perbandingan metode kit komersial dan sds untuk isolasi dna babi
advertisement
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) SKRIPSI RIAN HIDAYAT NIM: 1111102000096 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA 2015/1436H UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA PERBANDINGAN METODE KIT KOMERSIAL DAN SDS UNTUK ISOLASI DNA BABI DAN DNA SAPI PADA SIMULASI CANGKANG KAPSUL KERAS UNTUK DETEKSI KEHALALAN MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi RIAN HIDAYAT NIM: 1111102000096 FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA 2015/1436H ABSTRAK Nama : Rian Hidayat Program Studi : 1111102000096 Judul : Perbandingan Metode Kit Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi dari Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain reaction) Status kehalalan pada cangkang kapsul keras masih diragukan statusnya. Dari tiga ribu jenis obat baru ada tiga produk yang memiliki sertifikat halal. Analisis cangkang kapsul keras gelatin simulasi telah berhasil dilakukan dengan metode Real Time PCR. DNA cangkang kapsul keras gelatin simulasi diekstrasi dan diisolasi menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Hasil ekstraksi dan isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dihasilkan DNA genom simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi dan kemurnian berurut-turut adalah antara 8,70 – 19,01 ng/µl dengan kemurnian 1.169 – 1.851 dan 2.30 – 9.54 ng/µl dengan kemurnian 1.310 – 2.013 sementara dengan cell lysis buffer SDS 1% adalah 13.30 – 15.39 ng/µl dengan kemurnian 1.345 – 1.424 dan 20, 53 – 36.99 ng/µl dengan kemurnian 1.276 – 1.299. Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA genom dianalis dengan statistik yaitu uji t dengan nilai p = 0.936 (konsentrasi) dan p = 0.003 (kemurnian) sehingga tidak ada perbedaan yang signifikan rata-rata konsentrasi dan ada perbedaan yang signifikan ratarata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%. Berdasarkan hasil tersebut disimpulkan bahwa metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Praparation lebih unggul daripada metode cell lysis buffer SDS 1%. Kata Kunci : Gelatin, Real Time PCR, , Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®), cell lysis buffer SDS 1%, Isolasi DNA, Kemurnian DNA, Konsentrasi DNA v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRACT Name Major Title : Rian Hidayat : Pharmacy : Comparison of high Pure PCR Tamplate Preparation Kit and SDS Method for Pig and Cow DNA Isolation from Hard Capsule Shell of Gelatin for Halal Auntetication Use Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction) Halal status on hard capsule shell has been hesitated it. Three of three thousand have halal sertificate. Analysis of gelatin hard capsule shell was successfully done with Real Time PCR method. DNA from gelatin hard capsule shell were extracted and isolated by High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit and cell lysis buffer SDS 1%. Result of extraction and isolation with High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit from pig and cow gelatin hard capsule shell are approximately 8.70 – 19.01 ng/µl (purity = 1.169 – 1.851) and 2.30 – 9.54 ng/µl (1.310 – 2.013) while with cell lysis buffer SDS 1% are 13.30 – 15.39 ng/µl ( purity = 1.345 – 1.424) and 20, 53 – 36.99 ng/µl (purity = 1.276 – 1.299). DNA consentrations and purities value tested with statistic were t test. P values concentration and purity are 0.936 and 0.003 so it is not significance concentrations mean different and significance purity means both of them methods. Based on result that High Pure PCR Template Preparation (Roche®) kit method is the most better than cell lysis buffer SDS 1% method. Keywords : Real Time PCR, gelatin, high pure PCR tamplate preparation, cell lysis buffer SDS 1%, DNAconcentration, DNA purity vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa memberikan jalan keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang berjudul “Perbandingan Dua Metode Isolasi DNA Babi dan Sapi dari Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction)” ini berhasil penulis selesaikan. Sholawat beriring salam semoga selalu tercurah limpah kepada baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik sepanjang zaman, teladan umat manusia menjalani kehidupan. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat ujian akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah atas bantuan berbagai pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada : 1. Bapak Dr. Arif Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Ofa Suzanthi Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sudah membimbing dan memberikan ilmu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. dan Ibu Nely Suryani, Ph.D. Apt. selaku Ketua Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Sayat Hidayat dan ibunda Umi Sumiati yang senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putranya. Kakak-kakak dan Adik-adik tercinta yang selalu memberikan keceriaan dan semangat bagi penulis. 5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis menempuh pendidikan farmasi di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 6. Teman-teman Farmasi “Beng-beng” yang telah menjadi memori berkesan selama penulis menuntut ilmu. 7. Teman-teman Pendidikan Dokter, Kesehatan Masyarakat, dan Keperawatan yang sudah mengispirasi dan menghiasi suasana kampus FKIK. 8. Kakak-kakak laboran Farmasi (Kak Rachmadi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Tiwi, Kak Liken, Mbak Rani) yang telah membantu penulis dalam melakukan penelitian di Labolatorium. 9. Pak Deka, Mbak Helen, Kak Ayu yang telah bersedia berbagi ilmunya dan membantu penulis dalam penyelesaian penelitian RT PCR. vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10. Teman-teman seperjuangan Halal’s team (Kak Sulaiman, Kak Afifah, Kak Yanti, dan Fathiyah) yang telah menginspirasi dan menjadi the best partners dalam penelitian Real Time PCR. 11. Keluarga 3L (Liqoku, Liqomu, Liqota) Kak Sule, Kak Iyus, Suparman, Azmi, Dendi dan Ali serta Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang selalu mendo’akan dimanapun dan kapanpun semoga Allah mempertemukan kita dalam surga-Nya. Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan ucapan terima kasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya. Amiin. Jakarta, 29 Juni 2015 Penulis viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .......................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS .............................................. HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .......................................................... ABSTRAK .......................................................................................................... ABSTRACT ....................................................................................................... KATA PENGANTAR ....................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................... DAFTAR ISI ...................................................................................................... DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... DAFTAR TABEL .............................................................................................. DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... BAB 1. PENDAHULUAN ................................................................................. 1.1. Latar Belakang ............................................................................. 1.2. Rumusan Masalah ........................................................................ 1.3. Tujuan Penelitian ......................................................................... 1.4. Manfaat hasil Penelitian ............................................................... BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 2.1. Gelatin ......................................................................................... 2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin ........................................... 2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin .............................. 2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin ..................................... 2.2. Kapsul .......................................................................................... 2.2.1 Cangkang Kapsul Keras ..................................................... 2.3. Deoxyribonuckeat Acid (DNA) ................................................... 2.3.1 Struktur Kimia DNA .......................................................... 2.3.2 Sifat Fisika DNA ................................................................ 2.3.3 DNAMitokondria ................................................................ 2.4 Isolasi DNA ...................................................................................... 2.5 Polymerase Chain reaction (PCR) .............................................. 2.5.1 Komponen PCR .................................................................. 2.5.2 Tahapan PCR ...................................................................... 2.6 Real-Time PCR ............................................................................ BAB 3. METODE PENELITIAN .................................................................... 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian ...................................................... 3.1.1 Tempat ................................................................................ 3.1.2 Waktu .................................................................................. 3.2. Alat dan Bahan ........................................................................... i ii iii iv v vi vii viii ix xii xiii xiv xv xvi 1 1 3 3 4 5 5 6 7 8 8 9 9 10 12 12 14 17 17 19 20 22 22 22 22 22 x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.2.1 Alat ..................................................................................... 3.2.2 Bahan .................................................................................. 3.3. Prosedur Kerja ............................................................................. 3.3.1 Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi ................. 3.3.2 Pembuatan Larutan Stok ..................................................... 3.3.3 Preparasi Sampel ................................................................ 3.3.4 Isolasi DNA ........................................................................ 3.3.5 Pengukuran Kemurnian & Kuantitas DNA ........................ 3.3.6 Amplifikasi DNA dengan Metode Real-Time PCR ........... 3.3.7 Analisi Statistik ................................................................... BAB 4. HASI DAN PEMBAHASAN ............................................................... 4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cngkang Kapsul Keras Gela tin Sapi dan Babi ............................................................................. 4.2. Isolasi DNA ..................................................................................... 4.2.1 Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (PCR) ................................................................ 4.2.2 Isolasi DNA dengan Larutan Ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) .................................................................. 4.2.3 Pengukuran Isolat DNA ......................................................... 4.2.4 Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika ..... 4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin dengan Real Time PCR ............................................ 4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Sapi ............. 4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi dengan Primer Babi ............. BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 5.1. Kesimpulan ..................................................................................... 5.2. Saran ................................................................................................ DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 22 22 23 23 24 24 25 26 27 27 29 29 30 30 31 33 35 36 37 39 41 41 41 42 xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 2.5 Gambar 2.6 Gambar 2.7 Gambar 2.8 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Konversi Kolagen Menjadi Gelatin ............................................. Struktur Kimia Gelatin ................................................................ a. Ikatan 3’-5’ Fosfodiester .......................................................... b. Rantai DNA yang Lebih Sedrhana .......................................... Perbedaan struktur DNA dan RNA ............................................. Struktur Mitokondria ................................................................... Struktur mtDNA .......................................................................... Tahapan PCR ............................................................................... Bentuk Kurva Real-Time PCR .................................................... a. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Sapi Simulasi ...... b. Lembaran Cangkang Kapsul Keras Gelatin Babi Simulasi ..... Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin pada Primer Sapi ................................................... Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin pada Primer Babi .................................................. 6 7 10 10 11 13 13 19 20 29 29 38 39 xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL Tabel 1 Urutan Basa Primer dan Probe ............................................................... Tabel 2 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS ..................................... Tabel 3 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®) .... Tabel 4 Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan Simulasi Menurut Konsentrasi DNA ................................................................................... Tabel 5 Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan Simulasi Menurut Kemurnian DNA .................................................................................... 23 33 34 35 36 xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Kerangka Penelitian ..................................................................... Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ...... Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS ........................ Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Mel Ting Temperature) Primer ........................................................... Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure Pcr Tem plate Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis Probe Mastermix ......................................................................... Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein .......................................................... Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS ........................... Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS ............................ Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA ......................................................... Lampiran 10. Gambar Bahan-bahan yang Digunkan dalam penelitian ............. Lampiran 11. Gambar Alat-alatyang Digunakan dalam Penelitian ................... 47 48 49 51 52 53 54 57 60 64 65 xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN BHQ-1 : Black Hole Quencher-1 BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool bp : Base pair CP : Crossing Point cyt b : Cytochorme b dATP : Deoxyadenosine Triphosphate dCTP : Deoxycytidine Triphosphate dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate dTTP : Deoxythmidine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid FAM : Fluorescein Amidite mtDNA : mitochondrial Deoxyribonucleic Acid NCBI : National Center for Biotechnology Information NTC : No Template Control PCR : Polymerase Chain Reaction qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction RE : Retikulum Endoplasma RNA : Ribonucleic Acid Tm : Temperature Melting Ta : Temperature Annealing xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISTILAH BLAST ; Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA atau protein) dengan urutan basa DNA atau protein dari database NCBI Blastn : Nucleotide Blast atau bisa disebut blastn merupakan salah satu fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis kesejajaran nukleotida yang dimasukan pada query dengan nukleotida pada database NCBI CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan awal permulaan akumulasi amplikon telah memasuki peningkatan loglinear Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis threshold dengan kurva amplifikasi Garis Theshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal Flourescent berada pada titik terendah NCBI : National Ccenter for Biotechnology Information merupakan suatu institusi yang dimiliki United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat diakses database bioteknologi meliputi genebank, urutan basa DNA atau protein juga publikasi-publikasi ilmiah Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrument LightCycler 480 Maximum : Dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifiaksi mengalami kenaikan yang tajam Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia Tm : Temperature Melting atau suhu lebar adalah saat dimana 50% bagian DNA seolah terbuka menjadi untai tunggal xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB I PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Islam mengatur umatnya dalam dua perkara, yaitu halal dan haram. Halal adalah segala sesuatu yang diperbolehkan dalam syari’at Islam sedangkan haram adalah kebalikan dari halal (Al-Qardhawi, 1997). Pada hadist keenam dalam hadist Arba’in dijelaskan “Sesungguhnya yang halal itu jelas dan yang haram itu jelas. Di antara keduanya terdapat perkara-perkara yang syubhat (samar-samar) yang tidak diketahui oleh orang banyak. Maka siapa yang takut terhadap syubhat berarti dia telah menyelamatkan agamanya dan kehormatannya. Dan siapa yang terjerumus dalam perkara syubhat maka akan terjerumus dalam perkara yang diharamkan…” Salah satu perkara syubhat saat ini adalah sumber bahan baku cangkang kapsul keras dengan alasan baru ada 3 produk kapsul yang bersertifikat halal dari 3 ribu jenis obat yang ada di Indonesia (LPPOM MUI). Angka tersebut masih kecil dibanding dengan jumlah penduduk muslim Indonesia yang mencapai 85% (BPS dalam Vivikananda, 2014) Perkara syubhat dalam cangkang kapsul keras terletak pada sumber bahan bakunya, yaitu gelatin. Gelatin saat ini umumnya berasal dari kulit, tulang sapi dan babi (GMIA, 2012) karena gelatin yang dihasilkan memiliki kualitas yang lebih baik dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan. Keragu-raguan dalam memilih produk cangkang kapsul keras bertambah dengan diketahuinya bahwa produsen gelatin dunia masih didominasi oleh negara-negara non muslim (Eropa Barat, Kanada, dan Meksiko) (Jamaludin, et al., 2012). Oleh karena itu, analisis untuk membedakan cangkang kapsul keras yang bersumber dari gelatin perlu dilakukan. Beberapa peneliti telah melakukan analisis terhadap cangkang kapsul keras yang bersumber dari gelatin dengan cara membedakan komposisi asam amino menggunakan metode Fourier 1 Transform Infrared (FTIR) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 Spectroscopy dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang dikombinasikan dengan Principal Component Analysis (PCA), dan metode SDS-PHAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrilamide Gel Elektrophoresis) yang mampu mengidentifikasi fragmen gelatin hidrosilatnya berdasarkan perbedaan bobot molekul (Saputra, 2014 & Syafiqoh, 2014). Namun, metode ini belum bisa memberikan hasil yang maksimal dikarenakan protein tidak stabil dalam suhu panas sehingga hasil yang didapatkan akan berbeda-beda. Pendeteksian gelatin babi dan gelatin sapi telah berhasil dilakukan oleh Demirhan., et al (2011), Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) dengan mengidentifikasi DNA pada standar gelatin sapi dan babi dan produk gelatin (marsmallows, gums drops, dan beberapa makanan orang turki) dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction ). Analisis menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) membutuhkan DNA genom yang berkualitas baik secara jumlah maupun kemurnian. Gelatin merupakan bahan olahan begitu pula cangkang kapsul keras gelatin yang kemungkinan jumlah DNA relatif sedikit akibat adanya pengolahan sebelumnya (Demirham, et al., 2011) sehingga diperlukan metode isolasi DNA yang lebih unggul dari segi konsentrasi DNA genom yang didapat, tingkat kemurnian yang tinggi, efisiensi waktu pengerjaan, keamanan dan ekonomis. Pada penelitian Izzah (2014) dan Puspitaningrum (2015) metode ekstraksi gelatin yang digunakan adalah kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®). Konsentrasi DNA genom yang didapatkan masih sedikit dan dengan tingkat kemurniaan yang belum masuk dalam kemurnian ideal terbukti tidak terbentuknya pita pada gel agarose. Namun, DNA genom yang didapatkan dapat teramplifikasi pada Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction). Metode ekstraksi lain (konvensional) yang sering digunkan dalam analisis Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) adalah cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). DNA genom yang didapatkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3 mampu terdeteksi oleh gel agarose tetapi penggunaan metode ini masih terbatas dalam bentuk jaringan utuh (daging) dan olahannya (Rahmawati, 2012 & Mulyana, 2010). Oleh karena itu, penelitian selanjutnya akan dilakukan pendeteksian gelatin sapi dan babi pada simulasi cangkang kapsul keras dengan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan metode ekstraksi menggunakan kit (High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metode yang paling cocok untuk isolasi DNA antara kit (High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang akan diamplifikasi menggunakan Real-Time PCR (Polyemerase Chain Reaction) dengan gen spesifik mitokondria sitokrom b Sapi dan Babi. 1.2 RUMUSAN MASALAH 1. Bagaimanakah perbandingan metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1% dalam mengisolasi DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi terhadap DNA genom yang dihasilkan? 2. Apakah DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi yang diisolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1% dapat teramplifikasi dengan RT-PCR? 1.3 TUJUAN PENELITIAN 1. Mengetahui perbandingan DNA genom yang dihasilkan dari simulasi cangkang kapsul keras berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode isolasi DNA menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1% 2. Menentukan kondisi optimal amplifikasi DNA genom dari cangkang kapsul keras simulasi berbahan gelatin babi dan gelatin sapi dengan primer sapi dan primer babi pada RT-PCR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4 1.4 MANFAAT PENELITIAN Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi metode isolasi DNA babi dan DNA sapi dari cangkang kapsul keras simulasi berbahan gelatin sapi dan gelatin babi sehingga dapat dijadikan referensi dalam mendeteksi status kehalalan produk cangkang kapsul yang berbahan gelatin. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Gelatin Gelatin merupakan suatu biopolymer yang dihasilkan dari hidrolisis kolagen yang umumnya berasal dari kingdom hewan dan sebagian besar penyusunnya adalah protein. (Bailey dan Paul, 1998). Kata gelatin sendiri berasal dari Bahasa latin yaitu “gelare” yang artinya membuat beku dan merupakan senyawa yang tidak terjadi secara alamiah (Glicksman, 1969). Sifat gelatin yang dapat membeku (gelling agent) dan mengental (thickening agent) menjadi keberadaanya sangat luas terutama dalam produk makanan (Mariod dan Adam, 2013). Kolagen merupakan bahan utama dalam pembentukan gelatin yang sumbernya bisa dari hewan mamalia seperti tulang sapi dan kulit babi maupun ikan dan serangga (Mariod dan Adam, 2013). Kolagen akan menjadi gelatin dengan bantuan asam atau basa dan pemanasan yang bertujuan untuk memutuskan ikatan hydrogen dari molekul tropokolagen sehingga rantairantainya terpisah dan strukturnya rusak (Setiawati, 2009). Perubahan kolagen menjadi gelatin dan gelatin menjadi gel dipengaruhi oleh konsentrasi dan suhu seperti yang disajikan pada gambar 2.1. Menurut Belitz dan Grosch (1999) gelatin akan terbentuk apabila kolagen dipanaskan dengan suhu di atas suhu pengerutnya (T>Ts) di mana suhu pengerut (Ts) untuk kolagen dari kulit mamalia berkisar antara 60-650 C sehingga ikatan silang dari rantai triple helix pada kolagen akan terputus dalam jumlah yang sangat besar dan struktur kolagen akan terpisah menjadi gulungan (coils) secara acak yang larut dalam air. Pada saat konsentrasi rendah (C1), struktur intramolekuler gelatin akan membentuk untaian/ikatan-ikatan tunggal (singlestrands). Namun, untuk kembali ke kondisi semula (pada kolagen) pada saat konsentrasi tinggi (C2) dan proses pendinginan berjalan lambat (ΔT1), apabila proses berjalan cepat, maka akan dihasilakan segmen-segmen helix dengan ikatan-ikatan secara acak pada setiap struktur gulungannya (coils). 