Cover sampai daftar lampiran.rtf - USD Repository
advertisement
PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Nur’aniyah NIM : 048114040 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL SiHa SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Nur’aniyah NIM : 048114040 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2008 ii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI iii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI iv PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan (Surat Al Insyirah : 5) Anggaplah setiap step dalam hidup ini adalah proses untuk mencapai suatu kebahagiaan Barang siapa berbuat kebaikan seberat benda yang terkecilpun, maka ia akan melihatnya dan barang siapa berbuat keburukan seberat benda yang terkecilpun, maka ia akan melihatnya (Surat Al Zalzalah : 7 & 8) Dan sesungguhnya akhir itu adalah lebih baik bagimu daripada permulaan (surat Ad Duha : 4) Kupersembahkan karya ini untuk : Tuhanku Allah SWT ( 4JJI ) Mama, Mimi, Teteh Romi, Teteh Tika tercinta atas kasih sayang, do’a dan dukungannya Orang-orang yang menyayangiku Teman-teman dan Almamaterku v PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Nur’aniyah Nomor Mahasiswa : 048114040 Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul : “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa” beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Yogyakarta, 19 Juli 2008 Yang menyatakan (Nur’aniyah) PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI PRAKATA Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul ”Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan. Selesainya skripsi ini tidak lepas dari bantuan banyak pihak untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini. 3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya. 4. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan atas segala arahan, saran, kritik, dan waktunya. 5. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S. J., M. Sc., yang telah memberikan bimbingan dalam pengolahan data statistik dan memberikan banyak masukan dan saran. 6. Mbak Yuli dan segenap teknisi Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada yang telah membantu jalannya penelitian sehingga dapat terselesaikan dengan baik. 7. Mama, mimi, teteh romi & mas wendy, teteh tika & mas arief, atas kasih sayang, dorongan motivasi, do’a dan dukungannya selama ini. vi PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 8. Mas Ardiansyah yang senantiasa memberi dorongan motivasi, do’a, serta berbagi suka dan duka. 9. Rissa, Tika, Nophie, Rinta, Rina, Made ayu, Wida, Anna, Atin, Amanda, dan Novi buat persahabatan yang indah. Aku tak merasa sendiri karena kalian semua. 10. Ririt, Sisca, Meri, Eva, atas canda tawa, keluh kesah, kebersamaan dan kerjasamanya selama penelitian. 11. Teman-teman kosku : Fitri, Nancy, Agnes, Nita, Presty, dan teman-teman kelas FKK 2004 buat kebersamaan yang indah selama ini. 12. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini. Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, diharapkan kritik dan saran yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis bahwa skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat mendorong mahasiswa untuk berkarya lebih baik bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan kemajuan dunia farmasi di Indonesia. Penulis vii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI viii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI INTISARI Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel SiHa. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen kematian sel dan harga LC 50 yang kemudian diolah dengan analisis probit dan anova satu arah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC 50 yang diperoleh dari ekstrak etanolik daun sirih merah adalah 200,6 µg/ml. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas antikanker. Kata kunci: daun sirih merah, kanker, sel SiHa, sitotoksisitas, LC 50 ix PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI ABSTRACT Cancer is one of the most frightened disease because it causes death in all of the world. A lot of studies have been done to gain a new anticancer compound, one of them is the leaves of celebes pepper (Piper crocatum Ruiz & Pav). The objective of the research is to find out whether the ethanolic extract of celebes pepper leaves have cytotoxic against SiHa cells. This research is pure experimental with complete random and one way design. The cytotoxic test was obtained by applying a series concretation of ethanolic extract of celebes pepper leaves to SiHa cells. The cytotoxicity effect was determined using direct counting. The data were collected by counting the percentage of death cells and the LC 50 value were analyzed using probit statistic analysis and one way Anova. The result indicated that the ethanolic extract of celebes pepper leaves had cytotoxic effect to SiHa cells. The LC 50 value obtained from the ethanolic extract of celebes pepper leaves is 200,6 µg/ml. Therefore, the ethanolic extract of celebes pepper leaves might contains of compound that has anticancer activity. Keyword: celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, citotoxicity, LC50 value. x PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .................................................................................. .. ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ iii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... v PRAKATA..................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ viii INTISARI....................................................................................................... ix ABSTRACT..................................................................................................... x DAFTAR ISI.................................................................................................. xi DAFTAR TABEL.......................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xvii BAB I PENGANTAR ................................................................................... 1 A. Latar Belakang ...................................................................................... 1 1. Permasalahan ............................................................................... 3 2. Keaslian penelitian....................................................................... 4 3. Manfaat penelitian........................................................................ 4 Tujuan ................................................................................................... 4 1. Tujuan umum…… ....................................................................... 4 2. Tujuan khusus…………………………………………………. 4 B. xi PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................... 5 A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ............................... 5 1. Keterangan botani ........................................................................ 5 2. Sinonim ........................................................................................ 5 3. Nama daerah ................................................................................ 5 4. Deskripsi ...................................................................................... 5 5. Kandungan kimia ......................................................................... 6 6. Khasiat dan penggunaan .............................................................. 7 7. Penelitian mengenai tanaman sirih merah ................................... 8 B. Metode Penyarian..................................................................................... 9 1. Definisi ekstrak ............................................................................ 9 2. Cairan pelarut ............................................................................... 10 3. Maserasi ....................................................................................... 10 C. Kanker……………. ................................................................................. 11 D. Sel SiHa………........................................................................................ 13 E. Uji Sitotoksisitas ...................................................................................... 14 1. Metode MTT................................................................................ 15 2. Metode direct counting ................................................................ 16 F. Landasan Teori......................................................................................... 17 G. Hipotesis ................................................................................................... 17 BAB III METODOLOGI PENELITIAN .................................................... 18 A. Jenis dan Rancangan Penelitian............................................................... 18 xii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.......................................... 18 1. Variabel bebas.............................................................................. 18 2. Variabel tergantung...................................................................... 18 3. Variabel pengacau terkendali....................................................... 18 4. Definisi operasional ..................................................................... 