UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI

UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus
conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER
PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO
Naskah Publikasi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh:
Dian Indah Pratiwi
M0405005
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2009
PENGESAHAN
Naskah Publikasi
UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus
conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER
PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO
Oleh:
Dian Indah Pratiwi
M0405005
Telah disetujui untuk dipublikasikan
Surakarta,
April 2009
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Okid Parama Astirin, M.S.
NIP. 131 569 270
Dinar Sari C. W., S. Farm. Apt. M. Si
NIP. 132 310 094
Mengetahui
Ketua Jurusan Biologi
Dra. Endang Anggarwulan, M. Si
NIP. 130 676 864
UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus
conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER
PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO
CYTOTOXICITY TEST AND ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF
YELLOW FRUITS Pandanus conoideus Lam. ON IN VITRO BREAST
CANCER LINE T47D
Dian Indah Pratiwi, Okid Parama Astirin, dan Dinar Sari C. W.
Biology Department, Sciences and Mathematics Faculty,
Sebelas Maret University, Surakarta
ABSTRACT
Breast cancer was the most common cancer in Indonesian woman after cervix
cancer. Many breast cancer treatment like surgery, chemotherapy, and radiotherapy
had not effectiveness result. That is caused many alternative treatment such as herbal
medicine. Yellow fruit Pandanus conoideus Lam. was one of plants that has
empirical study became anticancer agent because the lack of carotene, beta carotene
and -tocopherol. The aims of this study were to know cytotoxicity and
antiproliferative effect of yellow fruits P. conoideus Lam. on in vitro breast cancer
cell line T47D.
Direct counting method used in cytotoxicity test using haemocytometer and
tryphan blue staining. RPMI 1640 used as medium to culture cell, and treatmented
with yellow fruits P. conoideus Lam. from I Made Budi. Doubling time sampling
done at 0, 24, 48, 72 hours.
The result from cytotoxicity test showed that LC50 yellow fruits P. conoideus
Lam was 0,25 µl/ml. Doubling time test showed that yellow fruits P. conoideus Lam.
in 0,125 µl/ml can inhibit cancer grow with doubling time 1,9 times compared with
the control. The result cloclused that yellow fruit P. conoideus Lam. potent as
anticancer agent on breast cancer cell line T47D.
Key words: Yellow fruits Pandanus conoideus Lam., breast cancer cell line T47D,
cytotoxicity test, antiproliferative effect, in vitro
PENDAHULUAN
Jumlah penderita kanker saat ini semakin meningkat, dan menempati urutan
keenam sebagai penyebab kematian (Hariani, 2005). Meningkatnya insiden kanker di
Indonesia sesuai dengan laporan World Health Organization (WHO) memperlihatkan
bahwa kanker payudara masih menduduki peringkat kedua penyakit keganasan pada
wanita setelah kanker leher rahim dan menyebabkan
502.000 kematian per tahun
(Riyasa, 2001).
Usaha penyembuhan kanker dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi
pada umumnya belum mampu memberikan hasil yang memuaskan (Sugiyanto et al.,
2003). Penggunaan terapi radiasi, kemoterapi dan terapi hormon, banyak
menimbulkan efek pada jaringan sehat non target ditandai dengan rontoknya rambut,
dan kulit yang menghitam (Jiang et al., 2004). Hal tersebut mengakibatkan banyak
dijumpai cara-cara pengobatan alternatif antara lain dengan obat tradisional
(Sugiyanto et al., 2003).
Selama ribuan tahun, produk alam telah memerankan peran yang sangat
penting dalam mengatasi dan mencegah penyakit manusia (Chin et al., 2006).
Pencarian agen anti-kanker dari bahan tanaman dimulai sejak tahun 1950 dengan
ditemukan dan dikembangkannya antara lain vinka alkaloida, dan isolasi dari
podofilotoksin (Reedy et al., 2003).
Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning merupakan salah satu
tanaman yang terbukti secara empiris memiliki aktivitas sebagai anti kanker.
Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning ini memiliki kandungan karoten,
betakaroten dan tokoferol. Kandungan tokoferol dari P. conoideus Lam. varietas buah
kuning ini lebih tinggi daripada P. conoideus Lam. varietas buah merah yang telah
dikenal sebelumnya sebagai agen anti kanker (Budi dan Paimin, 2005).
Sel kanker payudara T47D adalah galur sel kanker payudara yang diisolasi
dari penderita kanker payudara yang memiliki reseptor positif esterogen/progesteron
(Keydar et al., 1979 dalam Schafer et al., 2000). Sel ini mengandung satu kopi
missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding domain, L2) gen p53, dimana
terjadi perubahan kodon CCT menjadi TTT sehingga merubah asam amino leusin
menjadi fenilalanin. Mutasi gen p53 ini banyak dijumpai (55%) pada penderita
kanker (Davidoff et al., 1990).
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek sitotoksisitas sari P. conoideus
Lam. varietas buah kuning pada sel kanker payudara T47D secara in vitro.serta
menguji kemampuan penghambatan proliferasi sel kanker payudara T47D setelah
pemberian sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur sel T47D
yang diperoleh dari ATCC (American Type Culture and Collection), sari P.
conoideus Lam. varietas buah kuning yang didapatkan dari I Made Budi, media
RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640, tryphan blue, tripsin-EDTA 0,25%,
PBS(Phospate Buffer Saline) 20%, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, hepes, fungizon,
penicillin/streptomycin, alkohol 70%, HCL, NaOH.
Metode Penelitian
Sel kanker payudara T47D ditumbuhkan hingga konfluen dalam media RPMI
1640 lengkap dengan metode mengacu Freshney (2000). Kerapatan sel dihitung
dengan metode direct counting yaitu, dengan mengambil suspensi sel sebanyak 20µl
kemudian ditambah dengan tryphan blue 180 µl, sel dihitung dengan bantuan
haemocytometer pada mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali. Jumlah sel total
yang diperoleh dibagi 4 dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan konstanta
104/ml. Untuk keperluan uji sitotoksisitas sel T47D tiap sumuran dibutuhkan 2 × 104
sel dalam 100 µl media RPMI 1640 (Zhu et al., 2003; Gadek et al., 2002).
Larutan uji dibuat dengan melarutkan sari buah kuning pada media RPMI
steril, dari larutan induk kemudian dibuat serangkaian seri kadar yang dibutuhkan
dengan pengenceran menggunakan media RPMI 1640 (Freshney, 2000). Seri kadar
yang akan dicobakan untuk uji sitotoksisitas adalah: 1 µl/ml; 0,5 µl/ml; 0,25 µl/ml;
0,125 µl/ml; 0,0625 µl/ml; 0,03125 µl/ml; 0,015625 µl/ml; 0,0078125 µl/ml;
0,00390625 µl/ml.
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memasukkan 100 µl medium RPMI 1640
komplit yang mengandung suspensi sel dengan kerapatan sekitar 2 × 104 sel/ml
dimasukkan ke dalam 30 sumuran mikrokultur 96 sumuran. Selanjutnya sari P.
conoideus Lam. varietas buah kuning diberikan 100 µl pada peringkat konsentrasi
yang berbeda secara triplet dengan menggunakan mikropipet. Kontrol RPMI dan
kultur sel T47D digunakan untuk mengurangi bias penelitian. Sel diinkubasi selama
24 jam dalam inkubator CO, kadar CO 5%, suhu 37 C. Setelah 24 jam media RPMI
1640 dibuang dan diresuspensi dengan 100 µl tripsin-EDTA 0,25%. Penghitungan
dilakukan dengan metode direct counting yaitu, dengan menambahkan 100 µl trypan
blue, kemudian diambil kira-kira 10 µl diletakkan pada haemocytometer dan dihitung
jumlah sel mati dan sel hidup dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 .
