LUKLUATUN NISWAH
advertisement
UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK BUAH PARIJOTO (Medinilla speciosa Blume) MENGGUNAKAN METODE DIFUSI CAKRAM SKRIPSI LUKLUATUN NISWAH 1110102000032 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA SEPTEMBER 2014 i UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK BUAH PARIJOTO (Medinilla speciosa Blume) MENGGUNAKAN METODE DIFUSI CAKRAM SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Far) LUKLUATUN NISWAH 1110102000032 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA SEPTEMBER 2014 ii iii iv v ABSTRAK Nama : Lukluatun Niswah Program Studi : Farmasi Judul : Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Menggunakan Metode Difusi Cakram Parijoto (Medinilla speciosa Blume) adalah tanaman tropis yang mempunyai buah berwarna merah muda keunguan. Penelitian terdahulu menyebutkan bahwa, buah tanaman ini mempunyai kandungan senyawa tanin, saponin, flavonoid dan glikosida serta mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Uji aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana buah parijoto ini dilakukan dengan metode difusi cakram. Ketiga ekstrak buah parijoto lebih aktif terhadap bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dibandingkan dengan bakteri Escherichia coli ATCC 25922. Pada konsentrasi 200, 100, 50, 25, 12,5mg/mL ekstrak etil asetat mempunyai aktivitas antibakteri lebih besar daripada ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana dengan diameter hambat 17,67; 16,33; 15,67; 14,67; 13,33mm terhadap bakteri S. aureus dan 12,33; 11,33; 10,67; 9; 8mm terhadap bakteri E. coli. Kata kunci : Medinilla speciosa Blume, antibakteri, difusi cakram vi ABSTRACT Name : Lukluatun Niswah Program Study : Pharmacy Title : Antibacterial Activity Assay of Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Fruit Extract by Disc Diffusion Method Parijoto (Medinilla speciosa Blume) is tropic plant that has pink-purplish fruit. In the previous research, this fruit has tannin, saponin, flavonoid and glicoside compounds and also has high antioxidant activity. This assay of antibacterial activity of methanol, ethyl acetate and n-hexane extracts of parijoto fruit were determined by disc diffusion method. These extracts were more active against Staphylococcus aureus ATCC 25923 than Escherichia coli ATCC 25922. Ethyl acetate extract was more active than methanol and n-hexane extracts at concentration 200, 100, 50, 25, 12,5mg/mL with diameter zone inhibition 17,67; 16,33; 15,67; 14,67; 13,33mm to S. aureus bacteria and 12,33; 11,33; 10,67; 9; 8mm to E. coli bacteria. Keywords : Medinilla speciosa Blume, antibacterial, disc diffusion vii KATA PENGANTAR Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT atas segala nikmat dan limpahan rahmat-Nya sehingga saya dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi. Serta shalawat dan salam selalu tercurahkan kepada baginda Rasul Muhammad SAW yang membawa petunjuk dan penerang bagi umat manusia, semoga kita mendapat syafaat beliau. Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Menggunakan Metode Difusi Cakram” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana farmasi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan hingga penyusunan skripsi ini terasa sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.S., Apt selaku pembimbing pertama dan Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian hingga penulisan skripsi saya ini, semoga semua bantuan dan bimbingan yang Ibu berikan mendapat imbalan yang lebih baik disisi Nya. 2. Kementrian Agama RI yang telah memberikan beasiswa sehingga penulis bisa menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Drs. Umar Mansur, M.Sc. selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt selaku dosen Penasehat Akademik yang telah banyak memberikan dukungan moril kepada penulis. 4. Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi viii 5. Kedua orang tua, Bapak Abdul Khafid dan Ibu Siti Rohmah yang selalu memberikan doa, dukungan, dan ketenangan hati dengan nasihatnasihatnya; adik-adikku M. Adib Nuril Mubin, Ahmad Rifa’i, dan terutama adik tersayang M. Ali Ridlo yang selalu dengan senang hati memberikan bantuan, terutama saat pengumpulan sampel dari Desa Colo serta Ahmad Noor Solikhin, S.H.I. yang selalu memberikan semangat dan berbagi pengalaman. 6. Teman-teman angkatan 2010 “ANDALUSIA”, terkhusus untuk temanteman terbaik : Ninik, Rifa, Farida, Finti, Yanti, Liana, Nurul, Citra, Chaya, Maya, Hanny, Deisy, Desti yang selalu menemani dan mengobati ‘kegalauan’ dengan memberi keceriaan dari awal perkuliahan sampai selesainya penulisan skripsi ini. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan dan jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu dengan segala kerendahan hati, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat memberi sumbangan wawasan bagi pembaca, terutama di Prodi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Ciputat, 17 September 2014 penulis ix x DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ............................................................................................ ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iv HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ...............................................................v ABSTRAK .......................................................................................................... vi ABSTRACT ....................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ....................................................................................... viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH .........................x DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR..........................................................................................xiv DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................xvi BAB 1 PENDAHULUAN .....................................................................................1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................2 1.3 Tujuan Penelitian...................................................................................2 1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................2 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................3 2.1 Medinilla speciosa Blume .....................................................................3 2.1.1 Klasifikasi Tanaman .....................................................................3 2.1.2 Sinonim Medinilla speciosa Blume ...............................................3 2.1.3 Deskripsi Tanaman .......................................................................3 2.1.4 Tempat Tumbuh ...........................................................................4 2.1.5 Kandungan Kimia .........................................................................4 2.1.6 Khasiat .........................................................................................4 xi 2.2 Ekstraksi ...............................................................................................5 2.2.1 Pengertian Ekstrak ........................................................................5 2.2.2 Metode Ekstraksi ..........................................................................5 2.3 Pewarnaan Bakteri.................................................................................6 2.4 Bakteri Patogen .....................................................................................7 2.4.1 Staphylococcus aureus ..................................................................7 2.4.2 Escherichia coli ............................................................................8 2.5 Antibiotik ..............................................................................................8 2.6 Metode Skrining Antimikroba ...............................................................9 2.6.1 Metode Difusi ............................................................................. 