5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 Gambar 2.1 Konversi kolagen menjadi gelatin (sumber : Belitz dan Grosch, 1999 dalam Hasan, 2007) Berdasarkan perlakuan pada saat pembuatan, gelatin dibedakan menjadi dua perlakuan yaitu dengan asam atau basa. Gelatin dengan asam disebut gelatin tipe A dan dengan basa disebut gelatin tipe B. Gelatin tipe A memiliki titik isoelektrik pada pH 7-9 dan umumnya diperoleh dari kulit babi. Sedangkan gelatin tipe B memiliki titik isoelektrik pada pH 4.8 – 5.2 dan biasanya diperuntukan untuk bahan yang keras dan liat seperti kulit sapi (Poppe, 1992). 2.1.1 Sifat Fisika dan Kimia Gelatin Gelatin memiliki bentuk flakes, granul, maupun serbuk dengan warna kuning, tidak berbau, dan tidak berasa. Gelatin larut dalam gliserin dan air hangat (>300 C). Gelatin praktis tidak larut dalam kloroform, etanol (95%), aseton, eter, dan methanol. Gelatin kering stabil di udara dan dalam bentuk larutan dalam air juga stabil dalam waktu lama jika disimpan di bawah kondisi sejuk tapi dapat terjadi degradasi oleh bakteri (Rowe, Sheskey dan Owen, 2006). Namun, menurut Montero, et al (2000), pemanasan yang dilarutkan untuk melarutkan gelatin sekurang-kurangnya 490 C atau biasanya pada suhu 60-700 C. Pada temperature yang tinggi (di atas 500 C ), larutan gelatin dapat terjadi depolimerisasi dan reduksi kekuatan gel. Kondisi ini akan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 lebih cepat pada suhu 650 C dan kekuatan gel dapat berkurang setengah kali semula ketika dipanaskan pada suhu 800 C selama 1 jam (Rowe, Sheskey dan Owen, 2006). Protein merupakan kandungan tertinggi pada gelatin, tetapi kadar lemaknya rendah. Gelatin kering dengan kadar air 8-12% mengandung protein sekitar 84% - 86%, lemak dan vitamin hampir tidak ada (Carr et al, 1995). Bobot molekul gelatin termasuk tinggi sekitar 20.000 g/mol sampai 250.000 g/mol (Fatimah, 2012). Adanya perbedaan bobot molekul tersebut ini memberikan dampak pada kekuatan gel yang dihasilkan. Semakin tinggi bobot molekul gelatin semakin tinggi bloom (kekuatan gel) yang dihasilkan (Rabadiya, 2013). Kekuatan gel dapat ditentukan dengan menggunakan metode Gomez-Guillen et al (2010) dengan menggunakan analisis Tekstur Model TA-TX2 (Balti et al., 2010). 2.1.2 Struktur dan Komposisi Kimia Gelatin Sebagian besar kandungan gelatin adalah protein yang disusun dari beberapa asam amino. Komposisi asam amino gelatin bervariasi tergantung dari sumber kolagen, spesies hewan penghasil, dan jenis kolagen (Setiawati, 2009). Menurut Grobben et al., (2004) dalam Fatimah, (2009) gelatin terdiri dari 18 asam amino yang saling terikat oleh ikatan peptida dan sebagian besar penyusunnya adalah glisin dan prolin berturut-turut mencapai 30,5% dan 14,8% - 18%. Glisin Prolin Y Glisin X Hidroksiprolin Gambar 2.2. Struktur kimia gelatin (sumber: Poppe, 1992 dalam Setiawati, 2009) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 Senyawa gelatin merupakan suatu polimer linier yang tersusun oleh satuan terulang asam amino yaitu glisin-prolin-glisin dan glisinprolin-hidroksiprolin yang bergabung membentuk rangkaian polipeptida. Seperti yang tunjukkan pada gambar 2.2 bahwa susunan asam amino gelatin merupakan triplet peptide, yaitu glisin-X-Y, dimana X umumnya adalah asam amino prolin dan Y umumnya adalah asam amino hidroksiprolin. (Viro, 1992). 2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan Gelatin Dalam produk pangan, gelatin menjadi bahan tambahan yang sering digunakan baik sebagai pengental, penstabil, pengikat, dan pengemulsi. Gelatin yang dicampurkan bervariasi mulai dari 0.015% 9% tergantung fungsi keberadaannya dalam bahan campuran. Adapun produk pangan berbahan gelatin adalah jelly, marshmallows, gummy, wafer, dan cokelat. Selain digunakan dalam industri pangan, gelatin juga sering digunakan dalam industri fotografi, industri farmasi, dan produk kedokteran seperti cangkang kapsul keras dan lunak, pengikat pada tablet, suppositoria, gelatin sponge, dan pengganti plasma (GMIA, 2012). Beberapa tahun terakhir fungsi penting gelatin lainnya telah diidentifikasi dan dikembangkan. Kemampuan gelatin yang mirip dengan lemak terutama teksturnya, menempatkan gelatin sebagai pengganti lemak pada beberapa aplikasi. Salah satu kelompok produk utama dimana sifat ini digunakan adalah margarin makan rendah lemak (Tahmid, 2005). 2.2 Kapsul Bahan utama dalam pembuatan cangkang kapsul keras yaitu gelatin, air, gula. Pewarna biasanya ditambahkan untuk membuat kapsul menjadi lebih menarik dan khas. Selain itu, penambahan titan oksida juga diperlukan untuk membuat cangkang menjadi tidak transparan dan tidak tembus cahaya. Berdasarkan elastisitas dan komponen pembentuknya, kapsul dapat dibagi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 9 menjadi dua kategori, yaitu kapsul keras (dua cangang) dan kapsul lunak (satu cangkang) (Ansel, 2005 & Rabadiya, 2013). Cangkang kapsul umumnya tidak berbau dan tidak berasa. Cangkang kapsul gelatin dapat dibuat dengan berbagai ukuran dengan panjang dan diameter yang bervariasi. Pemilihan ukuran tergantung pada berapa banyak isi bahan yang akan dimasukkan ke dalam kapsul dan dibandingkan dengan kapasitas isi dari cangkang kapsul. Karena kepadatan dan penekanan dari serbuk atau campuran serbuk akan menentukan berapa jumlah yang dapat ditampung dalam kapsul dan karena tiap bahan mempunyai sifat tersendiri, maka tidak ada pengaturan yang ketat untuk menentukan ukuran kapsul yang tepat. Untuk diberikan kepada manusia, cangkang kapsul kosong berkisar dari 000 yang terbesar sampai no. 5 yang terkecil (Ansel, 2005) 2.2.1 Cangkang Kapsul Keras Cangkang kapsul keras gelatin harus dibuat dalam dua bagian, yaitu badan kapsul dan penutupnya yang biasanya lebih pendek. Biasanya kapsul dikategorikan sebagai kapsul keras atau lembut dipengaruhi oleh keberadaan plasticizer seperti gliserol yang dapat membuat kapsul lembut dan elastis. Kapsul keras dikatakan ideal jika memiliki kekuatan elastisitas permukaan 200-300 bloom; viskositas (600 C / 6-23%b/b dalam air) 44-60 MP; pH 4,5-6.5 (Rabadiya, 2013). 2.3 Deoxyribonucleat Acid (DNA) Asam nukleat adalah suatu molekul polimerik yang hanya terdiri dari empat jenis unit monomerik, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) yang berfungsi menyimpan dan menransmisikan informasi genetik dalam sel (Champe, et al., 2011; Koolman & Roehm, 2005; dan Murray, et al., 2012). DNA tidak hanya terdapat pada kromosom di nukleus organisme eukariot, tetapi juga di mitokondria dan kloroplas tumbuhan. Namun, pada organisme mempunyai prokariot, yang tidak mempunyai nukleus, satu kromosom tetapi dapat pula mengandung DNA nonkromosom dalam bentuk plasmid (Champe, et al., 2011). DNA berperan dalam sintesisi RNA (transkripsi) yang bertujuan untuk sintesis protein dalam sitoplasma (Stansfield et al., 2003 dalam Izzah, 2014). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 2.3.1 Struktur Kimia DNA Setiap nukleotida tersusun oleh tiga komponen, yaitu molekul gula pentosa (deoxyribose untuk DNA dan ribose untuk RNA), gugus fosfat, dan basa nitrogen. Semua nukleotida memiliki gula pentose dan gugus fosfat dengan susunan dan bentuk yang identik, sedangkan untuk penyusun basa nitrogen mempunyai susunan dan bentuk yang berbeda dari satu nukleotida dengan satu nukleotida yang lainnya. Menurut molekulnya, basa nitrogen dibagi dua, yaitu basa purin (Adenin dan guanin) dan basa pirimidin (cytosin, uracyl, dan thimin). Pada DNA penyusun basa pirimidin adalah sitosin dan timin, sedangkan pada RNA, yaitu sitosin dan urasil. Basa-basa tersebut berpasangan satu sama lain, yaitu pada DNA basa guanine berpasangan dengan basa sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenine berpasangan dengan basa timin (pada RNA dengan urasil) membentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga jumlah dari masing-masing basa baik purin maupun pirimidin akan selalu sama dalam molekul DNA (Muladno, 2010 dan Purves et al., 2004). a b Gambar 2.3 a. Ikatan 3’ – 5’ fosfodiester, b. Rantai DNA yang lebih sederhana (sumber: Champe, et al., 2011) DNA merupakan poli-deoksiribonukleat yang mengandung banyak mono-deoksiribonukleat yang dihubungkan secara kovalen melalui ikatan 3’-5’-fosfodiester. Ikatan fosfodiester menghubungkan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 gugus 5’-hidroksil deoksipentosa pada satu nukleotida dengan gugus 3’hidroksil deoksipentosa yang berdekatan melalui gugus fosfat (gambar 2.3). Rantai panjang ini dengan ujung -5’ (ujung dengan fosfat bebas) dan ujung -3’ (ujung dengan hidroksil bebas) yang tidak melekat pada nukleotida lain. Urutan basa DNA yang diperlihatkan pada gambar 2.3 dibaca “timin, adenine, sitosin, guanin” (5’-TACG-3’). Ikatan fosfodiester antara nukleotida (di DNA atau RNA) dapat diuraikan secara hidrolisis oleh bahan kimia, atau dihidrolisis secara enzimatik oleh famili nuklease: deoksiribonuklease untuk DNA dan ribonuklease untuk RNA (Champe, et al., 2011). Selain dari basa pirimidin (timin pada DNA dan urasil pada RNA) perbedaan antara DNA dan RNA lainnya adalah pada DNA untaiannya berbentuk double helix (untai ganda) sedangkan pada RNA single helix (untai tunggal) seperti pada gambar 2.4. Gambar 2.4 Perbedaan struktur DNA dan RNA (sumber: National Human Research Institute) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 12 Satuan panjang molekul DNA adalah pasang basa (pb). Satuan ini adalah unit ukuran panjang terkecil. Apabila molekul DNA hanya berbentuk serangkaian nukleotida tunggal (tidak berpasangan ), maka unit satuannya basa (b) dan bukan pasang basa (pb) (Muladno, 2010). 2.3.2 Sifat Fisika DNA Struktur untai ganda DNA dapat dipisahkan (dicairkan) menjadi dua untai komponen dalam larutan dengan cara meningkatkan suhu (>900 C) atau menurunkan konsentrasi garam. Akibatnya kedua tumpukan basa tidak saling menjauh, tetapi tumpukan basa-basa itu sendiri terurai meskipun masih berada dalam bentuk polimer karena adanya jembatan fosfodiester. Karena penumpukan basa dan ikatan hidrogen antar tumpukan, molekul DNA untai-ganda bersifat seperti batang yang kaku dan dalam larutan, DNA berbentuk seperti material kental yang akan kehilangan kekentalannya jika mengalami denaturasi. (Murray, et al., 2012). Denaturasi DNA bersifat reversible dimana proses renaturasi (pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi) dapat berjalan apabila suhu mendekati 600 C (Yuwono, 2009). 2.3.3 DNA Mitokondria DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya (Susmiarsih, 2010 dan Solihin, 1994). DNA mitokondria merupakan DNA yang ada di Mitokondria yang berperan dalam sintesis protein (Koolman, et al., 1994). Mitokondria adalah organel yang terletak di dalam sitoplasma eukariota (gambar 2.5) yang diselaputi oleh dua membrane dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan membran luar, matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh membrane dalam) dan ruang antar membran (Susmiarsih, 2010). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 13 Gambar 2.5 Struktur Mitokondria (sumber : Susmiarsih, 2010) Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama (gambar 2.6), yakni terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I, Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah intergenic (Moritz et al, 1987 dan Solihin, 1994). Gambar 2.6 Sturktur mtDNA (Andaman, 1992 dalam Pratami, 2011) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 14 DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu meng-copy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi), ukuran yang relative kecil sekitar 14 kb sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh, dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA inti (Hartati et al.,2004 dan Solihin, 1994). 2.4 Isolasi DNA Analisis molekular merupakan suatu metode analisis yang lingkup pengerjaanya sampai ke tahap molekul seperti analisis asam nukleat dan protein. Salah satu analisis molekular adalah metode PCR (Polymerase Chain Reaction) yang dalam tahapannya ada proses isolasi DNA. Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA dari komponen-komponen penyusun sel lainnya. Proses ini melibatkan penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein, dan pemurnian (purifikasi) DNA (Muladno, 2010). Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan awal dari isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim dan dikombinasikan dengan EDTA (Etilendiamin tetraasetat), SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), sarkosil dan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) (Muladno, 2010 dan Subandiyah, 2006). Menurut Giacomazzi et al (2005) ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghancurkan sel atau jaringan, yaitu dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K bertujuan untuk melisiskan membran pada sel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 15 darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki, 2000). SDS merupakan deterjen kationik yang mampu melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel sehingga merusak struktur membran sel (Kesmen et al., 2009; Maftuchah & Zainudin, 2006; Malisa et al., 2006). Metode isolasi dengan SDS lebih dikenal dengan metode fenol-kloroform. Buffer lisis metode ini biasanya terdiri atas EDTA, Tris HCL, NACL, dan SDS (Utami, et al., 2012). Setelah struktur sel rusak, komponen-komponen yang ada di dalamnya, yaitu RNA, DNA, lipid, dan karbohidrat akan keluar (Dale & Malcom, 2002). Penggunaan EDTA dalam proses lisis berfungsi untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nucleases karena EDTA ini merupakan agen pengkelat ion yang dibutuhkan sebagai kofaktor sebagian besar nucleases dengan cara mengikat kation divalen (Muladno, 2010; Dale & Malcom, 2002; Chawla, 2003). Kation divalen merupakan aktivator bagi DNAse yang dapat memutuskan ikatan fosfodiester pada DNA sehingga dengan pengikatan kation divalen oleh EDTA dapat menghambat aktivitas DNAse (Saili, 2006; Weir, 1993; Muladno, 2010; Wilson & Walker, 2005 dalam Rahmawati, 2012 ). Selain EDTA dan SDS ada juga deterjen yang sifatnya sama untuk menghancurkan membran sel, yaitu CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). CTAB merupakan detergen yang berguna untuk melarutkan membran plasma sel dan akan membentuk komplek dengan DNA. CTAB adalah detergen yang berkation yang akan membentuk komplek presipitasi dengan DNA ketika konsentrasi NaCl di bawah 0,7 M.. Presipitasi DNA dari buffer CTAB dengan adanya etanol atau isopropanol sering menghasilkan massa bergelatin yang komposisinya tidak diketahui. DNA pada umumya terlihat jelas dalam massa tersebut, tetapi sulit untuk memisahkannya, sehingga untuk menghindari terbentuknya massa ini digunakan presipitasi yang tidak menggunakan alkohol (Chawla, 2003). Setelah penambahan bufer lisis larutan diinkubasi dan proses lisis berakhir dengan pemisahan komponenkomponen hasil lisis dengan cara sentrifugasi (Muladno, 2010). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 16 Tahapan isolasi DNA yang kedua adalah pemisahan DNA dengan protein dengan cara penambahan fenol (mengikat protein dan sebagian kecil RNA), kloroform (membersihkan protein dan polisakarida dari larutan) dan RNAse (Muladno, 2010 & Utami, 2012). Selain ketiga bahan kimia tersebut ada pula dalam proses ini menambahkan isoamil alkohol (kloroform:isoamil alkohol 24:1). Adanya isoamil alkohol bertujuan untuk mengurangi pembentukan busa (anti foaming agent) (Marmur, 1961 & Restu et al., 2012). Pada tahapan selanjutnya adalah purifikasi yang sebelumnya dilakukan proses presipitasi DNA dengan penambahan garam (NaCl) dengan konsentrasi tinggi sehingga dapat mengendapkan protein dikarenakan adanya proses salting out (Kurniati, 2009). Pada salting out terjadi kompetisi antara protein dan garam dalam menghidrasi dalam proses solvasi, sehingga protein dapat mengendap (Plummer, 1971). Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA dapat dilakukan dengan waktu pengerjaan yang lebih efisien. Hal ini dikarenakan kegiatan preparasi larutan yang mendukung kerja isolasi dapat diminimalkan atau tidak dilakukan. Salah satu pengembangan teknik isolasi DNA, yaitu dengan penggunaan kit komersial yang semua larutannya sudah tersedia dalam satu paket dengan pertimbangan untuk penggunaan beberapa kali reaksi. Pengukuran jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan dengan mengukur melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan.penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260nm, sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280nm. Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan validasi kemurnian DNA. Nilai rasio 1,8 – 2,0 menunjukkan sampel DNA yang murni (Muladno, 2010). Nilai rasio yang lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein (Teare et al., 1997; Gallagher, 1989), sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 17 2.5 Polymerase Chain Reaction PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida melalui bantuan enzim dalam suatu thermocycler (Gaffar, S., 2007; Muladno, 2010; & Sulistyaningsih, 2007). Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal disebut enzim polimerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (Muladno, 2010). Menurut Gaffar (2007), PCR melibatkan banyak siklus yang masingmasing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polymerase. Keunggulan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan basa nukleotida ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah, 2008 dalam widiastika). 2.5.1 Komponen PCR Ada 5 komponen penting dalam reaksi PCR, yaitu DNA target/tamplate, sepasang primer, enzim Taq Polymerase, deoxynucleoside triphosphate (dNTP), dan larutan buffer PCR (Gaffar, 2007 dan Muladno, 2010). 1. DNA Template UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 18 Dalam proses PCR, DNA template berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama atau molekul DNA yang menjadi sekuen target yang akan diamplifikasi dan biasanya berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA yang mengandung fragmen DNA target yang dituju. Keberhasilan PCR tergantung dari ada atau tidaknya sekuen yang sama dengan primer. 2. Primer Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 16 – 30 nukleotida dan mempunyai 40 – 60 % basa G-C content. Sekuen primer kurang dari 16 basa dapat memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Untuk ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer pada situs non-target) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh pada efektifitas dan efisiensi proses PCR. 3. dNTPs (Deoxynucleotide Triphosphates) Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). 4. Buffer PCR dan MgCl2 Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH medium karena reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 19 berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 akan meningkatkan interaksi primer dengan template DNA. 5. Enzim DNA Polimerase Enzim DNA polymerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan pada proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 950 C. Aktivitas polymerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polymerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polymerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai. 2.5.2 Tahapan PCR Adapun beberapa tahapan dalam proses PCR (gambar 2.7) adalah denaturasi (pemutusan untai ganda menjadi untai tunggal melalui pemanasan pada suhu 900 C – 950 C). Gambar 2.7 Tahapan PCR (Sumber. www. faculty.unlv.edu) Hal ini dikarenakan putusnya ikatan hydrogen diantara basa-basa yang komplemen, annealing (penempelan primer reverse-forward pada suhu 550 C-720 C akibat katalis enzim Taq Polymerase yang akan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 20 berikatan dengan ikatan hydrogen pada suhu melting dimana separuh jumlah primer menempel pada template), dan extension (pemanjangan DNA dengan katalis enzim polymerase) (Gaffar, 2007; Muladno, 2010). 2.6 Real-time PCR Real-time Polymerase Chain Reaction (RTPCR) merupakan salah satu teknik analisis yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler modern (Vaerman, 2004). Dibanding dengan teknik PCR konvensional (endpoint PCR), Real-time PCR memiliki berbagai keunggulan, yaitu amplifikasi atau perbanyakan fragmen DNA yang dapat diamati seketika (secara realtime) dan juga dapat menentukan konsentrasi target molekul DNA hasil amplifikasi. Real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur adanya peningkatan fluoroscent yang berpendar ketika terikat dengan doubled stranded DNA. Fluoresensi yang dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang teramplifikasi (Dooley et al., 2004). Dalam kurva amplifikasi ditunjukkan adanya 3 fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial dan fasa plateau seperti pada gambar 2.8 (Vaerman, 2004). Gambar 2.8 Bentuk Kurva Real-time PCR (Sumber. Bio-rad.com) Untuk menghindari masalah terkait dengan kespesifikan produk amplifikasi PCR yang terdeteksi, satu atau lebih fluorescent probes dapat ditambahkan dalam mix reaction. Probe dirancang sebagai komplemen dalam sekuen target amplifikasi, dan produk PCR hanya akan terdeteksi jika UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 21 probe menempel pada situs target pada saat annealing. Apabila probe menempel pada produk PCR selama langkah elongasi, aktivitas 5’exonuclease dari enzim polimerase akan memotong probe. Pemotongan probe tersebut mengakibatkan terpisahnya reporter dari quencher yang menyebabkan sinyal reporter tidak lagi diredam sehingga fluoresensi reporter dapat terdeteksi (Velden et al.,2003). Prinsipnya, dalam setiap siklus PCR, fragmen DNA baru diamplifikasi dengan enzim DNA polimerase dengan bantuan primer forward dan primer reverse. Selama amplifikasi, TaqMan probe menempel pada DNA template dan dirusak oleh DNA polimerase, kemudian reporter melepaskan fluoresensi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Pangan dan Obat Halal, Laboratorium Teknologi Sediaan Steril, dan Laboratorium Penelitian II, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan-Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.1.2 Waktu Waktu pelaksanaan penelitian dilaksanakan dari bulan Maret 2015 hingga Juni 2015. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Real-Time PCR (LightCycler® 480.0-Roche), Sterofoam, tabung mikrosentrifus volume 1.5 ml (Biogenix), High Pure Filter Tube dan Collection Tubes (Kit High Pure PCR Tamplate Preparation-Roche®), Plastic Wrap, Multiwell Plate 96 (Roche®), Sealing Foil (Roche®), Mikropipet 0.5 – 10 µl (Biorad), Mikropipet 2 – 20 µl (Biorad), Mikropipet 20 - 200 µl (Biorad), Mikropipet 100 – 1000 µl (Biorad), Mikrotips volume 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Spatula, Sentrifugator (5417R - Eppendorf), Vortex, Freezer, Digital Waterbath (SB-100 Eyela), Autoklaf, batang pengaduk, gelas ukur, gelas beaker, cawan penguap, kertas perkamen, plastik tahan panas, timbangan analitik, kaca arloji, benang kasur, pipet tetes, Moisture Balance Analyzer, dan Spektrofotometer UV DNA (BioDrop®). 3.2.2 Bahan Gelatin babi [Sigma-Aldrich], gelatin sapi [Sigma-Aldrich], satu set kit komersial High Pure PCR Template Preparation Roche® (meliputi: Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, Proteinase K, Inhibitor Removal 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 23 Wash Buffer, dan Elution Buffer), Tris Base, NaOH, NaCl, Sodium Dodecyl Sulphat (SDS), Na2EDTA, Kloroform, Aquabidest [Roche], Etanol Absolut [Merck], Etanol 70%, Isopropanol [Merck], LC TaqMan Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6.4 mM) [Roche], dan Primer-probe (tabel 1). Tabel 1. Urutan basa primer dan probe (Tanabe, et al., 2007 dengan modifikasi) Nama Primer Runutan Basa Babi Forward 5'-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3' Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3' Probe 5'-(FAM)-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTACBHQ_1-3' Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3' Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3' Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-BHQ_1-3' Sapi 3.3 Prosedur Kerja 3.3.1 Pembuatan lembar cangkang kapsul simulasi a. Formulasi Gelatin 30% Sorbitol 5% Pewarna 0.05% Aquadest ad 100% b. Cara Pembuatan Sebanyak 9 gram masing-masing gelatin babi dan sapi ditimbang dan dimasukkan ke dalam beaker glass dan ditambahkan dengan 9 ml aquadest panas. Kemudian ditambahkan 1.5 ml sorbitol, dan 0.015 gram pewarna. Campuran dihomogenkan dan dicukupkan sampai 30ml dengan aquadest lalu dipanaskan sampai membentuk larutan berwarna jernih. Campuran homogen dituangkan ke dalam cetakan sehingga membentuk lapisan tipis. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 24 Selanjutnya, lembaran simulasi cangkang kapsul keras disimpan dalam wadah berisi silika gel. 3.3.2 Pembuatan Larutan Stok Tahap pembuatan larutan stok cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) terdapat di lampiran 2. 3.3.3 Preparasi Sampel a. Gelatin Sebanyak 100 mg standar gelatin sapi dan gelatin babi ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube dan ditambahkan 200 μl aquabidest panas lalu diinkubasi pada suhu 750 C selama 30menit. Selanjutnya ditambahkan 250 μl Tissue Lysis Buffer (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 400 μl Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] untuk melisiskan sel dan 50 μl (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 20 μl (metode cell lysis buffer SDS 1%) larutan Proteinase K. Untuk menghomogenkan larutan tersebut maka campuran di vortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57 0 C selama 21 jam (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 3 jam (metode cell lysis buffer SDS 1%) dalam waterbath. Larutan gelatin yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi DNA. b. Cangkang Kapsul Keras Gelatin Simulasi Sebanyak 50 mg cangkang kapsul keras gelatin sapi dan gelatin babi ditimbang. Selanjutnya, masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube dan ditambahkan 100 μl aquabidest, 250 μl Tissue Lysis Buffer (Roche®) dan 400 μl Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] untuk melisiskan sel dan 50μl (kit Roche®) dan 20 μl (SDS 1%) larutan Proteinase K. Untuk menghomogenkan larutan tersebut maka campuran di vortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 570 C selama 21 jam (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation Roche®) dan 3 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 25 jam (metode cell lysis buffer SDS 1%) dalam waterbath. Larutan gelatin yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk tahap isolasi DNA. 3.3.4 Isolasi DNA Metode 1 [Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®)] Meode isolasi DNA mengikuti metode Izzah (2014) dengan modifikasi. Larutan (gelatin sapi, gelatin babi, simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi, dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi) hasil inkubasi ditambahkan 230 μl larutan Binding Buffer. Campuran tersebut divortex selama 20 detik untuk menghomogenkan dan diinkubasi pada suhu ± 70oC selama 10 menit pada waterbath. Penambahan 150 μl isopropanol pada masing-masing tube dan dihomogenkan dengan vortex selama 20 detik. Selanjutnya campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke filter tube yang sebelumnya telah terpasang pada collection tube, kemudian tube ditutup dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Proses selanjutnya, filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan dengan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Kemudian, ditambahkan 500 μl Inhibitor Removal Buffer ke dalam filter tube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Sama seperti sebelumnya setelah disentrifugasi filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang bersamaan dengan collection tube. Filter tube dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Masing-masing tube ditambahkan 500 μl Wash Buffer kemudian sentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dilakukan sekali lagi dengan Wash Buffer seperti sebelumnya. Selanjutnya, filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 26 setrifugasi kembali selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm diasumsikan agar tidak ada lagi wash buffer yang tertinggal pada filter. Tahapan selanjutnya yaitu mengelusi DNA yang terdapat pada filter tube dengan cara pisahkan collection tube dari filter tube dan pasangkan dengan microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Kemudian ditambahkan 200 μl Elution Buffer yang sebelumnya telah dihangantkan pada suhu 70oC selama 3 menit lalu disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Pada microsentrifuge tube telah mengandung DNA terpurifikasi dan disimpan pada suhu 4oC untuk dianalisa selanjutnya. Metode 2 [Isolasi DNA dengan menggunakan Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate)] Metode yang digunakan mengikuti metode isolasi Zheng, et al., (1995) dalam Utami (2012) dengan modifikasi. Larutan (gelatin sapi, gelatin babi, simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi, dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi) hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 40 C. Supernatan dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 400 μL kloroform dan divortex selama 20 detik. Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik pada suhu 40 C. Lapisan atas yang terbentuk dipisahkan pada microtube baru dan ditambahkan 800 μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -350 C selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 20 detik . Endapan berupa pellet DNA ditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 μL TE dan disimpan pada suhu 350 C. 3.3.5 Pengukuran Kemurnian dan Kuantitas DNA Kuantitas dan kemurnian DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV DNA (BioDrop®). Proses pengukuran mengikuti protokol dari (BioDrop®) dengan cara pada layar spektrofotometer UV UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 27 DNA (Biodrop®) dipilih Nucleac Acid. Selanjutnya, sample port dibersihkan dengan tisu steril. Elution Buffer (metode kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®)) dan Trish-EDTA (metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) bertindak sebagai blangko. Sebanyak 2 µl sampel isolat dari masingmasing metode diteteskan ke bagian sample port untuk diukur kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol measure. Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA. 3.3.6 Amplifikasi DNA dengan metode Real-Time PCR Larutan induk primer dan probe dengan konsentrasi 100 μM dibuat dan dimasukkan ke dalam tube. Kemudian kedua larutan tersebut dibuat menjadi primer dan probe konsentrasi 10 μM dan disimpan ke dalam tube yang lain. Master Mix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL template DNA, 1.4 μL Aquabidest, 1.6 μL primer forward konsentrasi 0.8 μM, 1.6 μL primer reverse konsentrasi 0.8 μM, 0.4 μL probe konsentrasi 0.2 μM, dan 10 μL LightCycler® 480 probe master (enzim FastStart Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6.4 mM MgCl2). Master mix dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real-time PCR. Instrumen realtime PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva. 3.3.7 Analisis Statistik Data DNA genom yang telah berhasil diukur dengan Spektrofotometer UV DNA (BioDrop®) pada serapan gelombang 260/280 nm dianalisis dengan menggunakan Software statistika, yaitu UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 28 IBM SPSS Statistics 20 dengan taraf kepercayaan 95% dengan Uji t sehingga dapat diketahui apakah perbedaan rata-rata yang diperoleh bermakna atau tidak. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini dilakukan pengujian terhadap DNA simulasi cangkang kapsul keras dengan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi simulasi cangkang kapsul keras dengan menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). 4.1. Pembuatan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras Lembaran simulasi cangkang kapsul keras dibuat dari standar gelatin sapi dan babi, sorbitol, aquadest, dan pewarna tartrazin. Penggunaan gelatin sebagai bahan utama didasarkan atas pemanfaatan sifatnya yang sebagai gelling agent (GMIA, 2012). a b Gambar 4.1 a. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi b. Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi Lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang dihasilkan berupa lembaran tipis, sedikit transparan, dapat digulung, berwarna kuning terang (asal gelatin babi) dan kuning cokelat (asal gelatin sapi). Perbedaan warna yang dihasilkan tersebut akibat dari warna asal serbuk gelatin (serbuk gelatin babi putih dan serbuk gelatin sapi kuning-cokelat). Hasil simulasi cangkang kapsul keras ditunjukkan pada gambar 4.1. Kandungan air dari lembaran simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi dan babi yang dihasilkan berturut-turut adalah 10.6 % dan 10.15 %. Menurut Farmakope IV (1995) kandungan air dalam cangkang kapsul keras adalah 10 – 15% sehingga dapat disimpulkan bahwa kandungan air dalam lembaran simulasi cangkang kapsul keras yang dibuat memenuhi syarat. 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 30 4.2. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dari gelatin sapi, babi, dan simulasi sapi dan babi dengan cara mengekstraksinya. Metode ekstraksi yang digunakan ada dua cara, yaitu menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). Prinsip metode tersebut intinya sama yaitu penghancuran membran sel (cell lysis), pemurnian dari sel debris dan protein (purifikasi), dan presipitasi DNA (Muladno, 2010 dan Rochec, 2007). 4.2.1. Isolasi DNA dengan Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) terdiri dari lima larutan yang terpisah dan memiliki spesifikasi masing-masing seperti yang terperinci dalam lampiran 4 Prinsip dari kit ini adalah DNA sampel diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2) yang terdapat dalam filter tube dan selama pencucian dan pemusingan DNA tetap terikat dengan fiber glass sehingga ini dapat meminimalisir kehilangan DNA pada saat isolasi DNA (Izzah, 2014 dan Rochec, 2007). Metode isolasi dengan kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) mengikuti metode Izzah (2014) dengan mengalami modifikasi pada jumlah volume penggunaan Tissue Lysis Buffer, Binding Buffer, dan Proteinase K. Peningkatan jumlah volume penggunaan bahan tersebut berdasarkan arahan dari protokol Kit Roche® apabila dalam penggunaan prosedur isolasi tidak memberikan hasil yang memuaskan. Modifikasi pada penggunaan bahan tersebut didasarkan pada peran masing-masing, yaitu Tissue Lysis Buffer sebagai penghancur membrane sel dikarenakan adanya EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) sehingga dengan penambahan jumlah penggunaannya maka semakin besar sel yang hancur akibatnya semakin banyak pula DNA yang keluar dari sel, Binding Buffer berperan dalam ikatan DNA dan Silikon Dioksida sehingga dengan menambahkan jumlah volume pemakaiannya maka semakin UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 31 banyak DNA yang terikat kuat, dan Proteinase K yang mempunyai peran untuk menghilangkan protein sehingga dengan begitu ketika jumlah Proteinase K ditingkatkan maka jumlah kontaminan protein dalam isolat DNA semakin kecil. Keunggulan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah sederhana dan ekonomis. Dikatakan sederhana karena dalam pengerjaannya tidak rumit (proses presipitasi dihilangkan) dan aman (risiko terpapar bahan toksik dapat dihindari seperti tidak adanya penggunaan kloroform dan deterjen). Metode ini juga relatif ekonomis karena tidak membutuhkan banyak pelarut namun kandungannya lengkap seperti diperlihatkan pada lampiran 4. Dalam penelitian yang menjadi kelemahan dari metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) adalah relatif lama dalam pengerjaannya karena waktu proses lisis sel yang dilakukan overnight dan hanya dapat digunakan untuk beberapa reaksi saja. 4.2.2. Isolasi DNA dengan larutan ekstraksi SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) Salah satu metode konvensional untuk isolasi DNA adalah dengan penggunaan deterjen dan agen pengkhelat dalam proses lisisnya (Muladno, 2010). Deterjen yang digunakan dalam penelitian adalah SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) yang merupakan deterjen kationik yang memiliki kemampuan dapat melarutkan komponen lipid dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel sehingga struktur membran sel menjadi rusak (Kesmen, et al., 2009; Maftuchah & Zainudin, 2006; dan Malisa et al., 2006).) Keberadaan agen pengkhelat seperti EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid) dalam penelitian dapat memutuskan ikatan fosfodiester pada DNA dengan cara mengikat kation divalen yang merupakan aktivator bagi DNAse (Saili, 2006 dalam Rahmawati, 2012). Tahapan isolasi DNA mengikuti metode Utami, et al., (2012) dengan modifikasi pada jenis sampel yang diisolasi dan penambahan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 32 proteinase K. Sampel isolasi dalam penelitian ini adalah gelatin sapi dan babi dan simulasi sapi dan babi. Penambahan proteinase K bertujuan untuk menghilangkan kontaminan protein dalam isolat DNA dan memberikan aktivitas dari SDS 1% menjadi lebih