Karakteristik Bakteri Heterotrofik Penghasil Enzim Amilolitik

Karakteristik Bakteri Heterotrofik Penghasil Enzim Amilolitik Diperairan Situ
Cibuntu, Cibinong Bogor
(Heterotroph Bacteria Identification Which Produced Amylolytic in Situ Cibuntu
Freshwaters, Cibinong, Bogor)
Rismawati1, Tri Saptari Haryani1, S. Y. Srie Rahayu 2
Program Studi Biologi, FMIPA-Universitas Pakuan Bogor
1)
Abstrak: Air memegang peranan penting dalam kehidupan manusia dan juga
makhluk hidup lainnya, antara lain air dapat digunakan untuk minum, memasak,
mencuci, dan mandi. Pencemaran air dapat disebabkan oleh berbagai hal, salah
satunya adalah akibat adanya limbah organik. Bakteri heterotrofik merupakan bakteri
yang dapat memanfaatkan dan mendegradasi senyawa organik kompleks menjadi
senyawa sederhana yang digunakan sebagai sumber energi bakteri itu sendiri.
Amilase adalah enzim yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis amilum
menjadi molekul yang lebih sederhana. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
karakterisasi fenotipik dan mengidentifikasi isolat bakteri heterotrofik penghasil
enzim amilolitik dari perairan Situ Cibuntu, Cibinong. Metode pengujian dilakukan
secara makroskopis secara mikroskopis meliputi uji Gram, uji kapsul dan uji spora,
sedangkan morfologi bakteri di lakukan dengan pengamatan secara makroskopis
meliputi warna koloni, elevasi dan permukaan koloni. Pengujian secara molekuler
dilakukan menggunakan alat PCR. Identifikasi bakteri heterotrofik yang diuji
berjumlah 11 isolat, bakteri dengan kode isolat TSi5 merupakan isolat bakteri tidak
pathogen dengan hasil uji gram (+), uji kapsul (-) dan uji spora (-).
Kata kunci: Karakteristik Bakteri Heterotrofik, Bakteri Heterotrofik, Enzim
Amilolitik.
PENDAHULUAN
Air memegang peranan penting
dalam kehidupan manusia dan juga
makhluk lainnya, antara lain air dapat
digunakan untuk minum, memasak,
mencuci, dan mandi. (Effendi, 2003).
Telah diketahui beberapa bakteri
digunakan untuk mendeteksi tingkat
pencemaran di perairan. Pemantauan
kualitas air secara periodik dan
perbaikan pemanfaatan lahan di
wilayah perairan sangat diperlukan
guna
memelihara
kesehatan
masyarakat yang berada di sekitar
lingkungan
perairan.
Terdapat
kelompok bakteri heterotrofik yang
berperan penting dalam sistem
perairan karena kemampuan aktivitas
metabolismenya, baik pada lingkungan
aerob ataupun anaerob (Sigee, 2005).
Bakteri
heterotrofik
merupakan
golongan bakteri yang mampu
memanfaatkan dan mendegradasi
senyawa organik kompleks baik yang
mengandung unsur C, H, dan N
(Parwanayoni, 2008). Sutiknowati dan
Ruyitno (2008) menyatakan bahwa
bakteri heterotrofikdapat digunakan
sebagai salah satu indikator kualitas
kesuburan suatu perairan, karena
kemampuan menguraikan senyawa
organik. Jika kelimpahan bakteri
heterotrofik dalam suatu perairan
tinggi dapat indikasi bahwa dalam
suatu perairan terdapat cemaran bahan
organik.
BAHAN DAN METODE
Peralatan yang digunakan pada
penelitian ini antara lain: cawan petri,
autoclave, tabung reaksi, botol schott,
timbangan analitik, tabung eppendorf,
pipet
volumetriks,
vorteks,
kulkas,oven dan perangkat PCR.
Bahan yang digunakan adalah
isolat bakteri heterotrofik dari perairan
Situ Cibuntu sebanyak 11 isolat; bahan
media untuk pertumbuhan bakteri
heterotrofik: tripton, glucose, yeast,
agar, dan aquades, seperangkat reagen
untuk identifikasi jenis bakteri
heterotrofik
secara
makroskopis,
mikroskopis, maupun reagen untuk
reaksi molekular isolat bakteri.