10 2.6.2 Metode Dilusi ............................................................................. 10 2.6.3 Metode Bioautografi ................................................................... 11 2.7 Konsentrasi Hambat Minimum ............................................................ 11 BAB 3 METODE PENELITIAN ....................................................................... 12 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................. 12 3.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 12 3.2.1 Alat ............................................................................................ 12 3.2.2 Bahan ......................................................................................... 12 3.3 Cara Kerja ........................................................................................... 13 3.3.1 Determinasi Tanaman ................................................................. 13 3.3.2 Penyiapan Bahan ........................................................................ 13 3.3.3 Pembuatan Ekstrak ..................................................................... 13 3.3.4 Partisi Ekstrak Metanol ............................................................... 13 3.3.5 Uji Kadar Air Ekstrak ................................................................. 14 3.3.6 Penapisan Fitokimia .................................................................... 14 3.3.7 Skrining Antibakteri ................................................................... 16 3.3.7.1 Pembuatan Media dan Sterilisasi ..................................... 16 3.3.7.2 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Uji................................. 16 xii 3.3.7.3 Kontrol Positif dan Kontrol Negatif ................................ 17 3.3.7.4 Pembuatan Suspensi Bakteri ........................................... 17 3.3.7.5 Prosedur Uji Antibakteri ................................................. 17 3.3.7.6 Pewarnaan Bakteri Uji .................................................... 18 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 19 4.1 Determinasi Tanaman ......................................................................... 19 4.2 Ekstraksi dan Partisi ............................................................................ 19 4.3 Penapisan Fitokimia ............................................................................ 21 4.4 Uji Antibakteri .................................................................................... 22 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 27 5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 27 5.2 Saran ................................................................................................... 27 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 28 LAMPIRAN xiii DAFTAR GAMBAR Gambar 2.1 Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) .....................................4 Gambar 4.1 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli ............................................................................................... 24 Gambar 4.2 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli ....................................................................................... 25 Gambar 4.3 Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-heksana terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli .............................................................................................. 25 xiv DAFTAR TABEL Tabel 1.1 Perbedaan Bakteri Gram-Positif dan Gram-Negatif ................................7 Tabel 4.1 Karakterisasi Ekstrak ............................................................................ 20 Tabel 4.2 Berat Ekstrak n-heksana, Etil Asetat dan Metanol ................................. 20 Tabel 4.3 Hasil Uji Kadar Air .............................................................................. 21 Tabel 4.4 Hasil Uji Penapisan Fitokimia Ekstrak n-heksana, Etil Asetat dan Metanol ................................................................................................ 21 Tabel 4.5 Hasil Pengukuran Diameter (mm) Zona Hambat Ekstrak Metanol, Buah Parijoto terhadap bakteri S. aureus dan E. coli ...................................... 23 Tabel 4.6 Hasil Pengukuran Diameter (mm) Zona Hambat Ekstrak Etil Asetat Buah Parijoto terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli ...................................... 23 Tabel 4.7 Hasil Pengukuran Diameter (mm) Zona Hambat Ekstrak n-heksana Buah Parijoto terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli ..................................... 24 xv DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Lampiran 2. Bagan Alur Kerja Ekstraksi dan Uji Antibakteri Ekstrak Buah Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Lampiran 3. Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli Lampiran 4. Skrining Fitokimia Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) xvi BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Indonesia merupakan negara tropis yang memiliki keanekaragaman hayati tinggi. Hal tersebut seharusnya menjadi aset yang perlu digali sehingga dapat dimanfaatkan. Tanaman dari genus Medinilla adalah tanaman yang tumbuh di daerah tropis. Salah satu diantaranya adalah Medinilla speciosa. Di Indonesia tanaman ini dikenal dengan nama daerah parijoto yang merupakan salah satu tanaman khas dari Desa Colo-Kudus, Jawa Tengah. Tanaman parijoto tumbuh di lereng-lereng gunung, di hutan dan sekarang sudah mulai dibudidayakan sebagai tanaman hias (Wibowo et al, 2012; Maria, 2012). Parijoto adalah tanaman perdu khas, daunnya melengkung, tunggal, dan bersilang berhadapan; buahnya berwarna merah muda keunguan dan rasanya asam dan sepat. Secara tradisional, buah parijoto biasa digunakan sebagai obat sariawan sedangkan daunnya dapat digunakan sebagai obat antiradang. Masyarakat sekitar daerah Colo, kabupaten Kudus percaya bahwa ibu hamil yang mengkonsumsi buah parijoto ini anak yang dilahirkan akan terlihat cakap jika laki-laki dan cantik jika perempuan (Wibowo et al, 2012). Pada penelitian sebelumnya, disebutkan bahwa buah tanaman parijoto ini mempunyai kandungan senyawa tanin, flavonoid, saponin dan glikosida (Wachidah, 2013). Kemudian Wachidah (2013) juga melaporkan bahwa ekstrak metanol buah tanaman parijoto ini mempunyai kandungan antioksidan yang cukup tinggi. Xia JinYao et al (2009) melaporkan sembilan tanaman herbal Cina dari provinsi Yunnan yang salah satu diantaranya adalah Medinilla luchuenensis mempunyai nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dengan rentang 0,7812,50 mg/mL terhadap bakteri E. coli. Sedangkan Guo-Ying Zuo et al (2011) menyebutkan bahwa Medinilla luchuenensis mempunyai nilai KHM sebesar 3,12 mg/mL terhadap bakteri E.coli. Dengan adanya persamaan genus dengan tanaman Medinilla luchuenensis, diasumsikan bahwa tanaman parijoto juga mempunyai kandungan senyawa 1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2 antibakteri. Untuk itu perlu dilakukan penggalian lebih lanjut terhadap bioaktivitas kandungan kimia dari tanaman parijoto. Hal inilah yang melatarbelakangi penelitian uji aktivitas antibakteri dari ekstrak buah parijoto. 