Eksplorasi dan Identifikasi Bakteri Bacillus thuringiensis Berl. Rawa

Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
Eksplorasi dan Identifikasi Bakteri Bacillus thuringiensis Berl. Rawa
Lebak dan Pasang Surut
Arsi1), Yulia Pujiastuti1) dan Siti Herlinda1,2)*
Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Faperta, Universitas Sriwijaya, Indralaya
2
Pusat Unggulan Riset PengembanganLahan Suboptimal(PUR-PLSO),
Universitas Sriwijaya, Palembang
*)
Corresponding author: [email protected], [email protected]
Telp. +62711580663, Fax. +62711580276
1
ABSTRACT
The purposes of the research were to explore, to isolate, to count colony of B. thuringiensis
and to identify.Soil samples were taken from tidal areas in Tanjung Lago and Muara
Telang sub-districts which were belonged to Banyuasin regency, Pemulutan sub-districts
(belonged to Ogan Ilir regency) and Gandus sub-district (belonged to Palembang City).
Isolation and identification of colony B. thuringiensis and bioassay against S.litura larvae
were done in Laboratory of Phytopathology and laboratory of Entomology, Department of
Plant Pests and Diseases, Faculty of Agriculture Sriwijaya University. This research was
conducted from November 2012 until November 2013, with the condition of room
temperature average of 26,8 oC and the relative humidity was 79,6%.The results of the
exploration and identification of bacteria were 24 isolates of B. thuringiensis. The highest
colony number was 703.7cfu/mL of BUA isolate while the lowest was 161.0 cfu/mL of
SHA isolate
Key words: Bacillus thuringiensis, Spodopteraliruta, Swampy LanddanTidal Land
ABSTRAK
Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi, menghitung
koloni B.thuringiensis. Pengambilan Sampel tanah dilakukan di daerah pasang surut
kecamatan Tanjung Lago dan kecamatan Muara Telang (Kabupaten Banyuasin) dan daerah
lebak di kecamatan Pemulutan (Kabupaten Ogan Ilir) dan kecamatan Gandus (Kota
Palembang). Isolasi dan identifikasi bakteri di Laboratorium Fitopatologi dan Entomologi
Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya
Inderalaya. Penelitian dilakukan dari bulan November 2012 sampai November 2013, pada
kondisi laboratorium dengan suhu rata-rata 26,8oC dan kelembaban nisbi ruangan dengan
rata-rata 79,6%. Hasil eksplorasi dan identifikasi bakteri ditemukan 24 isolat B.
thuringiensis. Jumlah koloni bakteri tertinggi pada isolat BUA yaitu 703,7 cfu/mL
sedangkan terendah pada isolat SHA yaitu 161,0 cfu/mL.
Kata Kunci: Bacillus thuringiensis, Rawa Lebakdan Pasang Surut
PENDAHULUAN
Bakteri Bacillus thuringiensis sebagai pengendalian hayati sudah banyak dilakukan
seperti pada serangga dari ordo Lepidoptera, ordo Coleoptera, ordo Diptera, ordo
Hymenoptera, ordo Homoptera, ordo Mallophaga. Selain itu juga bakteri ini dapat
digunakan untuk mengendalikan kelas Acarina (Bravo et al., 1998). Bacillus thuringiensis
merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang, aerobik dan membentuk spora
(Bahagiawati 2002). Spora dari bakteri berbentuk oval. Kristal protein yang dimiliki oleh
487
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
Bacillus thuringiensis yang digunakan sebagai agens pengendali serangga menggandung
berbagai jenis protein kristal(Hofte & Whiteley 1989).
Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi dan mengidentifikasi
bakteri entomopatogen yang menyerang ulat grayak (S. litura) yang terdapat di daerah
PasangSurutdanLebak,
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di lahan Pasang Surut dan Lebak Sumatera Selatan untuk
pengambilan sampel tanahdan identifikasi bakteri dilakukan di Laboratorium Fitopatologi
dan Entomologi Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya Inderalaya. Penelitian dilakukan
dari bulan November 2012 sampai November 2013, dengan rata-rata suhu ruang26,8oC
dan kelembaban nisbi ruangan rata-rata dan 79,6 %.
Penelitian ini dilakukan dengan cara mengambil sampel tanah dari lahan tanah
pasang surut dan lebak kemudian dibawah ke Laboratorium untuk diisolasi bakteri
entomopatogen. Hasil pengamatan yang diperoleh disajikan dalam bentuk tabel, gambar
dan grafik serta dianalisis secara deskriptif serta menggunakan Rancangan Acak Lengkap
(RAL).
