analisis cemaran daging babi pada sosis sapi
advertisement
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG MENGGUNAKAN METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) SKRIPSI SAFIZAH UMMU HARISAH 1112102000010 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN JAKARTA FEBRUARI 2017 i UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ANALISIS CEMARAN DAGING BABI PADA SOSIS SAPI YANG BEREDAR DI PASAR PARUNG MENGGUNAKAN METODE REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi SAFIZAH UMMU HARISAH 1112102000010 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN JAKARTA FEBRUARI 2017 ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRAK Nama : Safizah Ummu Harisah Program Studi : Strata-1 Farmasi Judul : Analisis Cemaran Daging Babi pada Sosis Sapi yang Beredar di Pasar Parung Menggunakan Metode Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR) Sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain. saat ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang analisis halal. Teknologi tersebut diaplikasikan untuk mempermudah pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah satu alat yang digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Pada penelitian ini, metode Real Time Polymerase Chain Reaction digunakan untuk mengidentifikasi cemaran DNA babi pada 6 produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung. DNA genom daging babi, daging sapi dan sampel sosis sapi diisolasi dengan reagen KIT (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega). DNA diamplifikasi pada daerah spesifik DNA mitokondria sitokrom b dengan menggunakan sepasang primer spesifik DNA babi dan primer spesifik DNA sapi dengan jumlah siklus sebanyak 30 siklus. Hasil kurva amplifikasi menggunakan primer spesifik DNA sapi, menunjukkan bahwa semua DNA sampel sosis dan kontrol positif DNA sapi dapat teramplifikasi, sedangkan kontrol negatif DNA babi dan kontrol negatif ddH2O tidak teramplifikasi. Hasil primer spesifik DNA babi menunjukkan bahwa hanya sampel kontrol positif (DNA babi) yang menghasilkan kurva amplifikasi pada CP 19.97. Dengan demikian, dari 6 sampel sosis yang diperiksa, tidak ada DNA mitokondria sampel yang teramplifikasi dengan menggunakan primer spesifik DNA babi. Kata kunci : halal, babi, sampel sosis, real time PCR, primer spesifik. vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta ABSTRACT Name : Safizah Ummu Harisah Program Study : Strata-1 Pharmacy Title : Analysis Contamination of pork in Sausage Beef which Distributed In Parung Region Using Real Time PCR The sausage is a food product derived from a mixture of delicate meat with flour or starch with or without the addition of spices and other food additives. the current technological advances have improved in the areas of analysis kosher. The technology is applied to facilitate the testing of materials contaminated halal haram ingredients. One of the tools used for the detection of halal food is PCR. In this study, Real Time Polymerase Chain Reaction method was used to identify the pork contamination in 6 beef sausage products which distributed in the Parung market. DNA genome of pork, beef, and beef sausage samples was isolated using KIT reagents (Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega). DNA was amplified in a specific area of mitochondrial cytochrome b DNA by porcine specific primer and bovine specific primer as much as 30 cycle. The results of DNA amplification curves by bovine specific primers indicating that all the DNA samples of sausages and control positive bovine DNA can be amplified, while the negative control porcine DNA and negative control ddH2O are not amplified. Results of porcine DNA specific primers showed that only positive control samples (porcine DNA) which generate amplification curves in CP value 19.97. Therefore, from 6 samples of sausages which are examined there is no mitochondrial DNA samples are amplified by porcine specific primers. Keywords : halal, pork, sausage samples, real time PCR, specific primers. vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha pengasih dan Maha penyayang, yang telah memberi kekuatan kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam senantiasa terlimpahkan kepada Baginda Rasul, Nabi Muhammad SAW yang merupakan suri tauladan bagiumatnya. Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Dalam melaksanakan penyusunan skripsi ini, penulis menyadari bahwa penyusunan ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis menyampaikan terimakasih kepada : 1. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt sebagai Pembimbing I dan Ibu Dr. Zilhadia, M.Si., Apt sebagai Pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasehat, waktu, tenaga dan pikiran selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 2. Bapak Chris Adhiyanto, M.Biomed,Ph.D dan Bapak Hendri Aldrat, M.Si. Ph.D.Apt sebagai Penguji telah memberikan ilmu, saran dan nasehat kepada penulis. 3. Bapak Dr. Arif Sumantri S.K.M, M. Kes. Selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 5. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc, Apt selaku pembimbing akademik yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan. 6. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 7. Kedua orang tua, Ayah tercinta Iljam Ebentap lubis, umma tersayang Asmia Hasibuan S.Pd.I yang selalu ikhlas memberikan kasih sayang,dukungan moral viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan materil, nasehat-nasehat yang membantu penulis bersemangat tersenyum dan tertawa, serta lantunan do‟a setiap waktu. 8. Kakak tercinta, Ummu Salimah Albajaliah Lubis S.Pd.I, Abang M.Febryansah Hasibuan S.Pd.I. adek-adek tersayang Irwan Junaidi Lubis, M.Asril Husein Lubis, Hapipa Aswita Lubis, Rizki Khoirunnisa Lubis, yang memberikan semangat dan doa tanpa henti2nya, dan memberi tawa yang luar biasa. 9. Sahabat seperjuangan dalam suka maupun duka dalam menjalankan penelitian ini, semoga kita sama-sama sukses dunia dan akhirat “Vesty Anis Triana”. 10. Sahabat-sahabat terkasih Ayu Nopita, Apriliana Nur, Chalila Deli Gayo, Dwi Putri Rahmawati, Vesty Anis Triana, Ratnika Sari, Tharlis Diansyah Lubis serta teman-teman Farmasi 2012 atas semangat dan kebersamaan kita selama perkuliahan berlangsung. Semoga ukhuwah yang telah terjalin tidak pernah putus dan akan terus berlanjut. 11. Sahabat dalam mencari ilmu di perantauan yang selalu memberikan semangat tanpa diminta M. Misbahuddin Mukhlis SE., Nasyidah Hannum. 12. Teman-teman seperjuangan selama di pondok pesantren Al-mukhlishin Sibuhuan selama merantau mencari ilmu di Jakarta “IKAYAMIN JAKARTA” 13. Teman-teman Himpunan Mahasiswa Padang Lawas (HIMAPALAS) atas semangat dan kebersamaan kita selama berperoses diorganisasi berlangsung. 14. Teman-teman seperjuangan “DIGOXYN” Farmasi UIN 2012 atas kebersamaan kita selama ini. 15. Semua pihak yang telah membantu penulis selama melakukan penelitian dan penulisan yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan ini, oleh karena itu kritik dan saran sangat diharapkan demi perbaikan skripsi ini. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan. Ciputat, 28 Februari 2017 Penulis ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ................................................ iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. v ABSTRAK ........................................................................................................... vi ABSTRACT ......................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ......................................................................................... viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .................... x DAFTAR ISI ........................................................................................................ xi DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xvii DAFTAR ISTILAH ............................................................................................ xviii BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .............................................................................. 2 1.3 Tujuan................................................................................................. 2 1.4 Manfaat ............................................................................................... 2 BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................... 4 2.1 Daging Babi......................................................................................... 4 2.2 Organel Sel .......................................................................................... 4 2.3 Protein dan Asam Nukleat................................................................... 6 2.4 DNA .................................................................................................... 6 2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA .................................................. 6 2.4.2 Sifat Fisika DNA ....................................................................... 8 2.4.3 Fungsi DNA .............................................................................. 8 2.4.4 Isolasi DNA ............................................................................... 8 2.5 DNA Mitokondria ............................................................................... 11 2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................... 13 xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2.6.1 Komponen PCR......................................................................... 14 2.6.2 Tahapan PCR............................................................................. 15 2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (PCR-RFLP) ....................................................... 17 2.7 Real Time PCR ................................................................................... 18 2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe .................... 20 2.8 Daging Sosis ....................................................................................... 23 BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 25 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 25 3.1.1 Tempat .................................................................................... 