1.2 Rumusan Masalah 1. Belum diketahuinya aktivitas antibakteri dari ekstrak buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) terhadap bakteri Gram-negatif Escherichia coli dan bakteri Gram-positif Staphylococcus aureus. 2. Manakah dari ketiga ekstrak (metanol, etil asetat dan n-heksana) buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) yang mempunyai aktivitas tertinggi terhadap bakteri Gram-negatif Escherichia coli dan bakteri Gram-positif Staphylococcus aureus. 1.3 Tujuan Penelitian Dari rumusan masalah di atas, tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Untuk mengetahui aktivitas antibakteri ekstrak buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) terhadap bakteri Gram-negatif Escherichia coli dan bakteri Gram-positif Staphylococcus aureus dengan metode Difusi Cakram. 2. Untuk mengetahui ekstrak buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) manakah yang mempunyai aktivitas tertinggi terhadap bakteri Gramnegatif Escherichia coli dan bakteri Gram-positif Staphylococcus aureus. 1.4 Manfaat Penelitian 1. Penelitian ini dapat memberikan informasi ilmiah mengenai potensi aktivitas ekstrak n-heksana, etil asetat, dan metanol dari buah tanaman Medinilla speciosa Blume sebagai antibakteri 2. Dapat dijadikan dasar penelitian lebih lanjut yang berhubungan dengan aktivitas antibakteri di bidang kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Medinilla speciosa Blume 2.1.1 Klasifikasi tanaman Klasifikasi tanaman Medinilla speciosa Blume adalah sebagai berikut: Kingdom : Plantae Filum : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Ordo : Myrtales Famili : Melastomataceae Genus : Medinilla Spesies : Medinilla speciosa Blume (GBIF, 2013) 2.1.2 Sinonim Medinilla speciosa Blume Medinilla speciosa (Reinw. ex Blume) Blume, Melastoma speciosum Reinw. ex Blume (GBIF, 2013). 2.1.3 Deskripsi Tanaman Parijoto merupakan tanaman perdu dengan tinggi 1-2m; batang berbentuk bulat, kulit mempunyai lapisan gabus jika tua, bergerigi, kasar, putih kecoklatan; daun berupa daun tunggal, bersilang berhadapan, tangkai pendek, bulat, lunak, warna ungu kemerahan, helai daun berbentuk lonjong, pangkal dan ujung daun runcing, tepi rata, panjang 10-20cm, lebar 5-15cm, pertulangan daun melengkung, permukaan atas licin, berwarna hijau, permukaan bawah kasar, warna hijau kelabu; berbunga majemuk, terletak di ketiak daun, bunga sempurna, kelopak 5 helai, ujung runcing, pangkal berlekatan, panjang 3-8mm, benang sari 2 kali lipat jumlah mahkota, kepala sari berupa kuncup membengkok, kepala putik duduk di atas bakal buah, kepala putik bulat, ungu, mahkota lepas, 5 helai, panjang 5-8mm, warna merah muda; buah bulat, bagian ujung berbenjol 3 3 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4 bekas pelekatan kelopak, diameter 5-8mm, warna merah keunguan; biji berbentuk bulat, kecil, jumlah banyak, berwarna putih; akar berupa akar serabut, berwarna putih kotor (Anonim, 2014). Gambar 2.1 Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) [Sumber : Koleksi Pribadi, Februari 2014; www.plantillustrations.org] 2.1.4 Tempat Tumbuh Medinilla speciosa tumbuh liar di lereng-lereng gunung atau dihutanhutan dan kadang dibudidayakan sebagai tanaman hias, tumbuh baik pada tanah yang berhumus tinggi dan lembab pada ketinggian 800-2300m di atas permukaan laut, berbunga pada bulan November-Januari dan waktu panen yang tepat bulan Maret-Mei (Anonim, 2014). 2.1.5 Kandungan Kimia Daun dan buah parijoto mengandung saponin dan kardenolin, di samping itu buahnya juga mengandung flavonoid dan daunnya mengandung tanin (Anonim, 2014). Menurut Wachidah (2013), buah parijoto mengandung senyawa tanin, flavonoid, saponin dan glikosida. 2.1.6 Khasiat Secara tradisional buah dan daun parijoto digunakan sebagai obat sariawan dan anti radang (Anonim, 2014). Sedangkan masyarakat Colo, Kudus mempunyai keyakinan jika ibu hamil mengonsumsi Parijoto, kalau UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 5 anaknya laki-laki maka terlihat cakap, kalau perempuan terlihat cantik. Artinya bukan hanya secara fisik anak tapi juga perilakunya yang baik (Wibowo dkk, 2012). 2.2 Ekstraksi 2.2.1 Pengertian Ekstrak Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Depkes RI, 2000). Dalam parameter standar umum ekstrak tumbuhan dari Depkes RI (2000) disebutkan bahwa faktor yang berpengaruh pada mutu ekstrak adalah: a. Faktor Biologi Mutu ekstrak dipengaruhi dari bahan asal (tumbuhan obat), dipandang secara khusus dari segi biologi yaitu identitas jenis, lokasi tumbuhan asal, periode pemanenan, penyimpanan bahan, umur tumbuhan dan bagian yang digunakan. b. Faktor Kimia Mutu ekstrak dipengaruhi dari bahan asal (tumbuhan obat), dipandang secara khusus dari kandungan kimia, yaitu : 1. Faktor internal, seperti jenis senyawa aktif dalam bahan, komposisi kualitatif senyawa aktif, kadar total rata-rata senyawa aktif. 2. Faktor eksternal, seperti metode ekstraksi perbandingan ukuran alat ekstraksi, pelarut yang digunakan dalam ekstraksi, kandungan logam berat, ukuran kekerasan, dan kekeringan bahan 2.2.2 Metode Ekstraksi Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut ada dua, yaitu cara dingin dan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 cara panas. Ekstraksi cara dingin ada dua macam metode, yaitu maserasi dan perkolasi. Maserasi ialah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinyu (terus-menerus). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Cara ini dapat menarik zat-zat berkhasiat yang tahan pemanasan maupun yang tidak tahan pemanasan (Depkes RI, 2000). Metode perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses ini terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan. Ekstraksi ini membutuhkan pelarut yang lebih banyak. Sedangkan ekstraksi cara panas ada beberapa macam metode, yaitu refluks, sokletasi, digesti, infus dan dekok (Depkes RI, 2000). 2.3 Pewarnaan Bakteri Bakteri adalah organisme berukuran kecil dan terkadang berkelompok. Untuk memudahkan pengamatan di bawah mikroskop diperlukan pewarnaan mikroorganisme menggunakan zat pewarna. Pewarnaan yang sering digunakan adalah pewarnaan Gram, yaitu pewarnaan diferensial yang menggunakan lebih dari satu zat pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri, sehingga digunakan untuk membedakan jenis bakteri. Pewarnaan Gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram-positif dan Gram-negatif (Pratiwi, 2008). Perbedaan warna antara bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding sel UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 bakteri Gram-positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram-negatif banyak mengandung lipopolisakarida (Pratiwi, 2008). Tabel 2.1 Perbedaan bakteri Gram-Positif dan Gram-Negatif (Sumber : Johnson dkk, 2011) Gram-Positif Gram-Negatif Dinding sel peptidoglikan berlapis- Selubung sel memiliki lapisan lapis (dan biasanya tebal), peptidoglikan tipis (1-3 lapis) yang beranyam rapat yang mengurung terhubung dengan suatu membran kompleks besar kristal ungu- luar; peptidoglikan ini tidak teranyam iodium. rapat, sehingga mudah kehilangan kompleks ungu kristal-iodium pada proses pelunturan dengan alkohol. Bakteri