19 C. Alat dan Bahan......................................................................................... 19 1. Alat ............................................................................................. 19 2. Bahan ........................................................................................... 20 D. Tata Cara Penelitian................................................................................. 20 1. Determinasi tanaman.................................................................... 20 2. Pengumpulan daun sirih merah.................................................... 21 3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ............................. 21 4. Sterilisasi alat dan bahan.............................................................. 22 5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ................. 22 6. Preparasi sel SiHa ........................................................................ 23 7. Pembuatan larutan uji................................................................... 24 8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah .................... 24 E. Analisis Hasil............................................................................................ 25 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 27 A. Determinasi Tanaman.............................................................................. 27 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah.............................................................. 27 C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah...................................... 28 xiii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI D. Sterilisasi Alat dan Bahan........................................................................ 29 E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa................. 30 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 42 A. Kesimpulan .............................................................................................. 42 B. Saran......................................................................................................... 42 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43 LAMPIRAN ................................................................................................... 47 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 68 xiv PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Nilai absorbansi ekstrak etanolik daun sirih merah dengan metode MTT......................................................... Tabel II. Potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.................................................... Tabel III. 33 35 Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (Direct Counting) pada Haemocytometer............................................................... Tabel IV. 48 Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari masing- masing sumuran.................................................... 48 Tabel V. Persentase kematian sel SiHa.............................................. 49 Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% ..................................................... xv 59 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Reaksi pembentukan kristal formazan........................................ 31 Gambar 2. Foto kristal formazan di bawah mikroskop................................. 31 Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persen kematian sel SiHa penetapan I.......................... 35 Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan I ........................................................ 37 Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan II ....................................................... 37 Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan III.................................................... 38 Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran pada jam ke-24.............................................................................. 40 Gambar 8. Foto tanaman sirih merah............................................................. 47 Gambar 9. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit pada sel SiHa....................................................... 62 Gambar 10. Foto alat dan bahan...................................................................... xvi 66 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)...... 47 Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa....... 48 Lampiran 3. Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel SiHa dan Analisis Hasil dengan One Way Anova.................................................................................... 50 Lampiran 4. Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting)............................................................................... 51 Lampiran 5. Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa………...…. 54 Lampiran 6. Cara perhitungan harga LC 50 …………………………...…. 56 Lampiran 7. Perhitungan nilai korelasi LC 50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa pada taraf kepercayaan 95%………………………...…....... 59 Lampiran 8. Grafik hubunga n antara log kadar dengan angka probit……...........................................………………….…. 51 Lampiran 9. Harga probit sesuai dengan persentasenya......………….… 63 Lampiran 10. Foto alat dan bahan yang digunakan.....……………….… 64 Lampiran 11. Identifikasi tanaman………………………...…................ 67 xvii PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit yang disebabkan karena adanya sel abnormal. Hingga kini penyebab pertumbuhan sel tubuh yang abnormal tersebut belum dapat diketahui secara pasti. Penderita kanker semakin meningkat setiap tahunnya. Di negara yang telah maju yang telah berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskular. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab utama kematian pada wanita antara 30-54 tahun dan anak-anak antara 3-14 tahun (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Di Indonesia setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker baru dari setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2007a). Saat ini kanker cervix menjadi kanker pembunuh nomor satu di Indonesia. Jumlah penderita kanker cervix adalah 90 hingga 100 per 100.000 penduduk, atau sekitar 230.137 orang yang 63% diantaranya sudah berada di stadium 3-4 dan 50% diantaranya meninggal (Angel, 2008). Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas, karena menghambat jumlah pembelahan sel normal yang proliferasinya cepat misalnya sumsum tulang, epitel germinativum, mukosa saluran cerna, folikel rambut dan 1 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 2 jaringan limfosit. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal yang berproliferasi (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Karena itu sangat diharapkan suatu antikanker yang memiliki toksisitas selektif menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel normal. Untuk mencari pengobatan kanker yang selektivitas aksinya ini, maka dilakukan berbagai penelitian yang terus dikembangkan sampai ke tingkat molekuler. Pada tingkat molekuler kelainan atau kerusakan sel yang mengubah sel normal menjadi sel kanker yang ganas terlihat jelas (Sofyan, 2000). Kesadaran akan bahaya bahan-bahan kimiawi hasil sintesis yang terkandung dalam obat-obatan modern menyebabkan obat-obatan tradisional yang diwariskan secara turun-temurun menjadi lebih penting dan bernilai. Bahan-bahan untuk itupun telah disediakan secara melimpah oleh alam Indonesia (Soedibyo, 1998). Merebaknya kecenderunga n atau tren hidup kembali ke alam (back to nature) semakin menambah keingintahuan masyarakat tentang khasiat tanaman obat. Salah satu tanaman yang dipercaya masyarakat dapat menyembuhkan kanker adalah tanaman sirih merah. Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan asam urat (Sudewo, 2005). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 3 Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel kanker untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunya i aktivitas terhadap sel kanker. Jenis sel kanker yang berbeda dapat mempunyai sensitivitas dan selektivitas yang berbeda pula terhadap obat-obat antikanker, oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap berbagai sel kanker. Pada penelitian ini dilakukan uji efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa. Penelitian uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa ini penting untuk mendapatkan informasi ilmiah tambahan tentang efek sitotoksik ekstrak daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa yang bisa mendukung pencarian obat antikanker dari bahan alam dan dapat digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker. 1. Permasalahan Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan permasalahan sebagai berikut : a. apakah ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa? b. seberapa besar harga LC 50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa? PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 4 2. Keaslian penelitian Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi ilmiah dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, kegunaan, dan efek sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. b. Manfaaat praktis Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai pembuktian secara ilmiah penggunaan ekstrak etanolik daun sirih merah sebagai obat antikanker dari bahan alam. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik. 2. Tujuan khusus Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga LC 50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah 1. Keterangan botani Famili : Piperaceae Genus : Piper Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav. (Anonim, 2007b) 2. Sinonim Piper ornatum N. E. Br. 3. Nama daerah Sirih merah 4. Deskripsi Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar. Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari 5 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 6 secara terus- menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005). 5. Kandungan Kimia Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). Flavonoid Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol yang umumnya ada dalam bentuk terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon. Yang terdapat pada tanaman biasanya merupakan bentuk kombinasi glikosida (Harbone, 1987). Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6 – C3 – C6 yang artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzen tersubsitusi) disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon. Flavonoid merupakan senyawa polar karena mempunyai gugus OH dan gula, maka umumnya flavonoid larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, dan air. Aktivitas flavonoid dalam sistem biologis sangat berarti antara lain sebagai antioksidan, antivirus, antihistamin, peluruh kemih, antihipertensi, dan bakterisida. Beberapa senyawa flavonoid juga dapat menghambat monoamin oksidase (MAO), protein kinase, DNA polimerase, dan hipoksigenase (Robinson, 1995). Flavonoid telah menunjukkan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator. Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksid atif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1996). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 7 Alkaloid Istilah alkaloid pada umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem siklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari sebagian besar komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa ini biasanya terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik (Robinson, 1995). 6. Khasiat dan penggunaan Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker (Sudewo, 2005). Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 8 7. Penelitian tanaman sirih merah Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005). Beberapa dari flavonoid terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker (Grotewold, 2006). Diet tinggi flavonoid, buah-buahan, dan sayuran melawan berbagai macam penyakit, terutama penyakit kadiovaskular dan beberapa tipe dari kanker (Ness and powles, 1997). Salah satu studi menunjukkan bahwa flavonoid menghambat karsiogenesis in vitro dan diindikasikan juga substansi in vivo (Caltagirone et al., 2000; Miyagi et al., 2000). Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia (Grotewold, 2006). Penghambatan proliferasi sel kanker payudara pada manusia dan keterlambatan dari tumorigenesis oleh flavonoid juga ditemukan (So et al., 1996). Flavonoid, diantaranya resveratrol dan quercetin pada kadar 100 µM mampu menghambat aspek-aspek angiogenesis (proliferasi, migrasi sel endotelial dan pembentukan pipa pembuluh darah) (Igura et al., 2001). Silymarin, suatu flavonoid antioksidan, sedang dikembangkan sebagai agen inhibitor terhadap enzim COX-2 (Tosetti et al., 2002). Beberapa penelitian mengenai flavonoid merekomendasikan PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 9 kemungkinan aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan diantaranya melalui penghambatan angiogenesis. Fraksi alkaloid daun jarong (Achyrantes aspera linn) diketahui dapat menghambat siklus pembelahan sel pada stadium metafase (Adyana, 2006). Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis. Alkaloid dari tanaman juga mempunyai kemampuan mengikat tubulin yaitu suatu protein yang menyusun mikrotubulus dengan menghambat atau memblokade polimerasi protein ke dalam mikrotubulus (Chabner et al., 2001). Golongan alkaloid tanaman dapat menyebabkan gangguan pada membran sel sehingga berakibat komponen penyusun membran akan berubah dan proses fisiologi membran akan terganggu dengan terjadi kerusakkan dan pengkerutan pada membran tersebut (Gill et al., 2001; Jujena et al., 2001). B. Metode Penyarian Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan- lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986). 1. Definisi ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dari massa atau serbuk yang PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 10 tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995). 2. Cairan pelarut Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut, ekonomis, ramah lingkungan, dan keamanan (Anonim, 2000). Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas (Anonim, 1986). 3. Maserasi Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Maserasi digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain (Anonim, 1986). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 11 C. Kanker Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (Anonim, 2007c). Kanker adalah suatu penyakit di mana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat, dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan sel-sel baru (Dalimartha, 2006). Dikenal beberapa jenis kanker, seperti karsinoma, sarkoma, limfoma (neoplasma sistem limfatik) atau leukemia (neoplasma ganas sel darah putih). Karsinoma merupakan tumor ganas yang berasal dari sel epitel, misalnya kanker payudara, kanker kulit, dan kanker lambung. Sarkoma merupakan tumor ganas yang berasal dari jaringan mesodermal, misalnya fibrosarkoma (tumor ganas jaringan ikat), limfosarkoma (tumor ganas sistem limfatik), dan osteosarkoma (tumor ganas pada tulang) (Dalimartha, 2006). Kanker dibedakan menjadi dua macam jenis kanker yaitu kanker jinak (benigna) dan kanker ganas (maligna) (Macdonald and Ford, 1997). Disebut kanker jinak apabila kanker membentuk suatu massa sel tunggal dan belum mempengaruhi sel atau jaringan sekitarnya. Jika sel telah menginvasi jaringan disekitarnya dan masuk ke dalam aliran darah atau limfa maka disebut kanker ganas (Albert et al, 1994). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 12 Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen dapat menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dibandingkan yang lain dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald and Ford, 1997). Sejalan dengan pertumbuhan dan perkembangbiakannya, sel-sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas yang menyusup ke jaringan di dekatnya dan bisa menyebar ke seluruh tubuh. Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali dengan kerusakan gen pada regulator siklus sel. Pertumbuhan kanker merupakan proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung dalam beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis di mana dimulai dari satu sel kanker yang memperbanyak diri dan membentuk satu koloni kecil dalam jaringan yang sama dan mengakibatkan terjadinya perubahan genetik (Sherr, 1996). Karsinogenesis merupakan proses terjadinya kanker yang berlangsung lama. Karsinogenesis dapat terjadi akibat salah satu atau kombinasi faktor karsinogen kimiawi, alami, radiasi, biologis dan genetik. Perubahan akibat rangsangan faktor karsinogen tersebut melibatkan perubahan gen dari sel neoplasia atau sel yang mengalami transformasi (Soeripto, 1998). Kanker terjadi karena pemaparan berulangulang oleh satu atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 13 Sel kanker memiliki karakteristik sebagai berikut : a. Sel kanker mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri. Sinyal pertumbuhan diperlukan agar sel dapat terus membelah. Berbeda dari sel normal, sel kanker dapat tetap dan terus tumbuh. b. Tidak sensitif terhadap sinyal anti-pertumbuhan. Sel kanker tidak merespon adanya sinyal yang dapat menghentikan terjadinya pertumbuhan dan pembelahan sel, dengan demikian, sel kanker dapat terus membelah. c. Sel kanker mampu menghindar dari mekanisme apoptosis. Apoptosis merupakan program bunuh diri sel ketika sel tersebut mengalami kerusakan, baik struktural maupun fungsional, yang tidak dapat ditolerir lagi. Namun sel kanker dapat menghindar dari kematian dengan mengeblok jalur terjadinya apoptosis di dala m sel. d. Sel kanker memiliki potensi tak terbatas untuk mengadakan replikasi. e. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis untuk mencukupi kebutuhannya akan oksigen dan nutrisi. Akan terbentuk cabang baru pada pembuluh darah yang menuju sel kanker yang kemudian akan mensuplai kebutuhan nutrisi dan oksigen dari sel kanker. f. Sel kanker mampu menginvasi jaringan di sekitarnya dan membentuk anak sebar. (Hanahan dan Weinberg, 2000) D. Sel SiHa Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel jaringan primer dari PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 14 suatu karsinoma cervix dan merupakan squamosa yang tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip denga n sel epitelial dan sel ini me ngandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2007d). Kanker serviks berkembang secara bertahap, tetapi progresif. Proses terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi lalu berkembang menjadi sel displastik sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia (Dalimartha, 2006). Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa karsinoma yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai adenosquamosa karsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor- faktor penyebab kanker cervix antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-ganti, perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi metastasis yang jauh (King, 2000). E. Uji Sitotoksisitas Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan, pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik dari suatu senyawa (Freshney, 1986). Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000). Uji sitotoksisitas merupakan uji toksisitas secara in vitro pada suatu kultur sel. Metode in vitro mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan metode in vivo, PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 15 yakni metode in vitro lebih ekonomis, lebih mudah dan ditinjau dari segi kemanusiaan atau moralitas percobaan, metode in vitro lebih manusiawi daripada in vivo. Namun kerugian in vitro adalah kadang-kadang tidak memberikan efek senyawa uji yang sama dengan bila diberikan secara in vivo (Freshney, 1986). 1. Metode MTT Uji sitotoksik dilakukan dengan metode mikrotitrasi yang merupakan metode uji yang efisien, dalam satu plate terdapat 96 sumuran sehingga lebih banyak data yang didapatkan. Tiap sumuran memiliki luas 28 – 32 mm2 dengan kapasitas medium sebanyak 0,1 atau 0,2 ml. Dengan metode uji ini semua populasi sel terpapar sampel uji (Freshney, 2000). Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil- tiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel (Barille, 1997). Kemampuan sel untuk mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel . Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm dengan menggunakan microplate reader (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 16 2. Metode Direct Counting Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien adalah denga n menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat dilakukan. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan. Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan replikasi yang tetap. Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode yang paling sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000). Jika suatu uji sitotoksisitas menghasilkan harga LC 50 kurang dari 1000 µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan bersifat toksik dan bila lebih besar dari 1000 µg/ml maka senyawa tersebut dinyatakan tidak toksik terhadap senyawa uji (Meyer et al, 1982). Menurut NCI (National Cancer Institute) yang menyatakan suatu senyawa berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC 50 = 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991). PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 17 F. Landasan Teori Penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavanoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri. Genistein dan daidzein dapat menghambat perkembangan dari kanker yang berkenaan dengan hormon dan non hormon maupun keduanya, termasuk kanker payudara, kanker prostat dan kanker kulit pada tikus. Banyak flavonoid dapat menghambat proliferasi dari berbagai tipe kultur sel kanker manusia. Alkaloid yang berasal dari tanaman vinka bekerja spesifik pada siklus sel dengan menghambat proses mitosis. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau pelarut lain. Etanol dapat melarutkan alkaloid, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin, dengan demikian zat pengganggu yang larut hanya terbatas. G. Hipotesis Ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah. B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml. b. Variabel tergantung Persentase kematian sel SiHa. c. Variabel pengacau terkendali 1. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum. 2. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama. 3. Kematian alami sel dapat dikendalikan dengan kontrol dan pemberian nutrisi. 18 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 19 2. Definisi Operasional a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. b. Ekstrak etanolik adalah ekstrak etanolik daun sirih merah dan dinyatakan dalam µg/ml. c. Sel SiHa adalah salah satu sel kanker cervix yang menyebabkan kematian yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV16). d. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan dinyatakan dalam µg/ml. C. Alat dan Bahan 1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas, autoklaf, alumunium foil, Waterbath, Oven, Blender, Ayakan, inkubator CO2 (Memmer), timbangan analitik (Mettler Toledo), tissue, glove, masker, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge, mikropipet, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2), haemocytometer (Neubauer), ELISA reader. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 20 2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : a. Bahan utama : daun sirih merah segar b. Bahan untuk ekstraksi : etanol 70 % c. Uji sitotoksisitas : 1. Kultur sel SiHa yang diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. 2. Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Sigma), Natrium bikarbonat, dan hepes. 3. Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Sigma), FBS (Fetal Bovine Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco). 4. Pewarna Trypan blue (Sigma) 5. DMSO (Dimetil Sulfoksidase) 6. Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck) 7. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma) 8. Tripsin 0,5 % 9. Aquabidest D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih merah segar, yang telah dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Biologi Farmasi, PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 21 Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya me nggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965). 2. Pengumpulan daun sirih merah Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di daerah Mantenan, Mertoyudan, Magelang, Jawa Tengah. 3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah a. Pembuatan serbuk Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 65-70°C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak menggunakan ayakan 0,75 mm. b. Pembuatan ekstrak daun sirih merah Serbuk simplisia diekstrak secara maserasi memakai etanol 70%. Untuk tiap 100 gram serbuk digunakan 700 ml etanol 70%. Maserasi yang digunakan adalah secara remaserasi, yakni dengan menambahkan 100 gram serbuk simplisia dengan 500 ml etanol 70% dalam Erlenmeyer, kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam sari diserkai, dis aring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari sebanyak 200 ml, diaduk dan diserkai. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari kemudian endapan dipisahkan. Rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira- PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 22 kira 3 x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring, kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65o C, dibantu dengan kipas angin sampai kental. 4. Sterilisasi alat dan bahan Alat–alat gelas yang akan digunakan dalam keadaan steril, dicuci sampai bersih dan dikeringkan dalam oven. Setelah kering, alat-alat tersebut dibungkus dengan kertas payung, kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121o C selama 20 menit dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005). 5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh a. Pembuatan medium pencuci Media RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml. Larutan selanjutnya dihomogenkan dengan magnetic stirrer, kemudian di buffer dengan HCL 1 N hingga pH nya 7,2 sampai 7,4 dengan pH meter. Selanjutnya larutan disterilkan dengan penyaringan menggunakan membran filter polietilensulfon steril berdiameter 0,22 µm secara aseptis. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4o C (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979., Sambrook et al, 1989). b. Pembuatan medium penumbuh Untuk medium RPMI 1640-serum, ditambahkan FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter polietilensulfon berdiameter 0,22 µm. Media disimpan dalam PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 23 almari es pada suhu 4o C (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook, Fritsch dan Maniatis, 1989). 6. Preparasi sel SiHa a. Propagasi sel SiHa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37o C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifugasi kembali selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet sel ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37o C dengan aliran 5% CO2 . Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). b. Panen sel SiHa Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 24 diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 µl dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). 7. Pembuatan larutan uji Ekstrak kental ditimbang, dilarutkan dengan pelarut DMSO dan diaduk dengan homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Sebelum digunakan sediaan ekstrak disterilkan dengan filter membran. Dari sediaan steril ekstrak induk tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml. 8. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2x104 /100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate yang telah berisi 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar 1000 µg/ml pada sumuran A1 , B1 dan C1 pada kolom 1, kemudian pada sumuran A2 , B2 dan C2 di kolom 2 ditambahkan 100 µl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100 µl ekstrak daun sirih dengan kadar 750 µg/ml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Untuk kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 25 selama 24 jam pada suhu 37o C, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). Pada akhir inkubasi, ke dalam masing- masing sumuran ditambahkan 10 µl MTT 5 µg/ml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37o C, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 µl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. b. Uji Sitotoksisitas dengan Metode Direct Counting Seratus µl suspensi sel SiHa dengan kepadatan 2,0x104 sel/ 100 µl dimasukkan ke dalam sumuran pada 96-well plate, ditambah ekstrak uji pada kadar masing- masing 125 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml; 750 µg/ml; dan 1000 µg/ml. Untuk kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh. Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37o C. Pada akhir masa inkubasi tiap sumuran diresuspensi, ditambah 50 µl Trypan blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl untuk pengamatan. Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap dihitung dengan counter dibawah mikroskop. 9. Analisis hasil Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode perhitungan langsung (direct counting). Disini harga persentase kematian dapat ditentukan dengan PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 26 menghitung jumlah sel hidup sebagai kontrol dikurangi dengan jumlah sel hidup dengan adanya perlakuan, kemudian dibagi dengan jumlah sel hidup sebagai kontrol dan dikalikan 100 %. % kematian sel = ∑ sel hidup kelompok kontrol − ∑ sel hidup kelompok perlakuan ×100 % ∑ sel hidup kelompok kontrol Untuk menghitung harga LC 50 dilakukan perhitungan secara statistik menggunakan analisis probit (Mursyidi, 1985). Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui hubungan konsentrasi-respon (persen kematian sel) agar diperoleh persamaan garis lurus sehingga dapat digunakan untuk menentukan LC50 . Sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data dengan statistik Anova satu arah dengan sebelumnya dilakukan uji KolmogorovSmirnov untuk mengetahui distribusi datanya. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Penelitian ini menggunakan bahan utama berupa daun sirih merah. Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman sebelum digunakan dalam suatu penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Unive rsitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan mengacu pada referensi baku (Backer dan Van den Brink, 1965). Hasil yang diperoleh dari determinasi menyatakan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah benar tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). B. Pengumpulan Daun Sirih Merah Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diambil pada bulan September tahun 2007 di Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Jawa Tengah. Daun sirih merah diambil dari satu pohon dan dalam waktu sekali panen dengan tujuan untuk menghindari kemungkinan terjadinya perbedaan kualitas dan kandungan kimia yang terdapat pada daun sirih merah. Pengambilan bahan dari daerah yang berbeda dapat mengakibatkan kandungan kimia yang bervariasi. Dipilih daun yang tidak terlalu tua dan terlalu muda, sehingga diharapkan mempunyai kandungan senyawa aktif yang optimal. Daun sirih merah yang telah terkumpul dibersihkan dengan dari kotorankotoran yang menempel, seperti debu, serangga, dan benda asing lainnya. Daun sirih merah yang sudah dibersihkan kemudian dikeringkan sampai kering dengan cara 27 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 28 dimasukkan ke dalam oven pada suhu 60 – 70 °C untuk mengurangi kandungan air, dengan demikian reaksi enzimatis dapat diminimalkan dan menjamin agar kualitasnya tetap baik. Simplisia yag sudah kering diserbuk dengan blender dan diayak dengan ayakan 0,75 mm untuk memperkecil ukuran partikel. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara maksimal. C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Seratus gram serbuk sirih merah direndam dengan cairan penyari etanol 70%. Pemilihan etanol sebagai cairan penyari didasarkan pada kandungan senyawa yang ada dalam daun sirih merah yaitu flavonoid, alkaloid, polifenolat, minyak atsiri dan tanin yang dapat larut ke dalam etanol. Selain itu, etanol sebagai cairan penyari dikarenakan etanol merupakan pelarut universal. Beberapa kelebihan etanol antara lain lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan, panas ya ng digunakan untuk pemekatan lebih sedikit. Penyarian simplisia daun sirih merah menggunakan metode maserasi Beberapa kelebihan dari metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Selain itu metode maserasi tidak menggunakan pemanasan sehingga senyawa-senyawa yang tidak tahan panas tinggi dapat terhindar dari kerusakan. Maserasi dilakukan dalam bejana tertutup agar etanol PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 29 tidak menguap karena etanol mudah menguap pada suhu kamar dan mencega h masuknya kontaminan dari luar. Pada proses maserasi, serbuk daun sirih merah direndam selama 3x24 jam sambil sesekali diaduk. Perendaman dimaksudkan agar susunan sel sampel akan dapat larut dalam cairan penyari. Sedangkan pengadukan bertujuan agar penyari dapat mengalir secara berulang-ulang ke dalam serbuk halus sehingga memungkinkan adanya interaksi antara penyari dengan serbuk. Pada umumnya larutnya zat aktif akan terjadi apabila penyari menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang berisi zat aktif yang dapat larut dalam penyari. Zat aktif dapat keluar dari rongga sel kemungkinan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel. D. Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi bertujuan untuk menghilangkan kontaminasi mikroorganisme dari alat yang akan digunakan dalam penelitian ini. Proses sterilisasi sangat penting dalam penelitian ini karena objek penelitian merupakan sel yang sangat rentan terhadap adanya kontaminan sehingga dengan adanya kontaminan akan mempengaruhi kematian sel. Oleh karena itu alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu untuk menghilangkan semua pengotor dan kontaminan yang bisa mengganggu pada saat penelitian. Alat-alat tersebut dicuci sampai bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas payung kemudian disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan autoklaf selama kurang lebih 20 menit dengan suhu 1210 C dan tekanan 2,05 abs bar. Prinsip kerja dari PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 30 autoklaf ialah sterilisasi dengan uap bertekanan yaitu dengan menaikkan tekanan hingga suhu tinggi sehingga terbentuk uap air panas. Uap air panas tersebut akan membunuh mikroorganisme dengan menyebabkan terjadinya koagulasi dan denaturasi protein pada mikroorganisme. E. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. Dengan uji ini dapat diketahui konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan sel sampai 50 %. Dapat dikatakan bahwa uji sitotoksisitas yang dilakukan bersifat kuantitatif, yaitu dengan parameter uji sitotoksisitas yang digunakan adalah LC 50 (Lethal Concentration 50 %) yang merupakan implementasi potensi ketoksikan suatu senyawa. Uji sitotoksisitas yang dilakukan pada awalnya menggunakan metode MTT. Pemilihan metode MTT karena metode MTT ini termasuk metode yang cukup akurat karena absorbansi yang terbaca sebanding dengan jumlah sel hidup yang masih aktif melakukan metabolisme. Selain itu, uji ini juga dirasa cukup aman, sederhana, dan cepat. Aman karena tidak memerlukan penggunaan zat-zat yang berbahaya, sederhana karena perlakuan yang harus diberikan pada sampel sebelum diuji relatif cukup mudah, dan cepat karena waktu yang dibutuhkan cukup singkat sehingga sangat memungkinkan untuk menguji sampel dalam jumlah yang cukup banyak. Namun metode MTT ini juga memiliki kelemahan. Salah satunya adalah tidak tepat untuk menguji sampel yang berwarna karena dikhawatirkan dapat mempengaruhi absorbansi yang terbaca oleh ELISA Reader. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 31 bromide) merupakan suatu garam yang larut air. Prinsip uji sitotoksisitas dengan metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium MTT oleh enzim mitokondrial dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria sel sehingga terbentuk formazan yang berwarna ungu. Br N NADH N N N NH CH3 N N S CH3 NAD+ N N CH3 N S CH3 Formazan MTT Gambar 1. Reaksi Pembentukan Formazan Intensitas warna yang terbentuk kemudian ditetapkan absorbansinya dengan pembacaan ELISA reader. Pengukuran menggunakan ELISA Reader dilakukan pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Gambar 2. Formazan di Bawah Mikroskop (perbesaran 100x) PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 32 Namun pada penelitian ini, ternyata ELISA reader tidak mampu membaca dengan tepat intensitas warna ungu formazan yang terbentuk akibat reaksi MTT dengan kultur sel SiHa. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh warna coklat dari ekstrak etanolik daun sirih merah yang digunakan sebagai senyawa uji. Warna coklat dari ekstrak etanolik ini dapat berpengaruh pada nilai absorbansi yang dihasilkan, karena kemungkinan terjadi penambahan intensitas warna sehingga absorbansi yang terbaca menjadi lebih besar daripada nilai yang sebenarnya. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran absorbansi dari perlakuan dan kontrol pada masing- masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah. Hasil yang diperoleh antara pembacaan absorbansi dengan ELISA reader ternyata tidak signifikan dengan foto kultur sel SiHa. ELISA reader memberikan absorbansi yang rendah namun pada foto terlihat bahwa kultur sel SiHa pada seri konsentrasi selnya masih hidup. Seharusnya apabila absorbansinya rendah maka sel banyak yang mati. Karena hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT memberikan data yang fluktuatif, maka selanjutnya dilakukan metode penghitungan langsung (direct counting). Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas dengan metode MTT pada inkubasi selama 24 jam dapat dilihat pada tabel berik ut : PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 33 Tabel 1. Tabel nilai absor bansi ekstrak etanolik daun sirih merah dengan Metode MTT Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml) Kontrol 125 250 500 1000 2000 4000 8000 16000 32000 I Absorbansi 0,994 0,897 0,863 0,847 0,924 0,969 1,034 1,133 1,353 1,520 Penetapan II Absorbansi 1,050 0,879 0,860 0,851 0,882 0,928 0,983 1,118 1,337 1,483 III Absorbansi 1,127 0,903 0,907 0,865 0,936 0,938 0,977 1,071 1,330 1,458 Dari tabel di atas dapat dilihat bahwa semakin besar kadar ekstrak etanolik daun sirih merah maka semakin besar pula nilai absorbansi yang diperoleh, hal ini dikarenakan pengaruh dari warna ekstrak etanolik daun sirih merah yang ikut terbaca. Padahal intensitas warna yang terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar absorbansi berarti semakin banyak sel hidup yang aktif melakukan metabolisme dan sebaliknya, semakin kecil absorbansi yang terbaca menunjukkan semakin sedikit sel yang hidup. Dengan demikian, metode MTT pada penelitian ini tidak dapat digunakan. Selanjutnya uji sitotoksisitas menggunakan metode direct counting (Perhitungan langsung), yang dilakukan dengan menghitung jumlah sel hidup perlakuan kemudian dibandingkan dengan jumlah sel hidup kontrol (kontrol media). Metode ini disebut juga metode trypan blue, metode ini tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak etanolik daun sirih merah. Pada metode ini, penghitungan dilakukan PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 34 secara manual terhadap sel hidup setelah sebelumnya kultur sel diwarnai dengan reagen trypan blue. Sel yang mati akan menyerap reagen sehingga warnanya lebih gelap daripada sel hidup. Kelemahan dari metode direct counting adalah waktu yang dibutuhkan untuk menghitung sel terlalu lama dan subjekstivitasnya sangat tinggi. Oleh karena itu sebaiknya perhitungan sel dilakukan oleh satu orang dan orang yang sama untuk menghindari atau mengurangi variabel kesalahan yang terlalu besar. Pada penelitian ini, seri kadar yang digunakan sebanyak 5 konsentrasi dengan konsentrasi tertinggi 1000 µg/ml dan konsentrasi terendah 125 µg/ml. Sebagai kontrol dimasukkan media kultur RPMI 1640 100 µl beserta suspensi kultur sel SiHa. Plate diinkubasi dalam inkubator CO2 5 % + 95 % O2 selama 24 jam. Jumlah sel yang hidup dihitung di bawah mikroskop menggunakan haemocytometer dengan penambahan trypan blue. Untuk mempermudah perhitungan sel dilakukan resuspensi terlebih dahulu. Hal ini bertujuan untuk melepaskan sel dari dinding plate. Pengaruh pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa dapat dilihat pada tabel sebagai berikut : PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 35 Tabel II. Tabel potensi ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml) 125 250 500 750 1000 Persen kematian sel SiHa (%) Penetapan I Penetapan II Penetapan III 42,86 54,29 65,71 74,29 77,14 41,43 52,86 65,71 74,29 77,14 41,43 54,29 65,71 74,29 77,14 Harga LC 50 diperoleh dengan analisis probit (Mursyidi, 1985). Untuk memperoleh harga LC 50 ini diperlukan data yang tercantum pada tabel II dan harga probit untuk tiap persentase kematian sel dapat dicari dari tabel probit, kemudian dibuat regresi linier antara log kadar dengan harga probit. % kematian Grafik kadar vs % kematian sel SiHa 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Kadar (microgram/ml) Gambar 3. Grafik hubungan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap % kematian sel SiHa penetapan I PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 36 Pada gambar 3 dan tabel II dapat dilihat bahwa kenaikan kadar ekstrak etanolik daun sirih merah akan menaikkan persentase kematian sel SiHa, hal ini berarti jumlah sel yang hidup semakin kecil. Pada tabel II, penetapan I kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil yaitu 42,86 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Penetapan II, kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil ya itu 41,43 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Sedangkan pada penetapan III, kadar terendah ekstrak etanolik daun sirih merah 125 µg/ml menyebabkan persen kematian terkecil yaitu 41,43 %, sedangkan pada kadar tertinggi 1000 µg/ml menyebabkan persen kematian terbesar yaitu 77,14 %. Dari uji sitotosisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa diperoleh harga LC 50 sebesar 200,6 µg/ml. Berdasarkan NCI (National Cancer Institute), suatu senyawa dinyatakan berpotensi sebagai antikanker bila memiliki harga LC 50 = 20 µg/ml (Suffness dan Pezzuto, 1991). Meskipun harga LC50 cukup besar tetapi belum dapat mengatakan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah tidak berpotensi sebagai antikanker dikarenakan senyawanya masih berupa ekstrak dan belum berupa senyawa tunggal. Dapat dilihat dari tabel potensi ketoksikan dari tiap penetapan, maka ekstrak etanolik daun sirih merah ini masih mempunyai kemampuan untuk membunuh sel SiHa. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak etanolik PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 37 daun sirih merah ini mempunyai suatu senyawa yang dapat membunuh sel kanker, meskipun dalam jumlah kecil. Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,039x + 2,6264 R2 = 0,9999 Angka probit 6 5 4 3 2 1 0 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Log kadar Gambar 4. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan I Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,095x + 2,466 6 2 R =1 Angka probit 5 4 3 2 1 -3 -2 -1 0 -1 0 1 2 3 4 Log kadar Gambar 5. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan II PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 38 Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,087x + 2,491 R2 = 1 6 Angka probit 5 4 3 2 1 -3 -2 -1 0 -1 0 1 2 3 4 Log kadar Gambar 6. Grafik hubungan log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit penetapan III Untuk memperjelas hubungan antara kadar ekstrak etanolik daun sirih merah yang diberikan dengan persen kematian sel yang diperoleh maka dibuat grafik hubungan antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah vs angka probit seperti terlihat pada gambar 4, 5, dan 6. Pada gambar 4, 5, dan 6 terlihat bahwa terdapat hubungan yang linier antara log kadar ekstrak etanolik daun sirih merah dengan angka probit. Selain itu dilakukan pula penelitian terhadap sel kanker yang lain, yaitu pada sel HeLa dengan harga LC 50 sebesar 1.143,1 µg/ml (Atmaningsih, 2008), sel Raji dengan harga LC 50 sebesar 395,5 µg/ml (Dwikusumaningtyas, 2008), sel T47D dengan harga LC 50 sebesar 587,7 µg/ml (Neritika, 2008), dan sel Myeloma dengan harga LC 50 sebesar 434,1 µg/ml (Meri, 2008). Berdasarkan harga LC 50 yang diperoleh, dapat dilihat bahwa masing- masing sel kanker mempunyai harga LC 50 39 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI yang berbeda-beda. Hal ini kemungkinan disebabkan karena masing- masing sel kanker mempunyai karakteristik dan morfologi sel yang berbeda pula, sehingga besarnya harga LC 50 yang diperoleh pada masing- masing sel kanker berbeda. Seperti halnya pada sel HeLa, sel HeLa diketahui mempunyai membran sitoplasma yang lebih tebal, oleh karenanya dibutuhkan jumlah ekstrak daun sirih merah yang lebih besar untuk dapat berpenetrasi ke dalam sel. Selain mengamati jumlah sel yang hidup yang merupakan implementasi persen kematian sel, ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah juga dapat dilihat dari gambaran morfologi sel secara mikroskopik untuk mengetahui adanya perbedaan morfologi sel yang dikenai perlakuan dan yang tidak dikenai perlakuan. (b) (a) i ii (c) (d) PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 40 Gambar 7. Foto penampakan morfologi sel SiHa dalam sumuran pada jam ke 24 (a) kontrol sel (b) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 250 µg/ml (c) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 500 µg/ml (d) perlakuan dengan ekstrak etanolik daun sirih merah kadar 750 µg/ml (perbesaran 100x) Ket : (i) sel hidup (ii) sel mati Sel SiHa yang masih hidup tampak seperti helaian daun, berbentuk panjang, tampak cerah dan menempel di dasar sumuran. Dikarenakan membran sel nya masih utuh sehingga trypan blue tidak dapat berikatan dengan protein. Sel SiHa yang mati tampak berbentuk bulat, tampak gelap keruh, berukuran lebih kecil, dan tidak menempel di dasar sumuran. Hal ini dikarenakan pada sel yang mati terjadi kerusakan membran yang mengakibatkan protein di dalam sel akan keluar dan berikatan dengan trypan blue sehingga tampak berwarna biru. Selain dari morfologi kita juga dapat mengetahui ketoksikan ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa dengan membandingkan kerapatan sel antara kontrol media dengan perlakuan ekstrak etanolik daun sirih merah. Semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah, maka kerapatan sel hidupnya akan semakin kecil. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memberikan pengaruh dengan menginduksi kematian sel. Langkah lain yang dapat ditempuh untuk memperkecil harga LC 50 dari ekstrak etanolik daun sirih merah ini adalah dilakukannya fraksinasi sehingga diperoleh senyawa-senyawa yang lebih efektif dalam membunuh sel kanker. Analisis variansi (anova) satu arah digunakan untuk menguji apakah ratarata lebih dari dua sampel berbeda signifikan atau tidak. Pada penelitian ini anova digunakan untuk menguji apakah ada beda antara perlakuan dan kontrol. Sebelum PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 41 dilakukan analisis variansi (anova), terlebih dahulu dilakukan uji KolmogorovSmirnov untuk mengetahui apakah data yang ada terdistribusi normal atau tidak. Dari hasil uji Kolmogorov-Smirnov diperoleh hasil bahwa distribusinya normal. Dari hasil analisis anova satu arah diperoleh hasil bahwa ada perbedaan secara signifikan antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol yang digunakan (a < 0,05). Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa. Hasil penelitian ini tidak berbeda dengan penelitian terhadap sel Hela, sel T47D, sel Raji, dan sel Myeloma, yakni sama-sama mempunyai aktifitas sitotoksik karena hasilnya berbeda signifikan antara kontrol dan tiap perlakuan. Selain uji- uji diatas, dilakukan juga uji linieritas untuk mengetahui apakah data yang diperoleh linier atau tidak. Dari hasil analisis diperoleh bahwa harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa signifikan untuk taraf kepercayaan 95 %, di mana r hitung lebih besar dari r tabel. Pada penetapan I diperoleh nilai r hitung = 0,99856 dan r tabel = 0,878; penetapan II diperoleh nilai r hitung = 0,99914 dan r tabel = 0,878; dan penetapan III diperoleh nilai r hitung = 0,99927 dan r tabel = 0,878. Dari uraian nilai r hitung yang diperoleh dengan nilai r tabel diatas dapat dilihat bahwa nilai r hitung yang diperoleh pada masing- masing penetapan lebih besar dari nilai r tabel, maka dapat disimpulkan bahwa korelasinya linier. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa dengan harga LC 50 sebesar 200,6 µg/ml. B. Saran 1. Perlu dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak etanolik daun sirih merah untuk selanjutnya diteliti potensi sitotoksisitasnya. 2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel normal. 3. Perlu dilakukan ekstraksi dengan pelarut yang berbeda, terutama pelarut nonpolar yang dilanjutkan dengan uji sitotoksisitasnya untuk mengetahui potensi ketoksikan pada pelarut tersebut. 42 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Adyana, I.D.P., 2006, Efek Anti Telomerase Fraksi Alkaloid Terhadap Pembelahan dan Mitosis Sel Mieloma Mencit, Skripsi, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Albert, B., P., Lewis, J., Ratt, M., Roberts, K. dan Watson, J.D., 1994, Molecular Biology of The Cell, Third Edition, Garland Publishing Inc., New York Angel, 2008, http://angel.crysta-corp.com/?p=51, diakses februari 2008 Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan I, 9-11, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2007a, Apa Yang Harus Anda Ketahui Tentang Kanker, http://www.mastel.or.id/indonesia/Artikel%20Kesehatan/Apa%20Yang%20 Harus%20Anda%20Ketahui%20Tentang%20Kanker.htm, Diakses pada Oktober 2007 Anonim, 2007b, Piper crocatum taxonomy, http://zipcadezoo.com/plants/p/piper_crocatum.asp, diakses pada tanggal 9 Agusus 2007 Anonim, 2007c, http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer, diakses pada oktober 2007. Anonim, 2007d, SiHa Cell, http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/308.htm, diakses pada September 2007 Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen. Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43, Academic Press, Valencia, Spanyol. 43 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 44 Caltagirone, S., Rossi, C., Poggi, A., Ranelletti, F. O., Natali, P. G., Brunetti, M., Aiello, F.B., and Piantelli, M., 2000, Flavonoids Apigenin and Quercetin Inhibit Melanoma Growth and Metastatic Potential, Int J Cancer, 87 : 595600. Castell, J. V., & Gomez-Lechon, M. J., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 3-6, Academic Press, California. Chabner, B.A., D.P.Rian, L.Paz-Ares, R.G. Carbonero, and P. Calabresi, 2001, Antineoplastic Agents In Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, Graw-Hill, Medical Publishing Division, P.1417-1421. Dalimartha, Setiawan, 2006, Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, cetakan 8, Penerbit Swadaya, Jakarta. De Muth, James E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, John Willey and Sons Ltd, New York, 12-16, 47-50, 402 – 415 Dwikusumaningtyas, E., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th Edition, 71-73, A John Wiley & Sons, inc, New York Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta Gill, S.M.K., N. Balasioner, and P. Parte, 2001, Intermitent Treatment With Taxmoxiven on Reproduction in Male Rat, Asian. J. Andri 3(2)-P 155-158. Grotewold, Erich, 2006, The Science of Flavonoids, Departement of Cellular and Molecular Biology, Springer Science Business Media, Inc, The Ohio State University Columbus, Ohio, USA. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 45 Hagman, D.E., 2005, Sterilization, in, Beringer, Paul., Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, 776-781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. Hanahan, D., dan Weinberg, R. A., 2000, The Hallmarks of Cancer, Cell 100, 57-70 Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Terbitan kedua, Penerbit ITB, Bandung. Igura, K., Ohta T., Kuroda Y., and Kaji K., 2001, Resveratrol and Quercetin Inhibit Angiogenesis in Vitro, Cancer Lett, 171 (1): 11-6. Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York. Jujena, P., S. M.K.Gill., S. Dsolisa., V. Padwai., N. Balasimor., M. Aleem, and Zool, 2001, Anti Fertility Effect Estradiol in Adult Female Rat, J. Endokrinol. Invest 249(8): 598-607. King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd edition, School of Biological Sciences, University of Surrey, England. Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2, Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK Meleka, F.M., 1983, Dimensions of the Cancer Problem, 5-9, Karger, New York. Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Concenient, Planta Medica, Volume 45, 32-34. Miller, R. E., Rausher, M. D., dan Manos, P. S., 1996, Phylogenetic Systematics of Ipomoea (Convolvulaceae) Based on ITS and Waxy Sequence, Syst Bot, No. 24, 209-227. Miyagi, Y., Om, A. S., Chee, K. M., and Bennink, M. R., 2000, Inhibition of Azoxymethane-Induced Colon Cancer by Orange Juice, Nutr Cancer, 36: 224-229. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 46 Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, 101-102, 157, Penerbit Ghalia Indonesia, Jakarta Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Ness, A. R., and Powles, J. W., 1997, Fruit and Vegetables, and Cardiovascular Disease: a review, Int J Epidemiol, 26: 1-13. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan oleh Kosasih Padmawinata, edisi ke enam, Penerbit ITB, Bandung. Sambrook, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press. Sherr, C.J., 1996, Cancer Cell Cycle, Science, Volume 274, 5293, 1672 – 1677. So, F. V., Guthrie, N., Chambers, A. F., Moussa, M., and Carroll, K. K., 1996, Inhibition of Human Breast Cancer Cell Proliferation and Delay of Mammary Tumorigenesis by Flavonoids and Citrus Juices, Nutr Cancer, 26: 167-181. Soedibyo, M., 1998, Alam Sumber Kesehatan, Manfaat dan Kegunaan, cet 1, Balai Pustaka, Jakarta Soeripto, 1998, Mekanisme Molekuler Karsinogenesis, Bagian Patologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, No.127, 5-10. Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, cet I, 39-41, P.T. Agromedia Pustaka, Jakarta Suffness, M., dan Pezzuto, J.M., 1991, Assay Related to Cancer Drug Discovery, Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Volume VI, 71-133, Academic Press, London. Tosetti, F., Ferrari, N., de Flora S., and Albini A., 2002, ‘Angioprevention’: Angiogenesis is a Common and Key Target for Cancer Chemopreventive Agents, FASEB J., 16:2-14. PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 1 Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Gambar 8. Foto tanaman sirih merah 47 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 48 Lampiran 2 Data uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa Tabel III. Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting) pada haemocytometer : No 1 2 3 4 5 6 Kadar Ekstrak Sirih Merah (µg/ml) Kontrol 1000 750 500 250 125 Penetapan I II III 70 16 18 24 32 40 70 16 18 24 33 41 70 16 18 24 32 41 Tabel IV. Hasil perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dari masing-masing sumuran Penetapan I Rata-rata jumlah sel No. hidup kontrol (sel/ml) 1 2 3 35.000 4 5 Kadar ekstrak sirih merah (µg/ml) Jumlah sel hidup (sel/ml) 1000 750 500 250 125 8.000 9.000 12.000 16.000 20.000 Rata-rata jumlah sel hidup kontrol (sel/ml) Kadar ekstrak sirih merah (µg/ml) Jumlah sel hidup (sel/ml) 35.000 1000 750 500 250 125 8.000 9.000 12.000 16.500 20.500 Penetapan II No. 1 2 3 4 5 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Penetapan III No. 1 2 3 4 5 Rata-rata jumlah sel hidup kontrol (sel/ml) Kadar ekstrak sirih merah (µg/ml) Jumlah sel hidup (sel/ml) 35.000 1000 750 500 250 125 8.000 9.000 12.000 16.000 20.500 Tabel V. Persentase kematian sel SiHa Kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml) 125 250 500 750 1000 Persen kematian sel SiHa (%) Penetapan I Penetapan II Penetapan III 42,86 54,29 65,71 74,29 77,14 41,43 52,86 65,71 74,29 77,14 41,43 54,29 65,71 74,29 77,14 49 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 3 Uji distribusi data dengan Kolmogorov-Smirnov pada sel SiHa & Analisis Hasil dengan One Way Anova One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test SiHa LC50 N Normal Parameters(a,b) 18 16750,000 0 9445,2758 2 ,192 ,192 -,177 ,817 ,517 Mean Std. Deviation Most Extreme Differences Absolute Positive Negative Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a Test distribution is Normal. b Calculated from data. ANOVA LC50 Between Groups Within Groups Total Sum of Squares 151629166 6,667 333333,33 3 151662500 0,000 Df 5 12 17 Mean Square 303258333,33 3 27777,778 F 10917,300 Sig. ,000 50 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 51 Lampiran 4 Cara perhitungan jumlah sel SiHa yang hidup dalam tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting) Jumlah sel SiHa yang hidup dari tiap sumuran hasil perhitungan langsung (direct counting), dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Jumlah sel/sumuran = X x 10 x 200 4 Keterangan : X = jumlah sel hidup hasil perhitungan langsung pada haemocytometer 4 = jumlah bilik dalam haemocytometer 10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl) 200 = jumlah volume total (200 µl) Kontrol Penetapan I = 70 x 10 x 200 = 35.000 4 Penetapan II = 70 x 10 x 200 = 35.000 4 Penetapan III = 70 x 10 x 200 = 35.000 4 Rata-rata kontrol = 35.000 ⊕ 35.000 ⊕ 35.000 = 35.000 3 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Kadar 1000 µg/ml Penetapan I = 16 x 10 x 200 = 8.000 4 Penetapan II = 16 x 10 x 200 = 8.000 4 Penetapan III = 16 x 10 x 200 = 8.000 4 Kadar 750 µg/ml Penetapan I = 18 x 10 x 200 = 9.000 4 Penetapan II = 18 x 10 x 200 = 9.000 4 Penetapan III = 18 x 10 x 200 = 9.000 4 Kadar 500 µg/ml Penetapan I = 24 x 10 x 200 = 12.000 4 Penetapan II = 24 x 10 x 200 = 12.000 4 Penetapan III = 24 x 10 x 200 = 12.000 4 52 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Kadar 250 µg/ml Penetapan I = 32 x 10 x 200 = 16.000 4 Penetapan II = 33 x 10 x 200 = 16.500 4 Penetapan III = 32 x 10 x 200 = 16.000 4 Kadar 125 µg/ml Penetapan I = 40 x 10 x 200 = 20.000 4 Penetapan II = 41 x 10 x 200 = 20.500 4 Penetapan III = 41 x 10 x 200 = 20.500 4 53 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 54 Lampiran 5 Cara perhitungan persentase kematian sel SiHa Presentase kematian sel SiHa dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : % kematian sel = ∑ sel hidup kelompok kontrol − ∑ sel hidup kelompok perlakuan ×100 % ∑ sel hidup kelompok kontrol Kadar 1000 µg/ml Penetapan I = 35.000 − 8.000 x 100 % = 77,14 % 35.000 Penetapan II = 35.000 − 8.000 x 100 % = 77,14 % 35.000 Penetapan III = 35.000 − 8.000 x 100 % = 77,14 % 35.000 Kadar 750 µg/ml Penetapan I = 35.000 − 9.000 x 100 % = 74,29 % 35.000 Penetapan II = 35.000 − 9.000 x 100 % = 74,29 % 35.000 Penetapan III = 35.000 − 9.000 x 100 % = 74,29 % 35.000 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Kadar 500 µg/ml Penetapan I = 35.000 − 12.000 x 100 % = 65,71 % 35.000 Penetapan II = 35.000 − 12.000 x 100 % = 65,71 % 35.000 Penetapan III = 35.000 − 12.000 x 100 % = 65,71 % 35.000 Kadar 250 µg/ml Penetapan I = 35.000 − 16.000 x 100 % = 54,29 % 35.000 Penetapan II = 35.000 − 16.500 x 100 % = 52,86 % 35.000 Penetapan III = 35.000 − 16.000 x 100 % = 54,29 % 35.000 Kadar 125 µg/ml Penetapan I = 35.000 − 20.000 x 100 % = 42,86 % 35.000 Penetapan II = 35.000 − 20.500 x 100 % = 41,43 % 35.000 Penetapan III = 35.000 − 20.500 x 100 % = 41,43 % 35.000 55 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 56 Lampiran 6 Cara perhitungan harga LC50 Perhitungan harga LC 50 dilakukan dengan : antara log kadar dan angka probit dibuat hubungan regresi liniernya. Penetapan I A = 2,62639 B = 1,03896 r = 0,99856 Y = BX + A Y = 1,03896 X + 2,62639 5 = 1,03896 X + 2,62639 5 – 2,62639 = 1,03896 X 2,37361 1,03896 X = X = 2,28460191 LC50 = anti log x LC50 = anti log 2,28460191 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Penetapan II A = 2,46598 B = 1,09497 r = 0,99914 Y = BX + A Y = 1,09497 X + 2,46598 5 = 1,09497 X + 2,46598 5 – 2,46598 = 1,09497 X 2,53402 1,09497 X = X = 2,31423692 LC50 = anti log x LC50 = anti log 2,31423692 57 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Penetapan III A = 2,49094 B = 1,08696 r = 0,99927 Y = BX + A Y = 1,08696 X + 2,49094 5 = 1,08696 X + 2,49094 5 – 2,49094 = 1,08696 X 2,50906 1,08696 X = X = 2,308327813 LC50 = anti log x LC50 = anti log 2,308327813 Rata-rata LC 50 = anti log ( 2,28460191 + 2,31423692 + 2,308327813 ) 3 LC50 = anti log 2,302388881 = 200,6 µg/ml 58 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 59 Lampiran 7 Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa pada taraf kepercayaan 95% Tabel VI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% Degrees of Freedom 1% 5% (DF) 1 .997 1.000 2 .950 .990 3 .878 .959 4 .811 .917 5 .754 .874 6 .707 .831 7 .666 .798 8 .632 .765 9 .602 .735 10 .576 .708 11 .553 .684 12 .532 .661 13 .514 .641 14 .497 .623 15 .482 .606 16 .468 .590 17 .456 .575 18 .444 .561 19 433 .549 20 .423 .537 21 .413 .526 22 .404 .515 23 .396 .505 (De Muth, 1999) PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Nilai korelasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel SiHa : § Penetapan 1 : r2 = 0,9999 r = 0,99856 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier ----§ Penetapan 2 : r2 = 1 r = 0,99914 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier ----§ Penetapan 3 : r2 = 1 r = 0,99927 [rtabel (95%, 3) = 0,878] ----- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier ----- 60 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 8 Grafik hubungan antara log kadar dengan angka probit Penetapan I Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,039x + 2,6264 R2 = 0,9999 Angka probit 6 5 4 3 2 1 0 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 3 4 Log kadar Penetapan II Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,095x + 2,466 R2 = 1 6 Angka probit 5 4 3 2 1 -3 -2 -1 0 -1 0 1 Log kadar 2 61 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 62 Penetapan III Grafik log kadar vs angka probit 7 y = 1,087x + 2,491 R2 = 1 6 Angka probit 5 4 3 2 1 0 -3 -2 -1 -1 0 1 2 3 4 Log kadar Gambar 9. Grafik hubungan antara log kadar ekstrak sirih merah vs angka probit pada sel SiHa PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 63 Lampiran 9 HARGA PROBIT SESUAI DENGAN PERSENTASENYA Persentase 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 99 0 3,72 4,16 4,48 4,75 5,00 5,25 5,52 5,84 6,28 0,0 7,33 1 2,67 3,77 4,19 4,50 4,77 5,03 5,28 5,55 5,88 6,34 0,1 7,37 2 2,95 3,82 4,23 4,53 4,80 5,05 5,31 5,58 5,92 6,41 0,2 7,41 3 3,12 3,87 4,26 4,56 4,82 5,08 5,33 5,61 5,95 6,48 0,3 7,46 Probit 4 5 3,25 3,36 3,92 3,96 4,29 4,33 4,59 4,61 4,85 4,87 5,10 5,13 5,36 5,39 5,64 5,67 5,99 6,04 6,55 6,64 0,4 0,5 7,51 7,58 6 3,45 4,01 4,36 4,64 4,90 5,15 5,41 5,71 6,08 6,75 0,6 7,65 7 3,52 4,05 4,39 4,67 4,92 5,18 5,44 5,74 6,13 6,88 0,7 7,75 8 3,59 4,08 4,42 4,69 4,95 5,20 5,47 5,77 6,18 7,05 0,8 8,88 9 3,66 4,12 4,45 4,72 4,97 5,23 5,50 5,81 6,23 7,33 0,9 8,09 (Mursyidi, 1985) PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 10 Foto alat dan bahan yang digunakan saat penelitian 96-well plate (Nunc) cell counter (Nunc) & haemocytometer (Neubauer) tissue culture flask (Nunc) Pereaksi-pereaksi yang digunakan 64 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI swing rotor sentrifuge mikroskop (Olympus IMT-2) 65 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI laminar air flow (Labconco) 96-well plate (Nunc) dengan perlakuan Gambar 10. Foto alat dan bahan 66 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI Lampiran 11 67 PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI 68 BIOGRAFI PENULIS Penulis bernama Nur’aniyah yang lahir pada tanggal 30 Desember 1985 di Indramayu, Jawa Barat. Penulis merupakan anak ketiga dari pasangan Bapak Wadirah dan Ibu Carmi. Tahun 1992 menempuh pendidikan di SD Bugel VI Sukra, Indramayu dan lulus pada tahun 1998. Kemudian tahun 1998 sampai tahun 2001 menempuh pendidikan di SLTP Negeri 1 Sukra, Indramayu. Setelah menyelesaikan pendidikan SLTP, tahun 2001 melanjutkan ke SMU Bruderan Purwokerto dan lulus pada tahun 2004. Tahun 2004 penulis melanjutkan pendidikan S1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