Uji doubling time dilakukan dengan starvasi overnight 2×104 sel T47D dalam
100 µl media RPMI 1640 yang mengandung FBS 0,5 %. Pada masing-masing
sumuran ditambahkan larutan uji 3 konsentrasi di bawah LC50 24 jam sebanyak 100
µl secara triplet. Kontrol media RPMI 1640 200 µl dan kultur sel. Penghitungan sel
hidup dan sel mati dilakukan pada jam ke 0, 24, 48, dan 72 dengan metode direct
counting.
Hasil pengamatan kematian sel uji ditampilkan dalam bentuk persentase
kematian sel dengan rumus:
(Doyle and Griffith, 2000).
Data ditampilkan dalam bentuk kurva hubungan konsentrasi (sampel) sari P.
conoideus Lam. varietas buah kuning dengan persentase kematian sel uji. Beda nyata
antara masing-masing konsentrasi yang diberikan dianalisis menggunakan Analisis of
Variance (ANOVA). Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan LC50 24 jam yang
ditetapkan dengan analisa probit.
Analisis waktu penggandaan dilakukan dengan membandingkan nilai slope
grafik jumlah sel pada berbagai waktu pengamatan. Waktu penggandaan dihitung
dengan memasukkan nilai log jumlah sel awal ke dalam persamaan grafik jumlah sel
dan waktu pengamatan untuk masing-masing konsentrasi (Mursyidi, 1985).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Sitotoksisitas
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik dari sari P.
conoideus Lam. varietas buah kuning terhadap sel kanker payudara T47D dengan
parameter LC50. Uji ini dilakukan dengan metode direct counting menggunakan
pengecatan trypan blue. Zat warna trypan blue ini memiliki muatan negatif yang
tidak dapat berikatan dengan sitoplasma pada sel hidup. Sel yang hidup akan tampak
transparan (Gambar 1) (Freshney, 2000). Jika jarak antara pemberian tryphan blue
dan pengamatan terlalu lama maka sel yang hidup juga akan berwarna biru.
Penghitungan harus segera dilakukan setelah pengecatan (Moeljoprawiro et al.,
2007).
1
2
Gambar 1. Sel kanker payudara T47D setelah diwarnai dengan tryphan blue, (1) sel
mati tampak berwarna biru, (2) sel hidup tampak jernih.
Morfologi sel setelah perlakuan dengan menggunakan sari P. conoideus Lam.
varietas buah kuning dapat dilihat pada Gambar 2, pada kontrol (a) terlihat banyak
jumlah sel yang hidup dan menempel pada dasar flask, dan saling bertumpuk-tumpuk.
Pada perlakuan dengan dosis 1 µl/ml (Gambar 2.c) tampak semua sel mati, sel yang
mati terlihat bulat dan tidak menempel pada dasar flask dengan sitoplasma keruh.
Pada perlakuan dosis 0,25 µl/ml (Gambar 2.b) tampak sel mati dan hidup, sel hidup
terlihat menempel dan sebagian bulat jernih dengan ukuran yang lebih kecil
dibandingkan sel mati.
1
2
1
(a)
(b)
2
(c)
Gambar 2. Kenampakan sel T47D pada uji sitotoksisitas dengan perlakuan sari P.
conoideus Lam. pada konsentrasi : (a) kontrol; (b) konsentrasi 0,25
µl/ml; (c) konsentrasi 1 µl/ml. Keterangan: 1. Sel hidup, 2. Sel mati
Persentase kematian tiap-tiap konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 1.
Berdasarkan hasil analisa probit maupun direct counting yang dilakukan didapatkan
nilai LC50 sebesar 0,25 µl/ml. Hasil analisa probit ini diperoleh dengan mengubah
persentase kematian menjadi angkat probit dengan menggunakan tabel probit
(Lampiran 3), kemudian dibuat grafik persamaan regresi linier probit dan log
konsentrasi. Menurut Menurut Ueda et al. (2002) ekstrak tanaman yang memiliki
LC50 < 100 g/ml berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen anti kanker.