Gram positif tidak Membran luarnya memiliki memiliki membran luar maka tidak lipopolisakarida, yang paling sering memiliki penghalang (barrier) dikeluarkan pada saat kematian sel hidrofobik untuk membatasi jalan dan memiliki komponen toksik masuk untuk antibiotika besar. Contoh : Bacillus, Staphylococcus, Contoh Streptococcus, : Neisseria, Moraxella, Peptostreptoccus, Brucella, Francisella, Bordetella dan Clostridium, Enterococcus, dan lain sebagainya lain sebagainya 2.4 Bakteri Patogen 2.4.1 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus adalah bakteri Gram-positif, berbentuk bola atau kokus, berkelompok tidak teratur, berantai pendek atau bergerombol, diameter 0,8-1,0μm, tidak membentuk spora dan tidak bergerak, koloni berwarna kuning, tidak berkapsul, dan dinding selnya mengandung dua komponen utama yaitu peptidoglikan dan asam teikoat, tumbuh cepat pada suhu 370C. Koloni pada pembenihan padat berbentuk bulat halus, menonjol, berkilau. Bakteri ini terdapat pada kulit, selaput lendir, bisul dan luka. S. aureus dapat menimbulkan penyakit melalui kemampuannya UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 8 berkembang biak dan menyebar luas dalam jaringan. Metabolisme dapat dilakukan secara aerob dan anaerob. Infeksi yang disebabkan di golongkan sebagai penyakit menular/lokal (biasanya) atau menyebar (jarang). S. aureus menghasilkan koagulase, suatu protein mirip enzim yang dapat menggumpalkan plasma yang telah diberi oksalat atau sitrat dengan bantuan suatu faktor yang terdapat dalam banyak serum. Bakteri yang membentuk koagulase dianggap mempunyai potensi menjadi patogen invasif (Jawetz, 1996). 2.4.2 Escherichia coli Escherichia coli adalah bakteri Gram-negatif, aerob atau anaerob fakultatif, berbentuk bulat cenderung ke batang panjang biasanya berukuran 0,5 x 1-3μ, terdapat dalam bentuk tunggal, berpasang-pasangan dan rangkaian pendek, bergerak menggunakan flagella peritrik atau tidak bergerak, biasanya tidak berbentuk kapsul, tidak membentuk spora. E. coli merupakan flora normal saluran usus manusia dan hewan. Oleh karena itu dianggap sebagai organisme indikator adanya kontaminasi pada makanan dan minuman. E. coli merupakan bakteri patogen penyebab infeksi paling sering pada manusia. Infeksi ekstraintestinal termasuk infeksi saluran kemih yang terjadi ketika saluran terhambat atau secara spontan disebabkan oleh UPEC (Uropathogenic E. coli). Infeksi serius lainnya adalah kolesistitis, usus buntu, peritonitis, infeksi luka pasca operasi, dan sepsis. Dalam infeksi saluran kemih akut, E.coli merupakan organisme penyebab 70-80 % pada kasus kronik, 40-50 % penyebab infeksi persisten (Kayser, et al., 2005). 2.5 Antibiotik Pada awalnya istilah yang digunakan adalah antibiosis, yang berarti substansi yang dapat menghambat pertumbuhan organisme hidup yang lain dan berasal dari mikroorganisme. Namun pada perkembangannya, antibiosis ini disebut antibiotik dan istilah ini tidak hanya terbatas untuk substansi yang berasal dari mikroorganisme, melainkan semua substansi yang diketahui UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 9 memiliki kemampuan untuk menghalangi pertumbuhan organisme lain khususnya mikroorganisme. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotik dibedakan menjadi (Pratiwi, 2008) : 1. Antibiotik yang menghambat sintesis dinding sel Antibiotik ini adalah antibiotik yang merusak lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram-positif maupun bakteri Gram-negatif. 2. Antibiotik yang merusak membran plasma Antibiotik golongan ini umumnya adalah antibiotik golongan peptida yang bekerja dengan mengubah permeabilitas membran plasma sel mikroorganisme. 3. Antibiotik yang menghambat sintesis protein Antibiotik ini berikatan pada subunit 30S ribosom bakteri (beberapa juga terikat pada subunit 50S ribosom) dan menghambat translokasi peptidiltRNA dan menyebabkan kesalahan pembacaan mRNA dan mengakibatkan bakteri tidak mampu melakukan proses sintesis protein vital untuk pertumbuhannya. 4. Antibiotik yang menghambat sintesis asam nukleat Penghambatan pada sintesis asam nukleat berupa penghambatan terhadap transkripsi dan replikasi mikroorganisme. 5. Antibiotik yang menghambat sintesis metabolit esensial Penghambatan terhadap sintesis metabolit esensial antara lain dengan adanya kompetitor berupa antimetabolit, yaitu substansi yang secara kompetitif menghambat metabolit mikoorganisme karena memiliki struktur yang mirip dengan substrat normal bagi enzim metabolisme. 2.6 Metode Skrining Antimikroba Metode skrining yang sering digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba produk alam dibagi menjadi 3 kelompok yaitu metode difusi, dilusi dan bioautografi. Metode difusi dan bioautografi merupakan teknik secara kualitatif karena metode ini hanya akan menunjukkan ada atau tidaknya senyawa dengan aktivitas antimikroba. Sedangkan metode dilusi digunakan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 10 untuk kuantitatif yang akan menentukan Konsentrasi Hambat Minimum (Choma, 2010). 2.6.1 Metode Difusi Metode difusi dibagi lagi menjadi tiga, yaitu difusi cakram, difusi silinder dan hole plate. Dalam prosedur cakram, kertas cakram (berdiameter +6 mm) yang mengandung senyawa uji ditempatkan pada permukaan agar yang sebelumnya diinokulasi dengan mikroorganisme uji. Senyawa uji berdifusi ke medium Agar menyebabkan penghambatan pertumbuhan mikroorganisme. Cawan petri diletakkan pada suhu kamar sebelum inkubasi, kemudian zona hambat diukur. Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) ditentukan secara visual, karena konsentrasi senyawa uji terendah, yang dapat menyebabkan zona hambat pertumbuhan dapat dikenali. Namun, metode difusi kurang cocok untuk menentukan nilai KHM dari pada dilusi, karena tidak mungkin mengukur jumlah senyawa uji yang berdifusi ke dalam medium agar (Choma, 2010). 2.6.2 Metode Dilusi Keuntungan utama dari metode dilusi dapat memperkirakan konsentrasi senyawa uji dalam medium agar atau suspensi broth, biasanya digunakan untuk penentuan nilai KHM. Pada metode dilusi agar, medium diinokulasi dengan organisme uji dan sampel yang diuji dicampur dengan inokulum. Material yang diinokulasi dan pertumbuhan mikroorganisme dapat terlihat dan dibandingkan dengan kultur kontrol yang tidak mengandung sampel uji. Pengujian diulang dengan variasi dilusi sampel uji dalam medium kultur dan menentukan dilusi yang paling tinggi dapat mencegah pertumbuhan mikroorganisme sampel (Rahman, et al., 2005). Dalam tabung uji, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan suspensi bakteri pada beberapa tabung, konsentrasi terendah menyebabkan penghambatan pertumbuhan mikroorganisme sesuai dengan nilai KHM. Pada uji mikrodilusi cair, mikroorganisme yang tumbuh di sumur plat, dimana berbagai konsentrasi senyawa uji ditambahkan. Pertumbuhan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 mikroorganisme ditunjukkan oleh adanya kekeruhan dalam sumur (Choma, 2010). 2.6.3 Metode Bioautografi Prosedur dalam metode bioautografi mirip dengan yang digunakan dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah bahwa senyawa uji berdifusi dari kertas kromatografi ke media agar yang diinokulasi. Metode bioautografi dibagi lagi menjadi bioautografi kontak, imersi dan langsung. (Choma, 2010). 