teknologi fermentasi

m.k Dasar Teknologi Mikrobial
TIN 232 2(2-0)
MIKROBA INDUSTRI
ISOLASI, SELEKSI & IDENTIFIKASI
Departemen Teknologi Industri Pertanian
FATETA IPB
2012
MIKROBA INDUSTRI
Mikroba  kunci keberhasilan suatu fermentasi/ kultivasi
Kriteria Mikroba Industri :
 Merupakan galur murni
 Sifat genetiknya stabil
 Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit
reproduktif lain
 Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi
 Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam
waktu yang pendek & tidak menghasilkan produk
sampingan yang toksik
 Mampu melindungi diri /bertahan thd. pengaruh
lingkungan /kontaminan (pH, suhu, inhibitor)
 Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang
 Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi,
rekayasa genetika), sehingga produksinya meningkat
Sumber Mikroba

Sumber alami (tanah, air, tanaman/hewan, limbah dll) atau
lembaga koleksi kultur  jumlah dan jenis mikroba sangat
beragam

Seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri :
Isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (semua
sel dlm populasi identik & berasal dari sel induk yang sama
 sifat morfologi & fisiologi seragam).
Seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik
Identifikasi dengan menggunakan metode yang sesuai,
sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut 
e.g Bergey's manual panduan membedakan spesies bakteri
berdasarkan perbedaan fenotip isolat

Mikroba yang telah diperoleh harus disimpan dengan teknik
penyimpanan waktu yang panjang.
Identification
a. Identification is the determination of whether an organism
or isolate should be placed within a group of organisms
known to fit within some classification scheme.
b.Organisms are identified for practical purposes, such as
diagnosis of disease
Identification Techniques :
supplement
1. Morphological identification (cell shape, cell size,
endospore, flagella etc)
2. Differential staining
3. Use of differential media
4. Serological methods [agglutination test, ELISA, Western
blot)  antibodies are highly selective in terms of the
proteins or other cell structures to which they bind, to the
point that they are able to distinguish the proteins coming
from one bacterial species among many species, or even
one strain among many strain.
supplement
5. Flow cytometry (analyzes cells suspended in a liquid
medium by light, electrical conductivity, or fluorescence
as the cells individually pass through a small orifice.)
6. Phage typing (Phage can be very specific in what
bacteria they infect and the pattern of infection by many
phage may be employed in phage typing to distinguish
bacterial species and strains.)
7. Protein analysis (The size and other differences between
proteins among different organisms may be determined
very easily employing methods of protein separation
using methods collectively known as gel electrophoresis.)
8. Comparisons of nucleotide sequences
 16S gene DNA sequence
supplement
Classification
 describe the diversity of bacterial species by naming and
grouping organisms based on similarities
a. Placement of an organism within a scheme relating
different types of organisms, such as that presented in
Woese's universal tree
b.Organisms are classified for scientific purposes.
The science of classification is called taxonomy.
ISOLASI


Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari
campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah
Sebelum mengisolasi, harus diketahui :
- mikroba apa yang akan diisolasi
- habitat
 menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam ,
lokasi dan media apa yang akan digunakan
Metode Pengambilan Contoh
- Contoh berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu dll) :
 Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset
steril
 Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril
- Contoh berupa cairan atau semi cair (air, lumpur dll) :
 Diambil menggunakan pipet steril
 Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung
polipropilen steril
Contoh segera dibawa ke laboratorium
(bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan)
Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu
dingin (kulkas)
Teknik Isolasi Kultur Murni :
- 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran
(Spread-plate)
- 2. Penuangan (Pour-plate)
- 3. Kultur Yang Diperkaya (Enrichment Culture)
- 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)
- 5. Isolasi Sel Tunggal
1.

Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran
(Spread-plate)
Umumnya digunakan untuk memperoleh kultur murni
mikroba yang tidak berhasil ditumbuhkan pada media
padat dan hanya dapat tumbuh pada media cair
Untuk bakteri paling sesuai  menggunakan agar cawan
Sampel
Pengenceran berseri dg larutan
garam fisiologis (0,85 %)
Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran
(batang gelas) pada media agar  koloni tumbuh
menyebar
Penggoresan dilakukan berulang, sehingga
Diperoleh kultur murni
1 sel  1 koloni
Cara Penggoresan Kultur pada Agar Cawan ;
1. Goresan Langsung
2. Goresan Kuadran
3. Goresan Radian
Goresan Kuadran
http://www.personal.psu.edu/faculty/k/h/khb4/enve301/301labs/301labgraphics
/streak.gif
Metode Penggoresan
 Dengan penggoresan terjadi pengenceran sel secara gradien
Goresan langsung
Unt mengkultur mikroba)
Goresan radian (unt
mengkultur mikroba)
Goresan Kuadran (isolasi koloni tunggal untuk
mempelajari mikroba)
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pureculture.html
Teknik Penyebaran (Spread-plate)
Batang gelas
http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pureculture.html



Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri
& menggunakan peralatan yang sederhana
Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat
digunakan/disebarkan pada media
Dua sel dapat bergabung menjadi membentuk satu
koloni
Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak
 pencegahan dengan menambahkan deterjen
2. Teknik Penuangan (Pour-plate)


Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cair
(+/- 450C) alam tabung reaksi, sehingga distribusi
sampel merata  dituang ke petri dish & dibiarkan
mengeras pada suhu ruang, lalu diinokulasi
Tidak cocok untuk isolasi mikroba psikrofilik
Teknik Penuangan (Pour-plate)
Sampel +/- 1 g)
....
. ...
. ...
…..
.
1 ml
A
Agar cair
Diperiksa
....
. .. .. .
B
Pengenceran
Suspensi
Bakteri
A
B
Koloni terisolasi
Penuangan
Dibiarkan mengeras
C
. .
..
C
Inkubasi
Tahap I
Tahap II
Tahap III
Media agar miring
http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap06/lecture5.htm

Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif
(morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba)

Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan
menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus
sebelum penanaman pada agar cawan
Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  contoh terlebih dulu
diberi perlakuan pemanasan s.d 850C selama 5 menit

Media Selektif :
- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari
faeces
- Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae

Media Diferensial :
- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk
koloni berbeda & mudah dikenali
E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik
Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda
3. Kultur Yang Diperkaya

Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat
fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat)

Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi
inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri
tertentu
1
2
3
4
Media cair dgn substrat khusus
Contoh : bakteri tanah :
α-conidendrin
(+)
(-)
Verifikasi
4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat
dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain.
Contoh : S. lactis dalam susu asam

Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya
mengandung 1 galur mikroba

Perlu dicek kemurnian kultur
Serial-dilution Method
http://dc338.4shared.com/doc/9lEZll1X/preview.html
5. Teknik Isolasi Sel Tunggal
a. Metode Mikromanipulator
 Menggunakan
alat Mikromanipulator yang digabung
dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba
tunggal dari sampel
 Dengan
Mikromanipulator, operator dapat mengontrol
gerakan mikropipet (tabung kapiler) di bawah lensa
obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal & dipindahkan
ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media
yang sesuai
 Lebih
cepat, namun kelemahannya :
- alat mahal
- operator harus trampil
Micromanipulator
http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html
Micromanipulator
b. Metode Kapiler untuk mendapatkan sel tunggal mikroba
-Beberapa tetes media yang mengandung mikroba,
ditempatkan pada penutup gelas obyek steril menggunakan
pipet kapiler steril.
-Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang
mengandung hanya 1 mikroba. Tetesan tsb dipindahkan
dengan pipet kapiler steril ke media segar  mikroba
tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak untuk
menghasilkan kultur murni.
Pembuktian Kemurnian Kultur
Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur
murni  perlu dilakukan pengujian dengan kriteria
sbb. :
(Kultur murni : sel-sel mikroba yang ada  sejenis)
1. Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan
menunjukkan hasil pewarnaan yang sama
2. Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni
menunjukkan kesamaan .
3. Hasil penggoresan dll seragam
4. Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan /
karakteristik identik, contoh memfermentasi gula
yang sama dll
SELEKSI & IDENTIFIKASI
SELEKSI
Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik
 - rendemen lebih tinggi
- tidak menghasilkan produk sampingan yang
tidak dikehendaki
- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C
dan N yang murah  penurunan biaya prod.
- Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang
lebih mudah dipisahkan dari produk

Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :
1. Mutasi
2. Rekombinasi

Taksonomi (klasifikasi) :
penataan teratur unit-unit ke dalam kelompok satuan yang lebih
besar
 hierarkhi klasifikasi :
spesies  genus  familia  orde  kelas  filum atau
divisi
Spesies : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem
klasifikasi organisme

Nomenklatur :
penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi
 binomial nomenklatur : menggunakan nama kombinasi biner
Latin, misalnya Rhizopus oryzae


Identifikasi :
penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan
nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroba dengan
membandingkan dengan ciri-ciri/ karakteristik yang ada
a.l Menggunakan kunci-kunci identifikasi yang sesuai
Contoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

Contoh identifikasi bakteri :
- tidak terdapat bakteroklorofil
- sel tidak berbentuk filamen
- Gram positif
- berbentuk batang
- menghasilkan endospora
- Katalase positif
- Aerobik
- Nitrit negatif
- VP (Voges Proskauer) negatif
 Bacillus megaterium
Identifikasi Kapang :
 a.l. berdasarkan spora dan miselium
Identifikasi khamir :
 a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula
sebagai sumber karbon
IDENTIFIKASI
 Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi

Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan
menggunakan ciri/karakteristik :
1. Morfologis
Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya
flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop,
baik dengan pewarnaan maupun tidak
2. Nutrisional
Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus
(suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk
pertumbuhan mikroba
3. Kultural
Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai
macam media, baik cair maupun padat (bentuk koloni,
permukaan koloni, tepi koloni, warna dll)
Contoh 1. Karakteristik Morfologis
(Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela,
kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan
pewarnaan maupun tidak)
Aspergillus
E. coli
Streptomyces
Penicillium
Contoh 1. Bentuk & Susunan Sel
Sel
Bakteri
http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg
Contoh 3. Karakteristik Kultural
 Tampilan pertumbuhan pada media padat
(bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)
Kultur pada Agar Miring
4. Metabolik
Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang
dilakukan mikroba ( contoh kemampuan mikroba untuk
mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula
menjadi asam dan gas dll)
Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan
Salmonella typhi tidak dapat
5. Susunan Kimiawi
Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding
sel, nukleus, membran dll)
6. Susunan Antigen
Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas
* Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi
produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan
7. Patogenik
Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan
penyakit
8. Genetik
Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA
Probe
PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI
 Tujuan :
menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam
kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan
genetik & tidak terkontaminasi
 harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba
selama diawetkan
Cara :
1. Pemindahan Secara Periodik
- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke
media baru/segar, contoh : media agar miring
- Komposisi media & suhu serta interval waktu
pemindahan harus tepat dan disimpan pada suhu
dingin (50C)
 tidak cocok untuk penyimpanan jangka panjang
 bakteri 2-3 minggu, fungi 3-4 minggu

2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral
- Permukaan agar miring atau media cair dilapisi
dengan minyak mineral steril (parafin) +/- 0,5 inci
- Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba
di bawah permukaan minyak mineral dg jarum Ose,
lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap
mempertahankan kultur awal
- Lapisan parafin menjadikan kondisi anaerob dan
mencegah pengeringan medium
mikroba dorman  pengawetan dapat beberapa
tahun
3. Liofilisasi  Pengeringan beku (freeze-drying)
- Sel mikroba dikering-bekukan & aktivitas metabolisme
stop (dorman)  efektif untuk bakteri (dapat tetap hidup &
tidak berubah selama bertahun-tahun
- Cara :
* media berisi senyawa pelindung/penstabil : susu, serum,
natrium glutamat dll
* suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul
(vial) kaca
* Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C)  beku
* Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum
 kering (sublimasi)
* Ampul ditutup dengan melelehkan ampul kaca tsb dlm
keadaan vakum  penyimpanan pada suhu 40 C
- Keuntungan : Cocok untuk penyimpanan jangka panjang,
(tahunan) & kemungkinan perubahan kecil & Wadah
penyimpanan kecil
Freeze drying Chamber
Sampel
Kondensor
Pompa vakum
Foto Alat Freeze Dryer
4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah
(Cryopreservation)
- Menggunakan nitrogen cair (sekitar -156 sampai-1960C)
- Sel dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku
(gliserol atau dimetil sulfoksida)  mencegah
pembentukkan kristal es & meningkatkan ketahanan
hidup sel mikroba
- Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen
cair
- Cocok untuk kapang
- Kelebihan :
hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat
diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini
5. Penyimpanan pada Tanah Steril
- Diterapkan untuk penyimpanan spora bakteri,
actinomycetes dan kapang
- Suspensi 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisi 5 g bubuk tanah steril (campuran pasir halus
dan tanah liat 1:1)
- Dibiarkan pada suhu kamar selama 10 hari sampai
kering  disimpan pada lemari es
PEMANTAUAN VIABILITAS DAN KESTABILAN MIKROBA
• Sebelum dan sesudah penyimpanan, sebaiknya viabilitas
mikroba diperiksa, sehingga mikroba yang mati selama
penyimpanan dapat diketahui
•Sebaiknya diperiksa pula morfologi dan karakteristik
biokimianya
THE RIBOSOMAL 16S GENE AND BACTERIAL
IDENTIFICATION AND CLASSIFICATION
The most powerful techniques for bacterial identification
are based on comparisons of an essential gene, the
ribosomal 16S gene. This gene codes for the RNA present
in the small subunit of the ribosome.
Ribosomes are the machinery that translates DNA
sequence into proteins using the universal genetic code.
Because fidelity and maintenance of this translation
function are critical, some regions of the rDNA are so
highly conserved that they can be used to align genes
from dissimilar organisms.
Other regions less critical to translation of the code are
under less selective pressure and show enough variation so
that each species has a unique sequence. This variation
allows similar species to be distinguished.
Currently over 125,000 bacterial 16S sequences have been
deposited in the major public DNA databases, GenBank and
the Ribosomal Database Project.
An unknown bacterium can be identified by obtaining its
16S gene DNA sequence and comparing it to sequences in
these databases with a search engine called BLAST. The
process is commonly referred to as “BLASTing.”
QUIZ
Optimasi media kultivasi merupakan tahap penting
dalam pengembangan proses produksi yang ekonomis.
Di samping kelebihan-kelebihan yang dimiliki kultivasi,
harga juga harus dapat berkompetisi dengan sintesis
secara kimia. Usaha-usaha apa yang dapat dilakukan
untuk menekan biaya media kultivasi ?
Menurut sdr hasil samping atau limbah agroindustri
apa di daerah sdr yang berpotensi untuk digunakan
sebagai bahan baku pembuatan bioproduk ? Produk
apa yang prospektif dihasilkan dari hasil samping/
limbah tsb ?