Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 1 Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak dan Fraksi Daun Kuhung-Kuhung (Crotalaria pallida Aiton) terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 Erlays Melindah Rumondor, Moelyono M.W, dan Melisa I. Barliana Abstrak Daun kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton) merupakan tumbuhan yang digunakan secara tradisional oleh etnis bolaang mongondow sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiproliferasi dari ekstrak maupun fraksi daun kuhungkuhung pada sel kanker payudara MCF-7. Pengujian aktivitas antiproliferasi dilakukan dengan metode WST assay menggunakan sel line MCF-7. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun C. pallida Ait memiliki nilai IC50 terkecil yakni 29,67 µg/mL. Berdasarkan hasil tersebut, maka fraksi etil asetat daun kuhung-kuhung terbukti bersifat antiproliferasi dan bisa dijadikan dasar pengembangan tumbuhan antikanker Keyword : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7 Abstract Kuhung-kuhung leaf (Crotalaria pallida Aiton) is medicinal traditionally used by ethnic Bolaang Mongondow as anticancer. The purpose of this study was to showed antiproliferation activity from extract and fraction to human breast cancer cell line MCF-7. The research using WST-assay method with mammary adenocarcinoma cell line MCF-7. These results indicate that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf has lower IC50 29,67 value. Because of the fact that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf contribute to development anticancer agent. Keyword : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7 Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 2 Kanker merupakan suatu penyakit PENDAHULUAN Penduduk indonesia terdiri atas yang hingga saat ini dapat menjadi berbagai suku bangsa yang memiliki ancaman baik dalam bidang kesehatan di keanekaragaman budaya kearifan lokal dunia maupun Indonesia karena dapat dan tradisional mengenai pengetahuan menyebabkan kematian. Berdasarkan data tumbuhan obat serta cara penggunaan statistik, kanker payudara dan kanker dalam menyembuhkan penyakit sehingga serviks menjadi jenis kanker yang paling menjadi cikal bakal penemuan obat baru sering terjadi pada wanita (Tjindarbumi yang berasal dari alam (Moelyono, 2014). and Mangunkusumo 2002). Kahung-kahung merupakan BAHAN tumbuhan anggota keluarga Leguminosae Bahan yang digunakan dalam marga Crotalaria yang secara empiris penelitian ini adalah simplisia daun dan digunakan oleh penduduk Sulawesi Utara biji kuhung-kuhung (Crotalaria pallida sebagai obat Leguminosae kanker. Keluarga Ait. ), etanol 96%, etil asetat, n-heksana, dilaporkan memiliki aquadest, kloroform, ammonia, Dimetil aktivitas sitotoksik (Khalighi, et al., 2012). Sulfoxide Selanjutnya untuk spesies yang termasuk pereaksi Dragendorff, peraksi besi (III) pada mengandung klorida, eter, vanilin, asam sulfat pekat, berpotensi asam asetat anhidrat, toluen, kalium sitotoksik terhadap sel kanker (Maioli, et hidroksida, larutan gelatin. Sel uji yang al., digunakan marga metabolit 2011) Crotalaria sekunder didukung yang pada penelitian (DMSO), untuk pereaksi pengujian Mayer, aktivitas sebelumnya terhadap beberapa spesies adalah sel kanker serviks HeLa dan sel yang memiliki marga Crotalaria (Srinivas, kanker payudara MCF-7 (Laboratorium 2012). Kultur Sel dan Sitogenetik RSP Universitas Padjadjaran), medium kultur Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 Roswell Park Memorial 3 (RPMI-160) polar seperti n-heksan, pelarut semi polar (Sigma), Fetal Bovine Serum (FBS) etil asetat dan pelarut polar yaitu air. (Gibco), Phospate buffer saline (PBS) Sejumlah ekstrak ditimbang dan dilarutkan (Gibco), antibiotik (100 U/mL penisilin dalam pelarut n-heksan dalam corong dan 100 µg/mL streptomisin), larutan pisah pewarna Soluble pemisahan dan dilakukan secara berulang Tetrazolium (WST-8) (Dojindo), Sodium hingga mendapatkan lapisan n-heksan Dodecil Sulphate (SDS). yang bening. Fraksi n-heksan kemudian MTT, kit Water lalu didiamkan hingga