2.7 Konsentrasi Hambat Minimum Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) didefinisikan sebagai konsentrasi terendah obat yang akan menghambat pertumbuhan dari organisme setelah inkubasi semalam (periode ini diperpanjang untuk organisme seperti bakteri anaerob, yang membutuhkan inkubasi lama untuk pertumbuhan). KHM dianggap sebagai "gold standard" untuk menentukan kerentanan organisme terhadap antimikroba dan digunakan untuk menilai kinerja dari semua metode pengujian kerentanan. KHM digunakan di laboratorium diagnostik untuk mengkonfirmasi resistensi yang tidak biasa, untuk memberikan jawaban pasti ketika hasil batas diperoleh dengan metode lain yang tidak sesuai, misalnya ketika menentukan kerentanan koagulase-negatif staphylococci. Kisaran konsentrasi antibiotik yang digunakan untuk menentukan KHM diterima secara universal menggandakan dilusi diatas dan dibawah konsentrasi 1 mg/L sesuai yang diperlukan (Andrew, 2001). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia dan Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta mulai dari bulan Februari-Juli 2014 menggunakan metode eksperimental. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik (AND, GH202), blender (Philip), peralatan gelas standar (Duran), pompa vakum (ULVAC DTC-21), vacuum rotary evaporator (N-1001SW, EYELA-USA), digital waterbath (SB-1000 EYELA-USA), corong pisah, Laminar Air Flow, autoklaf, inkubator (MEMMERT), pembakar bunsen, cawan petri, pinset, tabung reaksi, jarum ose. 3.2.2 Bahan Sampel uji yang digunakan adalah ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana dari buah tanaman parijoto (Medinilla speciosa Blume) yang diperoleh dari daerah Gunung Muria, desa Colo kabupaten Kudus, Nutrient Agar (Pronadisa), Nutrient Broth (Criterion), cakram kertas (diameter ±6 mm), cakram antibiotik kloramfenikol 30µg (Oxoid), Alkohol 70%, Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922 yang didapatkan dari laboratorium Mikrobiologi FKUI, pelarut n-heksana (teknis), etil asetat (teknis), metanol (teknis), aquades dan reagen untuk skrining fitokimia (Mayer, Dragendorff, FeCl3 0,1%, H2SO4 10%, NaOH 1M, HCl 1N dan CHCl3). 12 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 13 3.3 Cara Kerja 3.3.1 Determinasi Tanaman Untuk memastikan kebenaran simplisia yang digunakan dalam penelitian ini, maka dilakukan determinasi di Pusat Penelitian Herbarium Bogoriense, LIPI, Cibinong, Bogor (Lampiran 1). 3.3.2 Penyiapan Bahan Tiga kilogram buah segar parijoto (Medinilla speciosa Blume) diambil buahnya yang berwarna ungu dan disortasi basah untuk dipisahkan dari kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing, kemudian dicuci dengan air mengalir hingga bersih, ditiriskan dan dikering-anginkan sehingga bebas dari sisa air. Buah parijoto diblender +2 menit sehingga didapatkan sampel buah parijoto halus. Didalam buah parijoto terdapat biji yang berukuran sangat kecil dan banyak didalamnya. 3.3.3 Pembuatan Ekstrak Sebanyak 1748 gram buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) yang telah diblender dimaserasi menggunakan metanol di dalam wadah tertutup dan terhindar dari cahaya. Hasil maserasi disaring menggunakan kapas kemudian disaring kembali dengan kertas saring 2 lapis. Remaserasi dilakukan 1-3 hari sekali hingga warna pelarut metanol bening. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator pada suhu ±40oC hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat sampel awal. % kadar ekstrak = 3.3.4 Partisi Ekstrak Metanol Ekstrak metanol yang didapatkan kemudian dilarutkan dengan 100mL metanol, dimasukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan 100mL n-heksana yang telah didestilasi. Corong pisah dikocok dengan hati-hati UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 14 selama ±5 menit, sesekali keran corong pisah dibuka. Corong pisah didiamkan hingga terdapat lapisan antara metanol dan n-heksana. Lapisan n-heksana di bagian atas dan lapisan metanol di bagian bawah. Keran corong pisah dibuka untuk memisahkan kedua lapisan. Lapisan atas dikumpulkan dan lapisan bawah dimasukkan kembali ke dalam corong pisah dan dipartisi dengan n-heksana baru dengan melakukan prosedur yang sama sampai lapisan n-heksana bening. Fraksi n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksana. Ekstrak metanol dipartisi kembali dengan 100mL etil asetat yang telah didestilasi. Corong pisah dikocok dengan hati-hati selama ±5 menit dan sesekali keran corong pisah dibuka. Corong pisah didiamkan hingga terdapat lapisan antara lapisan etil asetat dan metanol. Partisi dilakukan lagi sampai lapisan etil asetat bening. Fraksi etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental etil asetat. Fraksi metanol yang telah dipisahkan dari etil asetat dipekatkan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental metanol. Masing-masing ekstrak kemudian ditimbang. 3.3.5 Uji Kadar Air Ekstrak Uji kadar air dilakukan untuk mengetahui sisa air dalam ekstrak. Prosedur pengujian kadar air ekstrak adalah sebagai berikut: sebanyak 1g ekstrak metanol dan etil asetat dimasukkan ke dalam cawan porselen yang telah ditara secara terpisah kemudian dikeringkan dalam oven 105ºC selama 5 jam dan ditimbang. Pengeringan dilanjutkan kemudian ditimbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25%. (Depkes RI, 2000) 3.3.6 Penapisan Fitokimia Penapisan fitokimia dilakukan pada ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana. Pengujian ini dilakukan untuk menguji adanya UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 15 golongan senyawa metabolit sekunder flavonoid, terpenoid, saponin, tanin, alkaloid dan glikosida. Prosedur pengujiannya adalah sebagai berikut : a. Uji Alkaloid Ekstrak dilarutkan dalam asam klorida encer dan disaring. Filtrat dibagi menjadi dua bagian, salah satu bagian ditetesi dengan pereaksi Mayer dan bagian lain ditetesi dengan pereaksi Dragendroff. Pembentukan endapan berwarna kuning pada ekstrak yang ditetesi dengan pereaksi Mayer dan pembentukan endapan merah pada ekstrak yang ditetesi dengan pereaksi Dragendroff menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al, 2011). b. Uji Flavonoid Ekstrak ditetesi dengan larutan NaOH. Pembentukan warna kuning intens, yang kemudian memudar saat penambahan larutan asam, menunjukkan adanya flavonoid (Tiwari et al, 2011). c. Uji Tanin Sebanyak 0,5g ekstrak direbus dalam 10mL air dalam tabung reaksi dan kemudian disaring. Ditambahkan beberapa tetes FeCl3 0,1% dan diamati warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman (Ayoola et al, 2008). d. Uji Terpenoid Pada sejumlah 0,5g masing-masing ekstrak ditambahkan 2mL kloroform. Sebanyak 3mL konsentrat H2SO4 hati-hati ditambahkan untuk membentuk lapisan. Terbentuknya warna coklat kemerahan pada permukaan menunjukkan adanya terpenoid (Ayoola et al, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 16 e. Uji Saponin Pada 0,5g ekstrak ditambahkan 5mL air suling dalam tabung reaksi. Kocok campuran ekstrak dan air dan diamati hingga terbentuk buih yang stabil (Ayoola et al, 2008). f. Uji Glikosida Sejumlah 0,5g ekstrak yang diencerkan dengan 5mL air ditambah dengan asam asetat glasial yang berisi satu tetes larutan FeCl3. Kemudian ditambah dengan 1mL asam sulfat pekat. Terbentuknya cincin coklat pada permukaan mengindikasikan adanya gula deoksi kardenolida (Ayoola et al, 2008). 