25 3.1.2 Waktu ..................................................................................... 25 3.2 Alat dan Bahan ................................................................................... 25 3.2.1 Alat.......................................................................................... 25 3.2.2 Bahan ...................................................................................... 25 3.3 Tahapan Penelitian ............................................................................. 26 3.4 Prosedur Kerja .................................................................................... 26 3.4.1 Pengumpulan Sampel ............................................................. 26 3.4.2 Isolasi DNA ............................................................................ 26 3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV ... 27 3.4.4 Amplifikasi DNA dengan Metode Real Time PCR .............. 28 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 29 4.1 Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV ........................... 29 4.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel Sosis Sapi ............................. 32 4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC Menggunakan Primer Sapi ..................................................... 34 4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sampel Sosis Sapi dan NTC Menggunakan Primer Sapi ..................................... 36 4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC Menggunakan Primer Babi ..................................................... 38 4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sampel Sosis Sapi dan NTC Menggunakan Primer Babi ..................................... 39 xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 40 5.1 Kesimpulan......................................................................................... 40 5.2 Saran ................................................................................................... 40 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 41 LAMPIRAN ......................................................................................................... 46 xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR TABEL Tabel Halaman Tabel 1 Perbandingan Sel Prokariot dan Sel Eukariotik 5 Tabel 2 Kelebihan dan Kelemahan RFLP 18 Tabel 3 Kelebihan dan Kekurangan Real Time PCR 20 Tabel 4 Tahapan Proses Flurosensi Hydrolysis Probe 22 Tabel 5 Susunan Basa Primer dan probe 26 Tabel 6 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA 30 Tabel 7 Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II 33 xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1 Sel Prokariot dan Eukariot 5 Gambar 2 Struktur Purin dan Pyrimidin 7 Gambar 3 Struktur Double Heliks DNA 7 Gambar 4 Struktur Mitokondria 12 Gambar 5 Struktur mtDNA 12 Gambar 6 Untai DNA Mengalami Denaturasi 16 Gambar 7 Penempelan Primer dengan Untai DNA 16 Gambar 8 Perpanjangan DNA Secara Semi-Konservatif 17 Gambar 9 Proses Amplifikasi DNA Target 17 Gambar 10 Bentuk Kurva pada Real Time PCR 19 Gambar 11 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi 34 Gambar 12 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi dan sampel 36 Gambar 13 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi 38 Gambar 15 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi dan sampel 39 xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Konsentrasi dan Kemurnian Hasil Isolasi 46 Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer 47 Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer 48 Lampiran 4. Komponen Campuran Reaksi Real Time PCR 49 Lampiran 5. Hasil Kurva Amplifikasi 50 Lampiran 6. Alat-Alat yang digunakan dalam Penelitian 52 xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR SINGKATAN AFL : Arbitrary Fluorescence Level BLAST : Basic Local Aligment Search Tool CP : Crossing Point cyt b : Cytochrome b dATP : Deoxyadenosine Triphosphate dCTP : DeoxyCytidine Triphosphate dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate dNTPS : Deoxyribonucleaside Triphosphates dTTP : Deoxythymidine Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Etilen Diamin Tetra Asetat FAM : Fluorescein Amidite MtDNA : mitochondria DNA NLS : Nuclei Lysis Solution NTC : No Template Control pb : Pasang Basa PCR : Polymerase Chain Reaction PCR-RFLP : Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme Pfu : Pyrococcus Furiosus PPS : Protein Precipitation Solution qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction RFLP : Restriction Fragment Lenght Polimorfisme RNA : Ribonucleic Acid RT-PCR :Real Time Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium Dodesil Sulfat Tag : Thermus Aquaticus Tm : Temperature Melting USDA : United State Department of Agriculture xvii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR ISTILAH BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan program untuk menganalisis kesejajaran sekuen query (DNA) atau protein dengan sekuen DNA atau protein pada database NCBI. CP : Crossing Point merupakan siklus yang menunjukkan sinyal fluoresensi dari akumulasi amplikon telah melewati garis threshold. Garis Treshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal fluoresensi berada pada tingkat terendah (siklus 3-15). Formasi Hairpin : Terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer yang disebabkan oleh interaksi intramolekular yang dapat memicu terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik. Melting Curve : Analisis data pada Real time PCR digunakan untuk menguji spesifisitas amplikon yang terbentuk. Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga membentuk produk amplfikasi yang nonspesifik. NCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan suatu institusi milik United States National Library of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekular. Situs NCBI berisi database meliputi gene bank mengenai sekuens DNA atau protein serta memuat publikasi ilmiah. NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif karena well tidak dimasukkan DNA. Primer-Dimer : berikatannya suatu primer dengan primer sejenis atau dengan primer lainnya sehingga membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk diketahui kesejajarannya. Tm : Temperature melting atau suhu melting adalah suhu saat 50% bagian DNA telah terbuka menjadi untai tunggal. xviii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Islam mengajarkan umat muslim untuk menghindari hal yang dilarang dalam Al Qur‟an dan Al Hadist. Al Qur‟an sangat tegas menyatakan kehalalan dan keharaman makanan. Aturan tentang kehalalan makanan termuat dalam banyak ayat, salah satunya pada Surat Al-Baqarah (2) : 173 : “Sesungguhnya Allah hanya mengharamkan bagimu bangkai, darah, daging babi, dan binatang yang (ketika disembelih) disebut (nama) selain Allah”. Haramnya babi juga dijelaskan dalam firman Allah Surat Al-Ma‟idah (5) : 3, Surat Al-An‟am (6) : 145, dan Surat An-Nahl (16) : 115. Indonesia merupakan negara dengan mayoritas penduduknya beragama Islam. Hal ini seharusnya menjadi kewajiban bagi pemerintah untuk melindungi konsumen dari beredarnya makanan haram yang ada dipasaran. Namun pencampuran makanan halal dengan bahan yang diharamkan masih terjadi di masyarakat. Pada tahun 2012 ditemukan adanya bakso sapi yang dicampur dengan daging babi di wilayah Jakarta. September 2015 juga ditemukan kasus pencampuran daging babi pada bakso di pasar tradisional kota malang (Wardani, 2015). Tujuan pencampuran tersebut untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang lebih murah dibandingkan menggunakan bahan aslinya, mengingat harga daging sapi yang semakin mahal (Margawati dan Ridwan, 2010). Oleh sebab itu, untuk menghindari adanya makanan yang dicampur dengan bahan haram, dibutuhkan pengembangan uji analisis yang dapat dipercaya dan sensitif dalam pendeteksian bahan makanan (Rahmawati, 2012). Pada saat ini kemajuan teknologi telah mengalami peningkatan di bidang analisis halal. Teknologi tersebut dapat diaplikasikan dan mempermudah pengujian bahan halal yang terkontaminasi bahan haram. Salah satu alat yang digunakan untuk deteksi kehalalan makanan adalah PCR. Seperti halnya 1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 pengujian cemaran daging babi pada makanan diperoleh dari hipermarket lokal yang berbeda di Saudi Arabia melalui amplifikasi PCR (Alaraidha, 2008). Pratami 2011 telah melakukan identifikasi daging babi pada burger sapi melalui amplifikasi real time PCR. Begitu juga Mulyana (2010) yang melakukan identifikasi daging babi pada kornet sapi dengan menggunakan metode polymerase chain reaction (PCR). Walaupun PCR memberikan hasil yang cukup sensitif dan akurat, metode ini membutuhkan pemisahan produk pasca PCR dengan menggunakan gel elektroforesis yang memakai waktu lebih lama dan hanya semi-kuantitatif (Vivikananda, 2014). Tetapi kelemahan ini dapat di atasi dengan real time PCR yang menggunakan sistem fluoresensi sehingga hasil amplifikasi dapat dideteksi secara cepat dan dilihat secara langsung. Keunggulan teknik real time PCR dibandingkan dengan PCR konvensional antara lain adalah akurasi dan sensitivitas yang lebih tinggi, menurunkan kemungkinan terjadinya kontaminasi dan waktu analisa yang lebih singkat karena tidak perlu melakukan elektroforesis dan identifikasi suatu produk makanan dengan menggunakan pewarna dye SYBR green dan primer spesifik sapi (Liyana, K. et a.l, 2009). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa cemaran DNA babi pada bahan makanan olahan dengan menggunakan metode real time PCR. Bahan makanan yang diuji adalah sosis sapi dengan merek yang berbeda yang diperoleh dari pasar Parung. 1.2 Rumusan Masalah Apakah sosis sapi yang beredar di Pasar Parung tercemar daging babi. 1.3 Tujuan Penelitian Menganalisis cemaran daging babi pada sosis sapi yang beredar di Pasar Parung menggunakan metode real time PCR 1.4 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi untuk masyarakat tentang kehalalan sosis sapi yang beredar di pasar Parung. Hal ini dilakukan 3 sebagai dharma UIN terhadap masyarakat sekitar sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan bijaksana dalam mengonsumsi olahan daging seperti sosis sapi. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Daging Babi Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan berhidung ceper pemakan daging maupun tumbuh-tumbuhan dan merupakan hewan yang berasal dari Eurasia. Daging babi merupakan daging yang sangat sulit dicerna karena banyak mengandung lemak. Meskipun dagingnya empuk dan terlihat begitu enak dan lezat. Babi juga memiliki lemak punggung yang tebal dan bersifat oxidative rancidity, sehingga secara struktur kimia sudah tidak layak dikonsumsi. Penelitian ilmiah modern di dua negara yaitu Cina dan Swedia menyatakan bahwa daging babi merupakan penyebab utama kanker anus dan kolon. Babi banyak mengandung parasit, bakteri, bahkan virus yang berbahaya sehingga dikatakan sebagai Reservoir penyakit (Hilda, 2013). 2.2 Organel sel Sel yang menyusun makhluk hidup tingkat tinggi memang sangat kecil ukurannya sehingga tidak dapat dilihat dengan alat bantu yang sederhana, tetapi memiliki tugas yang sangat besar layaknya sebuah kota yang memiliki bagianbagian untuk menunjang kehidupan kota. Bagian-bagian yang menunjang kehidupan sel disebut organel-organel (Yuni et al, 2006). Organisme yang hidup saat ini dibagi menjadi dua kelompok besar, yaitu prokariot dan eukariot. 4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 5 Prokariot Eukariot Gambar 2.1. Sel Prokariot dan Eukariot (Widyastuti, 2012). Tabel 1. Perbandingan Sel Prokariotik dan Sel Eukariotik Ciri Sel Prokariotik Sel Eukariotik Ukuran ~ 1-10 mm Tipe inti Daerah nukleoid; tanpa inti sejati Umumnya sirkular Keduanya berlangsung di sitoplasma 50S dan 30S Sederhana ~10-100 mm (sel sperma, terpisah dari bagian ekornya, berukuran lebih kecil) Inti sejati dengan membran ganda DNA Sintesis RNA/Protein Ribosom Struktur sitoplasmatik Pergerakan sel Mitokondria Flagela yang tersusun atas protein flagelin Tidak ada Kloroplas Organisasi Tidak ada Umumnya satu sel Pembelahan sel Pembelahan biner Linear (kromosom) dengan protein histon Sintesis RNA berlangsung di dalam hati. Sintesis protein berlangsung di sitoplasma 60S dan 40S Sangat terstruktur dengan adanya membran intraseluler dan sitoskeleton Flagela dan silia yang tersusun atas protein tubulin Satu sampai beberapa lusin (beberapa tidak memiliki mitokondria) Pada alga dan tanaman Sel-sel tunggal, koloni, organisme tingkat tinggi dengan sel terspesialisasi Mitosis (pembelahan inti) dan sitokinesis (pembelahan sitoplasmatik) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 Jenis organisme 2.3 Bakteri dan archaea Protista, fungi, tanaman, hewan Protein dan Asam Nukleat Protein dan asam nukleat merupakan senyawa polimer utama yang terdapat pada sel. Protein merupakan produk dari aliran informasi genetik. Sel membutuhkan ribuan protein yang berbeda setiap waktu. Asam nukleat merupakan polimer dari ratusan, ribuan, bahkan jutaan nukleotida yang bergabung satu sama lainnya melalui ikatan fosfodiester. Asam nukleat merupakan suatu polinukleotida, yaitu polimer linier yang tersusun dari monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi utama asam nukleat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemindahan informasi genetik. Informasi ini tersusun dari sel induk ke sel anak melalui proses reflikasi. Sel memiliki dua jenis asam nukleat yaitu asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukleat (ribonucleic acid/RNA) (Kusuma, 2010). 2.4 DNA 2.4.1 Struktur dan Sifat Kimia DNA DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun dari subunit atau monomer nukleotida. Komponen penyususn nukleotida terdiri dari tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa pada RNA), basa nitrogen dan gugus fosfat. Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3‟, gugus fosfat pada posisi karbon 5‟ dan basa pada posisi karbon 1‟ molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5‟ fosfat dengan gugus 3‟ hidroksil (Gaffar, 2007). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 Gambar 2.2 Struktur Purin dan Pirimidin (Adenin dan Guanin; Cytosin, Tymin dan Urasil) (Gaffar, 2007) Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helixs (heliks ganda). Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda, basa nitrogen dari setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan dengan basa nitrogen dari setiap nukleotida pada rangkaian lainnya melalui ikatan hidrogen. Pengikatan basa nitrogen dari masing-masing nukleotida tersebut sangat spesifik. Basa A dari satu nukleotida selalu berikatan dengan basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan basa G selalu berikatan dengan basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G dan C lebih stabil dari pada pasangan A dan T (Pratami, 2011). Gambar 2.3. Struktur Double Helixs DNA Untai ganda molekul DNA dapat dipisahkan atau terdenaturasi dengan perlakuan suhu maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah. Tingkat denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Semakin tinggi suhunya maka UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 semakin banyak bagian DNA yang berubah menjadi struktur untai tunggal. Denaturasi lengkap biasanya terjadi pada suhu 90OC. Selain dapat terdenaturasi, DNA juga dapat terrenaturasi, yaitu untai tunggal yang terdenaturasi menjadi untai ganda kembali dengan adanya ikatan hidrogen. Suhu renaturasi biasanya sekitar 60OC. Faktor lain yang menentukan laju renaturasi adalah konsentrasi DNA. Semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antara molekul untai tunggal DNA menjadi semakin besar (Sriati, 2011). 2.4.2 Sifat Fisika DNA DNA akan terpisah dari rantai komplemennya (denaturasi) pada suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH<3 atau pH>10) dan bisa bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 60OC. DNA menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm. (Pratami, 2011). 2.4.3 Fungsi DNA DNA adalah dasar kimiawi hereditas dan penyususn gen yang menjadi unit fundamental informasi genetik. Informasi genetik yang disimpan dalam nukleotida berfungsi untuk memenuhi dua tujuan, yaitu sumber informasi bagi sintesis semua molekul protein pada sel serta organisme dan memberikan informasi yang diwariskan kepada anak atau generasi berikutnya (Pratami, 2011). 2.4.4 Isolasi DNA Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom (Gaffar, 2007). Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganisme, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan buffer yang mengandung satu atau lebih detergen, contohnya SDS, NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel yang ditimbulkan akibat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 9 pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan proteinase yang berfungsi untuk mendegradasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90OC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Danuz, 2014). Isolasi DNA saat ini lebih mudah dengan adanya bantuan teknologi canggih yang disebut purifikasi DNA yang menghasilkan isolasi DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat, dan penggunaan yang mudah. Purifikasi DNA menggunakan seperangkat mesin dengan reagen kit pemurnian DNA yang bekerja secara otomatis, singkat dan efisien. Pemurnian DNA dapat dilakukan dari darah, sel-sel, dan sampel jaringan. Instrumen ini dapat memproses sampai dengan 16 sampel dalam waktu 30-45 menit. DNA yang telah dimurnikan dapat digunakan langsung dalam berbagai aplikasi termasuk PCR, restriksi oleh enzim endonuklease, dan elektroforesis gel agarosa. Instrumen ini dapat memproses sampel cair dan padat. Dilengkapi dengan cartridge yang berisi lysis buffer, MagnesiI® PMPs dan wash buffer (Promegaa, 2007). Pada mesin purifikasi DNA, sampel yang telah dilisis oleh buffer lisis, dicuci dengan wash buffer dan dielusi dengan elution buffer menggunakan bantuan Magnesil PMPs (Pratami, 2011). Berikut adalah uraian tahapan isolasi DNA : 1. Penghancuran Membran Sel (lisis) Penghancuran membran sel bisa dilakukan secara fisik misalnya dengan cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya (Radji, 2011). Penggunaan lisozim biasanya untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+ yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat (Izzah, 2014). Pada kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan lisozim dan EDTA, akan tetapi juga sering ditambahkan bahan lain yang dapat melisiskan dinding sel antara lain UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 detergent triton X-100 atau sodium dodesil sulfat (Radji, 2011). SDS merupakan detergent yang dapat merusak integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada membran sel (Izzah, 2014). Setelah sel lisis, tahapan selanjutnya adalah memisahkan sel dibris dengan cara sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih (Radji, 2011). 2. Pemisahan DNA dari Protein Sel Disamping DNA, ekstrak sel juga mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar. Umumnya cara pemisahan DNA dilakukan dengan penambahan larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1. Sedangkan untuk pengendapan protein dengan cara sentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA (Radji, 2011). 3. Pemurnian DNA Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi (Radji, 2011). Pada umumnya, isolasi DNA dengan metode konvensional yang dijelaskan sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga beberapa jam bahkan sampai beberapa hari (Izzah, 2014). Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, metode isolasi DNA telah banyak dikembangkan dan digunakan dalam sebuah penelitian. Salah satu metode yang mudah pengerjaannya serta dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi yaitu dengan menggunakan metode kit komersial (Nishiguchi Michele K et al, 2002). Metode kit komersial tidak hanya digunakan untuk mengisolasi DNA dari produk makanan olahan tetapi juga dirancang untuk mengisolasi DNA yang berasal dari sel darah putih, sel kultur jaringan hewan, jaringan tanaman, dan juga UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 dari bakteri gram negatif serta gram positif (Promega, 2014). Keuntungan yang dihasilkan dari metode isolasi DNA dengan menggunakan kit diantaranya menghemat waktu selama proses isolasi karena dapat menghasilkan jumlah DNA hanya beberapa menit saja, meningkatkan sensitifitas dan keunggulan PCR dalam menganalisis karena pada proses isolasi menghasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, mengurangi seminimal mungkin jumlah kontaminan pada DNA yang dihasilkan, dan dapat digunakan untuk penelitian karena metode kit komersial dapat memurnikan DNA yang berasal dari berbagai sumber (Roche, 2007). Pengukuran kemurnian dan jumlah DNA hasil isolasi dapat dilakukan melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan iradiasi sinar UV secara maksimal oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan oleh protein pada panjang gelombang 280 nm. Perbandingan absorbansi pada 260 nm dan 280 nm (A260/A280) dapat memberikan validasi kemurnian DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan murni jika nilai rasio A260/280 antara 1,8-2,0. Nilai rasio yang lebih rendah dari 1,8 menunjukkan adanya kontaminasi protein sedangkan nilai rasio melebihi 2,0 menunjukkan adanya kontaminasi RNA (Hidayat, 2015). 2.5 DNA Mitokondria DNA mitokondria (mtDNA) adalah molekul DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler yang ditransmisikan secara maternal dan ukurannya relative sangat kecil dibandingkan dengan ukuran genom intinya. DNA mitokondria merupakan DNA yang ada di mitokondria yang berperan dalam sintesis protein. Mitokondria adalah organel yang terletak di dalam sitoplasma eukariota yang diselaputi oleh dua membran dan dua kompartemen, yaitu membran dalam dan membran luar; matriks mitokondria (yang diselimuti langsung oleh membran dalam) dan ruang antar membran (Hidayat, 2015). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 12 Gambar 2.4. Struktur Mitokondria (Aparna, 2015) Mitokondria memiliki diameter 1-2 µm dan mengandung bermacam-macam salinan DNA yang berbentuk sirkular. Jumlah dan bentuk setiap mitokondria berbeda-beda untuk setiap sel dengan tipe yang berbeda dan dapat beruba (Mulyana, 2010). Struktur organisasi mtDNA bersifat stabil, sehingga mtDNA hewan memiliki jumlah gen dan ukuran yang sama, yakni terdiri atas 13 gen yang menyandikan protein yaitu URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrom Oxidase unit I, Cytochrom Oxidase unit II, Cytochrom Oxidase unit III, Cytochrom b dan ATPase 6 (terlibat dalam respirasi sel), 2 gen menyandikan rRNA (12S dan 16S), 22 gen menyandikan tRNA dan beberapa daerah lain yang tidak menyandikan protein D-loop (Control Region) dan daerah intergenic (Hidayat, 2015). Gambar 2.5. Struktur mtDNA (Nageswara, 2007) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 13 DNA mitokondria memiliki karakteristik yang mendukung dalam keperluan analisis biologi dan keragaman genetik, yaitu mtDNA mampu mengcopy diri dalam jumlah yang tinggi (menjadikannya mudah diisolasi), ukuran yang relatip kecil sekitar 14 kb sampai 34 kb sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh, dan memiliki laju evolusi yang tinggi sekitar 510 kali lebih cepat dari DNA inti (Hidayat, 2015). 2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang mampu mengamplifikasi segmen tertentu dari keseluruhan genom bakteri. Proses amplifikasi PCR melibatkan variasi suhu yang mendekati suhu didih air, maka diperlukan enzim polimerase yang tetap stabil dalam temperatur yang tinggi. Pada proses PCR, enzim polimerase yang digunakan berasal dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang hidup di lingkungan bersuhu lebih dari 90OC (Agung, 2010). Target PCR yaitu asam nukleat (DNA) untai ganda yang diekstraksi dari sel dan terdenaturasi menjadi asam nukleat beruntai tunggal. Proses yang terjadi dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu pemisahan untai ganda DNA (denaturasi), penempelan primer (annealing) dan pemanjangan primer ekstensi (ekstensi). Proses yang dimulai dari denaturasi, penempelan dan ekstensi disebut sebagai satu siklus. Produk PCR dapat berlangsung melalui proses elektroforesis dan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Produk PCR dipisahkan dengan elektroforesis gel yang diwarnai dengan bromida dan divisualisasikan dengan sinar ultraviolet (Esti, 2013). PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkan ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 14 fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3‟. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3‟ dengan gugus 5‟ fosfat dNTP yang ditambahkan. Proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5‟-3‟ dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Gaffar, 2007). 2.6.1 Komponen PCR Berikut adalah komponen yang diperlukan untuk reaksi PCR, yaitu : a. DNA cetak / DNA target Merupakan keseluruhan DNA sampel yang di dalamnya terkandung fragmen DNA target. b. Primer Primer adalah suatu oligonukleotida yang memiliki 10 sampai 40 pb (pb = pasangan basa) dan merupakan komplementer dari DNA target. Pemilihan primer yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara gen target dengan primer. Berikut adalah kriteria pemilihan primer, yaitu : 1. Panjang primer : 15-30 pb 2. Kandungan GC sekitar 50% 3. Temperatur penempelan kedua primer tidak jauh berbeda 4. Urutan nukleotida yang sama harus dihindari 5. Tidak boleh terjadi self dimmer, pair dimmer, atau hairpin c. Enzim Taq DNA Polymerase Polimerase adalah suatu molekul komplek yang memiliki tiga aktivitas diantaranya sebagai aktivitas polimerase dari ujung 5‟-3‟, aktivitas exonuclease (aktivitas pengoreksian) dari ujung 3‟-5‟dan bisa juga dari 5‟-3‟ (Viljoen.Gerrit.J et al, 2005). Enzim DNA polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 15 enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC. Aktivitas polimerase DNA bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi. Sebagai contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai (Handoyo, et al., 2001). Enzim ini tetap stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih air. d. Buffer / Dapar Buffer atau Dapar yang digunakan umumnya mengandung MgCl2 yang mempengaruhi stabilitas dan kerja enzim polimerase. e. dNTPS dNTPS atau deoxynukleotide Triphosphates merupakan suatu nukleotida bebas yang berperan penting dalam perpanjangan primer melalui pembentukan pasangan basa dengan nukleotida dari DNA target. 2.6.2 Tahapan PCR Ada tiga tahap pengulangan yang penting dalam proses PCR yaitu : 1. Denaturasi Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94OC yang menyebabkan terjadinya pemisahan untai ganda menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 16 Gambar 2.6. Untai DNA mengalami denaturasi (Agung, 2010) 2. Penempelan (Annealing) Enzim Tag polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa) yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan sushu yang rendah sekitar 55OC selama 30-60 detik. Gambar 2.7. Penempelan primer dengan untai DNA yang telah terdenaturasi (Agung, 2010) 3. Pemanjangan (Ektension) Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA cetakan dan nukleotida. (Agung, 2010) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 17 Gambar 2.8. Perpanjangan DNA secara Semi-konservatif (Agung, 2010) Ketika tiga tahap diatas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial. (Agung, 2010). Amplifikasi secara eksponensial Gambar 2.9. Proses Amplifikasi DNA Target (Agung, 2010). 2.6.3 Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (PCR-RFLP) Banyak metode yang dapat digunakan untuk melakukan analisis DNA, salah satunya yaitu amplifikasi dengan PCR-RFLP. Teknik ini adalah salah satu teknik penandaan DNA yang didasarkan pada perbedaan sisi pemotongan (situs UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 18 restriksi). Enzim restriksi endonuklease yang dapat mendigesti DNA akan memotong DNA pada sisi-sisi restriksi tertentu menjadi fragmen-fragmen yang kemudian dengan analisis elektroforesis gel dapat ditentukan analisis yang diinginkan sesuai dengan markernya masing-masing (Uswahdani, 2013). Metode PCR-RFLP yang memanfaatkan amplifikasi dengan primer spesifik atau universal yang diikuti dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi endonuklease telah banyak digunakan untuk penentuan filogeni tanaman. Pemanfaatan PCR-RFLP dalam identifikasi dan penentuan filogeni pada tanaman telah banyak dilakukan, antara lain pada fungi, Phaseolus dan pisang (Ekasari, 2011). Tabel 2. Kelebihan dan Kelemahan Restriction Fragment Lenght Polimorfisme (RFLP) Kelebihan Bersifat 2.7 Kelemahan kodominan sehingga Menyita banyak tenaga dan sangat baik untuk komparatif waktu, kuantitas dan kualitas pemetaan genom. Polymorphisme DNA yang diperlukan sangat akan perbedaan tinggi, prosedur hibridisasinya ukuran fragmen yang terpotong, rumit, sehingga menyulitkan sehingga setiap siklus restriksi otomatisasi, dapat dipetakan, dapat diturunkan pustaka probe dari nuclear genom, kloroplas spesies tanaman genom, dan mitokondria genom pernah dieksplorasi sebelumnya (Nurlaily, 2012). (Nurlaily, 2012). menghasilkan dan memerlukan untuk yang spesiesbelum Real Time PCR Real time polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Real time PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 19 terdapat pada sampel. Maka teknik ini disebut quantitative PCR (qPCR) (Sriati, 2011). Instrumen real time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Quantitative PCR dimunginkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Pratami, 2011) Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2011) Gambar 2.10. Bentuk Kurva pada Real Time PCR (Pratami, 2010). Instrument real time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan sofware sebagai analisa data. Real time PCR juga dapat menganalisa banyak sampel dalam waktu bersama menggunakan multiwell plates (Pratami, 2011). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 20 Tabel 3. Kelebihan dan kelemahan Real Time PCR Kelebihan Kelemahan pada real time PCR jumlah DNA Real yang diamplifikasi bisa langsung mempunyai kelemahan yaitu diamati secara real time sehingga memerlukan peralatan dan tidak memerlukan analisis dengan reagen elektroforesis gel untuk mengetahui pemahaman produk PCR. Real time PCR lebih benar untuk hasil yang akurat dikenal sebagai quantitative PCR (Ayu, et al. 2014). karena kemampuan time PCR yang mahal teknik juga serta yang analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Pratami, 2012). 