terjadi diambil dan dikumpulkan. Residu yang METODE EKSTRAKSI dihasilkan disimpan Bahan segar dikeringkan menjadi simplisia fraksinasi untuk kemudian dirajang dan dihaluskan hingga Sejumlah residu ditambahkan etil asetat menjadi serbuk simplisa. Simplisia halus dan didiamkan untuk didapatkan lapisan ditempatkan pada wadah untuk diekstraksi etil asetat selanjutnya dilakukan berulang menggunakan yaitu hingga di dapatkan lapisan etil asetat yang dengan etanol 96% selama 3 hari (3x24 bening kemudian dipisahkan. Residu yang jam). Selanjutnya maserat ditampung dan dihasilkan digunakan untuk fraksinasi pelarutnya rotary pelarut polar yakni air. Residu dikocok dan evaporator sehingga dihasilkan ekstrak didiamkan hingga didapatkan lapisan air kental. bening. FRAKSINASI PENAPISAN FITOKIMIA metode diuapkan Ekstrak kuhung-kuhung etanol maserasi dengan daun difraksinasi dan biji untuk pelarut dilakukan etil asetat. a. Pengujian Golongan Senyawa Alkaloid cair-cair Masing-masing bahan simplisia dan menggunakan pelarut dengan kepolaran ekstrak dibasahkan dengan menambahkan yang berbeda yaitu dengan pelarut non sedikit ammonia, kemudian dimasukkan Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 4 dalam mortar lalu digerus dengan stamper senyawa sambil 1966). ditambahkan kloroform. Selanjutnya lapisan kloroform diambil alkaloid (Farnsworth, b. Pengujian Senyawa Flavonoid dengan cara dipipet sambil disaring dan Bahan berupa simplisia dan ekstrak dipindahkan ke dalam tabung reaksi. masing-masing dimasukkan dalam tabung Setelah itu, pada tabung reaksi yang berisi reaksi filtrat ditambahkan asam klorida 2 N. magnesium dan asam klorida 2 N. Campuran dikocok dengan kuat hingga campuran dipanaskan di atas penangas air, terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam dipipet lalu dan dipisahkan menjadi 3 bagian. dimasukkan 1. Bagian pertama digunakan sebagai blanko 2. Bagian lalu dicampur disaring. Filtrat ke dengan yang tabung serbuk diperoleh reaksi lalu ditambahkan amil alkohol, lalu dikocok kuat-kuat. Apabila terbentuk warna jingga, kedua ditambahkan merah atau kuning maka menunjukkan pereaksi Mayer, amati perubahan bahwa positif terdapat senyawa flavonoid yang terjadi. Apabila terbentuk (Farnsworth, 1966). kekeruhan atau endapan putih, c. Pengujian Senyawa Polifenol menunjukkan adanya senyawa golongan alkaloid. 3. Bagian ketiga pereaksi Sejumlah kecil bahan simplisia dan ekstrak ditambahkan dimasukan ke dalam tabung reaksi lalu dipanaskan diatas amati penangas air, lalu disaring. Filtrat yang Bila diperoleh ditambahkan larutan pereaksi terbentuk kekeruhan atau endapan besi (III) klorida. Terbentuknya senyawa berwarna kuning jingga hijau-biru hitam menunjukkan adanya menandakan adanya golongan perubahan Dragendorff, masing-masing yang terjadi. senyawa polifenol (Farnsworth, 1966). dalam sampel Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 5 d. Pengujian Senyawa Kuinon vanillin 10% dalam asam sulfat pekat. Sejumlah kecil bahan dimasukkan kedalam tabung menunjukkan adanya dipanaskan di atas tangas air, lalu disaring. monoterpenoid dan Tambahkan larutan kalium hidroksida 5%. (Farnsworth, 1966). Adanya g. Pengujian Senyawa Triterpenoid dan senyawa reaksi, selanjutnya Adanya warna warna yang terbentuk kuinon ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga Sejumlah Bahan ekstrak dan simplisia dimassukkan masing-masing ke tabung berupa reaksi, lalu ditambahkan sedikit eter dan ekstrak maupun simplisia masing-masing dikocok, lalu larutan eter dipipet dan dalam tabung reaksi dipanaskan di atas ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat tangas air, lalu disaring. Kedalam filtrat dan 0,5 mL kloroform lalu dikocok. ditambahkan larutan gelatin 1%. Jika Larutan tersebut dimasukkan ke dalam terbentuk endapan putih menunjukkan tabung yang kering. Kemudian melalui bahwa dinding tabung diteteskan 1 mL asam bahan kecil seskuiterpenoid Steroid merah (Farnsworth, 1966). e. Pengujian Senyawa Tanin nyawa bahan mengandung golongan senyawa tanin (Farnsworth, 1966). sulfat pekat. Apabila terbentuk cincin f. Pengujian