Prosedur Penelitian
Proses ini dilakukan untuk
menghindari adanya mikroorganisme
dari peralatan yang akan digunakan.
Proses sterilisasi dilakukan secara
basah menggunakan autoclave dengan
suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15
menit untuk pembuatan media, dan
sterilisasi secara kering menggunakan
oven dengan suhu 800C selama 2 jam
untuk mensterilkan peralatan yang
terbuat
dari
gelas
dan
baja
(Hadioetomo, 1985).

Peremajaan Isolat Bakteri
Heterotofik
Proses ini dilakukan untuk
meremajakan
kembali
bakteri
heterotrofik yang akan digunakan
dalam pengujian. Peremajaan bakteri
menggunakan media NA. Diambil
sedikit biakan bakteri heterotrofik
kemudian digoreskan pada media NA
miring dan diinkubasi pada suhu
kamar selama 24 jam. Setelah
diinkubasi selama 24 jam, biakan siap
digunakan
untuk
pengujian
karakteristik fenotipik bakteri.

Pengujian Karakteristik
Fenotipik Isolat Bakteri
Heterotrofik
Pengujian karakterisasi fenotipik
bakteri heterotrofik dilakukan dengan
beberapa
pengujian
diantaranya
pengamatan
morfologi
atau
makroskopis koloni bakteri berupa
warna, bentuk, elevasi, permukaan,
tepi, ukuran dan karakteristik optik;
dan karakter mikroskopis koloni
bakteri berupa bentuk sel, reaksi
Gram, reaksi endospora dan uji kapsul.
Pengujian karakterisasi fisiologis
meliputi: UjiIndole, MR-VP, katalase,
Uji motilitas dan uji oksidase. Isolat
bakteri
yang
sudah
diketahui
karakternya kemudian dicocokkan
dengan buku panduan Bergey’s
Manual of Determinative Bacteriology
9th Edition (Holt, et al., 2000).

Amplifikasi PCR
Reaksi PCR menggunakan alat
PCR (Eppendorf German) dengan
predenaturasi pertama pada suhu 94C
selama 90 detik, dilanjutkan dengan 30
siklus yang terdiri dari denaturasi pada
suhu 95C selama 30 detik,
penempelan primer pada suhu 50C
selama 30 detik dan ekstensi pada suhu
72C selama 90 detik. Setelah 30
siklus
selesai,
diikuti
fase
pemanjangan pada suhu 72C selama 5
menit dan pendinginan pada suhu 4C
selama 20 menit (Promega 2012).
Hasil amplifikasi PCR (produk pcr)
dielektroforesis menggunakan agarose
gel 0,8%, dengan volume produk PCR
per lane: 1 uL, voltase elektroforesis
100 V, waktu elektroforesis 25 menit
dan volume 1Kb DNA ladder per lane:
1 uL. Gel hasil elektroforesis direndam
dalam larutan ethidium bromida
selama 30 menit. Gel didokumentasi
menggunakan gel documentation
system. Hasil amplifikasi PCR daerah
sekuen 16S ribosomal DNA bakteri
menghasilkan pita DNA tunggal
dengan ukuran 1500 bp (Promega,
2012). Selanjutnya dipurifikasi dan di
cycle seqencing dengan primer 27F
(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3')
dan
1492R
(5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3').
Analisis sekuensing dilakukan di
laboratorium First Base (Malaysia).
Data hasil sekuensing selanjutnya di
trimming dan di assembling dengan
program BioEdit dan selanjutnya
dikonversi dalam bentuk FASTA
format. Hasil sekuensing DNA dalam
bentuk FASTA format selanjutnya di
BLAST untuk mencari homologi
secara on line di pusat database DNA
di NCBI.
PARAMETER YANG
DIAMATI
 Perbedaan
karakter
secara
morfologi dan fisiologi dari 11 isolat
bakteri heterotrofik dengan melihat
morfologi bakteri yang disesuaikan
dengan buku Bergey’s Manual of
Determinative
Microbiology.
Identifikasi dilakukan dengan cara
melihat bentuk koloni dan morfologi
sel bakteri, sedang pengujian secara
mikroskopis meliputi uji morfologi sel
dan uji fisiologi sel bakteri

