pada media agar darah (Bonang dan Koeswardono, 1982). A B Gambar 22. Media BAP sebelum distreak dengan bakteri (A), media BAP yang sudah distreak bakteri S. pyogenes diinkubasi selama 24 jam (B). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 59 Gambar 23. Bentuk koloni bakteri S. pyogenes yang ditanam dalam media BAP Berdasarkan hasil identifikasi, bakteri S. pyogenes yang ditanam dalam media BAP secara streak plate membentuk warna putih keruh setelah diinkubasi selama 24 jam (Gambar 23), sedangkan media yang tidak ditanami bakteri tetap berwarna merah. Hal ini menunjukkan kemampuan hemolisis yang merupakan ciri spesifik bakteri S. pyogenes. Bentuk koloni yang dihasilkan kokus berantai, kecil, bening, bulat, dan cembung dengan permukaan tidak mengkilap. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang didapatkan dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta merupakan bakteri Streptococcus pyogenes. G. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap Bakteri S. pyogenes Uji potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius dilakukan dengan metode difusi sumuran. Ekstrak dilarutkan dalam aquadest steril dengan seri konsentrasi 5%, 10%, 20%, 40%, dan 80% yang. Penentuan seri konsentrasi ekstrak mengacu pada penelitian yang sudah dilakukan oleh Lim, et al., (2009). Dalam penelitian tersebut, digunakan ekstrak daun M. tanarius yang disari PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 60 menggunkan metanol 100% dengan konsentrasi ekstrak 1%. Pada penelitian ini konsentrasi ekstrak yang digunakan dimulai dari konsentrasi 5%. Perbedaan metode pengeringan, ekstraksi dan jenis penyari dengan penelitian sebelumnya dapat memberikan hasil yang berbeda, oleh karena itu konsentrasi pada penelitian ini ditingkatkan. Berdasarkan hasil orientasi, konsentrasi 80% adalah konsentrasi tertinggi ekstrak dapat larut dalam aquadest, sehingga konsentrasi 80% digunakan sebagai konsentrasi tertinggi. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media NA. Media NA dipilih karena memiliki kandungan nutrisi yang lengkap bagi pertumbuhan bakteri. Kandungan nutrisi tersebut antara lain pepton, NaCl, yeast extract, dan beef extract. Media ini dapat digunakan untuk berbagai jenis mikroorganisme (Atlas, 1996). Pada penelitian ini digunakan kontrol negatif aquadest yang merupakan pelarut ekstrak dan kontrol positif amoxicillin 25 mg/ml. Kontrol negatif digunakan untuk melihat apakah aquadest sebagai pelarut turut memberikan pengaruh pada zona hambat yang terbentuk. Sedangkan kontrol positif yang digunakan Amoxicilin dipilih karena sering digunakan dalam pengobatan kasus radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri. Selain itu, menurut teori Amoxicilin dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. pyogenes (Finch, Greenwood, Norrby, and Whitley, 2010). Antibiotik ini merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif. Mekanisme kerjanya dengan mencegah ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan menghambat protein pengikat penisilin yang terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 61 peptidoglikan dinding sel bakteri dan mencegah aktivitas enzim transpeptidase yang membungkus ikatan silang polimer gula yang membentuk dinding sel sehingga dinding sel menjadi rapuh dan mudah lisis (Pratiwi, 2009). Dalam penelitian ini dilakukan replikasi sebanyak tiga kali, dari setiap replikasi tersebut dilakukan repetisi tiga kali. Dari hasil pengamatan didapatkan zona hambat yang diukur menggunakan jangka sorong dengan satuan milimeter (mm). Pengukuran dilakukan secara vertikal, horizontal dan diagonal, kemudian dari tiga kali pengukuran tersebut hasilnya dirata-rata. Hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes disajikan secara lengkap dalam Lampiran 9. Gambar 24. Hasil uji difusi ekstrak daun M. tanarius terhadap Streptococcus pyogenes dengan metode difusi sumuran Keterangan : A = Konsentrasi 80% B = Konsentrasi 40% C = Konsentrasi 20% D = Konsentrasi 10% E = Konsentrasi 5% + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 62 Hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes diringkas dalam Tabel IV. Tabel IV. Hasil