optimal (Hilz, et al., 1975 dan Muladno, 2010). Larutan yang digunakan dalam metode konvensional ini adalah kloroform, etanol absolut, dan etanol 70%. Fungsi dari kloroform adalah untuk presipitasi protein, sedangkan etanol absolut dan etanol 70% berturut-turut berperan sebagai presipitasi DNA dan purifikasi DNA (Utami, et al., 2012). Pada saat presipitasi DNA terbentuk 3 lapisan seperti yang diperlihatkan pada lampiran 5 yaitu lapisan atas adalah fase air, lapisan tengah adalah protein, dan lapisan bawah adalah fase organik (kloroform). Kejadian ini terjadi karena adanya perbedaan masa jenis. Masa jenis air lebih kecil (1 g/mL) dari masa jenis kloroform (1.4474 g/mL) shingga air berada di lapisan atas dan kloroform berada di lapisan bawah. Lapisan atas merupakan fase air yang mengandung DNA terlarut akibat dari sifat keduanya yang sama-sama polar. Sifat DNA yang polar dikarenakan adanya muatan negatif pada rantai fosfat sedangkan protein berada pada pelarut organik (kloroform) akibat sifatnya yang nonpolar (Rahmawati, 2002). Proses presipitasi dilakukan dua kali yang bertujuan untuk memperkecil DNA dari kontaminan protein. Adanya DNA pada fase air maka lapisan ini diambil dan dipisahkan untuk proses presipitasi DNA. Presipitasi DNA menggunakan etanol absolut dengan cara membuat DNA menjadi kurang hidrofil sehingga DNA mengendap. Pemisahan endapan (pellet) dan supernatan perlu kehati-hatian karena akan menentukan pada kemurnian isolat yang dihasilkan. Isolasi dengan metode SDS memiliki keuntungan, yaitu efisiensi waktu pengerjaan yang relatif cepat dan dapat digunakan beberapa kali reaksi. Pengerjaan yang relatif cepat dikarenakan proses lisis sel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 33 yang hanya diperlukan 3 jam dalam penelitian sehingga total pengerjaan kurang lebih 5 jam (lihat tabel 4.1). Tabel 4.1 Hasil Analisis Metode Kit Komersial dan SDS Nama Metode Kit Roche® Waktu Pengerjaan ± 23 jam SDS ± 5 jam Biaya (1xReaksi) ± Rp 30.800 Tahapan Sederhana (tidak ada tahap presipitasi protein dan DNA) ± Rp101.500 Rumit (ada pembuatan larutan stok, ada tahap presipitasi protein dan DNA) Namun, kekurangan metode ini adalah step-step pengerjaan yang cukup rumit, membutuhkan ketelitian yang ekstra terutama dalam hal pemisahan supernatan dan endapan (pellet) karena kemungkinan kehilangan isolat lebih tinggi akibat dari pengulangan tahapan tersebut dan tingkat keamanan yang harus diperhatikan karena kontak dengan bahan-bahan yang toksik (serbuk SDS, kloroform, etanol absolut) dalam jumlah yang cukup banyak serta membutuhkan biaya yang mahal. 4.2.3. Pengukuran Isolat DNA Isolat DNA yang dihasilkan diukur menggunakan alat Spektrofotometer DNA (Biodrop®) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Hasil analisis diinterpretasikan pada tabel 4.1. Analisis isolat DNA didapatkan nilai konsentrasi (jumlah DNA) dan kemurnian. Pengukuran nilai konsentrasi didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam isolat. Secara maksimal penyerapan iradiasi oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan untuk protein pada panjang gelombang 280 nm (Muladno, 2010). Dari hasil yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 34 dengan metode cell lysis buffer SDS 1% berkisar 16.73 – 20.83 ng/ µl, 4.55 – 11.97 ng/ µl, 13.30 – 15.39 ng/ µl, dan 20.53 – 36.99 ng/ µl. Hasil konsentrasi gelatin sapi dan babi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) yang didapatkan lebih besar dari penelitian sebelumnya yang hanya sekitar 19.38 ng/ µl untuk gelatin sapi dan 13.63 ng/ µl untuk gelatin babi (Izzah, 2014). Secara garis besar isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) memperoleh konsentrasi DNA yang lebih tinggi dibandingkan metode isolasi dengan cell lysis buffer SDS 1% karena pada metode kit tidak terjadi proses presipitasi dan kandungan reagennya lebih banyak seperti adanya Urea dan Triton X namun pada simulasi babi sebaliknya metode SDS yang lebih tinggi. Tabel 4.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer DNA (Biodrop®) Nama Sampel Kit Roche Gelatin Sapi I ® SDS Kit Roche Gelatin Babi Hasil Nama Metode Isolasi ® SDS ® Simulasi cangkang Kit Roche kapsul dari gelatin SDS sapi Simulasi cangkang Kit Roche® kapsul dari gelatin SDS babi Keterangan : a mean ± SD Konsentrasi (ng/µl) Rata-rata a II III I Kemurnian (A260/A280) Rata-rata a II III 27.84 31.63 48.77 36.08 ± 11.15 1.561 1.698 1.698 1.652 ± 0.079 16.73 20.83 19.26 18.94 ± 2.07 1.367 1.401 1.351 1.373 ± 0.026 3.71 11.70 16.90 10.77 ± 6.64 1.369 1.510 1.707 1.529 ± 0.170 4.55 9.09 11.97 8.536 ± 3.74 1.284 1.195 1.092 1.190 ± 0.096 8.70 13.82 19.01 13.84 ± 5.15 1.851 1.169 1.583 1.534 ± 0.343 13.57 15.39 13.30 14.09 ± 1.14 1.408 1.345 1.424 1.392 ± 0.041 2.30 4.33 9.54 5.388 ± 3.73 1.772 1.310 2.013 1.698 ± 0.357 20.53 23.87 36.99 27.13 ± 8.70 1.283 1.299 1.276 1.286 ± 0.012 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 35 Hasil pengukuran kemurnian yang didapatkan belum dikatakan murni. Menurut Muladno, (2010) bahwa DNA yang dikategorikan murni berkisar 1.8 – 2. Dalam penelitian, nilai kemurnian gelatin sapi, gelatin babi, simulasi sapi, dan simulasi babi pada metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) berturutturut berkisar 1.561 – 1.698, 1.369 – 1.707, 1.169 – 1.851, dan 1.310 – 2.013 sedangkan metode cell lysis buffer SDS 1% berturut-turut 1.351 – 1.401, 1.092 – 1.284, 1.345 – 1.424, dan 1.276 – 1.299. Berdasarkan nilai-nilai tersebut dapat disimpulkan bahwa isolasi dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) memberikan hasil kemurnian yang lebih bagus dikarenakan adanya pengikatan DNA pada fiber glass (silikon dioksida) sehingga pencampuran dengan bahan lain dapat diminimalisir. 4.2.4. Hasil Analisis Pengukuran Isolat DNA dengan Statistika Analisis pengukuran isolat DNA dilakukan dengan bantuan program statistik, yaitu software IBM SPSS Statistics 20 bertujuan agar lebih mudah dan cepat. Adapun hasilnya disajikan dalam tabel 4.2. Tabel 3. Distribusi Rata-rata Konsentrasi DNA Gelatin dan simulasi menurut konsentrasi DNA Metode Isolasi a Metode 1 Metode 2 b Mean 16.520 17.174 SD c 13.500 7.881 SE d 6.750 3.941 P value 0.936 N 4 4 Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) c. Standar Deviasi d. Standar Error Tujuan analisis dengan statistik adalah untuk mengetahui apakah ada perbedaan mean antara dua kelompok (metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan cell lysis buffer SDS 1%). Uji yang dipakai adalah uji t tidak berpasangan karena terdiri dari 2 kelompok dan tidak saling ketergantungan (Hastomo, 2007). Syarat uji t adalah wajib berdistribusi normal dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 36 data konsentrasi ini memenuhinya. Dari tabel 3. rata-rata konsentrasi DNA metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) adalah 16.520 ng% dengan standar deviasi 13.500 ng%, sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata konsentrasi DNA-nya adalah 17.174 ng% dengan standar deviasi 7.881 ng%. Hasil uji statistik didapatkan nilai p=0.936, berarti pada alpha 5% terlihat tidak ada perbedaan yang signifikan rata-rata konsentrasi DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%. Tabel 4. Distribusi Rata-rata Kemurnian DNA Gelatin dan simulasi menurut kemurnian DNA Metode Isolasi Mean SD c SE d Metode 1 a Metode 2 b 1.60325 1.31025 0.084976 0.042488 0.092500 0.092500 P value N 0.003 4 4 Keterangan : a. Kit komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) b. Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) c. Standar Deviasi d. Standar Error Dari tabel 4.3 rata-rata kemurnian DNA metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) adalah 1.60325 dengan standar deviasi 0.084976 , sedangkan untuk metode cell lysis buffer SDS 1% rata-rata kemurnian DNA-nya adalah 1.31025 dengan p=0.003, standar deviasi 0.092500 . Hasil berarti pada alpha 5% terlihat uji t didapatkan nilai ada perbedaan yang signifikan rata-rata kemurnian DNA antara metode isolasi DNA dengan kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Roche®) dan metode isolasi DNA dengan cell lysis buffer SDS 1%. 4.3. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin dengan Real Time PCR Amplifikasi DNA dengan Real Time PCR menggunakan metode Hydrolisis Probe dengan mengikuti metode Izzah (2014) dengan sedikit modifikasi pada jumlah siklus, yaitu 50 siklus menjadi 65 siklus untuk primer UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 37 sapi dan 60 siklus menjadi 65 siklus untuk primer babi. Persiapan metode Hydrolisis Probe adalah menentukan sepasang primer target spesifik dengan cara mendesain primer. Dalam penelitian, primer yang digunakan mengacu pada Tanabe, et al., (2007) dalam Izzah (2014) dengan modifikasi. 4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin dengan Primer Sapi Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu tahap denaturasi, anealing, dan ekstensi. Denaturasi adalah tahap dimana DNA tamplate membelah menjadi untai DNA tunggal pada suhu 950 C. Suhu tersebut merupakan waktu optimal DNA terdenaturasi (Muladno, 2010). Tahap penempelan (anealing) antara primer dan DNA tamplate pada suhu 610 C sesuai optimasi yang dilakukan oleh Izzah (2014). Salah satu keberhasilan dalam amplifikasi PCR adalah tergantung pada suhu annealing primer. Jika suhu annealing terlalu tinggi, oligonukleotida primer tidak akan menempel dengan baik, sehingga hasil produk akan sangat sedikit. Namun, apabila suhu annealing terlalu rendah, primer dapat menempel pada bukan situs target (non-spesific), sehingga dihasilkan produk PCR yang tidak diinginkan bahkan bisa jadi tidak ada produk yang dihasilkan (Dale & Malcom, 2002; Bartlet & Stirling, 2003). Format deteksi dari Hydrolisis Probe adalah FAM (6-carboxylflourescein) sebagai reporter dan BHQ1 (Block Hole Quencher) sebagai quencher (Johansson, 2006). FAM merupakan hidrolisis probe yang memiliki serapan gelombang pada 483nm dan gelombang emisi 533nm (Roche®), sedangkan BHQ1 memiliki serapan gelombang 543nm (Johansson, 2006). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 38 DS GS2 SS2 GS GB2 SB DB SB SS SB2 GB NTC SB Gambar 4.2 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin pada primer sapi Keterangan : DS (Daging sapi), DB(daging babi), GS (Gelatin Sapi metode kit), GS2 (Gelatin sapi metode SDS), GB (Gelatin babi metode kit), GB2 (gelatin babi metode SDS), SS (simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi metode kit), SS2(simulasi cangkang kapsul gelatin sapi metode SDS), SB (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode kit), SB2 (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode SDS), dan NTC (No Tamplate Control) Data kualitatif yang diperoleh dari hasil analisis berupa Crossing point (Cp). Cp adalah nilai dimana flouresens pada sampel meningkat di atas fase lag (background) dan ini menjadi tanda pada siklus keberapa sampel mulai teramplifikasi seperti diperlihatkan pada gambar 4.2. Dari hasil kurva amplifikasi terlihat kenaikan kurva (membentuk fase log) pertama kali dari daging sapi sesuai gambar 4.2 dengan Cp 13,92; selanjutnya diikuti berturut-turut gelatin sapi metode SDS (26.47), simulasi sapi metode SDS (27.77), simulasi sapi metode kit (27.85), gelatin sapi (29.78), dan daging babi (33.49). Kenaikan tersebut menandakan primer yang dipakai spesifik dikarenakan semua sampel yang sebagai kontrol positif dapat teramplifikasi dan NTC tidak mengalami kenaikan. Naiknya daging babi kemungkinan pada saat pengerjaan reaksi RT-PCR terkontaminasi. Real time PCR ini dapat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 39 mendeteksi cemaran sampai 0.01% dan bahkan sampai piktogram (Roche c). 