Tabel 1. Rata-rata persentase kematian sel T47D setelah perlakuan dengan sari P.
conoideus Lam. varietas buah kuning.
No.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Konsentrasi Persentase Kematian sel
(µl/ml)
(%)
I
II
III
Kontrol
0
0
0
1
72,09
68,18
70,45
0,5
59,57
58,33
59,57
0,25
50
50
50
0,125
40,39
39,52
39,52
0,0625
32,14
31,58
31,58
0,03125
26,67
26,23
26,23
0,015625
20,64
19,05
19,05
0,0078125
13,64
13,64
13,43
0,00390625 5,71
7,04
5,71
Rerata(%)±SD
0±0
70,24±1,96
59,16±0,72
50±0
39,87±0,44
31,77±0,32
26,37±0,25
19,58±0,92
13,57±0,12
6,15±0,77
Senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik pada P. conoideus Lam.
varietas buah kuning adalah karoten, betakaroten, dan -tokoferol. Ketiga senyawa
ini bersifat sebagai antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas (Budi dan
Paimin, 2005). Interaksi ketiga senyawa tersebut dengan sel kanker dimulai dari
membran sel, -tokoferol, karoten dan betakaroten merupakan senyawa yang larut
dalam lemak sehingga dapat berdifusi melalui membran sel, kemudian ke dalam
sitoplasma (Bieri et al., 1975). Alfa tokoferol di dalam membran sel maupun
membrane mitokondria akan menghambat aktivitas Na dan K ATPase sehingga tokoferol dapat mengganggu pertukaran ion melalui Na dan K channel. Alfa
tokoferol juga telah terbukti menghambat aktivitas beberapa enzim oksidasi,
diantaranya adalah enzim-enzim yang terlibat dalam proses glikolisis dan fosforilasi
oksidatif ADP menjadi ATP, sehingga akan menurunkan produksi ATP dalam sel
(Kawai et al., 1974).
Berdasarkan penelitian Prasad et al. (1999) -tokoferol terbukti menghambat
protein kinase C, meningkatkan sintesis dan transformasi growth factor B yang
merupakan salah satu sinyal penghambat pertumbuhan. P. conoideus Lam. yang
mengandung -tokoferol diduga dapat menghambat proliferasi sel kanker payudara
T47D. Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui efek penghambatan proliferasi
sel oleh sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
Uji Doubling Time
Uji doubling time dilakukan dengan tiga konsentrasi perlakuan dibawah LC50.
Uji doubling time digunakan untuk mengetahui kemampuan sari P. conoideus Lam.
varietas buah kuning dalam menghambat proliferasi sel T47D. Kemampuan
proliferasi sel dapat diartikan sebagai kemampuan sel untuk tumbuh membelah dan
berkembang (Moeljoprawiro et al., 2007).. Doubling time sendiri merupakan waktu
yang diperlukan oleh sel untuk menggandakan dirinya menjadi dua kali jumlah
semula. Senyawa yang mampu memperpanjang waktu doubling time menunjukkan
kemampuan senyawa tersebut untuk menghambat proliferasi sel kanker melalui
mekanisme cell cycle arrest (Meiyanto et al., 2007). Apabila proliferasi sel kanker
dihambat melalui mekanisme cell cycle arrest maka sel akan berhenti membelah,
sehingga pengaruh hambatan ini berupa kematian sel
Gambar 3. Grafik hubungan jumlah sel dan waktu inkubasi pada uji doubling time
sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning konsentrasi 0,03125 µl/ml;
0,0625 µl/ml; dan 0,125 µl/ml yang dilakukan perhitungan pada waktu
inkubasi 0, 24, 48, dan 72 jam.
Hasil uji doubling time selama 72 jam menunjukkan bahwa pada konsentrasi
0,03125 µl/ml sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning telah mampu
menghambat proliferasi sel sebesar 17,47%. Pada konsentrasi 0,0625 µl/ml sari P.
conoideus Lam. mampu menghambat proliferasi sel T47D sebesar 33,15%. Pada
konsentrasi 0,125 µl/ml terjadi penghambatan proliferasi sebesar 48,79% (Gambar 3).