Penelitian 1. Eksplorasi dan Seleksi Bakteri Entomopatogen, B. thuringiensis
Wilayah Pengambilan Sampel Tanah meliputi 4 kecamatan dari wilayah pasang
surut dan lebak di Sumatera Selatan. Eksplorasi bakteri entomopatogen dilakukan dengan
cara pengambilan sampel tanah diambil dari lokasi tanaman. Permukaan tanah dibersihkan,
darirumputatautanamanlainnya diukur jarak sekitar 30 cm dari batang tanaman dengan
kedalaman 5 cm dan diambil sampel tanah. Sampel tanah tersebut dimasukkan ke dalam
plastik sebanyak 1 kg dan diberi label berdasarkan wilayah pengambilan tanah (Tabel 1).
Isolasi Bakteri B. thuringiensis. Sampel tanah diambil sebanyak 10 g kemudian
disuspensi ke dalam 90 mL air steril dalam erlenmeyer secara aseptik lalu dikocok 3-5 dan
dipanaskan pada suhu sekitar 80 ºC selama 15 menit. Kemudian diambil sebanyak 1 mL
supernatan contoh tanah tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi steril dan diencerkan
sampai 106. Ambil sebanyak 1 mL, supernatant tersebutditebarkan pada cawan petri yang
berisi media NGKG (NaCl Glycine Kim and Geofard) dan diratakan pada seluruh
permukaan media tersebut dengan menggunakan spatel Drygalski dan diinkubasikan pada
suhu 28 oC selama 1-3 hari hingga koloni bakteri tumbuh. Setiap hari koloni yang tumbuh
dicatat. Koloni bakteri yang tumbuh dilakukan pengujian dan dilakukan penyimpanan.
Pengamatan Mikrokopis. Pembuatan preparat olesan bakteri pada setiap bakteri
diambil dengan menggunakan jarum ose selanjutnya air steril diletakkan di atas permukaan
gelas objek. Lalu diambil biakan bakteri dengan jarum ose kemudian diletakkan di atas
tetesan air steril dan diratakan sampai seluas kira-kira 1 cm². Pewarnaan differensial dari
spora dan kristal protein B. thuringiensis. Pada tahap ini uji yang dilakukan yaitu jarum ose
biakan bakteri diletakkan pada objek, kemudian ditetesi larutan malakit green 5% dan
dipanaskan dengan cara dilewat-lewatkan di atas bunsen selama kurang 10 menit. Setelah
itu kelebihan pewarna pada preparat dicuci dengan air mengalir dan ditiriskan. Setelah
kering ditetesi dengan larutan safranin 0,5% selama 1 menit, kemudian dicuci kembali
dengan air mengalir dan ditiriskan hingga kering. Kemudian dilakukan pengamatan di
bawah mikroskop.
Pengujian Bakteri Entomopatogen, B. thuringiensis. Pada pengujian B. thuringiensis
dilakukan dilaboratorium dengan 3 metode yaitu :
488
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
A. Uji Gram
Uji gram adalah pengujian ini dilakukan dengan cara mengambil dan meletakkan 1
ujung jarum ose biakan B. thuringiensis pada kaca preparat yang sebelumnya telah ditetesi
dengan larutan KOH 3%, jika bakteri tidak berlendir maka bakteri tersebut merupakan
bakteri bergram positif, sedangkan bakteri yang menghasilkan lendir merupakan bakteri
bergram negatif.
B. Uji Katalase
Larutan yang digunakan untuk menguji katalase, yaitu larutan hidrogen peroksida
(H2O2). Diteteskan pada kaca preparat, selanjutnya bakteri digoreskan menggunakan jarum
ose dan diletakkan pada kaca preparat.Kemudian diaduk sampai menghasilkan gelembung,
pada bakteri gram positif tidak akan menghasilkan gelembung sedangkan pada bakteri
gram negatif menghasilkan gelembung.
C. Reaksi Oksidasi
Pengujian ini untuk melihat perubahan warna yang terjadi pada kertas oxidase strip.
Kertas oxidase strip merupakan kertas yang digunakan untuk menentukan bakteri bergram
positif atau negatif. Kertas oxidase strip ditempelkan pada media kemudian diamati
perubahannya setelah 10 detik.