2.7.1 Analisis Menggunakan Metode Hydrolysis Probe Instrumen real time PCR menggunakan pewarna fluoresensi secara langsung dan real time, baik untuk memonitor hasil dari produk PCR selama siklus berlangsung maupun setelah siklus pada proses melting hasil produk PCR untuk menganalisis melting curve. Ada beberapa analisis pewarnaan yang dapat dilakukan antara lain : 1. Uji Deteksi Sequence Independent Mengandalkan fluorophores yang mengikat semua DNA molekul untai ganda (dsDNA) terlepas dari urutan basanya : misalnya SYBR Green I. 2. Uji Sequence-Specific Probe Binding Mengandalkan fluorophores yang berpasangan ke probe oligo nukleotida dengan Sequence-Specific yang berhibridisasi dengan urutan komplementernya dalam target produk PCR yaitu Metode UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 21 Simpel Probe, Hybridization Probe (Hyb Probe) dan Hydrolysis Probe. Probe dilabelin oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5‟ probe yang merupakan pewarna fluoresensi dan quencher pada ujung 3‟ probe yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum berkomplemen dengan target, molekul reporter akan mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencher. Karena jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA target saat mencapai suhu annealing lalu mekanisme eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencher terhenti karena jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe berdekatan maka 5‟ nuklease yang terdapat pada DNA polimerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada real time PCR (Rasyid, 2015). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 22 Tabel 3. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe No Gambar Keterangan 1 Hydrolysis probe membawa dua fluorescent dye berdekatan dengan quencher dye menekan sinyal fluorescent reporter. Ujung 3‟ dari probe terfosforilasi sehingga tidak dapat memanjang selama PCR. 2 Di tahap annealing, primer dan probe sama-sama menempel ke urutan basa pada target spesifik 3 Ketika DNA polimerase memanjangkan primer dan bertemu dengan probe. Kemudian memecah probe pada ujung 5‟ sehingga menggantikan posisinya dan terus memanjang sampai membentuk amplikon baru. 4 Saat probe terpecah, reporter tidak lagi berdekatan dengan quencher sehingga dapat mengemisikan cahaya fluorescent yang dibaca oleh detektor. Semakin tinggi fluoresensi yang reporter secara dipancarkan dari langsung berkolerasi dengan akumulasi pelepasan molekul reporter dye (sekaligus menandakan jumlah produk PCR yang dihasilkan) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 23 Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative real time PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang berbeda. Metode hydrolysis probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan SYBR Green karena dapat mengamplifikasi DNA lebih spesifik (Izzah, 2014). Pewarna fluorescent yang digunakan dalam hydrolysis probe bermacam ragamnya yang disesuaikan dengan penggunaannya. Metode hydrolysis probe dapat digunakan secara terpisah atau dengan kombinasi pewarna. Dalam penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan reporter FAM dengan nilai eksitasi dan emisis berturut-turut 483 dan 533, pewarna lainnya yang tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500, Hex, Red 610 dan Cy 5 dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal berturut turut 450 dan 500, 523 dan 568, dan 558 dan 610 serta 615 dan 670. Sebagai quencher terutama untuk deteksi multicolor digunakan quencher dye gelap, direkomendasikan menggunakan BHQ1 atau DABCYL (Rasyid, 2015). 2.8 Daging Sosis Kata sosis berasal dari bahasa latin “salsus” yang berarti garam. Sosis merupakan salah satu produk daging olahan atau giling yang diberi bumbu dan dimasukkan ke dalam selongsongan atau casing menjadi bentuk silindris. Casing yang digunakan dapat berupa usus hewan atau bahan sintesis. Dalam adonan sosis biasanya ada tambahan tepung, susu skim, lemak, es atau air dan protein nabati (Irawati, 2001). Sosis adalah daging giling yang diberi bumbu dan juga mengalami proses curing, pemanasan dan pengasapan. Curing adalah proses pengolahan daging dengan menambahkan garam NaCl, natrium nitrit atau natrium nitrat dan bumbubumbu. Bumbu-bumbu yang biasa digunakana seperti pala, bunga pala, lada, kapulaga, cengkeh, ketumbar, paprika, jahe dan bawang putih. Penambahan nitrit pada proses curing berguna sebagai bahan pembangkit warna khas curing (merah UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 24 cerah dan stabil) dan memberi cita rasa yang khas. Fosfat juga sering ditambahkan untuk menurunkan pH dan memperbaiki warna (Irawati, 2001). Klasifikasi sosis ada empat jenis yaitu sosis segar, sosis kering, sosis setengsh kering dan sosis fermentasi kering dan setengah kering, sosis rebus asap dan tanpa asap. Kategori sosis menurut USDA (United State Department of Agriculture) dibagi menjadi lima yaitu sosis segar, sosis mentah diasap, sosis matang, sosis kering dan semi kering serta sosis spesialitas daging masak. Sosis segar terbuat dari 50% atau lebih daging segar. Daging yang dipakai biasanya berasal dari daging sapi, unggas dan babi. Pembuatan sosis segar ini tidak melalui proses curing, pengasapan atau pemanasan, sehingga sosis yang dihasilkan harus dimasak sebelum dikonsumsi. Sosis kering dan semi kering berbeda pada kadar air yang terkandung dalam produk akhir. Biasanya kadar air sosis semi kering sekitar 70-80% dari berat awal, sedangkan kadar air sosis kering antara 60-70% dari berat awal (Irawati, 2001). Sosis asap adalah sosis yang mengalami pengasapan dalam rumah asap (smooked house) untuk menghasilkan citarasa yang khas (Pearson dan Tauber, 1984). Tahap-tahap pembuatan sosis meliputi grinding (penggilingan), mixing (pencampuran), chopping (penghalusan dan pencampuran semua bahan-bahan), emulsifying (pengemulsian), stuffing (pengisian), linking dan tying (pengikatan), smooking dan cooking (pengasapan dan pemasakan) kecuali untuk sosis segar, chilling (pendinginan) dan pengepakan (Irawati, 2001). Sosis adalah makanan yang dibuat dari daging yang telah di cincang kemudian dihaluskan dan diberi bumbu-bumbu, dimasukkan ke dalam pembungkus yang berupa usus hewan atau pembungkus buatan, dengan atau tidak dimasak. Menurut SNI 01-3020-1995 sosis adalah produk makanan yang diperoleh dari campuran daging halus (mengandung daging tidak kurang dari 75%) dengan tepung atau pati dengan atau tanpa penambahan bumbu-bumbu dan bahan tambahan makanan lain yang diizinkan dan dimasukkan ke dalam selongsong sosis (Sriati, 2011). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Analisa Obat dan Pangan Halal dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.1.2 Waktu Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2016 hingga September 2016. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Real Time PCR (LightCycler® 480-Roche), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), Multiwell Plate 96 (Roche®), tabung mikrosentrifuge volume 1,5 (Biogenix), Mikropipet 0,5-10 µl (Biorad), Mikropipet 20-200 µl (Biorad), Mikropipet 100-1000 µl (Biorad), Mikrotip volume 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower), Sentrifugator (5417R-Eppendrof), Vortex, Digital Waterbath (SB-100 Eyela), Freezer, Autoklaf, Spektrofotometer UV DNA (DeNovix®), Timbangan Analitik, Spatula, Batang pengaduk, Gelas beaker, Kertas perkamen, Kaca arloji, Pipet tetes, Lumpang dan Alu. 3.2.2 Bahan Daging sapi segar, daging babi segar, 6 produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung, satu set kit komersial Wizard® Genomic DNA Purification Kit, (meliputi: Nuclei Lysis Solution, Protein Precipitation Solution, DNA Rehydration Solution, RNase Solution), LC TaqMan Probe Master (terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM), Isopropanolol absolut, NaOH, NaCl, Etanol 70%, Aquabidest, Primer-Probe (Tabel 3.1). 25 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 26 Tabel 3.1. Susunan Basa Primer dan Universal Probe Library untuk DNA Sapi dan Babi (Roche®) dengan Modifikasi Spesies Primer Sequencing Babi (Sus scrofa) Forward 5'- TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG -3‟ Reverse 5'- TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT -3„ UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3' Forward 5'- TGAGGGGGTGTGTTGAGTG -3„ Reverse 5'- TACTATTCGCACCCGACCTC -3„ UPL 5'- (FAM)GACCCAGA -3' Sapi (Bos taurus) 2.7 Tahapan Penelitian 1. Pengumpulan sampel 2. Isolasi DNA 3. Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV 4. Amplifikasi DNA Menggunakan Metode Real Time PCR 2.8 Prosedur Kerja 2.8.3 Pengumpulan sampel Sampel sosis sapi dikumpulkan dari semua merek yang beredar di Pasar Parung dengan jumlah sampel sebanyak 6 merek sosis sapi dari produsen yang berbeda. 3.4.2 Isolasi DNA Proses isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). 1. Preparasi Jaringan Hewan Sebanyak 20 mg dari masing-masing daging sapi segar, daging babi segar, dan sampel sosis sapi dihancurkan sampai halus menggunakan pisau steril, lumpang alu dan blender. Masing-masing daging dan sampel dimasukkan ke dalam mikrosentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 600 μl nuclei lysis solution. Masing-masing campuran tersebut UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 27 dihomogenkan selama 10 detik kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 30 menit. 2. Pelisisaan Sel dan Presipitasi Protein Masing-masing campuran yang sudah diinkubasi ditambahkan 3 μl larutan RNAse lalu diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 30 menit. Selanjutnya ditambahkan 200 μl protein precipitation solution dan divortex, kemudian didiamkan dalam ice selam 5 menit lalu disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 4 menit. 