Tabel 2. Persamaan garis regresi dari waktu inkubasi dan jumlah sel, serta nilai
doubling time
Konsentrasi
(µl/ml)
0,03125
0,0625
0,125
Kontrol
Persamaan garis
waktu
inkubasi
dan jumlah sel
Y=0,159x+0,911
Y=0,125x+1,182
Y=0,088x+1,258
Y=0,198x+0,562
Nilai
slope
R2
0,159
0,125
0,088
0,198
0,929
0,943
0,898
0,922
Nilai
doubling time
(jam)
23,214
27,36
38
20,404
Nilai doubling time menunjukkan lama waktu yang diperlukan oleh sel T47D
untuk mencapai jumlah dua kali lipat pada konsentrasi perlakuan sari P. conoideus
Lam. varietas buah kuning dan kontrol. Semakin tinggi nilai slope menunjukkan
semakin cepat waktu doubling time yang diperlukan. Kontrol dengan nilai slope
tertinggi 0,198 memiliki waktu doubling time tercepat yaitu 20,404 jam, sedangkan
konsentrasi 0,125 µl/ml memiliki nilai slope terendah 0,088 memiliki waktu doubling
time terlama yaitu 38 jam.
Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa kandungan senyawa yang
terdapat pada sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dalam hal ini -tokoferol,
karoten, dan betakaroten dapat menyebabkan cell cycle arrest, sehingga dapat
menghambat proliferasi sel kanker. Hal ini sesuai dengan penelitian Albright et al.
(2004) yang menyatakan bahwa kombinasi antara tokoferol dengan vitamin A
terbukti mampu menghambat pertumbuhan dan metastasis sel kanker payudara pada
mencit transgenik. Kombinasi penggunaan betakaroten dan -tokoferol juga terbukti
memiliki aktivitas kemopreventif dan penghambatan tumorigenesis secara in vivo
pada kanker paru-paru (Kim et al., 2006).
Sinyal tranduksi dalam cell cycle arrest ini diduga dimulai dari penghambatan
kerja enzim oksidasi yang berperan dalam produksi ATP oleh -tokoferol, sehingga
energi yang digunakan untuk pembelahan sel kurang tersedia (Kawai et al., 1974),
selain itu juga dikarenakan adanya penghambatan protein kinase C (Prasad et al.,
1999). Protein kinase C berfungsi dalam fosforilasi pRb, dimana pRb akan menjadi
hipoposforilasi sehingga akan mengikat E2F dan menghambat aktivitas dari E2F
yang merupakan faktor transkripsi. Penghambatan E2F ini akan menyebabkan cell
cycle arrest (Guasconi et al., 2002). Penghambatan aktivitas dari E2F ini
kemungkinan dapat mengatur ekspresi gen p53 tipe wild sebagai salah satu tumor
suppressor gen pada fase G1/S dan menginduksi apoptosis (Braithwaite et al., 2006).
Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Carlisle et al. (2000) dimana tokoferol
terbukti mampu penginduksi apoptosis dan meningkatkan ekspresi gen p53 tipe wild
pada kanker paru-paru (HLF cell).
Interaksi antara
-tokoferol dan betakaroten bersifat sinergis dimana,
-
tokoferol yang telah mendonorkan elektronnya pada senyawa radikal bebas akan
berubah menjadi
-tokoferoksil radikal yang tidak reaktif apabila dibandingkan
dengan ROS. Alfa tokoferoksil radikal ini kemudian akan menerima elektron dari
betakaroten sehingga menjadi -tokoferol kembali, selanjutnya betakaroten radikal
akan dihilangkan oleh adanya aktivitas anti oksidan endogen seperti superoxside
dismutase dan gluthation peroksidase dari sel (Böhm et al., 1997).