Uji Skrining Toksisitas B. thuringiensis. Uji ini dilakukan setelah pengamatan
mikrokopis berdasarkan dari hasil yang didapat meliputi bentuk spora, jumlah spora dan
pewarnaan kristal.Parameter pengamatan yaitu morfologi bakteri dan koloni bakteri,
Data perbedaan mortalitas larva antar perlakuan baik pada perlakuan isolat Analisys
of variance (ANOVA).Semua penghitungan dibantu dengan bantuan program SPSS
16.00.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Eksplorasi dan Seleksi Bakteri Entomopatogen
Tanah berasaldariwilayah Pasang surut ada dua kecamatan yang tanah digunakan
pada penelitian ini yaitu, kecamatan Tanjung Lago dan kecamatan Muara Telang. Pada
lahan lebak ada dua wilayah yang diambil tanahnya yaitu kelurahan Gandus dan
kecamatan Pemulutan.
Kemudiantanahtersebutditumbuhkanpada media NGKG
kolonibakterimenunjukkan ciri-ciri yang sama yaitu bentuk koloni bundar berwarna putih
susu, berlendir, tepi licin dan sangat bau busuk (Tabel 3). Bakteri ini dapat diperoleh dari
tanah dan permukaan daun.Pada lingkungan yang baik dengan nutrisi yang cukup, bakteri
ini akan membentuk spora. Spora tersebut akan terus hidup dan melanjutkan pertumbuhan
vegetatifnya. B. thuringiensis dapat tumbuh diberbagai habitat tanaman yang ada baik
pada tanaman padi, tanaman sayuran dan tanaman hutan (Khetan 2001).
Koloni B. thuringiensis yang tumbuh pada media memiliki yaitu, bentuk bundar,
bewarna putih, berlendir, tepi licin dan berbau busuk (Gambar 1). Menurut Rusman
(2000) yang menyatakan koloni bakteri yang tumbuh pada media pada berbentuk bulat,
besarnya 5-10 mm, memiliki warna putih. Pada tepian bakteri ini sedikit mengkerut atau
bergelombang. Bakteri ini memiliki elavansi timbul serta permukaannya kasar. Kolonikoloni bakteri yang tumbuh pada hari pertama sangat kecil dan hampir rata dengan dengan
media, kemudian pada hari kedua bakteri akan membesar dan agak lebar tetapi tidak
bersentuhan satu dengan yang lainnya. Pada hari ketiga bakteri yang tumbuh pada hari
pertama akan membesar.
Sel bakteri tersebut berbentuk basil memiliki warna kebiruan. Pada penelitian ini
sel bakteri juga ditemukan berbentuk basil dan berwarna hijau kebiruan. Pertama sel
489
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
bakteri berbentuk batang atau bacil kemudian sel bakteri tersebut akan membelah dan
berbentuk oval (Gambar 2). Bakteri ini akan membentuk spora secara aerob dan pada
waktu sporulasi bakteri ini akan membentuk kristal protein. Kristal protein yang terbentuk
dikenal dengan nama delta-endotoksin (Khaswar et al.,2001).Reaksi gram yang dilakukan
pada penelitian menunjukkan reaksi gram positif. Hal ini disebabkan apabila bakteri yang
diberikan KOH 3% pada biakan bakteri yang diletakkan pada kaca preparat tidak ikut
terangkat pada jarum ose. (Gambar 3).
Uji katalase yang dilakukan dengan cara
meletakkan satu jarum ose biakan B.thuringiensis pada kaca preparat yang sebelumnya
sudah ditetesi larutan Hidrogen Peroksida (H2O2) 5% tidak menghasilkan buih maka
bakteri tersebut bergram positif (Gambar 4).Reaksi oksidasi pada penelitian ini dengan
cara menempalkan kertas oxidase strip pada media yang ada bakterinya. Apabila pada
kertas oxidase strip tersebut berubah warna maka bakteri itu bergram positif (Gambar 5).
Uji gram, uji katalase dan uji oxsidase strip merupakan uji untuk menentukan genus
bakteri tersebut. Sedang untuk uji spesies mengunakan media selektif yaitu NGKG (NaCl
Glycine Kim and Geofard), hal ini bisa dilihat dari perubahan warna yang ditimbulkan
pada media. Populasi koloniB. thuringiensis tertinggi dan terendah berasal tanah pasang
surut. Tertinggi pada kode isolat BUA dengan rata-rata 703,7 cfu/mL sedangkan terendah
kode isolat SHA dengan rata-rata 161,0 cfu/mL. Rata-rata populasi koloni B. thuringiensis
yang tumbuh pada media NGKG sangat bervariasi antar asal tanah. Tanah-tanah yang
diambil dapat membunuh serangga hama, hal ini disebabkan karena mengandungB.