pengukuran zona hambat dalam milimeter (mm) Konsentrasi Replikasi 1 (Mean±SD) 13±0,81 14±0,95 18±0,53 24±2,40 Replikasi 2 (Mean±SD) 12±0,05 13±0,68 17±0,43 27±2,84 Replikasi 3 (Mean±SD) 12±0,18 14±0,24 18±1,40 25±2,97 Total (Mean±SD) 12±0,84 a 14±0,50 a 18±0,28 b 25±1.61 c 5 10 40 Kontrol + 6 6 6 6d Kontrol Keterangan: *Repetisi tiap replikasi sebanyak 3 kali *Diameter lubang sumuran 6 mm *Angka-angka yang diikuti oleh huruf sama, berbeda tidak bermakna berdasarkan uji T tidak berpasangan pada taraf p<0,05 Berdasarkan data tersebut, zona hambat yang ditunjukkan berasal dari kemampuan ekstrak. Pelarut tidak memberikan pengaruh terhadap zona hambat yang terbentuk, ditunjukkan dengan nilai kontrol negatif yang seluruhnya bernilai nol ketika sudah dikurangi lubang sumuran. Data zona hambat yang didapatkan selanjutnya dilakukan analisis hasil secara statistik. Analisis hasil secara statistik bertujuan untuk melihat adanya potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes. Data dianalisis normalitas distribusi menggunakan uji Shapiro Wilk. Royston (1995), mengatakan bahwa jumlah data antara 3 hingga 5000 dapat dianalisis menggunakan Shapiro Wilk. Dari uji Shapiro Wilk didapatkan hasil data tidak terdistribusi normal (Lampiran 10). Data yang tidak normal, yaitu konsentrasi 20% dan 80% tidak diikut sertakan dalam analisis statistik selanjutnya. Selanjutnya dilakukan uji Levene untuk mengetahui variasi data (Lampiran 11). Pada hasil uji Levene didapatkan variasi data homogen PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 63 (p>0,05) sehingga dapat dilanjutkan uji Anava Satu Arah untuk mengetahui berbeda bermakna. Berdasarkan uji Anava Satu Arah didapatkan nilai p<0,05 sehingga terdapat data yang berbeda bermakna secara statistik (Lampiran 12). Untuk mengetahui kelompok data yang memiliki perbedaan bermakna maka dilakukan uji T tidak berpasangan yang didahului uji varian. Uji varian berguna untuk melihat variansi antar 2 kelompok data. Nilai p<0,05 menunjukkan variansi kedua kelompok tidak homogen sedangkan nilai p>0,05 menunjukkan variansi kedua kelompok homogen (Lampiran 13). Setelah uji varian dilanjutkan uji T tidak berpasangan antar dua kelompok data dimana nilai p<0,05 menunjukkan berbeda bermakna antar dua kelompok data. Berdasarkan hasil uji T tidak berpasangan didapatkan hampir seluruh kelompok data berbeda bermakna, kecuali antara konsentrasi 5% dengan 10% (Lampiran 14). Berdasarkan hasil analisis statistik tersebut antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol negatif berbeda bermakna. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki potensi daya antibakteri terhadap S. pyogenes. Selain itu, antar variasi konsentrasi uji juga berbeda bermakna, maka menunjukkan semakin besar konsentrasi uji memberikan aktivitas antibakteri yang berbeda pula. Namun pada konsentrasi 5% dengan 10% menunjukkan hasil statistik berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukkan konsentrasi 5% memiliki kemampuan yang sama dengan konsentrasi 10% dalam penghambatan bakteri S. pyogenes. Pada perbandingan antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol positif didapatkan hasil statistik berbeda bermakna. Artinya aktivitas antibakteri PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 64 yang ditunjukkan ekstrak etanol daun M. tanarius tidak sebesar antibakteri dari Amoxicilin. Hal ini dapat disebabkan karena ekstrak merupakan campuran dari berbagai senyawa, dimana senyawa yang aktif sebagai antibakteri bercampur dengan senyawa yang tidak aktif sebagai antibakteri. Dapat pula senyawa tersebut bercampur dengan senyawa yang bersifat antagonis sehingga meniadakan aktivitas antibakteri atau dapat juga bercampur dengan senyawa yang sinergis namun jumlahnya tidak cukup untuk memberikan aktivitas antibakteri. Perlu penelaahan lebih lanjut untuk mengetahui kandungan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri dan interaksi kandungan senyawa yang terdapat dalam ekstrak. Selain itu, adanya kemungkinan difusi senyawa terhalangi sehingga tidak dapat memberikan aksi penghambatan. Sedangkan Amoxicilin yang merupakan turunan penisilin telah lama terbukti memiliki daya antibakteri