Identifikasi
isolat
bakteri
heterotrofik
dilakukan
di
mikrobiologi
LIPI
dengan
metode coloni PCR dilakukan
secara molekuler berdasarkan
analisis genetik secara parsial.
(Pitcher et al., 1990; Modified),
ANALISIS DATA
Data yang telah diperoleh dari
berbagai pengujian yang telah
dilaksanakan kemudian dilakukan
analisis data secara deskriptif untuk
mengetahui
karakterisasi
bakteri
heterotrofik hingga tingkat genera dan
berpedoman pada buku panduan
Bergey’s Manual Of Determinative
Bacteriology 9th Edition (Holt, et al.,
2000).
HASIL DAN PEMBAHASAN
 Karakteristik Morfologi
Bakteri Heterotrofik
Dari hasil identifikasi 11 isolat
bakteri heterotrofik secara morfologi
diperoleh dua kelompok bakteri yaitu
basilus dan kokus yang tumbuh pada
media Nutrient Agar. Identifikasi
dilakukan secara morfologi meliputi
bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel,
uji Gram, uji spora dan uji kapsul.
Hasil selengkapnya dapat dilihat pada
Tabel 3 dan Tabel 4.
Dari Tabel 3 tampak bahwa
warna koloni secara umum berwarna
putih, kecuali isolat TSi5 berwarna
kuning bening dan TSi2 berwarna
transparan. Bentuk koloni tumpul,
elevasi koloni cekung, bentuk sel
didominasi bentuk basil (batang). Hal
ini sesuai dengan pendapat Hatim, W.
(2013),
bahwa
Situ
Cibuntu
didominasi oleh kelompok bakteri
berbentuk batang dikarenakan pH air
berkisar antara 5,5 - 5,8 dan
merupakan pH optimum untuk
pertumbuhan bakteri heterotrofik.
Dari hasil pengujian secara
mikroskopis diperoleh hasil seperti
pada Tabel 4, dimana isolat dengan
kode isolat TSi5 memberikan hasil
Pewarnaan Gram (+), Pewarnaan
Spora (-) dan Pewarnaan Kapsul (-),
berarti isolat TSi5 merupakan isolat
yang
bersifat
tidak
pathogen,
mendominasi diperairan Situ Cibuntu,
dan mampu menghasilkan enzim
amylase yang dapat mengkatalisis
proses hidrolisis pati menjadi senyawa
sederhana yang dimanfaatkan untuk
proses metabolisme bakteri itu sendiri.
Hal ini sesuai dengan pendapat Inggit,
dkk (2013) dan Hatim, W (2013)
bahwa isolat TSi5 mampu membentuk
zona hambat sebesar 5cm dan
menghasilkan enzim amilase.

Hasil Identifikasi Sekuen DNA
Sampel Bakteri Heteroprofik
Isolat kode TSi5 teridentifikasi sebagai
Micrococcus luteus. Sekuen isolat
kode TSi5 dianalisis menggunakan
BLAST di NCBI menunjukkan
homologi dengan max identity 100 %
terhadap Micrococcus luteus.

Karakteristik Molekuler Bakteri
Heterotrofik
Dari hasil pengujian karakteristik
morfologi diperoleh isolat TSi5 merupakan
isolat yang paling efektif menghasilkan
enzim amilase, oleh karena itu isolat TSi5
yang di uji secara molekuler untuk
menentukan
jenis
bakterinya
menggunakan alat PCR yang dilakukan di
laboratorium Mikrobiologi LIPI Cibinong,
Bogor.
Gambar. 1. Isolat Bakteri Heterotrofik