thuringiensis (Salaki et al., 1997; Situmorang 1993).Kondisi yang lembab ini sangat cocok
untuk B. thuringiensis. Hal ini dikarenakanB. thuringiensis bersifat aerob, sedangkan pada
kondisi lingkungan yang tidak tetap atau berubah-ubah membuat kondisi mikroorganisme
di dalam tanah tersebut juga sedikit(Tabel 4). Menurut De lucca et al., (1981) menyatakan
bahwa B. thuringiensis bisa dilakukan isolasi dari tanah. Tanah tersebut bisa digunakan
dalam proses untuk mendapatkan bakteri tersebut.B. thuringiensis bisa hidup di semua
tempat, sehingga untuk mengisolasi bisa dari beberapa sumber seperti yang dilakukan pada
penelitian ini. Jumlah kerapatan sel pada masing-masing isolat sangat bervariasi.
KESIMPULAN
Simpulan yang dapat diambil dari penelitian ini yaitu Spesies bakteri
entomopatogen yang ditemukan dari tanah lebak dan pasang surut Sumatera Selatan adalah
B. thuringiensis. Koloni bakteri tertinggi pada isolat BUA yaitu 703,7 cfu/mL sedangkan
terendah pada isolat SHA yaitu 161,0 cfu/mL.
SARAN
Perlu dilakukan uji penyimpanan baik terhadap isolat bakteri maunpun
bioinsektisida.Dilakukan pengujian terhadap bakteri DNA dari B. thuringiensis untuk
menentukan subspesies dan perlu dilakukan pengujian di lapangan untuk mengetahui
tingkat toksisitas di lahan.
DAFTAR PUSTAKA
Bahagiawati. 2002. Penggunaan Bacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Balai
Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor.
Bravo A, Sarabia S, Lopez L, Ontiveros H, Abarca C, Ortiz A, Ortiz M, Lina L, Villalobos
FJ, Pena G, Nunez-Valdez M-E, Soberon M and Quintero R. 1998. haracterization
490
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Appl nviron
Microbiol 64: 4965-4972.
De Lucca AJ, JG Simonson, AD Larson. 1981. Bacillus thuringiensis Distribution in Soli
of the United States Can. J. Microbiol. 27:865-870.
Hofte H dan HR Whiteley. 1989. Distribution of Bacillus thuringiensis. Microbiol. Rev.
53(2): 242-255.
Khaswar, Rahayuningsih M, dan Yulianti. 2001. Pengaruh Aerasi terhadap Produksi
Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis Subsp. Israelensis pada Bioindikator
Tangki Berpengaduk dan Kolom Gelumbang. Jurusan Teknologi Indutri Pertanian,
Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor, volume 11(3), 92-100
Khetan SK. 2001. Microbial Pest Control. Maecell Dekker, Inc. USA.p.3-141
Rusman R. 2000. Makalah Faksafah Sains (Pps 702). Program Pascasarjana/S3. Institut
Pertanian Bogor, Oktober, 2001.p
Situmorang J. 1993. Isolasi Bakteri Tanah Entomopatogenik (Bacillus spp.)di Daerah
Yogyakarta dan Uji Patogenitasnnya terhadap Ulat Grayak (Spodoptera litura
Fabr.). Biologi. Vol. Laboratotium Entomologi, Fakultas Biologi. UGM.
Salaki C, Situmorang J, Sembiring L. 1997. Isolation dan Characterization og Indonesia
indigenous bacteria (Bacillus thuringiensis) which are potential for biological
control agent against cabbage heart caterpillar (Crocidolomia binotalis Zell).
Jurusan Hama dan Penyakit, Fakultas UNSRAT Manodo. Laboratorium
Entomologi. Fakultas Biologi UGM. Laboratorium Mikrobiologi, Fakulta Pertanian
UGM. Yogyakarta.
491
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
Gambar 1:
Koloni B. thuringiensis yang berasal dari tanah yang tumbuh pada media
NGKG
Gambar 2Sel B. thuringiensis pada perbesaran 10 x 100
Gambar 3:
Reaksi gram pada B. thuringiensis menggunakan larutan KOH 3% yang tidak
menghasilkan lendir (gram positif)
492
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
Gambar 4:
Uji katalase pada B. thuringiensis menggunakan larutan H2O2 yang tidak
menghasilkan buih (gram positif)
A
Gambar 5.