dengan spektrum luas. Senyawa yang terkandung didalamnya telah terisolasi menjadi senyawa tunggal serta telah melalui berbagai pengujian sehingga efek penghambatannya teruji. Menurut David (cit., Moerfiah dan Supomo, 2011), ketentuan antibakteri sebagai berikut : 1. Sangat kuat (diameter zona hambat ≥20 mm) 2. Kuat (diameter zona hambat 10-20 mm) 3. Sedang (diameter zona hambat 5-10 mm) 4. Lemah (diameter zona hambat ≤ 5 mm) Berdasarkan ketentuan tersebut zona hambat yang terbentuk ketika sudah dikurangi lubang sumuran (6 mm) termasuk dalam kekuatan antibakteri sedang PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 65 hingga kuat yakni rata-rata 6 hingga 13 mm. Kontrol positif Amoxicilin termasuk dalam kekuatan antibakteri kuat karena memiliki rata-rata 19 mm (Lampiran 9). Rata-rata Diameter Zona Hambat 25,00 20,00 Diameter 15,00 Zona Hambat (mm±SD) 10,00 Rata-rata Diameter Zona Hambat 5,00 0,00 kontrol - 5 10 40 kontrol + Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius Gambar 25. Diagram rata-rata diameter zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes Aktivitas antibakteri yang muncul dikarenakan kandungan senyawa fenolik, flavonoid, tanin dan saponin yang terkandung dalam ekstrak daun M. tanarius. Turunan fenol berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah terbentuk kompleks protein fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan prespitasi serta denaturasi protein. Pada kadar tinggi fenol menyebabkan koagulasi protein dan sel membran mengalami lisis (Parwata dan Dewi, 2008). Senyawa fenolik memiliki mekanisme kerja dalam menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara inaktivasi protein (enzim) pada membran sel. Fenol berikatan dengan protein melalui ikatan hidrogen sehingga mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Dimana sebagian besar struktur dinding sel dan membran sitoplasma bakteri mengandung protein dan lemak. Ketidakstabilan pada dinding sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 66 fungsi permeabilitas selektif, fungsi pengangkutan aktif, pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi terganggu yang akan berakibat pada lolosnya makromolekul dan ion dari sel, sehingga sel bakteri menjadi kehilangan bentuknya dan terjadilah lisis (Susanti, 2008). Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom. Ion hidroksil secara kimia menyebabkan perubahan komponen organik dan transpor nutrisi sehingga menimbulkan efek toksik terhadap sel bakteri (Sabir, 2003). Cincin B pada flavonoid dapat menyebabkan interkalasi atau ikatan hidrogen dengan susunan asam nukleus basa, hal ini menjelaskan aksi penghambatan pada sintesis DNA dan RNA pada bakteri. Aktivitas antibakteri dari flavonoid juga dilakukan dengan pengurangan fluiditas membran pada sel bakteri dan penghambatan metabolisme energi pada bakteri (Cushnie and Lamb, 2005). Mekanisme tanin menghambat bakteri belum dijelaskan secara jelas, namun Akiyama, et al., (2001) meringkas mekanisme antimikroba dari tanin yaitu, (i) zat astringent pada tanin dapat menginduksi kompleksasi dengan enzim dan substrat, berbagai enzim mikrobial mengalami penghambatan ketika dicampur dengan tanin, (ii) toksisitas tanin erat kaitannya dengan aksi pada membran mikroorganisme, dan (iii) kompleksasi logam ion pada tanin dapat merusak membran sitoplasma dari bakteri. Aktivitas biologis tanin mungkin ditentukan oleh konfigurasi spasial dari gugus ortho- phenolic hydroxyl. Tanin telah terbukti mengganggu integritas membran karena menyebabkan kebocoran PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 67 dari liposom. Aktivitas tanin lebih rendah pada bakteri Gram negatif oleh adanya lipopolisakarida pada permukaan sel bakteri Gram negatif. Hal ini menyebabkan bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap efek bakterisida tanin dibanding bakteri Gram negatif (Smith, Imlay, and Mackie, 2003). Saponin memiliki sifat seperti deterjen dan mungkin meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri tanpa menghancurkan bakteri tersebut. Secara teori, hal ini mungkin memfasilitasi masuknya zat antibakteri melalui membran dinding sel bakteri Saponin dapat mengganggu permeabilitas pada lapisan terluar membran. Pada bakteri Gram negatif, lapisan terluar membran dilapisi oleh lipopolisakarida. Saponin hanya berikatan pada bagian Lipid A dan dapat meningkatkan permeabilitas membran pada bakteri Gram negatif (Arabski et al., 2012). Hardiningtyas (cit., Pranoto, Ma’ruf, dan Pringgenies, 2012) menambahkan, saponin merupakan golongan senyawa yang dapat menghambat atau membunuh mikroba dengan cara berinteraksi dengan membran sterol. Efek utama saponin terhadap bakteri adalah adanya pelepasan protein dan enzim dari dalam sel. H. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap Bakteri S. pyogenes Penentuan KHM dan KBM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil ekstrak yang mampu menghambat dan membunuh bakteri. Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan metode dilusi padat menggunakan range konsentrasi hasil dari uji potensi. Berdasarkan hasil uji potensi, didapatkan konsentrasi terkecil (5%) masih memiliki zona hambat. Dibuat seri konsentrasi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 68 untuk menentukan KHM dan KBM dengan konsentrasi 5% sebagai konsentrasi tengah sehingga seri konsentrasi yang didapatkan 1,5% ; 3,5% ; 5% ; 6,5% dan 8,5%. Seri konsentrasi tersebut direplikasi tiga kali menggunakan ekstrak yang sama dengan uji difusi. Hasil dari penentuan KHM dan KBM ini dibandingkan kekeruhannya dengan kontrol positif dan kontrol negatif. Kekeruhan menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri sedangkan media yang jernih menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri. Media yang sangat keruh diberi notasi +++, keruh ++ dan media yang jernih diberi notasi – untuk memudahkan pengamatan. Tabel V. Hasil uji KHM dan KBM ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap S. pyogenes Konsentrasi 1,5% 3,5% 5% 6,5% 8,5% Kontrol + Kontrol - Kekeruhan Replikasi Replikasi Replikasi 1 2 3 + + + ++ ++ ++ Keterangan: : jernih + : keruh ++ : agak keruh +++ : sangat keruh Berdasarkan hasil pengujian pada ketiga replikasi didapatkan konsentrasi 1,5% dari ketiga replikasi masih keruh namun tidak sekeruh kontrol negatif. Selanjutnya media yang jernih dengan dua konsentrasi terkecil dilakukan uji penegasan dengan metode streak plate. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 69 I. Uji Penegasan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius dengan Streak Plate Hasil dari dilusi padat selanjutnya dilakukan uji penegasan untuk mengetahui KHM dan KBM. Cawan petri yang tidak terdapat pertumbuhan bakteri (dipilih dua konsentrasi terkecil) dilakukan uji penegasan. Uji penegasan dilakukan tiga kali sesuai dengan replikasi yang dilakukan pada uji dilusi. Uji penegasan dilakukan dengan menggoreskan ose pada permukaan media kemudian dilakukan streak plate pada media NA steril secara zig-zag. Diinkubasi selama 24 jam dan diamati, bila masih terdapat pertumbuhan bakteri disekitar goresan streak plate maka menunjukkan KHM, sedangkan bila tidak terdapat pertumbuhan bakteri di sekitar goresan streak plate maka menunjukkan KBM. A B Gambar 26. Hasil penegasan uji KHM dan KBM konsentrasi 3,5%(A) dan 5%(B) Berdasarkan hasil pengamatan didapatkan hasil konsentrasi 3,5% masih terdapat pertumbuhan bakteri pada ketiga replikasi sehingga konsentrasi 3,5% dinyatakan sebagai KHM, sedangkan konsentrasi 5% pada ketiga replikasi tidak menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri sehingga dinyatakan sebagai KBM (Lampiran 16). PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 70 Menurut Aligiannis et al., (cit., Diaz, et al., 2010), suatu senyawa memiliki aktivitas antibakteri yang kuat bila nilai KHM berkisar antara 0,05 - 0,50 mg/mL, aktivitas sedang bila nilai KHM antara 0,6 - 1,50 mg/mL dan aktivitasnya dikatakan lemah bila memiliki nilai KHM diatas 1,50 mg/mL. Berdasarkan teori tersebut, nilai KHM dari ekstrak etanol daun M. tanarius termasuk aktivitas lemah dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. pyogenes. Hal ini disebabkan karena ekstrak merupakan campuran senyawa, dimungkinkan hanya satu atau sedikit senyawa yang bertanggung jawab dalam aktivitas antibakteri tersebut atau senyawa yang aktif sebagai antibakteri dapat bercampur dengan senyawa yang tidak aktif sebagai antibakteri. Selain itu, senyawa tersebut dimungkinkan bercampur dengan senyawa yang bersifat antagonis sehingga meniadakan aktivitas antibakteri atau dapat juga bercampur dengan senyawa yang sinergis namun jumlahnya tidak cukup untuk memberikan aktivitas antibakteri. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. pyogenes. 2. Ekstrak etanol daun M. tanarius memiliki nilai KHM 3,5% dan KBM 5% terhadap bakteri S. pyogenes. B. Saran 1. Perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk memastikan kandungan senyawa dalam daun M. tanarius yang memiliki aktivitas antibakteri menggunakan metode yang lebih spesifik. 2. Perlu dilakukan penetapan kadar senyawa yang bertanggung jawab dalam aktivitas antibakteri dan dilanjutkan ke tahap fraksinasi hingga isolasi senyawa untuk mendapatkan nilai KHM yang kuat. 71 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 72 DAFTAR PUSTAKA Akiyama et al., 2001, Antibacterial Action of Several Tannins against Staphylococcus aureus, Journal of Antimicrobial Chemotheraphy 48, 487491. Arabski et al., 2012, Effects of Saponins against Clinical E. coli Strains and Eukaryotic Cell Line, Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume 2012, Atlas, R.M., 1996, Handbook of Microbiological Media 2nd Edition, CRC Press, Boca Raton, pp. 1026. Badan POM RI, 2010, Acuan Sediaan Herbal, Direktorat OAI Deputi II, Jakarta, pp.6. Bala, N., Aitken, E. A. B., Fechner, N., Cusack, A, and Steadman K. J., 2010, Evaluation of Antibacterial Activity of Australian Basidiomycetous Macrofungi Using A High-Throughput 96-Well Plate Assay, Pharmaceutical Biology, pp. 1–9. Bonang, G., dan Koeswardono, E. S., 1982, Mikrobiologi Kedokteran untuk Laboratorium dan Klinik, Gramedia, Jakarta, pp. 18, 92,93. Chinedum, I. E., 2005, Microbial Resistance to Antibiotics, African Journal of Biotechnology, 4 (13), 1606-1611. Cook, G. C., dan Zumla, A. I., 2009, Manson’s Tropical Disease, Saunders Elseviers, New York pp. 152. Cushnie, T. P., and Lamb, A. J., 2005, Antimicrobial Activity of Flavonoids, International Journal of Antimicrobial Agents 26, 343–356. Daniel, 2010, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid pada Fraksi Etil Asetat dari Daun Tumbuhan Sirih Merah (Piper crocantum Ruiz & Pav), Mulawarman Scientifie, Volume 9, 17-26. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 1-52. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Materia Medika Indonesia, Jilid VI, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 336. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2009, Farmakope Herbal Indonesia, Edisi I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 7. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 73 Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2013, Riset Kesehatan Dasar 2013, Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. viii. Diaz, et al., 2010, Screening of Medicinal Plants for Antibacterial Activities on Staphylococcus aureus Strains Isolated from Bovine Mastitis, Brazilian Journal of Pharmacognosy 20 (5): 724-728. Finch, R., Greenwood, D., Norrby, S. R., and Whitley, R. J., 2010, Antibiotic and Chemotherapy, 9th edition, Saunders Elsevier, New York, pp. 215. Finch, R., Davey, P., Vilcox, M., and Irving, W., 2012, Antimicrobial Chemotherapy, 6th edition, Oxford University Press, New York, pp. 224225. Ganjar, I. G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 323, 328, 353-366. Grace, P. A., dan Borley, N. A., 2007, At Glance Ilmu Bedah, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp. 78. Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan, ITB, Bandung, pp. 70, 71, 154-285. Herlianawati, 2007, Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Umbi Binahong (Andredera cordifolia (Tenore) Steen) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, 42-50, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., and Wiliams, S. T., Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Edition, Lippincot Williams & Walkins, Philadelphia, pp. 116. ITIS, 2011, ITIS Report Macaranga tanarius (L.) Müll. Arg., Available : http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search value=503637&print_version=SCR&source=from_print diakses pada 6 Maret 2014 pukul 19.08. Jawetz, E., Melnick, J. L., and Adelberga, A., 1984, Mikrobiologi untuk Profesi Kesehatan, Edisi 16, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 244, 248. Jawetz, E., Melnick, J. L., and Adelbergb, A., 1995, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 160, 222, 224. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 74 Kawakami, S., et al., 2008, Macaflavanones A-G, Prenylated Flavanones from the Leaves of Macaranga tanarius, J. Nat. Prod., 71, 1872–1876. Kurniawaty, A. Y., 2010, Efek Antiinflamasi Ekstrak Metanol-Air Daun Macaranga tanarius pada Mencit Betina Galur Swiss, Skripsi, 78, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Lim, T.Y., Lim, Y.Y., and Yule, C.M., 2009, Evaluation of Antioxidant, Antibacterial and Anti-Tyrosinase Activities of Four Macaranga Species, Food Chemistry 114, 594–599. Lorian, V., 2005, Antibiotics in Laboratory Medicine, Fifth Edition, Lippincot Williams & Wilkins, Philadelphia, pp. 30-31. Madigan, M. T., Martinko, J. M., and Parker, J., 2009, Brock Biology of Microorganisms, Pearson Benjamin Cummings, San Fransisco, pp. 779,792,793,794, 821, 966, 967. Markham, K. R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Penerbit ITB, Bandung, pp. 24-25. Marliana, Suryanti, dan Suyono, 2005, Skrining Fitokimia dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol, Biofarmasi 3 (1): 26-31. Marliana, E., 2007, Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dari Batang Spatholobus Ferrugineus (Zoll & Moritzi) Benth yang Berfungsi sebagai Antioksidan, Jurnal Penelitian MIPA Volume 1, No.1 23-28. Matsunami, K., et al., 2006, Radical-Scavenging Activities of New Megastigmane Glucosides from Macaranga tanarius (L.) Mull.-Arg, Chem. Pharm. Bull. 54(10) 1403—1407. Matsunami, K., et al., 2009, Absolute Configuration of (+)-Pinoresinol 4-O-[600O-galloyl]-b-D-Glucopyranoside, Macarangiosides E, and F Isolated from the Leaves of Macaranga tanarius, Phytochemistry, (70) 1277–1285. Mauseth, J. D., 1998, Botany An Introduction to Plant Biology, Jones and Bartlett Publishers, Canada, pp. 565. Meiyanto, H. dkk., 2011, Potensi Kemopreventif Ekstrak Etanolik Kulit Jeruk Keprok (Citrus reticulate) pada Karsinogen Sel Hepat Tikus Galur Sparaue Dawley terinduksi DMBA, Jurnal Farmasi Indonesia Pharmacon Vol. 12 No. 1 9-13. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 75 Moerfiah dan Supomo, F. D. S., 2011, Pengaruh Ekstrak Daun Sirih Merah terhadap Bakteri Penyebab Sakit Gigi, Ekologia, Vol. 1 No. 1 30-35. Mulyani S., dan Laksana T., 2011, Analisis Flavonoid dan Tannin dengan Metoda Mikroskopi-Mikrokimiawi, Majalah Obat Tradisional, 16(3),109 – 114. Murray, P. R., Baron, E. J., Pfaller, M. A., Tenover F. C., and Yolken, R. H, 1999, Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, American Society for Microbiology, Washington DC, pp. 284. Parwata dan Dewi, 2008, Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Minyak Atsiri dari Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga L.), Jurnal Kimia 2 (2) 100-104. Phommart S., Sutthivaiyakit P., Chimnoi N., Ruchirawat S., dan Sutthivaiyakit S., 2005, Constituents of the Leaves of Macaranga tanarius, J. Nat. Prod. 68, 927-930. Pranoto E. N., Ma’ruf W. F., Pringgenies D., 2012, Kajian Aktivitas Bioaktif Ekstrak Teripang Pasir (Holothuria Scabra) terhadap Jamur Candida Albicans, Jurnal Pengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan Volume 1, Nomor 1, 1-8. Pratiwi, S. T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Penerbit Erlangga, Jakarta, pp. 180. Robinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Penerbit ITB, Bandung, pp. 157. Sabir, A., 2003, Pemanfaatan Flavonoid dalam Bidang Kedokteran Gigi, Majalah Kedokteran Gigi (Dental Journal) FKG Unair, (36) 81-87. Sirait, 2007, Penuntun Fitokimia dalam Farmasi, Penerbit ITB, Bandung, pp. 5459. Sitepu, Suada dan Susrama, 2012, Uji Aktivitas Antimikroba Beberapa Ekstrak Bumbu Dapur terhadap Pertumbuhan Jamur Curvularia lunata (Wakk.) Boed. dan Aspergillus flavus LINK., E-jurnal Agroekoteknologi Tropika, Vol. 1, No. 2, 107-114. Smith, A. H., Imlay, J. A., and Mackie I. R., 2003, Increasing the Oxidative Stress Response Allows Escherichia coli To Overcome Inhibitory Effects of Condensed Tannins, Appl. Environ. Microbiol. 