3.3.7 Skrining Antibakteri 3.3.7.1 Pembuatan Media dan Sterilisasi Serbuk Nutrient agar ditimbang sebanyak 2,3g dan dicampur dengan 100mL aquades dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer diatas hotplate hingga larut. Dengan perlakuan yang sama, 0,8g Nutrient broth dicampur dengan 100mL aquades dalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer diatas hotplate hingga larut. Cawan petri, tabung reaksi, vial, tip beserta wadah yang telah dicuci bersih dan dikeringkan dibungkus dengan kertas dan plastik, sedangkan kertas cakram dimasukkan ke dalam cawan petri bersih. Media dan semua alat disterilisasi dalam autoklaf 1210C selama 15 menit (Pelczar, 2005). Setelah disterilisasi, semua alat dan bahan disimpan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya sudah disterilisasi dengan lampu UV selama 30 menit dan dibersihkan dengan alkohol 70%. 3.3.7.2 Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Uji Pada penelitian ini seri konsentrasi ekstrak uji (ekstrak metanol, ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksana) yang digunakan adalah 200, 100, 50, 25 dan 12,5mg/mL dengan pelarut dimetilsulfoksida (DMSO) (Natheer et al, 2012). Ekstrak uji 200mg/mL dibuat dengan cara menimbang 400mg UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 17 ekstrak dan dilarutkan dalam 2mL DMSO. Konsentrasi 100, 50, 25 dan 12,5mg/mL dibuat dengan melakukan serial pengenceran ekstrak dengan DMSO. Kertas cakram steril dijenuhkan dengan 10µL larutan ekstrak uji dan dikeringkan dalam cawan petri steril pada suhu ruangan. 3.3.7.3 Kontrol Positif dan Kontrol Negatif Kontrol positif yang digunakan adalah cakram antibiotik kloramfenikol 30µg sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut DMSO (Natheer et al, 2012). 3.3.7.4 Pembuatan Suspensi Bakteri Sebanyak satu ose koloni bakteri diinokulasikan dalam 10mL Nutrient broth kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Densitas optik kultur tersebut diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 625nm (OD625). OD625 yang dihasilkan kemudian dikonversi menjadi 0,1. OD625 0,1 senilai dengan standar 0,5McFarland (kepadatan sel bakteri 1x108 sel/mL). Suspensi bakteri kemudian diencerkan menjadi suspensi bakteri dengan kepadatan sel 106 sel/mL dengan mengambil sebanyak 1mL suspensi bakteri 108 sel/mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9mL Nutrient broth kemudian divortex dan dihasilkan suspensi bakteri dengan kepadatan sel 107 sel/mL. Kemudian 1mL suspensi bakteri 107 sel/mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9mL Nutrient broth, divortex dan dihasilkan suspensi bakteri dengan kepadatan sel 106 sel/mL (Lopez, 2003; Widiastomo, 2013). 3.3.7.5 Prosedur Uji Antibakteri Sebanyak 1mL suspensi bakteri dengan kepadatan sel 106 sel/mL dimasukkan ke dalam cawan petri steril, kemudian ditambahkan 15mL Nutrient agar cair. Cawan petri kemudian digoyangkan berlawanan arah jarum jam sebanyak 5-10x dan digoyangkan lagi searah jarum jam sebanyak 5-10x agar media dan suspensi tercampur. Pembuatan media UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 18 dilakukan di dekat api bunsen dalam Laminar Air Flow. Setelah agar memadat, setiap cawan petri dibuat diagram 6 bagian. Kertas cakram kontrol positif, kontrol negatif dan cakram yang telah dijenuhkan dengan larutan ekstrak, diletakkan pada masing-masing bagian dan kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam (Nufailah, 2008). Uji antibakteri ini dilakukan pengulangan tiga kali. Area jernih disekeliling cakram menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri yang kemudian diukur menggunakan mistar. Hasil pengukuran zona hambat diklasifikasikan berdasarkan tabel 3.1. Tabel 3.1 Klasifikasi Aktivitas Antibakteri (Greenwood, 1995) Diameter zona hambat (mm) <10 11-15 16-20 >20 Aktivitas antibakteri Tidak aktif Lemah Sedang Kuat 3.3.7.6 Pewarnaan Bakteri Uji Pewarnaan bakteri uji yang dilakukan adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan bakteri dilakukan untuk identifikasi dan untuk memastikan tidak ada kontaminan pada kultur kerja. Kaca obyek yang akan digunakan terlebih dahulu dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringkan. Dibuat lingkaran dengan pensil warna di bagian bawah kaca obyek untuk menandai tempat bakteri. Satu ose bakteri diambil dan ditempatkan dalam batas lingkaran yang sudah ditetesi dengan NaCl 0,9% dan dicampur hingga merata. Bakteri difiksasi dengan cara melewatkan kaca obyek diatas api bunsen sehingga membentuk noda pada kaca objek. Preparat diwarnai dengan crystal violet selama 1 menit kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya preparat diwarnai dengan iodin selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir dan ditetesi dengan alkohol 96% selama 30 detik. Setelah alkohol 96% dicuci, preparat diwarnai dengan safranin selama 1 menit. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam bakteri Gram positif sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam bakteri Gram negatif (Pratiwi, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 19 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Determinasi Tanaman Determinasi tanaman parijoto telah dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Hasil determinasi menunjukkan bahwa sampel tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Medinilla speciosa Blume dari famili Melastomataceae (Lampiran 1). 4.2 Ekstraksi dan Partisi Pada penelitian ini sampel yang digunakan adalah buah segar parijoto. Didalam buah parijoto terdapat biji sangat kecil dan banyak sehingga dalam penelitian ini biji tidak dipisahkan dari buahnya. Sampel yang diambil adalah buah yang berwarna ungu kemudian disortasi untuk dipisahkan dari kotoran atau bahan asing. Dari hasil sortasi didapatkan buah parijoto sebanyak 1748g. Buah parijoto kemudian diblender dan dimaserasi dengan 12,5 liter metanol yang telah didestilasi. Setelah difiltrasi, maserat kemudian diuapkan dengan vaccum rotary evaporator. Proses ekstraksi buah parijoto dilakukan dengan metode maserasi dengan pelarut metanol tanpa pemanasan, tujuannya agar senyawa-senyawa yang sensitif dengan suhu tidak terdekomposisi. Pada saat maserasi berlangsung pelarut berdifusi ke dalam sampel dan melarutkan senyawa-senyawa yang mempunyai kepolaran yang mirip dengan pelarut. Penghalusan sampel bertujuan untuk meningkatkan luas permukaan sehingga meningkatkan proses ekstraksi dan mempersingkat waktu maserasi (Ncube et al, 2008). Dari hasil maserasi diperoleh ekstrak kental metanol berwarna merah kecoklatan sebanyak 60,84 gram dengan rendemen 3,48%. Kecilnya hasil rendemen kemungkinan disebabkan oleh sampel yang digunakan adalah bagian buah yang mana mengandung banyak lemak sehingga tidak bisa ditarik oleh metanol. Sebanyak 51,46 gram ekstrak metanol yang didapatkan kemudian dipartisi dengan pelarut n-heksana dan etil asetat yang telah didestilasi menggunakan 19 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 20 corong pisah. Partisi ekstrak bertujuan untuk memisahkan senyawa-senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Senyawa non-polar pada ekstrak metanol akan terlarut dalam pelarut n-heksana sedangkan senyawa semi polar akan terlarut dalam pelarut etil asetat. Hasil partisi yang diperoleh kemudian diuapkan dengan vaccum rotary evaporator dan dihasilkan tiga ekstrak, yaitu ekstrak n-heksana 1,88 gram (3,65%), ekstrak etil asetat 15,44 gram (30%) dan ekstrak metanol 31,72 gram (61,64%). Masing-masing karakterisasi dan berat ekstrak disajikan dalam tabel 4.1 dan 4.2 berikut : Tabel 4.1 Karakterisasi ekstrak Bentuk Warna Bau Ekstrak Metanol Ekstrak etil asetat Ekstrak kental Ekstrak kental Coklat Merah Tidak ada Tidak ada Ekstrak n-heksana Ekstrak kental Hijau Tidak ada Tabel 4.2 Berat ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol No. 1 2 3 Ekstrak n-heksana Etil asetat Metanol Berat (gram) 1,88 15,44 31,72 Rendemen (%) 3,65 30 61,64 Hasil ekstrak kemudian di freeze dry yang bertujuan untuk mengurangi sisa pelarut sehingga tidak mengganggu hasil uji antibakteri. Selanjutnya dilakukan uji kadar air pada ekstrak metanol dan etil asetat. Ekstrak n-heksana tidak diuji kadar air karena jumlah ekstrak yang dihasilkan sedikit. Uji kadar air dijadikan indikator sisa air dalam ekstrak. Dalam penelitian ini, uji kadar air dilakukan dengan metode gravimetri, yaitu dengan mengeringkan ekstrak metanol dan etil asetat secara terpisah dalam oven 105ºC selama 5 jam kemudian dilanjutkan pengeringan pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25%. Hasil uji kadar air ekstrak metanol dan etil asetat dapat dilihat pada tabel 4.3 berikut ini: UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 21 Tabel 4.3 Hasil Uji Kadar Air No. 1 2 Sampel Ekstrak Metanol Ekstrak Etil Asetat Bobot awal (g) 1,0420 1,0020 1,0045 1,0090 Bobot akhir (g) 0,9402 0,9051 0,8361 0,8239 Kadar air (%) 9,76 9,67 16,76 18,34 Rata-rata (%) 9,72 17,55 Hasil uji kadar air ekstrak metanol yang diperoleh adalah 9,72% dan ekstrak etil asetat adalah 17,55% sedangkan dalam parameter standar umum ekstrak tumbuhan dari Depkes RI (2000) batas kadar air ekstrak adalah <10%. Hal ini menunjukkan bahwa kadar air ekstrak etil asetat melebihi parameter standar kadar air ekstrak. Kadar air yang tinggi pada ekstrak etil asetat kemungkinan disebabkan oleh pengerjaan partisi yang tidak sempurna pada saat pemisahan lapisan metanol dan etil asetat. 4.3 Penapisan Fitokimia Ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol yang diperoleh kemudian diuji penapisan fitokimia menggunakan metode yang dikembangkan oleh Ayoola et al (2008) dan Tiwari et al (2011). Tabel 4.4 Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol No. 1 2 3 4 5 6 Metabolit Sekunder Alkaloid Flavonoid Saponin Tanin Glikosida Terpenoid Ekstrak n-heksana + Ekstrak Etil Asetat + + + + - Ekstrak Metanol + + + + - Keterangan: + = memberikan reaksi positif = memberikan reaksi negatif Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui adanya metabolit sekunder seperti flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, glikosida dan terpenoid dalam ekstrak uji. Dari hasil skrining fitokimia ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat mengandung senyawa flavonoid, saponin, tanin dan glikosida UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 22 sedangkan ekstrak n-heksana mengandung senyawa terpenoid. Adanya senyawa metabolit sekunder pada masing-masing ekstrak dikarenakan sifat kepolaran dari tiap pelarut yang dapat menarik senyawa tersebut. Senyawa flavonoid, saponin, tanin dan glikosida umumnya dapat ditarik oleh pelarut polar seperti metanol (Ncube et al, 2008) dan etil asetat sedangkan senyawa terpenoid adalah senyawa non-polar yang umumnya dapat tertarik pada pelarut non polar seperti kloroform dan n-heksana (Tiwari et al, 2011). 4.4 Uji Antibakteri Metode uji aktivitas antibakteri yang digunakan adalah metode difusi cakram. Proses peremajaan bakteri dilakukan dengan menggunakan media nutrient broth sehingga lebih mudah pada saat pengukuran kepadatan sel bakterinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang yang digunakan adalah λ 625nm. Hasil absorban yang didapatkan kemudian dikonversi menjadi 0,1 dengan menambahkan nutrient broth sebagai pengencer (Lopez et al, 2003). Suspensi bakteri dengan absorban 0,1 setara dengan suspensi bakteri dengan kepadatan sel bakteri 10 8 sel/mL (Widiastomo et al, 2012). Pada saat inokulasi, suspensi bakteri yang digunakan adalah suspensi dengan kepadatan sel 106 sel/mL yang telah diencerkan dengan menambahkan nutrient broth (Lopez et al, 2003). Kontrol negatif yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut DMSO yang diteteskan pada cakram kertas steril. Natheer et al (2012) menyebutkan bahwa zat yang dijadikan sebagai kontrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pengencer ekstrak. Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan sebagai pengencer tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri ekstrak. Oleh karena itu kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO 100%. Hasil zona hambat kontrol negatif terhadap kedua bakteri uji adalah 0 mm. Hal ini menunjukkan bahwa penggunaan pelarut DMSO tidak mempengaruhi hasil uji antibakteri dari ekstrak. Kontrol positif yang digunakan adalah cakram antibiotik kloramfenikol 30µg. Kloramfenikol merupakan golongan antibiotik berspektrum luas. Kloramfenikol dikatakan resisten apabila diameter hambat pertumbuhan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 23 bakteri yang dihasilkan <20mm dan sensitif apabila hasil diameter hambat >21mm (Andrews, 2011). Hasil diameter hambat kloramfenikol terhadap kedua bakteri uji dalam penelitian ini berkisar antara 26-31mm. Hal ini menunjukkan bahwa cakram kloramfenikol yang digunakan sensitif terhadap kedua bakteri uji. Tabel 4.5 Hasil pengukuran diameter hambat ekstrak metanol buah Parijoto terhadap bakteri S. aureus dan E. coli Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi S. aureus E. coli Ekstrak I II III Rata2 I II III Rata2 200 mg/mL 18 14 15 15,67 10 10 12 10,67 100 mg/mL 15 15 14 14,67 9 10 11 10 50 mg/mL 13 14 14 13,67 8 9 8 8,33 25 mg/mL 13 14 11 12,67 0 0 0 0 12,5 mg/mL 11 8 10 9,67 0 0 0 0 Kontrol positif (cakram 28 25 29 27,33 27 28 28 27,67 kloramfenikol 30µg) Kontrol negatif 0 0 0 0 0 0 0 0 (DMSO) Keterangan : I = pengulangan pertama; II = pengulangan kedua; III = pengulangan ketiga Tabel 4.6 Hasil pengukuran diameter hambat ekstrak etil asetat buah Parijoto terhadap bakteri S. aureus dan E. coli Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi S. aureus E. coli Ekstrak I II III Rata2 I II III Rata2 200 mg/mL 19 16 18 17,67 12 13 12 12,33 100 mg/mL 16 15 18 16,33 11 12 11 11,33 50 mg/mL 17 14 16 15,67 10 11 11 10,67 25 mg/mL 15 13 16 14,67 10 9 8 9 12,5 mg/mL 15 13 16 13,33 9 8 7 8 Kontrol positif (cakram 28 27 28 27,67 29 30 29 29,33 kloramfenikol 30µg) Kontrol negatif 0 0 0 0 0 0 0 0 (DMSO) Keterangan : I = pengulangan pertama; II = pengulangan kedua; III = pengulangan ketiga UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 24 Tabel 4.7 Hasil pengukuran diameter hambat ekstrak n-heksana buah Parijoto terhadap bakteri S. aureus dan E. coli Diameter Zona Hambat (mm) Konsentrasi S. aureus E. coli Ekstrak I II III Rata2 I II III Rata2 200 mg/mL 17 11 10 13 8 7 7 7,33 100 mg/mL 14 8 9 10,33 6 6 6 6 50 mg/mL 10 0 0 3,33 0 0 0 0 25 mg/mL 0 0 0 0 0 0 0 0 12,5 mg/mL 0 0 0 0 0 0 0 0 Kontrol positif (cakram 30 26 30 28,67 29 28 28 28,33 kloramfenikol 30µg) Kontrol negatif 0 0 0 0 0 0 0 0 (DMSO) Keterangan : I = pengulangan pertama; II = pengulangan kedua; III = pengulangan ketiga Berdasarkan data diatas dapat dilihat perbandingan diameter hambat ratarata ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana terhadap bakteri S. aureus dan E.coli pada kurva berikut ini: Zona Hambat (mm) 20 15 15.67 14.67 10.67 10 10 13.67 12.67 9.67 8.33 S. aureus 5 0 0 25 12.5 E. coli 0 200 100 50 Konsentrasi ekstrak metanol (mg/mL) Gambar 4.1 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Zona Hambat (mm) 25 20 17.67 15 12.33 16.33 15.67 11.33 10.67 10 14.67 13.33 9 8 S. aureus 5 E. coli 0 200 100 50 25 12.5 Konsentrasi ekstrak etil asetat (mg/mL) Zona Hambat (mm) Gambar 4.2 Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etil