4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dan Lembaran Simulasi Cangkang Kapsul Keras Gelatin dengan Primer Babi Amplifikasi DNA gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras mengikuti metode Puspitaningrum (2014) dengan suhu annealing 610 C. DNA genom yang diamplifikasi adalah DNA genom yang memiliki konsentrasi yang tinggi diantara tiga kali pengulangan dari masingmasing sampel [gelatin babi (metode kit & SDS 1%), gelatin sapi (metode kit & SDS 1%), simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi (metode kit & SDS 1%), dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi (metode kit & SDS 1%) ]. Dari gambar 4.3 sampel yang mengalami kenaikan adalah daging babi dengan Cp 10,86; simulasi babi metode SDS (18.59), gelatin babi metode kit (27.29), dan daging sapi (31.78). DB SB2 Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi DNA Gelatin dan simulasi cangkang kapsul keras gelatin pada primer babi Keterangan : DS (Daging sapi), DB(daging babi), GS (Gelatin Sapi metode kit), GS2 (Gelatin sapi metode SDS), GB (Gelatin babi metode kit), GB2 (gelatin babi metode SDS), SS (simulasi cangkang kapsul keras gelatin sapi metode kit), SS2(simulasi cangkang kapsul gelatin sapi metode SDS), SB (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode kit), UIN Syarif Hidayatullah Jakarta NTC GB GB2 SB DS SS GS2 SS2 GS 40 SB2 (simulasi cangkang kapsul keras gelatin babi metode SDS), dan NTC (No Tamplate Control) Nilai Cp yang dihasilkan sesuai urutan tertinggi dengan jumlah konsentrasi yang dimiliki dari masing-masing sampel. Sampel simulasi cangkang kapsul keras dari gelatin babi dengan metode kit komersial High Pure PCR Template Preparation dan gelatin babi metode cell lysis buffer SDS 1% tidak mengalami kenaikan dikarenakan ada kemungkinan DNA yang dikandung mengalami fragmentasi pada saat pengolahan sehingga tidak ada sekuens yang cocok dengan primer babi (Demirhan., et al., 2011) Naiknya daging sapi kemungkinan tercemar pada saat pencampuran reaksi RT-PCR. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa: 1. Metode isolasi DNA kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation lebih unggul (ekonomis, tingkat kemurnian tinggi, lebih aman, dan lebih sederhana) dibanding metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate). 2. DNA genom dari simulasi cangkang kapsul keras dengan metode kit komersial High Pure PCR Tamplate Preparation belum dapat teramplifikasi, sedangkan dengan metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) sudah dapat teramplifikasi. 5.2 Saran 1. Perlu dilakukan optimasi pada tahap presipitasi protein pada metode cell lysis buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) dengan asetonitril, asam tungstat, dan asam trikoloroasetat agar didapatkan DNA genom dengan tingkat kemurnian yang lebih bagus dari kloroform. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan metode isolasi DNA yang lain seperti dengan deterjen CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide) dan kit SureFood® Animal ID Sens agar didapatkan DNA genom yang lebih murni. 3. Perlu dilakukan pengujian lanjut dengan sampel cangkang kapsul yang beredar di pasaran. 41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 42 DAFTAR PUSTAKA Ansel, Howard. (2005). Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi ed. Keempat. Jakarta: UI Press Bailey A.J., Paul R.G., (1998). Collagen – A not so simple protein. J. Soc. Leather Techn. Chem. 82 (3), 104-110 Balti, et al. (2010). Extraction and Functional Properties of Gelatin From The Skin of Cuttlefish (Sepia officinalis) using Smooth Hound Crude Acid Protease-Aided Process. Artikel pada Press Food Hydrocolloids Belitz, H. D., and W. Grosch. (1999). Food Chemistry. 2nd Edit. Springer, Germany. Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng dan C.R. Lively. (2012). Realtime PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. J. Food Compos. Anal., 25, 83-87 Carr, J.M., K. Sufferling, dan J. Poppe. (1995). Hydrocolloids and Their Use in The Confectionery Industry. Journal of Food Technology. Vol.32 (7). Hal: 41-42 Chawla, H. S. (2003). Plant Biotechnology : A Practical Approach. Science Publishers, Inc. Plymouth Dale, Jeremy W. & Malcom von Schantz. (2002). From Genes to Genomes: Concepts and Applications of DNA Technology. United Kingdom : John Wiley & Sons, Ltd Fatimah, Widia. (2012). Analisa Profil Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Sebelum dan Setelah Perlakuan Hidrolisis Enzim Pepsin. Skripsi. Program Studi Kimia. Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gaffar, Shabrani. (2007). Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPAUniversitas Padjajaran Gallagher, S.R. (1989). Quantitation of DNA and RNA with Absorption and Fluorescene Spectroscopy, dalam : F.A. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology. New York : John Wiley & Sons Giacomazzi, et al., (2005). Medium-Range Structural Properies of Vitreus Germania Obtained Through First Principles Analyss of Vibrational Spectra. Phys. Rev. Lett 95, 075505 Glicksman M. (1969). Gum Technology in Food Industry. New York: Academic Press UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 43 Grobben, A.H., et al., (2004). Inactivation of the ovine-spongiform-encephalopathy (BSE) agent by the acid and alkali processes used the manufacture of bone gelatin. Biotechnology and Applied biochemistry 39: 329-338 GMIA, (2012), Gelatin Handbook , USA : Gelatin Manufactures Instituteof America Guillen, Gomez M.C., Perez-Mateos, M., Gomez-Estaca, J., Lopez-Caballero, E., Gimenez., B., & Montero, P. (2009). Fish Gelatin: A RenewableMaterial for The Development of Active Biodegradable Films. Trends in Food Science and Technology. Vol.20. hal 3-16 Hartati, Yeni W., Maksum, Iman P. (2010). Amplifikasi 0,4 kb Daerah D-Loop DNA Mitokondria dari Sel Epitel Rongga Mulut untuk Keperluan Forensik, FMIPA-Universitas Padjadjaran Hidaka, S. dan S.Y. Liu. (2003). Effects of gelatins on calcium phosphate precipitation: A possible application for distinguishing bovine bone gelatin from porcine skin gelatin, J. Food Compos. Anal., 16, 477-483 Holme D.J. P. Hazel. (1998). Analytical Biochemistry 3rd ed, London: Addison Wesley Longman Izzah, A.N. (2014). Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolisis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapid an DNA Babi dengan menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Johansson, M.K. 2006. Choosing Reporter-Quencher Pairs for Efficient Quenching Through Formation of Intramolecular Dimers, dalam Methods in Molecular Biology 335 : 17 – 29 Kesmen, Z., A.Gulluce., F. Sahin., H. Yetim. (2009). Identification of Meat Species by Taqman-Based Real-Time PCR assay. Meat Science 82: 444 – 449 Khosravinia, et al, (2007). Optimazing Factors Influencing DNA extraction from Fresh Whole avian blood. African journal of Biotechnology. Vol. 6(4). Pp-481-486. Koolman, Jan. (1994). Atlas Berwarna dan teks Biokimia / Jan Koolman, KlausHeinrich Rohm ; alih bahasa, Septelia Inawati Wanandi ; editor edisi bahasa Indonesia, Moh. Sadikin. Jakarta : Hipokrates, 2000 Kurniati, Elly. (2009). Pembuatan Konsentrat Protein dari Biji Kecipir dengan Penambahan HCL. Jurnal Penelitian Ilmu Teknik 9(2) : 115 – 122 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 44 M. Wink, (2006), An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology, Wiley-VCH, Weinheim, Germany Maftuchah., & Zainudin, Agus. (2006). Pengembangan Metode Isolasi DNA Genom pada Tanaman Jarak Pagar (Jatropha Curcas L.). HUMANITY 2(1): 63 – 69 Malisa, A. L., P. Gwakisa., S. Balthazary., S. K. Wasser., B.M. Mutayoba. (2006). The Potential of Mitochondrial DNA Markers and Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism for Domestic and Wild Species Identification. African Journal of Biotechnology 5 (18): 1588 Mariod, A.A. & Adam, H.F., (2013), Review: Gelatin, Source, Extraction, and Industrial Applications, J. Acta Sci. Pol., Technol. Aliment 12 (2), 135147 Marmur, J., & L. Lane. (1958). Strand Separation and Specific Recombination in Deoxyribonucleic Acids Biological Studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (44): 671 – 682– 1593 Montero, P; and M.C. Gomez-Guillen. (2000). Extracting Condition for Mergin (Lepidorhombus boscii) Skin Collagen Affect Functioonal Properties of Resulting Collagen. Jurnal of Food science, 55(2) 1 –5 Muladno. (2010). Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press Mulyana, Yopi. (2010). Analisis Cemaran Daging Babi pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Murray, et al., (2012). Biokimia Harper. Jakarta : EGC Nhari, R.M.H.R., A. Ismail dan Y.B. Che Man. (2012). Analytical methods for gelatin differentiation from bovine and porcine origins and food products.J. Food Sci., 71, R42-R46 Plummer, D.T. (1971). An Introduction to Practical Biochemistry 1st Edition. New Delhi : Tata McGraw-Hill Publishing Company Ltd Pratami, D.F. (2011). Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Burger Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 45 Purves, et al. (2004). Life: The Science of Biology. Edisi Ketujuh. United States of America : Sinauer Associates and W.H. Freeman Puspitaningrum, Yanti. (2015). Deteksi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi pada Simulasi Gummy Vitamin C Menggunakan Real-Time PCR untuk Analisis Kehalalan. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Rabadiya, Bhavisha dan Paresh Rabadiya. (2013). Capsule Shell Material from Gelatine to Non Animal Origin Material. International Journal of Pharmaceutical Research and Bio Science (IJPRBS). Vol. 2(3). Hal: 4271 Rahmawati, Putri. (2012). Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR. Skripsi. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Replubika. (2014). Gelatin kulit babi vs kulit sapi, Republika online vers, Breaking News, 25 November 2014. http//www.republika.co.id Rowe, Raymond C., Paul J. Sheskey, dan Marian E Quinn. (2009). Handbook of Pharmaceutical Excipients. Edisi Keenam. London:Pharmaceutical Press Saputra, F.R. (2014). Aplikasi Metode SDS-PHAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) untuk Mengidentifikasi Sumber Gelatin pada Kapsul Keras. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Setiawati, Ima Hani. (2009). Karakterisasi Mutu Fisika Kimia Gelatin Kulit Ikan Kakap Merah (Lutjanus sp.) Hasil Proses Perlakuan Asam.Skripsi. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor Solihin, Dedy Duryadi. (1994). Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587 Subandiyah, S. (2006). Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA.Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR. Malang. Hal. 22-25 Sulistyaningsih, Erma. (2007). Polymerase Chain Reaction: Era Baru Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Biomedis, 1 (1) : 17 – 25 Surzycki, S.J. (2000). Basic Techniquesin Molecular Biology. Springer-Verlag publisher ISBN 3-540-66678-8 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 46 Stansfield, et al. (2003). Shaum’s Easy Outlines : Molecular and Cell Biology. USA: Mc.Graw-Hill Companies, Inc Susmiarsih, T. (2010). Peran Genetika DNA Mitokondroa (mtDNA) Pada Motilitas Spermatozoa. Universitas Yarsi, Fakultas Kedokteran :Majalah Kesehatan Pharma Medika Syafiqoh, Fathmah. (2014). Analisis Gelatin Sapid an Gelatin Babi pada Produk Cangkang Kapsul Keras Obat dan Vitamin Menggunakan FTIR dan KCKT. Skripsi. Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tahmid, Muhammad. (2005). Studi Kelayakan Pendirian Industri Gelatin TipeB Berbasis Tulang Sapi di Indonesia. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor Teare, J.M., R. Islam., R. Flanagan., S. Gallagher., M.G Davies., C. Grabau. (1997). Measurement of Nucleic Acid Concentrations Using the DyNA QuantTM and the GeneQuantTM. BioTechniques 22 : 1170 – 1174 Utami, et al., (2012), Varisai Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma xanthorrhiza, Roxb), Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa, Surabaya. Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. (2004). Evaluation of Real-Time PCR Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles Windiastika, G. Teknologi Marka Molekular Tanaman. Balai Besar Pembenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya Wink, M. (2006). An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology, Germany: Wiley-VCH, Weinheim Yuwono, Triwibowo. (2009). Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 47 Lampiran 1. Kerangka Penelitian Gelatin Babi Gelatin Sapi Cangkang Kapsul Simulasi Babi Cangkang Kapsul Simulasi Sapi Preparasi Ekstraksi Isolasi dan Purifikasi DNA Metode SDS Metode Kit Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA Keterangan : DNA tidak terisolasi DNA terisolasi Analisis Statistik (Uji t) Amplifikasi dengan Real Time PCR Produk Proses Kesimpulan Analisis hasil UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 48 Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS a. Jumlah serbuk Na2EDTA yang diperlukan Massa = = M x Mr x V 1000 0.5 x 372.24 x 10 1000 = 1.8612 gram b. Jumlah serbuk TRIS yang diperlukan Massa = = M x Mr x V 1000 1 x 121.14 x 10 1000 = 1.2114 gram c. Jumlah serbuk NaCl yang diperlukan Massa = = M x Mr x V 1000 5 x 58.44 x 30 1000 = 8.76 gram d. Larutan Na2EDTA yang diperlukan M1 x V1 = M2 x V2 25 x 100 = 500 x V2 V2 = 5 ml e. Larutan Tris-HCl yang diperlukan M1 x V1 = M2 x V2 50 x 100 = 1000 x V2 V2 = 5 ml f. Larutan NaCl yang diperlukan M1 x V1 = M2 x V2 300 x 100 = 5000 x V2 V2 = 6 ml UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 49 Lampiran 3. Pembuatan Larutan Stok Cell Lysis Buffer SDS a. Larutan SDS 5 % - SDS : 2.5 gram - NaCl : 1 gram - Aquadest ad 50 ml - Larutan dibuat dengan cara mencampurkan bahan kimia dalam beaker glass sembari diaduk secara perlahan-lahan agar busa yang dihasilkan tidak terlalu banyak. b. Larutan Tris-HCL 1M pH 7.45 (10 ml) - Tris : 1.2114 gram - HCL p.a : 0.42 gram - Aquadest ad 10 ml - Larutan dibuat dengan cara mencampurkan bahan kimia dalam beaker glass dengan bantuan pengadukan magnetic stirrer dalam hot plate - Larutan homogen disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit c. Larutan Na2EDTA 0.5M pH 7.44 (10ml) - Na2EDTA : 1.8612 gram - NaOH : 0.2 gram - Aquadest ad 10 ml - Larutan dibuat dengan cara mencampurkan bahan kimia dalam beaker glass dengan bantuan pengadukan magnetic stirrer - Untuk pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan HCL hingga pH7.44 - Larutan homogen disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit d. Larutan NaCL 5M pH 7.5 (30 ml) - NaCl : 8.76 gram - Aquadest ad 30 ml UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 50 - Larutan dibuat dengan cara melarutkan NaCl dalam aquadest dengan bantuan pengadukan menggunakan batang pengaduk - Larutan homogen disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit e. Buffer SDS (100 ml) - Larutan SDS 1% : 20 ml larutan SDS 5% - Larutan NaCl 300 mM : 6 ml larutan NaCl 5M pH 7.5 - Larutan Na2EDTA 25mM : 5 ml larutan EDTA 0.5M pH 7.44 - Larutan Tris-HCl 50mM : 5 ml larutan Tris-HCl 1M pH 7.45 - Aquadest steril - Larutan komponen buffer SDS dicampur homogenkan dengan bantuan ad 100 ml batang pengaduk f. Buffer TE (50ml) - Larutan Tris-HCl 1M pH 7.45 : 0.5ml - Larutan EDTA 0.5M pH 7.44 : 0.1 ml - Aquadest ad 50ml - Larutan dicampurkan dan dihomogenkan dengan bantuan batang pengaduk UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 51 Lampiran 4. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe serta Tm (Melting Temperature) Primer a. Perhitungan pembuatan larutan primer 1. Membuat larutan primer dan probe 10 µM dari larutan induk 100 µM M1 x V1 = M2 x V2 10 µM x 100 µL = 100 µM x V2 V2 = 10 µL Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µL dan di cukupkan sampai volume 100 µL dengan PCR eater grade 2. Membuat larutan primer dengan konsentrasi 10 µM M1 x V1 = M2 x V2 0.8 µM x 20 µL = 10 µM x V2 V2 = 1.6 µL Maka, diambil 1.6 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM 3. Membuat larutan probe dengan konsentrasi 0.2 µM M1 x V1 = M2 x V2 0.2 µM x 20 µL = 10 µM x V2 V2 = 0.4 µL Maka, diambil 0.4 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM b. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer Primer sapi Primer Babi Tm Forward = 20 C (2+8) + 40 C (2+8) Tm Forward = 20 C (7+6) + 40 C (4+7) = 600 C Tm Reverse = 20 C (5+8) + 40 C (6+5) = 700 C Tm Reverse = 20 C (8+7) + 40 C (6+4) = 700 C = 700 C Tm Rata-rata Primer sapi Tm Rata-rata Primer babi Tm Tm = (60+70)/2 = 650 C Ta* = 600 C = (70+70)/2 = 700 C Ta* = 650 C UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 52 Lampiran 5. Tabel Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) dan Campuran Reaksi Hydrolisis Probe Mastemix Tabel 1. Spesifikasi Komponen Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche®) No. Nama Komponen Kit Komposisi 1. Tissue Lysis Buffer 4M Urea, 200mM Tris, 20mM NaCl, 200mM EDTA pH 7.4 2. Binding Buffer 6M Guanidine HCl, 10mM Urea,10 mM Tris-HCl, 20% Triton X100 (v/v) pH 4.4 3. Inhibitor Removal Buffer 5M Guanidine HCl, 20mM Tris-HCl pH 6.6 4. Proteinase K Enzim Proteinase PCR grade 5. Wash Buffer 20mM NaCl, 2mM TrisHCl pH 7.5 6. Elution Buffer 10mM Tris-HCl pH 8.5 7. High Pure Filter Tube Berasal dari bahan polipropilen yang terdiri dari dua lapisan serat kaca 8. Collection Tube Berasal dari bahan polipropilen Tabel 2. Campuran Reaksi Hydrolisis Probe Mastemix Primer Forward Primer Riverse Probe LightCycler® 480 Probe Master ddH2O DNA Tamplate Konsentrasi Larutan Induk 0.8 µM 0.8 µM 0.2 µM 10 µM 10 µM 10 µM Jumlah yang digunakan 1.6 µM 1.6 µM 0.4 µM - - 10 µM Total - 1.4 µM 5 µM 20 µM UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 53 Lampiran 6. Gambar Presipitasi Protein a b c Gambar 1. Fase air (a), protein (b) dan kloroform (c) pada ekstraksi gelatin sapi Gambar 2. Fase air (a), protein (b), dan kloroform (c) pada ekstraksi simulasi cangkang kapsul sapi a b c Gambar 3. Fase air (a) , protein (b) dan kloroform (c) pada ekstraksi gelatin babi Gambar 4. Fase air (a), protein (b) dan kloroform (c) pada ekstraksi simulasi cangkang kapsul gelatin babi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 54 Lampiran 7. Hasil Analisis Nilai Konsentrasi dengan SPSS 1. Uji Normalitas Kolmogorov-Smirnova Metode Statistic df Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. Kit Roche® .329 4 . .854 4 .238 SDS 1% .161 4 . .990 4 .959 Konsentrasi a. Lilliefors Significance Correction Uji Normalitas menggunkaan parameter Shapiro-Wilk karena sampel ≤ 50 Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Data terdistribusi normal Ha = Data tidak terdistribusi normal Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 maka hipotesis nol diterima (data terdistribusi normal) Group Statistics5% Metode N Mean Std. Deviation Std. Error Mean Kit Roche® 4 16.51950 13.500123 6.750061 SDS 1% 4 17.17400 7.881768 3.940884 Konsentrasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 55 2. Uji Varians dan Uji t Tidak Berpasangan Independent Samples Test Levene's t-test for Equality of Means Test for Equality of Variances F Sig. T df Sig. (2- Mean Std. Error 95% Confidence Interval of the tailed) Difference Difference Difference Lower Equal variances assumed .865 .388 Upper -.084 6 .936 -.654500 7.816258 -19.780195 18.471195 -.084 4.832 .937 -.654500 7.816258 -20.958431 19.649431 Konsentrasi Equal variances not assumed a. Uji Varians menggunkaan parameter Levene Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Data varians sama Ha = Data varians beda Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 (0.388) maka hipotesis nol diterima (data varians sama) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta b. Uji t tidak berpasangan 56 Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Rata-rata tidak berbeda secara signifikan Ha = Rata-rata berbeda secara signifikan Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 (0.936) maka hipotesis nol diterima ( Rata-rata tidak berbeda secara signifikan ) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 57 Lampiran 8. Hasil Analisis Nilai Kemurnian dengan SPSS 1. Uji Normalitas Tests of Normality Kolmogorov-Smirnova Metode Statistic df Shapiro-Wilk Sig. Statistic df Sig. Kit Roche® .292 4 . .851 4 .229 SDS 1% .251 4 . .916 4 .512 Kemurnian a. Lilliefors Significance Correction Uji Normalitas menggunkaan parameter Shapiro-Wilk karena sampel ≤ 50 Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Data terdistribusi normal Ha = Data tidak terdistribusi normal Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 maka hipotesis nol diterima (data terdistribusi normal) Group Statistics Metode N Mean Std. Deviation Std. Error Mean Kit Roche® 4 1.60325 .084976 .042488 SDS 1% 4 1.31025 .092500 .046250 Kemurnian UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 58 2. Uji Varians dan Uji t Tidak Berpasangan Independent Samples Test Levene's Test for t-test for Equality of Means Equality of Variances F Sig. t df Sig. (2- Mean Std. Error 95% Confidence Interval of the tailed) Difference Difference Difference Lower Equal variances Purity .001 assumed .983 Equal variances not assumed Upper 4.665 6 .003 .293000 .062804 .139325 .446675 4.665 5.957 .004 .293000 .062804 .139058 .446942 a. Uji Varians menggunkaan parameter Levene Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Data varians sama Ha = Data varians beda Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 (0.983) maka hipotesis nol diterima (data varians sama) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a. Uji t tidak berpasangan 59 Nilai sig./p merupakan nilai yang menunjukkan besarnya peluang salah menolak Ho dari penelitian (Hastono, 2007) Nilai α yang digunakan adalah 5% (tingkat kemaknaan) Hipotesis : Ho = Rata-rata tidak berbeda secara signifikan Ha = Rata-rata berbeda secara signifikan Kesimpulan : Dari tabel di atas nilai sig. keduanya (Kit Roche® dan SDS 1%) > 0.05 (0.003) maka hipotesis nol diterima ( Rata-rata berbeda secara signifikan ) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 60 Lampiran 9. Bagan Metode Isolasi DNA a. Metode Isolasi DNA Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Izzah, 2014) 0 50 mg gelatin + 100 µL aquadest 75 C+ 200 µL Tissue lysis buffer + 40 µL Proteinase K 0 ink. 57 C, 21 jam Vortex 1’ , ink. 570 C, 21 jam ’ + 200 µL Binding buffer 0 Vortex 1’ , ink. 70 C, 10 menit + 150 µL Isopropanol Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1 menit, ganti collection tube Vortex 1 menit + 500 µL Inhibitor Removal Buffer sentrifugasi 8000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 500 µL Washing Buffer sentrifugasi 8000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 500 µL Washing Buffer sentrifugasi 12000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 150 µL Elution Buffer Buang filter tube Simpan pada suhu 40 C UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 61 b. Metode Isolasi DNA Kit Komersial High Pure PCR Tamplate Preparation (Izzah, 2014 dengan modifikasi) 0 100 mg simulasi cangkang kapsul + 200 µL aquadest 75 C 0 ink. 75 C, 30 menit Vortex 1’ , ink. 570 C, 21 jam ’ lysis buffer + 50 µL Proteinase K + 250 µL Tissue 0 Vortex 1 menit, ink. 57 C, 21 jam Vortex 1’ , ink. 570 C, 21 jam ’ + 230 µL Binding buffer 0 Vortex 1 menit , ink. 70 C, 10 menit + 150 µL Isopropanol Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1 menit, ganti collection tube Vortex 1 menit + 500 µL Inhibitor Removal Buffer sentrifugasi 8000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 500 µL Washing Buffer sentrifugasi 8000 rpm, 1menit, ganti collection tube Filter tube, sentrifugasi 8000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 500 µL Washing Buffer sentrifugasi 12000 rpm, 1menit, ganti collection tube + 150 µL Elution Buffer Buang filter tube Simpan pada suhu 40 C UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 62 c. Metode Isolasi DNA Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) (Utami, et al., 2012) 200 mg daun temulawak, + 400 µL buffer SDS 1% Digerus halus + 100 µL buffer SDS 1%, + 20 µL Proteinase K + 400 µL kloroform Ambil lapisan atas Inversi, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 400 µL kloroform Ambil lapisan atas + 800 µL etanol absolut 0 Ambil pellet ink. -20 C, 1 jam, Sentrifugasi 13000 rpm, 3’ + 500 µL etanol 70% Ambil pellet, keringanginkan Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 50 molecular water 0 Simpan di - 20 C UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 63 d. Metode Isolasi DNA Cell Lysis Buffer SDS 1% (Sodium Dodecyl Sulphate) (Utami, et al., 2012 dengan modifikasi) 0 100 mg simulasi cangkang kapsul + 200 µL aquadest 75 C 0 Ink. 75 C, 30’ + 400 µL buffer SDS 1%, + 20 µL Proteinase K 0 Ambil supernatan Ink. 57 C, 3 jam, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 400 µL kloroform Ambil lapisan atas Vortex 20’’, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 400 µL kloroform Ambil lapisan atas Vortex 20’’, Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 800 µL etanol absolut 0 Ambil pellet ink. -35 C, 1 jam, Sentrifugasi 13000 rpm, 3’ + 500 µL etanol 70% Ambil pellet, keringanginkan Sentrifugasi 13000 rpm, 1’ + 150 µL TE 0 Simpan di - 35 C UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 64 Lampiran 10. Gambar Bahan-Bahan yang digunakan dalam penelitian Gambar 1. Larutan Stok SDS Ekstraksi Gambar 2. Larutan Stok Kit Ekstraksi (Roche®) Gambar 3. Serbuk Gelatin Babi dan Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi Gambar 4. Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi dan Serbuk Gelatin Sapi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 65 Lampiran 11. Gambar Alat-alat yang Digunakan dalam Penelitian Gambar 1. Spektrofotometer DNA (Biodrop®) Gambar 3. Real Time PCR (Polymerase Cain Reaction) Gambar 2. Collection Tube dan Filter Tube (Roche®) Gambar 4. Multiwell, Sealing Foil, dan Perekat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