69(6): 3406–3411. Stahl, E., (1985), Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung, pp. 67. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 76 Susanti, A. 2008. Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Beluntas (Pluchea Indica Less) terhadap Escherichia coli secara In Vitro, Jurnal Universitas Airlangga Vol. 1 No. 1. Voight, R., 1995, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 561-565. Wagner, H., Bladt, S., and Zgainski, E. M., 1984, Plant Drug Analysis : A Thin Layer Chromatography Atlas, Springer-Verlag, Berlin, pp. 163-165. Wang Y., et al., 2007, Exploration of The Correlation Between The Structure, Hemolytic Activity, and Cytotoxicity of Steroid Saponins, Bioorganic & Medicinal Chemistry 15, 2528–2532. Wibowo, W. I., 2013, Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam (Syzygium polyanthum (Wight.) Walp.) terhadap Bakteri Streptococcus mutans Penyebab Karies Gigi, Skripsi, 24, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta World Agroforest Centre, 2014, AgroForestryTree Database, Available : http://www.worldagroforestrycentre.org/sea/Products/AFDbases/af/asp/Spe ciesInfo.asp?SpID=1092 diakses pada 6 Maret 2014 pukul 19.00. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN 77 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 78 Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi M. tanarius PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 79 Lampiran 2. Tanaman M. tanarius Daun segar M. tanarius Pohon M. tanarius PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 80 Lampiran 3. Ekstraksi Daun M. tanarius Serbuk daun M. tanarius Replikasi 2 Replikasi 1 Replikasi 3 Ekstrak etanol daun M. tanarius PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 81 Lampiran 4. Uji Kelarutan Ekstrak Etanol Daun M. tanarius Pelarut aquadest Pelarut DMSO 4% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 82 Lampiran 5. Seri Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 83 Lampiran 6. Surat Keterangan Kultur Bakteri S. pyogenes PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 84 Lampiran 7. Kultur Bakteri S. pyogenes Kultur Bakteri S. pyogenes Penyetaraan suspensi bakteri dengan Mac Farland 0,5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 85 Lampiran 8. Hasil Uji Potensi Antibakteri dengan Metode Difusi Sumuran Perlakuan a. Replikasi 1 i. Repetisi 1 Kontrol ii. Repetisi 2 iii. Repetisi 3 Keterangan : A = Konsentrasi 80% B = Konsentrasi 40% C = Konsentrasi 20% D = Konsentrasi 10% E = Konsentrasi 5% + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 86 Perlakuan b. Replikasi 2 i. Repetisi 1 Kontrol ii. Repetisi 2 iii. Repetisi 3 Keterangan : A = Konsentrasi 80% B = Konsentrasi 40% C = Konsentrasi 20% D = Konsentrasi 10% E = Konsentrasi 5% + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 87 Perlakuan c. Replikasi 3 i. Repetisi 1 Kontrol ii. Repetisi 2 iii. Repetisi 3 Keterangan : A = Konsentrasi 80% B = Konsentrasi 40% C = Konsentrasi 20% D = Konsentrasi 10% E = Konsentrasi 5% + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 88 Kontrol Media Kontrol Pertumbuhan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 9. Tabel Hasil Pengukuran Zona Hambat Uji Difusi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap S. pyogenes Konsentrasi 5 10 20 40 80 kontrol + kontrol - 1A 8,1 9,3 11,0 12,5 12,3 18,0 0 Replikasi 1 (mm) 1B 1C Mean±SD 7,7 6,5 7,4±0,81 8,4 7,4 8,4±0,95 10,1 10,9 10,7±0,48 11,4 12,1 12±0,53 13,6 12,6 12,8±0,66 19,8 15,0 17,6±2,40 0 0 0 2A 6,2 6,7 8,9 11,0 13,9 22,5 0 Replikasi 2 (mm) 2B 2C Mean±SD 6,3 6,3 6,3±0,05 7,5 8,1 7,4±0,68 8,9 9,1 8,9±0,10 11,5 11,9 11,4±0,43 12,0 11,5 12,5±1,24 22,4 17,5 20,8±2,84 0 0 0 3A 5,6 7,8 9,8 10,9 12,5 17,8 0 Replikasi 3 (mm) 3B 3C Mean±SD 5,8±0,18 6,0 5,8 7,6±0,24 7,7 7,4 8,9±0,90 9,0 8,0 11,3 13,5 11,7±1,40 12,4 13,5 12,8±0,63 17,7 22,9 19,4±2,97 0 0 0 Mean±SD 6,5±0,84 7,8±0,50 9,5±0,99 11,8±0,28 12,7±0,20 19,3±1.61 0 89 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 90 Lampiran 10. Hasil Uji Normalitas Shapiro Wilk A. Uji Normalitas Kontrol Negatif B. Uji Normalitas Kontrol Positif C. Uji Normalitas Konsentrasi 5% D. Uji Normalitas Konsentrasi 10% E. Uji Normalitas Konsentrasi 20% F. Uji Normalitas Konsentrasi 40% G. Uji Normalitas Konsentrasi 80% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 91 Lampiran 11. Hasil Uji Levene Lampiran 12. Hasil Uji Anava Satu Arah Lampiran 13. Hasil Uji Varian A. Perbandingan kontrol negatif dan kontrol positif B. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 5% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 92 C. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 10% D. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 40% E. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 5% F. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 10% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 93 G. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 40% H. Perbandingan konsentrasi 5% dan konsentrasi 10% I. Perbandingan konsentrasi 5% dan konsentrasi 40% J. Perbandingan konsentrasi 10% dan konsentrasi 40% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 94 Lampiran 14. Hasil Uji T Tidak Berpasangan A. Perbandingan kontrol negatif dan kontrol positif B. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 5% C. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 10% D. Perbandingan kontrol negatif dan konsentrasi 40% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 95 E. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 5% F. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 10% G. Perbandingan kontrol positif dan konsentrasi 40% H. Perbandingan konsentrasi 5% dan konsentrasi 10% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 96 I. Perbandingan konsentrasi 5% dan konsentrasi 40% J. Perbandingan konsentrasi 10% dan konsentrasi 40% PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 97 Lampiran 15. Hasil Uji KHM dan KBM dengan metode Dilusi Padat Replikasi 1 Replikasi 2 Konsentrasi 1,5% Replikasi 3 (+) (+) Konsentrasi 3,5% (+) (-) (-) (-) Konsentrasi 5% (-) Keterangan : + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril (-) (-) PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 98 Replikasi 1 Replikasi 2 Konsentrasi 6,5% Replikasi 3 (-) (-) Konsentrasi 8,5% (-) (-) (-) (-) Keterangan : + = Amoxicilin 25mg/ml - = aquadest steril Kontrol Media Kontrol pertumbuhan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 99 Lampiran 16. Hasil Uji Penegasan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius Replikasi 1 Replikasi 2 Konsentrasi 3,5% Konsentrasi 5% Replikasi 3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Muhadela Tiara Murtiwi, lahir di Semarang, 21 April 1993. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara dari pasangan Muryono dan Sri Pratiwi serta memiliki dua kakak perempuan. Penulis mengawali bangku sekolah di TK Pancaran Kasih (1996-1998) dan melanjutkan sekolah di SDN Bratan 1 Surakarta (1998-1999), SDN 1 Jati Kulon, Kudus (1999-2004), kemudian di SMPN 1 Kudus (2004-2006), SMPN 9 Surakarta (2006-2007) dan melanjutkan di SMA Negeri 4 Surakarta (2007-2010). Penulis melanjutkan pendidikan jenjang Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2010-2014). Selama menempuh jenjang perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis aktif dalam kegiatan kepanitiaan dan organisasi. Penulis pernah bergabung dalam kepanitiaan Pharmacy Performance sebagai Sie Dana Usaha (2010), Hari Anti Temabakau sebagai Bendahara (2011), TITRASI (2011), dan Panitia Seminar Nasional Diabetes (2011). Dalam kegiatan organisasi, penulis aktif dalam kepengurusan ISMAFARSI sebagai Sie Organisasi (2011) dan Komisaris ISMAFARSI sehingga dapat bergabung dalam Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi sebagai Contact Person ISMAFARSI (2012). Penulis juga aktif mengikuti kegiatan ISMAFARSI di luar kampus seperti Latihan Kepemimpinan Tingkat Wilayah (2012), Latihan Kepemimpinan Nasional (2012), PraMusyawarah Nasional (2012), Rapat Kerja Nasional (2013), dan lainnya. Penulis pernah menjadi Asisten Praktikum Mikrobiologi (2012 dan 2013). 100