Senyawa Monoterpenoid dan merah kecoklatan atau ungu pada batas Seskuiterpenoid kedua larutan dan larutan pada bagian atas Bahan masing-masing simplisia digerus dan dengan ekstrak eter, menjadi hijau atau ungu menunjukkan positif steroid atau triterpenoid selanjutnya dipipet sambil disaring. Filtrat (Farnsworth, 1966). ditempatkan dalam cawan penguap, lalu h. Pengujian Senyawa Saponin dibiarkan menguap hingga kering. Hasil pengeringannya tambahkan larutan Bahan ekstrak dan simplisia dimasukkan masing-masing ke tabung Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 6 reaksi, lalu dicampur dengan air dan dalam dipanaskan kemudian diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37oC. disaring. Setelah dingin filtrat dalam Reaksi dihentikan dengan penambahan tabung reaksi reaksi dikocok kuat selama reagen stopper SDS (100 µl) dan akan lebih kurang 30 detik. Apabila terbentuk terlihat reaksi antara sel yang hidup busa setinggi lebih kurang 1 cm tinggi dan dengan MTT sehingga akan menjadi persisten selama beberapa menit serta warna kuning. Kemudian laju proliferasi tidak hilang pada saat penambahan 1tetes sel ditentukan dengan membaca microtiter asam klorida encer menunjukkan adanya plate reader dan mengukur absorbansi golongan senyawa saponin (Farnsworth, pada panjang gelombang 450 nnm. beberapa saat, 1966). masing-masing lubang dan . Selanjutnya, penentuan tingkat inhibisi proliferasi sel dtentukan dengan rumus : PENGUJIANAKTIVITAS ANTIPROLIFFERASI % inhibisi = TERHADAP Absorban blanko−Absorban sampel SEL KANKER PAYUDARA absorban blanko X 100 % Pengujian antiproliferasi terhadap sel kanker serviks Hela maupun sel kanker payudara MCF-7 dilakukan dengan penambahan beberapa variasi konsentrasi ekstrak maupun fraksi HASIL DAN PEMBAHASAN EKSTRAKSI, FRAKSINASI DAN PENAPISAN FITOKIMIA menggunakan metode MTT assay dengan menempatkan prosedur Sel (5 x 104- 5 x 105) dalam 96 lubang plate well. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya, 10 µL WST-8 cell counting solution ditambahkan ke Simplisia daun dan biji kuhungkuhung diperoleh (Crotalaria dari pallida Aiton) Langowan Timur Kabupaten Minahasa, Sulawesi Utara. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 7 ini adalah Crotalaria pallida Aiton, marga polar. Proses maserasi dilakukan selama Crotalaria, suku Fabaceae dan memiliki 3x24 sinonim Crotalaria striata DC. kemudian ditampung dan diuapkan dengan Sebanyak 1.195,45 gram daun jam. Maserat yang diperoleh menggunakan rotary vaporator untuk kuhung-kuhung dan 2.449,93 gram biji menguapkan kuhung-kuhung dirajang didihnya sehingga zat yang terkandung di menggunakan dalam pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi pelarut etanol 96%. Dalam penelitian ini agar mendapatkan ekstrak kental. Berat digunakan pelarut etanol, karena etanol ekstrak kental total daun kuhung-kuhung merupakan pelarut universal yang dapat diperoleh sebanyak 57 gram dan untuk biji menarik metabolit sekunder baik yang kuhung-kuhung kemudian yang dimaserasi sudah bersifat polar, semi polar maupun non pelarut dibawah 42 titik gram. Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 8 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak dan Fraksi C. pallida Ait. Sampel Fraksi Fraksi Daun Ekstrak Ekstrak No Gol Senyawa Biji n-h ea air n-h ea Ket : Biji Daun air 1 Alkaloid-Dragendorf - + + + + + + + 2 Flavonoid - + - - - + + - 3 Saponin + + + + + + + + 4 Triterpenoid + + - + + - + - 5 Steroid + + - + + - - + 6 Fenol - + + - + + + + 7 Monoterpen - + + - + + + - 8 Seskuiterpen - + - + + n-h : n-heksana ea : etil asetat + Hasil uji antiproliperasi ekstrak dan fraksi C. pallida Ait. Zat uji Konsentrasi IC50 8 16 31 63 125 250 500 1000 (µg/mL) Ekstrak etanol daun kuhung-kuhung 0 8 33 54 86 85 84 80 56.7 Fraksi N- heksan daun kuhung-kuhung 0 6 27 44 53 77 86 84 107.1 Fraksi Etil asetat daun kuhung-kuhung 0 16 54 79 89 86 83 77 29,67 Fraksi air daun kuhung-kuhung 0 0 18 65 85 82 >200 Ekstrak etanol biji kuhung-kuhung 12 18 29 46 28 35 57 84 >200 Fraksi N- heksan biji kuhung-kuhung 0 0 49 57 84 89 88 89 35.71 Fraksi Etil asetat biji kuhung-kuhung 1 22 40 65 52 68 86 88 44.25 0 0 Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 9 Fraksi air biji kuhung-kuhung 0 0 0 0 0 0 0 0 - Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air daun kuhung-kuhung % Penghambatan Proliferasi Sel terhadap sel kanker payudara MCF-7 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Konsentrasi (µg/ml) ekstrak etanol etil asetat n-heksan air Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air biji kuhung-kuhung terhadap % Penghambatan Proliferasi Sel sel kanker payudara MCF-7. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 200 400 600 Konsentrasi (µg/ml Ekstrak etanol etil asetat 800 n-heksan 1000 air 1200 Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 10 Telah dilakukan pengujian aktivitas biji, fraksi air daun dan biji tidak dapat antiproliferasi ekstrak dan fraksi dari daun memberikan kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton) terhadap sel kanker payudara MCF-7. dengan metode MTT assay terhadap sel KESIMPULAN kanker payudara MCF-7. Kanker penghambatan proliferasi Berdasarkan penelitian yang telah payudara dan kanker dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai serviks merupakan 2 jenis kanker yang berikut : paling sering menyebabkan kematian pada 1. wanita. Pada penelitian ini dilakukan uji mempunyai antiproliferasi dari daun maupun biji terhadap sel kanker payudara MCF-7. kuhung-kuhung (Crotalaria paliida Aiton) 2. Fraksi etil asetat daun, fraksi n-heksan terhadap sel kanker payudara MCF-7. biji, fraksi etil asetat biji dan ekstrak etanol Hasil WST assay menunjukkan bahwa daun berpotensi kuat dalam menghambat ekstrak maupun fraksi C. pallida Ait proliferasi sel kanker payudara MCF-7 menghambat sel kanker payudara MCF-7 dengan nilai IC50 berturut-turut dengan nilai IC50 terkecil 29,67 µg/mL µg/mL, 32.1 µg/mL, 44.25 µg/mL dan oleh fraksi etil asetat daun diikuti oleh 56.7 µg/mL. Fraksi n heksan daun, fraksi fraksi n-heksan biji, fraksi etil asetat biji etil asetat daun dan biji berpotensi sedang dan ekstrak etanol daun yang memiliki dengan IC50 107,14 µg/mL terhadap MCF- IC50 berturut-turut 32.1 µg/mL, 44.25 7, sedangkan ekstrak etanol biji, fraksi air µg/mL dan 56.7 µg/mL. Fraksi n heksan daun daun, fraksi etil asetat daun dan biji antiproliferatif baik terhadap MCF-7. memiliki nilai IC50 107,14 µg/mL terhadap sel kanker payudara MCF-7, 170,83 µg/mL sedangkan ekstrak etanol Daun dan dan biji C. aktivitas biji pallida Ait. antiproliferatif tidak 29,67 berpotensi Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 11 Maioli, M. A., Alves, L. C., Perandin, D., DAFTAR PUSTAKA Boldrin, P. K., Resende, F. A., Höhne, A. Garcia, A. F., Pereira, F. T., and P., de Camargo, M. S., Espanha, L. Mingatto, G., Nogueira, C. H., and Varanda, Cytotoxicity of monocrotaline in E. isolated rat hepatocytes: Effects of A. 2013. Estrogenic and F. E. mutagenic activities of Crotalaria dithiothreitol pallida measured by recombinant fructose. Toxicon, 57(7), yeast assay and Ames test. BMC 1064. complementary and (2011). and 1057- alternative medicine, 13(1):216. Moelyono, MW. 2014. Etnofarmasi. Yogyakarta : Deepublish.208-213 Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. J. pharm Sci (3): 243-269 Srinivas, N., Sandeep, K. S., Anusha, Y., and Devendra, B. N. 2014. In vitro Cytotoxic Khalighi-Sigaroodi, F., Hadjiakhoondi, M., Yazdani, Ahvazi, A., D., M., Taghizadeh, Khalighi- Evaluation Detoxification of Monocrotaline (Mct) Alkaloid: An approach. International silico Invention Journal Cytotoxicity Bioinformatics, 2(3), 20-29. antioxidant of in Sigaroodi, S., and Bidel, S. 2012. and and Biochemistry and activity of 23 plant species of Leguminosae family. IJPR, 11(1) : 295-302 Subarnas, A., Diantini A, Abdullah R, Zuhrotun A, et al 2015. Apoptosis induced in MCF-7 Human breast cancer cells by 2,4-dihydroxy-6- Farmaka Vol. 14 No. 2 2016 methoxy-3,5-dimethylchalcone isolated from Eugenia aquea Burn F. Leaves. Oncology Letters Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future. Jpn J Clin Oncol 32:17-21 12