3. Presipitasi dan Rehidrasi DNA Endapan dan supernatan yang terbentuk dipisahkan lalu ditambahkan 600 μl isopropanol kedalam supernatan tersebut. Campuran dikocok dan disentrifus dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang lalu ditambahkan 600 μl etanol 70%. Campuran dikocok dan disentrifus kembali dengan kecepatan 16.000 rpm selama 1 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan etanol lalu endapan di hairdry selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 μl rehidration DNA solution dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 650C atau selama semalam pada suhu 40C. 3.4.3 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV DNA yang sudah diisolasi dianalisis menggunakan Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®). Proses analisis dilakukan dengan cara pada layar Spektrofotometri UV DNA (DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Kemudian Sample port dibersikan menggunkan tisu steril. Siapkan DNA Rehidration Solution yang digunakan sebagai blanko sebanyak 1 μl lalu ditaruh di atas Sample port dan dianalisis. Sample port dibersihkan kembali menggunakan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 1 μl DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Analisis dilakukan untuk mengukur kemurnian dan kuantitas DNA dengan menekan tombol “Measure”. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Tunggu beberapa detik akan muncul data kemurnian dan kuantitas DNA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 28 3.4.4 Amplifikasi DNA dengan metode Real Time PCR a. Pembuatan Primer 50 μM Dari Larutan Induk 100 μM Sebanyak 50 μl larutan induk primer 100 μM dimasukkan kedalam mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 50 μl aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet. b. Pembuatan Primer 5 μM Dari Seri Larutan Induk 50 μM Sebanyak 3 μl larutan induk primer 50 μM dimasukkan kedalam mikrosentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ditambahkan 27 μl aquadest kedalam masing-masing tube tersebut. Larutan tersebut dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas pada mikroppipet. c. Pembuatan Mastermix Real Time PCR Master mix dibuat dengan volume total 20 μl yang terdiri dari 5 μl DNA template; 3,8 μl Aquabidest; 0,4 μl primer forward 5 μM; 0,4 μl primer reverse 5 μM; 0,4 μl UPL 10 μM; dan 10 μl LightCycler® 480 probe master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM MgCl2). d. Loading Sampel dan Taqman Probe Mastermix kedalam Multiwell Plate (Roched, 2008) Campuran reaksi dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan. Kemudian dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas secara perlahan dan ditutup dengan sealing foil. Dilakukan proses pengaturan program LightCycler® 480 real time PCR yang akan digunakan untuk proses amplifikasi. Setelah campuran reaksi total PCR dan program amplifikasi telah siap, campuran reaksi total PCR diletakkan pada multiwell plate yang ditutup menggunakan sealing foil, kemudian diletakkan pada mesin real time PCR. Instrumen real time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis dan langsung memberikan hasil amplifikasi melalui monitor dalam bentuk kurva. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini dilakukan analisis cemaran daging babi pada produk sosis sapi yang beredar di Pasar Parung menggunakan metode Real Time Polymerase Chain Reaction. Pemilihan alat real time dikarenakan pada real time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real time sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang akurat, sensitif dan spesifik sehingga mengurangi kesalahan pada hasil. Selain amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen dapat diamati secara cepat, teknik ini juga dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sampel. Cytochrome b adalah salah satu bagian dari sitokrom yang terlibat dalam transportasi elektron dalam mitokondria. Cyt b berisi delapan transmembran heliks yang dihubungkan oleh intramembran atau domain ekstramembran. Gen cyt b dikodekan oleh DNA mitokondria. Adanya variasi urutan pada cyt b menyebabkan gen ini banyak digunakan untuk membandingkan spesies dalam genus atau famili yang sama. Keunikan sekuen cyt b yaitu terdapat bagian yang bersifat kekal (conserve sequence) di dalam tingkat spesies, sehingga dapat digunakan untuk pengelompokan berdasarkan jenis hewan atau untuk penentuan hubungan kekerabatan antar jenis hewan. Sekuen gen cyt b yang berasal dari sapi (Bos taurus) dan babi (Sus scrofa) mempunyai panjang sekuen 1140 pb (Primasari, 2011). Analisis dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi DNA, pengukuran kemurnian dan kuantifikasi DNA hasil isolasi, amplifikasi DNA dan analisis DNA hasil amplifikasi. 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 30 4.1. Hasil Analisis DNA dengan Spektrofotometri UV Tabel 4.1 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA No Sampel Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280) 1. Daging Babi 127.419 1.84 2. Daging Sapi 84.086 1.89 3. Sampel 1 146.477 1.87 4. Sampel 2 164.050 1.69 5. Sampel 3 145.785 1.90 6. Sampel 4 48.115 1.87 7. Sampel 5 73.760 1.82 8. Sampel 6 90.532 1.90 Isolasi DNA dilakukan terhadap daging sapi, daging babi, dan 6 sampel sosis sapi yang beredar di Pasar Parung. Metode isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega. Prinsip kerja isolasi DNA menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit yaitu lisis, ekstraksi, homogenisasi, presipitasi protein, dan rehidrasi DNA. Bahan-bahan yang digunakan pada proses isolasi DNA pada daging sampel adalah nuclei lysis solution, RNAse, protein precipitation solution, isopropanol, etanol 70%, dan DNA rehydration solution (Promega, 2012). nuclei lysis solution untuk penghancur dinding sel maupun membran sel. Reagen yang digunakan pada proses lisis adalah NLS. Penambahan NLS merupakan cara kimia yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan nukleus. NLS menghancurkan membran sel dengan cara mengganggu ikatan kimia pada membran tersebut. Ekstraksi bertujuan untuk menghancurkan sel sehingga materi yang ada didalam sel dapat keluar. Homogenisasi bertujuan untuk mencampurkan zat. Homogenisasi biasanya dilakukan pada setiap penambahan suatu zat. Presipitasi atau pengendapan bertujuan untuk memisahkan supernatan dengan endapan. Reagen yang digunakan pada proses presipitasi adalah protein precipitation solution. PPS tersusun atas garam penyangga (salt buffer) sehingga reagen ini dapat menurunkan kelarutan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 31 protein sehingga protein dapat mengendap. DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. RNAse merupakan enzim yang berfungsi untuk mendegradasi RNA. Hal tersebut dapat memudahkan proses isolasi karena RNAse akan merusak RNA sedangkan DNA tidak. Molekul DNA yang telah diisolasi kemudian dimurnikan dengan cara presipitasi etanol. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+ pada suhu -200C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Rehidrasi DNA merupakan tekhnik pemurnian DNA dengan cara mengeringkan atau menguapkan (Radji, 2011). Isolat DNA yang dihasilkan dari tahapan kerja di atas, didapatkan konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometri DNA (DeNovix). Hasil isolasi diukur konsentrasinya dengan menggunakan spektrofotometer Denovix pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pengukuran kuantitas (konsentrasi) dan kualitas (kemurnian) didasarkan pada prinsip penyinaran sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan (Muladno, 2010). Konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing sampel bervariasi antara 48,115 ng/µl-164,050 ng/µl (Lampiran 1). Berdasarkan hasil isolasi dan konsentrasi DNA (Lampiran 1), sampel nomer 2 memiliki konsentrasi paling besar yaitu 164,050 ng/µl. Sampel nomer 4 dengan konsentrasi terendah yaitu 48.115 ng/µl. Dengan demikian, konsentrasi DNA yang didapatkan dari tiap sampel masih dapat dilanjutkan ke tahap amplifikasi DNA menggunakan real time PCR karena batas konsentrasi minimal untuk melanjutkan real time PCR adalah 0,03-0,80 pg (Andreo et al, 2005). Perbandingan antara panjang gelombang 260 nm dan 280 nm merupakan nilai kemurnian DNA. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260 nm, sedang protein akan menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (A260/A280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8-2,0 (Stephenso, 2003; Muladno, 2010; Sambrook, et al, 1989; Fatchiyah, 2010). Nilai kemurnian yang dihasilkan dari genom yang diperoleh memiliki nilai antara 1,69-1,90 (Lampiran 1). Sampel yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 32 memiliki nilai kemurnian dibawah 1,8 sebanyak satu sampel yang menunjukkan adanya kontaminasi protein. Sedangkan sampel yang memiliki nilai kemurnian diatas 2,0 tidak menunjukkan adanya kontaminasi RNA. Setelah proses isolasi DNA, sampel di amplifikasi menggunakan real time PCR primer dan UPL yang spesifik (Roche, 2008) dianalisis secara in silico dengan BLAST berdasarkan informasi database NCBI melalui internet. Selain BLAST, primer dan UPL diuji spesifikasinya dengan cara kedua primer dan UPL digunakan untuk mengamplifikasi daging sapi segar dan daging babi segar (gambar 4.1 dan gambar 4.3). Campuran reaksi total PCR (Lampiran 4) dibuat dalam volume 20 µL dengan konsentrasi tiap primer forward dan reverse 20 µM dan untuk konsentrasi UPL/probe. Konsentrasi primer dibuat dari larutan induk 100 µM. Konsentrasi primer untuk PCR sebaiknya berkisar antara 0,3-1 μM dan untuk konsentrasi hydrolysis probe berkisar antara 0,05-0,2 μM (Roche, 2008). Konsentrasi primer yang optimal adalah konsentrasi terendah yang dapat menghasilkan nilai CP awal dan kurva fluoresen yang baik, begitu juga dengan probe (Roche, 2008). 