KESIMPULAN
Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa LC50 sari Pandanus conoideus
Lam. varietas buah kuning terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro adalah
0,25 µl/ml, sehingga berpotensi untuk diteliti lebih lanjut mengenai aktivitas
antikankernya.
Sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada konsentrasi 0,03125 µl/ml
telah mampu memperlama waktu penggandaan sel kanker payudara T47D menjadi
1,14 kali dibandingkan kontrol tanpa perlakuan. Pada konsentrasi 0,0625 µl/ml waktu
penggandaan sel T47D menjadi lebih lama 1,34 kali. Konsentrasi 0,125 terbukti
paling efektif dalam penghambatan proliferasi, dengan waktu penggandaan sel T47D
lebih lama 1,9 kali.
DAFTAR PUSTAKA
Albright, C. D., R. I., Salganik, and T. V., Dyke. 2004. ‘Dietary Depletion of Vitamin
E and Vitamin A Inhibits Mammary Tumor Growth and Metastasis in
Transgenic Mice’. Journal of Nutrition 134:1139-1144
Bieri, J. G., R. P., Evart, and J. J., Gart. 1975. ‘Relative Activity of a-Tocopherol and
y-Tocopherol in Preventing Oxidative Red Cell Hemolysis’. Journal of
Nutrition:124-127
Böhm F., R., Edge, E. J., Land, D., McGarvey, T. G., Truscott. 1997. ‘Carotenoids
Enhance Vitamin E Antioxidant Efficiency’. J Am Chem Soc. 119:621–622
Braithwaite, A. W., G. D., Sal, X., Lu. 2006. ‘Some p53-Binding Proteins That Can
Function as Arbiters of Life and Death’. Cell Death and Differentiation
13:984–993
Budi, I. M., dan F. R., Paimin. 2005. Buah Merah. Seri Agrisehat. Jakarta: Penebar
Swadaya. h:20-48
Carlisle, D. L., D. E., Pritchard, J., Singh, B. M., Owens, L.J., Blakenship, J. M.,
Orestein, and S. R., Patieno. 2000. ‘Apoptosis and p53 Induction in Human
Lung Fibroblast Exposed to Chromium (VI): Effect of Ascorbate and
Tocopherol’. Toxicological Science 55:55-68
Chin, Y. W.,M. J., Balunas, H. B., Chai, and A. D., Kinghorn. 2006. ‘Drug Discovery
From Natural Sources’. The AAPS Journal 8(2):239-253
Davidoff, A. M., P. A., Humphrey, J. D., Iglehart. 1990. ‘Genetic Basis for p53
Overexpression in Human Breest Cancer’. Proc Natl Acad. Sci. USA.
87:8751-55
Doyle, A., and J. B., Griffith. 1988. Cell and Tissue Culture For Medical Research.
Chichester: John Willey and Sons LTD. p.12-16
Freshney, R. 2000. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique 4th
Edition. New York: John Wiley and Sons. Inc
Gadek, J. Wesierska, V., Kotala, C. S., Kuch, and M. D., Horky. 2002. ‘Induction of
Apoptosis in Human Cervik Carsinoma Cells During Therapy by Cisplatin’.
Institute Cancer Research University of Vienna, Austria. Apoptosis Molecular
Mechanisms Journal. p.150
Carlisle, D. L., D. E., Pritchard, J., Singh, B. M., Owens, L.J., Blakenship, J. M.,
Orestein, and S. R., Patieno. 2000. ‘Apoptosis and p53 Induction in Human
Lung Fibroblast Exposed to Chromium (VI): Effect of Ascorbate and
Tocopherol’. Toxicological Science 55:55-68
Hariani, R. 2005. Nutrisi Pada Penderita Kanker. http://www.dharmais.co.id/
new/content.php?page=article&lang=id&id=4, [20 Juli 2008]
Jiang, Q., J., Wong, H., Fyrst, J. D., Saba, and B. N., Ames. 2004. . ‘ -Tocopherol or
Combinations of Vitamin E Forms Induce Cell Death in Human Prostate
Cancer Cells by Interrupting Sphingolipid Synthesis’. PNAS 101 (51):1782517830
Kawai, K., M., Nakao, T., Nakao, and G., Katsu. 1974. ‘Inhibition of Membrane Cell
Adenosine Triphosphatase By Alpha-tokopherol and Its Derivates’. J. Clin.