Amplifikasi PCR
Hasil amplifikasi PCR daerah sekuen
16S ribosomal DNA bakteri divisualisasi
menggunakan gel documentation system
sebagai berikut :
di NCBI menunjukkan homologi dengn
max identity 100 % terhadap Micrococcus
luteus. Klasifikasi isolat bakteri tersebut
sebagai berikut (Chen et al., 2009; Wieser,
et al., 2009):
Kingdom
: Bacteria
Filum
: Actinobacteria
Class
: Actinobacteria
Subclass
: Actinobateridae
Ordo
: Actinomycetatles
Famili
: Micrococcaceae
Genus
: Micrococcus
Spesies
: Micrococcus luteus.
Micrococcus luteus merupakan
bakteri Gram positif, koloni berbentuk
bulat dan berwarna kuning terang pada
medium Nutrient Agar dan bersifat aerobe
obligat. Micrococcus luteus ditemukan di
tanah, air, udara dan sebagian merupakan
flora normal kulit mamalia. Micrococcus
luteus bersifat koagulase negative, sensitif
pada basitrasin dan secara taksonomi
berkerabat dekat dengan Micrococcus
endophyticus (Chen et al.,2009; Wieser, et
al., 2009).

Dengan adanya hasil dokumentasi
agarose, maka dapat diketahui bahwa
DNA Micrococcus teramaplifikasi dengan
sempurna dan menunjukkan berat bakteri
tersebut sebesar 1500 bp . Dari hasil
tersebut DNA yg teramplifikasi dapat
diartikan DNA tersebut sesuai dengan
praimer spesifik yg digunakan, sehingga
bakteri dapat teridentifikasi sebangai
bakteri Micrococcus luteus spesifik yaitu
dari praimer.