4.2 Uji Cemaran DNA Babi pada Sampel Sosis Sapi Amplifikasi DNA daging sapi, daging babi dan 6 sampel sosis sapi yang beredar di Pasar Parung dilakukan dengan menggunakan dua primer yaitu primer sapi dan primer babi. Penggunaan primer sapi bertujuan untuk memastikan bahwa sampel sosis yang berlogo sapi mengandung daging sapi. Sedangkan primer babi digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan babi didalam sampel sosis sapi. Konsentrasi primer pada PCR yang dianjurkan berkisar antara 0,1-0,5 µM. Konsentrasi primer yang tinggi (≥0,5 µM) dapat meningkatkan kesalah penempelan primer pada DNA cetakan, sehingga menyebabkan penumpukan primer yang tidak spesifik. Namun, penggunaan konsentrasi primer yang terlalu rendah akan memberikan hasil amplifikasi yang tidak jelas (Bintang, 2010). Proses amplifikasi pada PCR biasanya 35-40 siklus (Muladno, 2010), namun pada penelitian ini hanya menggunakan 30 siklus. Hal ini dikarenakan sebelum mencapai siklus ke 30 sudah terjadi amplifikasi pada sekuen DNA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 33 Program amplifikasi yang digunakan pada real time PCR dipilih berdasarkan penanda yang digunakan. Penelitian ini menggunakan UPL sebagai penanda pada reaksi real time PCR sehingga program yang digunakan dapat dilihat pada tabel 4.2 dibawah ini: Tabel 4.2 Program Dual Color Hydrolysis Probe – UPL Probe 96-II Analisis kurva amplifikasi dilihat dari kenaikan kurva dan nilai CP (Crossing Point) pada kurva amplifikasi. Spesifisitas hasil amplifikasi dapat dilihat melalui nilai TM (Melting Temperature) pada melting curve. CP adalah jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca diatas Arbitrary Fluorescence Level (AFL) yang menunjukkan awal mulainya fase pertumbuhan eksponensial (Roche, 2008). Semakin rendah nilai CP maka semakin tinggi konsentrasi DNA target. Tm adalah suhu dimana 50% bagian dari DNA telah terbuka menjadi untai tunggal. Nilai Tm tergantung dari jumlah basa A, G, T dan C. Primer yang spesifik akan menghasilkan satu puncak Tm pada DNA target (Izzah, 2014). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 34 4.2.1 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi dan NTC Menggunakan Primer Sapi Gambar 4.1. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: NTC (No Template Control) Gambar 4.1. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: NTC (No Template Control Analisa menggunakan real time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Saat probe terpecah, reporter tidak lagi berdekatan dengan quencher sehingga dapat mengemisikan cahaya fluorescent yang dibaca oleh detektor. Semakin tinggi fluorescent yang dipancarkan dari reporter secara langsung berkolerasi dengan akumulasi pelepasan molekul reporter (sekaligus menandakan jumlah produk PCR yang dihasilkan). Apabila dilihat pada grafik amplifikasi positif kontrol (kurva standar) ditandai dengan adanya akumulasi pada signal fluorescent dan melintasi base line threshold. Sedangkan kontrol negatif dan NTC tidak melintasi base line threshold sehingga menunjukkan hasil negatif. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 35 Amplifikasi yang pertama dilakukan menggunakan primer sapi. daging sapi sebagai kontrol positif, daging babi sebagai kontrol negatif dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk mengetahui primer sapi yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging sapi. Kurva amplifikasi terhadap kontrol menggunakan primer sapi dapat dilihat pada gambar 4.1. Hasil uji terlihat pada gambar 4.1 dimana primer sapi hanya mengamplifikasi daging sapi segar pada CP 11,31 sedangkan pada daging babi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang dihasilkan oleh daging sapi menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi, sedangkan pada daging babi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini menunjukan bahwa primer sapi dapat mengamplifikasi DNA daging sapi secara spesifik. Hasil amplifikasi yang spesifik dikarenakan tidak terjadi mis-priming ataupun primer dimer. Primer dimer adalah terbentuknya struktur sekunder karena menempelnya sesama primer sejenis ataupun primer yang tidak sejenis yaitu antara primer forward dengan komplemen primer reverse (Widowati, 2013). Sedangkan mis-priming adalah penempelan primer diluar sekuen DNA target (Izzah, 2014). Berdasarkan hasil amplifikasi diatas, maka primer sapi dapat digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu untuk menganalisa kandungan sosis sapi yang digunakan sebagai sampel. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 36 4.2.2 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Sampel Sosis Sapi, dan NTC Menggunakan Primer Sapi Gambar 4.2. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Sampel Menggunakan Primer Spesifik Sapi. *Keterangan: 1 (Sampel 1), 2 (Sampel 2),3 (Sampel 3),4 (Sampel 4), 5 (Sampel 5), 6 (Sampel 6), NTC (No Template Control). Amplifikasi kedua yang dilakukan menggunakan primer sapi sebagai kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel, dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap sampel menggunakan primer sapi dilakukan untuk memastikan bahwa sosis sapi yang digunakan sebagai sampel mengandung daging sapi. Kurva amplifikasi terhadap kontrol positif, sampel dan NTC menggunakan primer sapi dapat dilihat pada gambar 4.2. Seluruh sampel diuji menggunakan primer sapi dan UPL sebagai penanda pada reaksi real time PCR. Hasil amplifikasi menggunakan primer sapi dapat dilihat pada gambar 4.2 terlihat adanya perbedaan kenaikan kurva dan CP pada tiap sampel. Kontrol positif memberikan CP lebih awal yaitu pada 11,15 meskipun dalam data konsentrasi DNA daging sapi segar hanya 84,086 ng/µL. Dan sampel nomor 1 memiliki konsentrasi paling besar kedua yaitu 146.477 ng/µL memberikan CP lebih awal pada 16,78 sedangkan sampel nomor 3 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 37 memiliki konsentrasi paling tinggi kedua yaitu 145.785 ng/µL tetapi memberikan CP paling lama yaitu pada 27,12. Perbedaan kenaikan kurva pada tiap sampel dipengaruhi oleh konsentrasi DNA dalam sampel (Roche, 2008). Sampel dengan konsentrasi DNA paling tinggi membutuhkan siklus amplifikasi lebih sedikit untuk mencapai CP. Begitu juga dengan konsentrasi DNA yang rendah membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang untuk mencapai CP. Namun kenyataannya, konsentrasi DNA sampel yang besar membutuhkan siklus amplifikasi lebih panjang dengan memberikan nilai CP yang besar. Hal ini disebabkan hasil isolasi DNA sampel yang didapat bukan hanya pada DNA yang spesifik terhadap desain primer dan probe. DNA organisme eukariotik terdapat di dalam inti sel yang terbentuk sebagai kromosom (Stansfield et al, 2006) dan di dalam mitokondria atau yang biasa disebut mtDNA. Desain primer dan UPL yang digunakan dalam penelitian ini hanya spesifik pada daerah mitokondria sitokrom b (Tanabe et al, 2007). Meskipun dengan konsentrasi DNA yang besar namun jika tidak mengandung sekuen DNA mitokondia sitokrom b, maka tidak akan terjadi amplifikasi. Pemilihan DNA mitokondria sebagai desain primer karena DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk berbagai keperluan analisis genom. Kemudian ukuran DNA mitokondria yang relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh (Sholihin, 1994). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 38 4.2.3 Hasil Amplifikasi DNA Daging Sapi, Daging Babi, dan NTC Menggunakan Primer Babi Gambar 4.3 Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Menggunakan Primer Spesifik Babi. *Keterangan: NTC (No Template Control Amplifikasi yang pertama dilakukan menggunakan primer babi. Daging babi sebagai kontrol positif, daging sapi sebagai kontrol negatif dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap kontrol dilakukan untuk mengetahui primer babi yang digunakan spesifik atau tidak terhadap daging babi. Kurva amplifikasi terhadap kontrol menggunakan primer babi dapat dilihat pada gambar 4.3. Hasil uji terlihat pada gambar 4.3 dimana primer babi hanya mengamplifikasi daging babi segar pada CP 16,31 sedangkan pada daging babi dan NTC tidak menghasilkan nilai CP. Nilai CP yang dihasilkan oleh daging babi menunjukkan telah terjadinya proses amplifikasi sedangkan pada daging sapi dan NTC tidak terjadi proses amplifikasi. Hal ini menunjukan bahwa primer babi dapat mengamplifikasi DNA daging babi secara spesifik. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 39 4.2.4 Hasil Amplifikasi DNA Daging Babi, Sosis Sapi, dan NTC Menggunakan Primer Babi Gambar 4.4. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Sampel Menggunakan Primer Spesifik Babi *Keterangan: NTC (No Template Control). Amplifikasi yang kedua dilakukan menggunakan primer babi sebagai kontrol positif, sosis sapi sebagai sampel, dan NTC sebagai blanko. Amplifikasi terhadap sampel sosis sapi menggunakan primer babi dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan daging babi di dalam sampel sosis. Kurva amplifikasi terhadap kontrol positif, sampel dan NTC menggunakan primer babi dapat dilihat pada gambar 4.4. Seluruh sampel diuji menggunakan primer babi dan UPL sebagai penanda pada reaksi real time PCR. Amplifikasi menggunakan primer babi pada sampel sosis sapi yaitu 15,29 dengan konsentrasi DNA daging babi sebesar 127.419 ng/µL. Sedangkan NTC dan seluruh sampel hanya memberikan garis lurus. Hal tersebut menandakan tidak terjadinya amplifikasi primer babi pada DNA sampel. Terbukti bahwa produk sosis sapi yang diuji masih sesuai dengan bahan asal yang digunakan tanpa kontaminasi daging babi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik babi dan sapi dapat dilakukan dengan real time PCR sebanyak 30 siklus dengan kondisi suhu denaturasi 950C selama 10 detik dan annealing pada suhu 600C selama 30 detik. 2. Kurva amplifikasi real time PCR menggunakan primer spesifik babi menunjukkan bahwa kontrol positif teramplifikasi dengan nilai CP 19,97 sedangkan kontrol negatif dan enam sampel sosis sapi tidak teramplifikasi. 3. Kurva amplifikasi DNA menggunakan real time PCR, menunjukkan bahwa produk sosis sapi yang diuji tidak mengandung daging babi. 5.2 Saran Perlu dilakukan optimasi dan evaluasi terhadap alat real time PCR dan mesin isolasi DNA. 40 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR PUSTAKA Alaraidha, Ibrahim Abdullah. 2008. Improved DNA Extraction Method for Porcine Contaminants, Detection in Imported Meat to The Saudi Market. Saudi Arabia : Saudi Journal of Biologic Sciences 15 (2) 225-229 December 2008. htt:www.saudibiosoc.com. diakses pada 23 Maret 2016 pukul 18.17 Ali, M.E., U. Hashim., S.Mustafa., Y.B. Che Man., Th.S.Dhahi., M.Kashif., Md. Kamal Uddin., S.B.Abd Hamid. 2012. Analysis of pork adulteration in commercial meatballs targeting porcine-specific mitochondrial cytochrome b gene by TaqMan probe real-time polymerase chain reaction. Malaysia. Andreo, Mario Lopez., Laura Lugo., A Garrido-Pertierra., M. Isabel Prieto and A Puyet. 2005. Identification and quantitation of species in complex DNA mixtures by real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 339(1), 73-82Bio-Rad. 2006. Ayu, D.H., Dharmayanti NLPI. 2014. Perkembangan Teknologi Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan Newcastle Diseases. Balai Besar Penelitian Veteriner, Jl. RE Martadinata No. 30, Bogor 16114. Bio-Rad. 2006. Real Time PCR Application Guide. http://www.bio-rad.com, diakses pada 22 Februari 2016 pukul 10.11 Bintang, Maria. 