Nutr. 27:987 -994
Keydar, I., L., Chen, S., Karby, F. R., Weiss, J., Delarea, M., Radu, S., Chaitcik, and
Brenner, H. J. 1979. ‘Establishment and Characterization of a Cell Line of
Human Breast Carcinoma Origin’. Eur. J. Cancer. 15:659–670
Kim, Y., N., Chongviriyaphan, C., Liu, R. M., Russel, and X. D., Wang. 2006.
‘Combined Antioxsidan ( -Carotene, -Tocopherol, and Ascorbic Acid)
Suplementation in Increase The Level of Lung Retinoic Acid and Inhibits The
Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase in The Ferret Lung Cancer
Model’. Carcinogenesis 27(7):1410-1419
Meiyanto, E., R., Fitria, dan R., Sugeng. 2007. ‘Efek Sitotoksik Fraksi Semipolar
Ekstrak Metanolik Kulit Batang Cangkring (Erythrina fusca Lour.) Terhadap
Sel Hela’. Majalah Obat Tradisional, 11(41): 1-11
Moeljoprawiro, S., M. R., Anggelia, D., Ayuningtyas, B., Widaryanti, Y., Sari, dan I.
M., Budi. 2007. ‘Pengaruh Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.)
Terhadap Pertumbuhan Sel Kanker Payudara dan Sel Kanker Usus Besar’.
Berkala Ilmiah Biologi 6(2): 121-130
Mursyidi, A. 1985. Statistika Farmasi dan Biologi. Jakarta: Ghalia
Prasad, K. N., A., Kumar, V., Kochupillai, and W. C., Cole. 1999. ‘High Doses of
Multiple Antioxidant Vitamins: Essential Ingredients in Improving the
Efficacy of Standard Cancer Therapy’. Journal of the American College of
Nutrition, 18(1):13–25
Reddy, L., B., Odhav, and K. D., Bhoola,. 2003. ‘Natural Products For Cancer
Prevention: A Global Perspective. Pharmacology & Therapeutics 99:1-13
Riyasa, K. T. 2001. ‘Hubungan Tingkat Depresi pada Penderita Kanker Mammae
yang Menjalani Pengobatan dengan Operasi dan Kombinasi (Operasi dan
Radioterapi)’. Laporan Tahunan Pusat Penelitian Pengembangan
Pemberantasan Penyakit. ITB-Bandung
Schafer, J. M. G, E. S., Lee, R. M., O’Regan, K., Yao, and V. C., Jordan. 2000.
‘Rapid Development of Tamoxifen Stimulated Mutant p53 Breast Tumor
(T47D) in Athimyc Mice’. Regular Articles. Clinical Cancer Research vol.6.
p:1-19
Sugiyanto, B., Sudarto, Edy, M., dan Agung, E. N. 2003. ‘Aktivitas Antikarsinogenik
Senyawa Yang Berasal Dari Tumbuhan’. Majalah Farmasi Indonesia.
14(3):132–141
Ueda, Y., Y., Tezuka, A. H., Banskota, Q. L., Tran, Q. K., Tran, Y., Harimaya, I.,
Saiki, and S., Kadota. 2002. ‘Antiproliferatif Activity of Vietnamese
Medicinal Plants’. Biol.Pharm Bull 25 (6): 753-760
Zhu, J., O., Hirokazu, O., Shigeki, N., Shinobu, and N., Shinji. 2003. ‘Arsenic
Trioride Induces Apoptosis in Leukimia and Lymphoma Cell Lines Via The
CD95/CD95L System’. Oncology Reports 10: 705-709. Nora Medical
University, Japan