B
Reaksi Oksidasi menggunakan kertas oxidase strip P. fluorescens (A)
berubahwarna (gram negatif) danB. thuringiensis (B) tidak berubah warna (gram
positif
Tabel1. Lokasieksplorasi bakteri entomopatogen, B. thuringiensis
Tipe
Ekosistem
No. Lokasi Tanah
Nama Tanaman
Rawa
1.
Desa Panca Mukti
Pasang Surut
Gelam
Kec. Muara Telang
Nangka
2.
Desa Sumber Hidup
Pasang Surut
Jabon
Kec. Muara Telang
Akasia
3.
Desa Telang Rejo
Pasang Surut
Pisang
Kec. Muara Telang
Akasia
4.
Desa Sumber Mulyo
Pasang Surut
Rambutan
Kec. Muara Telang
Akasia
5.
Desa Muara sugih
Pasang Surut
Pisang
Kec. Tanjung Lago
Padi
Kelapa Sawit
Akasia
6.
Desa Banyu Urip
Pasang Surut
Akasia
Kec. Tanjung Lago
Pisang
Padi
7.
Desa Pemulutan Ilir
Lebak
kelapa
Kode Sampel
Tanah
PMG
PMN
SHJ
SHA
TRP
TRA
SMR
SMA
MSPi
MSP
MSKS
MSA
BUA
BUPi
BUP
PIK
493
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
8.
9.
10.
Kec. Pemulutan
Desa Pemulutan Ulu
Kec. Pemulutan
Lebak
Desa
Pelabuhan
Lebak
Dalam
Kec. Pemulutan
Gandus
Lebak
Kec.Gandus
Mangga
Mangga
Pisang
Kelapa
PIM
PUM
PUPi
PUK
Ubi Kayu
PDUK
Kelapa
Akasia
Karet
PDK
GA
GK
Tabel 2. Pembuatan Mediumcair berbahan aktif bakteri entomopatogen
Media Cair
Kode Media
Bt (NGKG) + Media Nutrien Borth
A
Bt (NGKG) + Air Kelapa
B
Bt (NGKG) + Cairan Limbah Tahu
C
Bt (NGKG) + Air Rendaman Kedelai
D
Bt (NGKG) + Air kelapa + Cairan Limbah Tahu
E
Bt (NGKG) + Air kelapa + Air Rendaman kedelai
F
Aquades
G
Tabel 3:
Ciri morfologi koloniB. thuringiensisyang diambil dari lahan tanah Pasang Surut
dan Lebak
Kode isolat
PMG
PMN
SHJ
SHA
TRP
TRA
SMR
SMA
MSPi
MSP
MSKS
MSA
BUA
BUPi
BUP
PIK
PIM
PUM
PUPi
PUK
Bentuk
Tepian
Elevasi
warna
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Licin
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
494
Prosiding Seminar NasionalLahan Suboptimal 2016, Palembang 20-21 Oktober 2016
ISBN .........................
PDUK
PDK
GA
GK
Bundar
Bundar
Bundar
Bundar
Licin
Licin
Licin
Licin
Timbul
Timbul
Timbul
Timbul
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Putih Susu
Tabel 4. Populasi B. thuringiensis dalam tanah di lahan Lebak dan PasangSurut
Kode Isolat
PMG
PMN
SHJ
SHA
TRP
TRA
SMR
SMA
MSPi
MSP
MSKS
MSA
BUA
BUPi
BUP
PIK
PIM
PUM
PUPi
PUK
PDUK
PDK
GA
GK
Populasi dalam tanah (cfu /ml)
Kisaran
Rata-rata
420,33 defg
306,00-489,00
342,67fg
244,00-407,00
304,00 g
258,00-346,00
161,00 h
153,00-166,00
539,33 abcd
506,00-568,00
519,00 abcde
451,00-604,00
468,00 bcdef
385,00-518,00
619,33 abc
574,00-682,00
664,00 ab
631,00-719,00
507,67 abcde
428,00-633,00
666,33 ab
662,00-669,00
624,00 abc
559,00-682,00
703,67 a
680,00-718,00
644,00 abc
624,00-662,00
367,33 defg
334,00-419,00
443,00 cdefg
439,00-451,00
403,67 defg
359,00-430,00
518,67 abcde
471,00-584,00
385,00 defg
336,00-412,00
654,00 abc
642,00-647,00
547,67 abcd
524,00-582,00
399,33 defg
349,00-427,00
557,67 abcd
528,00-613,00
558,00 abcd
578,00-534,00
Keterangan : Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama berbeda tidaknyata berdasarkan uji BNJ 5 % = 0,23
(Transformasi Log)
495