2010. Biokimia Tekni Penelitian. Jakarta. Erlangga Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005. Standardisation of data from real-time quantitative PCR methodsevaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC Biotecnology doi.10.1189/1472-6750-5-31 Danuz, Sonia Zulfa Deshi. 2014. Amplifikasi DNA Leptospira dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (iiPCR). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Dono, Nanung Danar S.Pt.,M.P. Skema Manfaat dan Penggunaan Babi. Dosen Fakultas Peternakan UGM Yogyakarta dan Sekretaris Eksekutif/Auditor Halal LPPOM MUI Propinsi DIY. diakses pada 29 Februari 2016 pukul 09.19 41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 42 Fatchiyah. 2010. Uji Kualitatif dan Kuantitatif DNA dan RNA. http://www.scribd.com/doc/31385295/Uji-Kuantitatif-Dan-KuantitatifDNA-Dan-RNA-2010, diakses pada 25 Desember 2016 pukul 10.00 WIB. Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung : Universitas Padjajaran. Handoyo, Darmo., & Rudiretna, Ari. 2001. General Principles Implementation of Polymerase Chain Reaction. Unitas, 9(1) : 17-29 and Hidayat, Rian. 2015. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi untuk Deteksi Kehalalan Cangkang Kapsul Keras dari Gelatin dengan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Hildaa, Dr. Lelya, M.Si. 2013. Pandangan Sains Terhadap Haramnya Lemak Babi. TSAIN Padangsidimpuan. diakses pada 20 Januari 2016 pukul 03.28 Hildab, Dr. Lelya, M.Si. 2014. Analisis Kandungan Lemak Babi dalam Produk Pangan di Padang Sidimpuan secara Kualitatif dengan Menggunakan Gas Kromatografi (GC). IAIN Padangsidimpuan. diakses pada 20 Januari 2016 pukul 03.30 Irawati, Yiyin. 2001. Pemanfaatan Primer Pengapit Pre-1 (Porcine Repetitive Element) untuk Mendeteksi Daging Babi pada Beberapa Produk Sosis. Skripsi. Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor. Izzah, Nurul Afifah.2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Kusuma, Sri Agung Fitri,M.Si.Apt. Polymerase Chain Reaction (PCR).2010.Universitas Padjadjaran Fakultas Farmasi. diakses pada 30 Januari 2016 pukul 13.24 Liyana, Farihah K., Shuhaimi, M., Che Man, Y.B., Sazili A.Q., Aida A.A., Raha A.R. 2009. Porcine Specific Real time Polymerase Chain Reaction (PCR) for Halal Verification. Proceedings of the 3rd IMT-GT International Symposium on Halal Science and Management 2009. Malaysia : UPM Serdang, Selangor. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 43 Margawati, Endang Tri., Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemarann Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR: Pencarian Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI. Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik Edisi Kedua. Bogor : IPB press Mulyana,Yopi. 2010. Analisis Cemaran Daging Babi pada Kornet Sapi di Wilayah Ciputat dengan Menggunakan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Nurlaily, Enik Afifah. 2012. Penggunaan Penanda Molekuler untuk Mempercepat dan Mempermudah Perbaikan Kualitas Tanaman Teh (Camellia Sinensis (L.) O. Kuntze). Skripsi. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Oebaidillah, Syarief. 2011. 60 % Produk yang Beredar tidak Dijamin Halal http://bataviase.co.id/node/522354, diakses tanggal 22 Februari 05.54 Pasaribu, Dian Tantri Y. 2009. Pengaruh Taraf Penambahan Tepung Terigu sebagai Bahan Pengikat Terhadap Kualitas Sosis Daging Ayam. Medan : Departemen Peternakan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Medan 2009. diakses pada 29 Februari 2016 pukul 08.36 Pratami, D.F. 2011. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Burger Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Melalui Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Primasari, Almira. 2011. Sensitivitas Gen Sitokrom B (Cyt b) Sebagai Marka Spesifik pada Genus Rattus dan Mus untuk Menjamin Keamanan Pangan Produk Asal Daging. Tesis. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Promega. 2007. Technical Manual Maxwell® 16 DNA Purification Kits. http://www.promega.com. diakses pada 26 Maret 2016 pukul 23.58 Radji, Maksum. 2011. Rekayasa Genetika. Jakarta: ISBN : 978-602-8674-40-9 Rahmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 44 Rahmawati., Sismindari., Raharjo., T.J., Sudjadi and Rohman,A. 2016. Analysis of pork contamination in Abon using mitochondrial D-Loop22 primers using real time polymerase chain reaction method. Indonesia. International Food Research Journal 23(1): 370-374 (2016). diakses pada 23 Maret 2016 pukul 18.08 Rasyid, Sulaiman. 2015. Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real Time Polymerase Chain Reaction dengan Metode Hydrolysis Probe. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Rochea. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari pukul 20.54 2016 Rocheb. 2008. The LightCycler® 480 System, Unleash the Potential of Real Time PCR. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari 2016 pukul 20.54 Rochec. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. Version February 2008. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 20 Januari pukul 20.54 2016 Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Labolatory Manual. 2nd edition. New York : Cold Spring Harbour Laboratory Press. Book 1.6.1-6.17 Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587 Stansfield, William D., Jaime S.Colome., Raul J.Cano. 2006. Shaum’s Easy Ountlines Biologi Molekuler dan Sel; alih bahasa, Varian Fahmi ; editor, Amalia Safitri. Jakarta : Erlangga Stephenson, Frank, H., 2003. Calculations in Molecular Biology and Biotechnology, A Guide to Mathematics in The Laboratory, Academic Press, California, USA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 45 Sriati, Nur. 2011. Analisis Cemaran DNA Mitokondria Babi pada Produk Sosis Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Metode Real Time PCR. Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura., and Hiroshi Akiyama. 2007. A Real Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan : Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007 Uswahdani, Rohati Hikmah. 2013. Keanekaragaman Molekuler Durian Berdasarkan Fragmen Internal Transcribed Spacers (ITS) DNA Ribosomal Melalui Analisis PCR-RFLP. Skripsi. Universitas Negeri Semarang. Vivikananda, Evira.2014.Deteksi DNA Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Wardani, Agustin Krisna., Elok Puji Kurnia Sari. 2015. Deteksi Molekuler Cemaran Daging Babi pada Bakso Sapi di Pasar Tradisional Kota Malang Menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Malang : Jurnal Pangan dan Agroindustri Vol. 3 No 4 p. 1294-1301. diakses pada 15 Januari 2016 pukul 16.59. Widyastuti, Endrika. 2012. Sel Struktur dan Fungsi. Fakultas Teknologi Pertanian UB. diakses pada 22 Januari 2016 pukul 21.51 Wijaya, Yoga Permana. 2009. Fakta Ilmiah Tentang Keharaman Babi. http://yogapw.wordpress.com. diakses pada 29 Februari 2016 pukul 09.17 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 46 Lampiran 1 Tabel 4. Konsentrasi dan kemurnian hasil isolasi No Sampel Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian (A260/A280) 1. Daging Babi 127.419 1.84 2. Daging Sapi 84,086 1.89 3. Sampel 1 146.477 1.87 4. Sampel 2 164.050 1.69 5. Sampel 3 145.785 1.90 6. Sampel 4 48.115 1.87 7. Sampel 5 73.760 1.82 8. Sampel 6 90.532 1.90 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 47 Lampiran 2. Perhitungan Pembuatan Larutan Primer a. Membuat larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM V1 x N1 = V2 x N2 V1 x 100 = 100 x 50 V1 = 50 µL Maka, 50 µl diambil dari larutan induk primer konsentrasi 100 µM, kemudian ditambahkan aquabidest sampai volume 100 µl. b. Membuat larutan primer 5 µM dari seri konsentrasi primer 50 µM. V1 x N1 = V2 x V1 x 50 = 30 x 5 V1 = 3 µL N2 Maka, diambil 3 µl dari larutan primer konsentrasi 50 µM, kemudian ditambahkan aquabidest sampai volume 30 µl. c. Membuat larutan primer 0,1 µM dari konsentrasi 5 µM. V1 x N1 = V2 x N2 V1 x 5 = 20 x 0,1 V1 = 0,4 µL Maka, diambil 0,4 µL dari larutan primer konsentrasi 50 µM. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 48 Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer Rumus Tm = 2oC (A + T) + 4oC (G + C) PRIMER SAPI PRIMER BABI Primer Sapi Forward Primer Babi Forward Tm = 2oC (2 + 6) + 4oC (11 + 0) = 60oC Primer Sapi Reverse Tm = 2oC (4 + 5) + 4oC (2 + 9) = 62oC Tm rata-rata primer sapi: Tm = (60 + 62) / 2 = 6oC Tm = 2oC (1 + 9) + 4oC (10 + 0) = 60 oC Primer Babi Reverse Tm = 2oC (5 + 9) + 4oC (2 + 9) = 72oC Tm rata-rata primer babi: Tm = (60 + 72) / 2 = 66oC UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 49 Lampiran 4. Tabel 5. Komponen Campuran Reaksi Real Time PCR Komposisi Jumlah Primer Forward 20µM 0,4 µl Primer Reverse 20µM 0,4 µl UPL 0,4 µl Buffer PCR 10 µl ddH2O 3,8 µl Template 5 µl Total 20 µl UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 50 Lampiran 5. Hasil Kurva Amplifikasi Gamabar 5.1 Kurva Amplifikasi Uji Spesifitas Primer dan UPL Gambar 5.2 Kurva Amplifikasi Uji Spesifitas Primer Babi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 51 Gambar 5.3. Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Sampel Menggunakan Primer Spesifik Sapi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 52 Gambar 5.4 . Kurva Real Time PCR yang Menunjukkan Hasil Amplifikasi Sampel Menggunakan Primer Spesifik Babi. Lampiran 6 Gambar. Alat – alat yang digunakan dalam Penelitian Gambar 5.3 Spektrofotometri DNA Gambar 5.5 Masker, Glove Gambar 5.4 Kit Ekstraksi (Promega) Gambar 5.6 Mikrotips, Microsentrifuge, tube UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 53 Gambar 5.7 Microsentrifugasi Gambar 5.9 Mikropipet (1) Vol 1000 µl; (2) Vol 200 µl; (3) Vol 20 µl Gambar 5.11 Real Time PCR Gambar 5.8 vortex Gambar 5.10 Multiwell Plates, Sealing Foil Gambar 5.12 Timbangan Analitik UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 54 Gambar 5.13 Microsentrifugase 5417R Gambar 5.15 Oven Gambar 5.17 Sosis Gambar 5.14 Lemari pendingin suhu -21 Gambar 5.16 Autoklav Gambar 5.18 Daging Babi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