Hasil Identifikasi Sekuen DNA
Sampel Bakteri Heteroprofik
Isolat kode TSi5 teridentifikasi
sebagai Micrococcus luteus. Sekuen isolat
kode TSi5 dianalisis menggunakan BLAST
Karakteristik Morfologi Bakteri
Heterotrofik
Dari hasil identifikasi 11 isolat
bakteri heterotrofik secara morfologi
diperoleh dua kelompok bakteri yaitu
basilus dan kokus yang tumbuh pada
media
Nutrient
Agar.
Identifikasi
dilakukan secara morfologi meliputi
bentuk dan elevasi koloni, bentuk sel, uji
Gram, uji spora dan uji kapsul. Hasil
selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 3
dan Tabel 4.
Dari Tabel 3 tampak bahwa warna
koloni secara umum berwarna putih,
kecuali isolat TSi5 berwarna kuning bening
dan TSi2 berwarna transparan. Bentuk
koloni tumpul, Gambar.
elevasi 3.koloni cekung,
bentuk sel didominasi bentuk basil
(batang). Hal ini sesuai dengan pendapat
Hatim, W. (2013), bahwa Situ Cibuntu
didominasi oleh kelompok bakteri
berbentuk batang dikarenakan pH air
berkisar antara 5,5 - 5,8 dan merupakan
pH optimum untuk pertumbuhan bakteri
heterotrofik.
Dari hasil pengujian secara
mikroskopis diperoleh hasil seperti pada
Tabel 4, dimana isolat dengan kode isolat
TSi5 memberikan hasil Pewarnaan Gram
(+), Pewarnaan Spora (-) dan Pewarnaan
Kapsul (-), berarti isolat TSi5 merupakan
isolat yang bersifat tidak pathogen,
mendominasi diperairan Situ Cibuntu, dan
mampu menghasilkan enzim amylase yang
dapat mengkatalisis proses hidrolisis pati
menjadi
senyawa
sederhana
yang
dimanfaatkan untuk proses metabolisme
bakteri itu sendiri. Hal ini sesuai dengan
pendapat Inggit, dkk (2013) dan Hatim, W
(2013) bahwa isolat TSi5 mampu
membentuk zona hambat sebesar 5cm dan
menghasilkan enzim amilase.
KESIMPULAN DAN SARAN
 Dari hasil penelitian, karakteristik
morfologi
bakteri
heterotrofik
didominasi oleh kelompok bakteri
berbentuk basil (batang), elevasi dari
isolat makroskopis diperoleh elevasi
isolat bakteri koloni cekung. Bakteri
dengan kode isolat TSi5 merupakan
isolat bakteri tidak pathogen dengan
hasil uji Gram termasuk (+), uji Spora
(-) dan uji Kapsul (-).
 Hasil identifikasi bakteri isolat dengan
kode isolat TSi5 teridentifikasi sebagai
Micrococcus luteus, yang dianalisis
menggunakan BLAST di NCBI
menunjukkan
homologi
terhadap
Micrococcus luteus.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih
lanjut mengenai isolasi enzim amilolitik
dari isolat TSi5 dan isolat-isolat lainnya.
DAFTAR PUSTAKA
Achmad, R. 2004. Kimia Lingkungan.
Penerbit Andi. Yogyakarta.
Chen,H., G.Zhao, D.Park,3 Y.Zhang,L.
Xu, J.Lee, C. Kim and W.Li . 2009.
Micrococcus endophyticus sp. nov.,
isolated
from
surface-sterilized
Aquilaria
sinensis
roots.
International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology 59:
1070-1075.
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia.
Jilid IV. Departemen Kesehatan
Republik Indonesia. Jakarta.
Effendi, Hefni. 2003. Telaah Kualitas Air
Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan
Lingkungan Perairan. Kanisuis,
Yogyakarta.
Fatmawati, R. Aniek. M. Dan M. Solichin.
2012. Kajian Identifikasi Daya
Tampung Beban Pencemaran Kali
Ngorowo Dengan Menggunakan
Paket
Program
QUAL2Kw.
Universitas Brawijaya. Malang.
Jurnal : Teknik Perairan. Vol. 3. No.
2.
Hindarko. 2003. Mengelola air limbah
agar tidak mencemari orang lain.
ESHA. Jakarta.
Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi
Dasar dalam Praktek teknik dan
Prosedur Dasar laboratorium. PT.
Gramedia. Jakarta.
Inggit.W, Tri. S. H , dan Tri R. N . 2013.
Pemanfaatan
Enzim
Amilolitik
Bakteri
Heterotrofik
Dalam
Menurunkan Tingkat Pencemaran
Perairan
Tawar.
Universitas
Terbuka. Tangerang
Janda, J. M. and S. L. Abbott. 2007. 16S
rRNA
Gene
Sequencing
for
Bacterial ldentification in the
Diagnostic
Laboratory:
Pluses,
Perils, and Pitfalls. Minireview.
Journal of Clinical Microbiology
45(9): 2761-2764.
Jawetz E., J. L Melnick, E. A. Adelberg,
G. F. Brooks, J. S. Butel, L. N.
Ornston.
1995.
Mikrobiologi
Kedokteran, ed. 20, Universiti of
California, San Fransisco.
Kristanto, P. 2004. Ekologi Industri.
Penerbit Andi, Yogyakarta.
Lee, T.D. 1978. Handbook of Variables of
Environmental Impact As Sesment
Arbor: An Arbor Science publishor
inc.
Parwanayoni, S. 2008. Pergantian
Populasi Bakteri Heterotrofik, Alga,
dan Protozoa di Lagoon BTDC
Penanganan Limbah Nusa Dua Bali.
Jurnal BumiLestari.
Rahadi, B. Dan N. Lusiana. 2012.
Penentuan Kualitas Air Tanah
Dangkal dan
Arahan
Penelolaan (Studi Kasus Kabupaten
Sumenep). Universitas Brawijaya.
Malang. Jurnal: Teknologi Pertanian.
Vol. 13. No. 2.
Tannock, G.W. 1999. ldentification of
Lactobacilli and Bifidobacteria.
Current lssues Molecular Biology 1
(1): 53-64.
Waluyo,
L.
2009.
Mikrobiologi
Lingkungan. UMM press. Malang.
Wieser M., E.B. M. Denner, P.Kampfer,P.
Schumann, B. Tindall, U. Steiner, D.
Vybiral, W. Lubitz, A. M.
Maszenan, B. K. C. Patel, R.J.
Seviour, C. Radax and H.J.Busse.
2002. Emended descriptions of the
genus Micrococcus, Micrococcus
luteus (Cohn 1872) and Micrococcus
lylae (Kloos et al. 1974).
International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology 52:
629–637.
Wardhana,
W.A.
2004.
Dampak
Pencemaran Lingkungan. Penerbit
Andi, Yogyakarta