Asetat terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli 15 13 10.33 10 7.33 6 S. aureus 3.33 5 0 0 0 50 25 12.5 E. coli 0 200 100 Konsentrasi ekstrak n-heksana (mg/mL) Gambar 4.3 Aktivitas Antibakteri Ekstrak n-heksana terhadap Bakteri S. aureus dan E. coli Dari hasil pengukuran diameter hambat pada tabel 4.5-4.7, secara umum menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat mempunyai daya hambat yang lebih besar dibandingkan ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana. Hal tersebut dikarenakan adanya senyawa metabolit sekunder pada ekstrak uji. Hasil uji penapisan fitokimia menunjukkan ekstrak etil asetat dan metanol mempunyai kandungan senyawa tannin, flavonoid, saponin dan glikosida sedangkan ekstrak n-heksana mengandung senyawa terpenoid. Okeke et al (2001) dan Rahman et al (2010) menyebutkan bahwa beberapa senyawa metabolit sekunder seperti glikosida, saponin, tanin, flavonoid, terpenoid dan alkaloid telah dilaporkan mempunyai aktivitas antibakteri. Quercetin, salah satu senyawa turunan golongan flavonoid dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus (Bimlesh Kumar et al, 2011) sedangkan Indoquinolin dari Cryptolepsis sanguinolenta mempunyai aktivitas UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 26 antibakteri terhadap bakteri Gram negatif dan kapang (Silva et al, 1996). Tanaman menyintesis senyawa flavon, flavonoid dan flavonol untuk merespon infeksi mikrobial (Ncube et al, 2008). Anyasor et al (2011) menyatakan bahwa aktivitas antibakteri dari ekstrak tanaman kemungkinan disebabkan oleh adanya senyawa tanin dan flavonoid yang berikatan dengan dinding sel bakteri dan menghambat biosintesisnya. Dari daya hambat terhadap bakteri uji, ketiga ekstrak buah parijoto lebih sensitif terhadap bakteri S. aureus daripada E. coli. Hal ini mungkin dikarenakan perbedaan susunan dinding sel bakteri dimana E. coli mempunyai lapisan dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan S. aureus (Natheer et al, 2012). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 27 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian uji antibakteri dari ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana buah parijoto yang dilakukan, maka dapat disimpulkan sebagai berikut : 1. Dari ketiga ekstrak uji dengan konsentrasi 200, 100, 50, 25, 12,5mg/mL secara berturut-turut ekstrak etil asetat mempunyai diameter hambat pertumbuhan bakteri paling tinggi yaitu 17,67; 16,33; 15,67; 14,67; 13,33mm terhadap bakteri S. aureus dan 12,33; 11,33; 10,67; 9; 8mm terhadap bakteri E. coli. 2. Dari ketiga ekstrak uji, ekstrak etil asetat buah parijoto mempunyai potensi aktivitas antibakteri tertinggi daripada ekstrak metanol dan n-heksana terhadap bakteri E. coli dan S. aureus. 5.2 Saran Saran yang dapat diberikan untuk penelitian selanjutnya adalah : 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap senyawa aktif pada ekstrak buah parijoto yang mempunyai aktivitas antibakteri. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui bioaktivitas lain dari ekstrak buah parijoto. 27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 28 DAFTAR PUSTAKA Andrews, Jennifer M. 2001. Determination of Minimum Inhibitory Concentration. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2001) 48, Suppl. S1,5-16 Andrews, J.M. and R.A. Howe. 2011. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 10). J. Antimicrob Chemotheraphy 2011; 66: 2726– 2757 Anonim.2013.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/en.[30 November 2013] Anonim.2014.http://www.warintek.ristek.go.id/pangan_kesehatan/tanaman_obat/ depkes/5-062.pdf. [19 januari 2014] Anyasor GN, Aina DA, Olushola M, Aniyikaya AF (2011). Phytochemical constituent, proximate analysis, antioxidant, antibacterial and wound healing properties of leaf extracts of Chromolaena odorata. Ann. Biol. Res., 2: 441-451. Arora, D.S., Jasleen Kaur. 1999. Antimicrobial activity of spices. International Journal of Antimicrobial Agents 12 (1999) 257–262 Arora, D.S., G.J. Kaur. 2007. Antibacterial activity of some Indian medicinal plants. J Nat Med (2007) 61:313–317 Ayoola, GA., dkk. 2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, September 2008; 7 (3): 1019-1024 Basri DF, Fan SH (2005). The potential of aqueous and acetone extracts of galls of Quercus infectoria as antibacterial agents. Ind. J. Pharmacol., 37(1): 2629. Bimlesh Kumar, Harleen Kaur Sandhar, Sunil Prasher, Prashant Tiwari, Manoj Salhan, Pardeep Sharma. 2011. A Review of Phytochemistry and Pharmacological of Flavonoids. International Pharmaceutica Sciencia Choma, Irena M, Edyta M Grzelak. 2010. Bioautography Detection in Thin-Layer Chromatography. Journal of Chromatography A Chroma-351708 CLSI.2012.Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard—Eleventh Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500 Wayne, PA 19087 USA Djide dan Sartini. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi Farmasi. Lephas, Makasar. Depkes RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta. 28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 29 European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID). 2000. Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution. EUCAST DEFINITIVE DOCUMENT E.Def 3.1 Greenwood. 1995. Antibiotics, Susceptibility (Sensitivity) Test Antimicrobial And Chemoterapy. Mc. Graw Hill Company, USA Guo-Ying Zuo, Fan-Yan Meng, Jun Han, Xiao-Yan Hao, Gen-Chun Wang, YunLing Zhang and Qing Zhang. In Vitro Activity of Plant Extracts and Alkaloids against Clinical Isolates of Extended-Spectrum β-Lactamase (ESBL)-Producing Strains. Molecules 2011, 16, 5453-5459; doi:10.3390/molecules16075453 Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, terbitan ke-2, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Penerbit ITB : Bandung Jawetz, Ernest. 1996. Mikrobiologi Kedokteran edisi 20. EGC : Jakarta Johnson, Arthur G. dkk. 2011. Essensial Mikrobiologi dan Imunologi, edisi kelima, diterjemahkan oleh Prof. Dr. Julius E. Surjawidjaja. Binarupa Aksara Publisher : Tangerang Selatan Kayser, Fritz H., Kurt A. Bienz, Johannes Eckert, Rolf M. Zinkernagel, . 2005. Medical Microbioly. New York : Thieme Stuttgart Lopez, Crisanto Maglaque., Sunee Nitisiprasert., Penkhae Wanchaitanawong and Ngamtip Poovarodom. Antimicrobial Activity of Medicinal Plant Extracts Against Foodborne Spoilage and Pathogenic Microorganisms. Kasetsart J. (Nat. Sci.) 37 : 460-467 (2003) Maria, C., Buta Erszebet, Horţ Denisa. 2012. Medinilla: An Exotic and Attractive Indoor Plant With Great Value. Journal of Horticulture, Forestry and Biotechnology. 16 (2) : 9-12 Melki, dkk. 2011. Uji Antibakteri Ekstrak Gracilaria sp (Rumput Laut) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Natheer, S.E., C. Sekar., P. Amutharaj., M. Syed Abdul Rahman and K. Keroz Khan. 2012. Evaluation of Antibacterial Activity of Morinda citrifolia, Vitex trifolia and Chromolaena odorata. African journal of Pharmacy and Pharmacology Vol. 6 (11), pp. 783-788 Ncube, NS, Afolayan AJ, Okoh AI. Assesment Technique of Antimicrobial Properties of Natural Compounds of Plant Origin: Current Methods and Future Trends. African Journal of Biotechnology 2008; 7 (12): 1797-1806 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 30 Nufailah, Dina.,dkk. 2008. Uji Aktivitas Antibakteri Produk Reduksi Asam Palmitat Dalam Sistem NaBH4/ BF3.Et2O Terhadap Escherichia coli Dan Staphylococcus aureus. Universitas Diponegoro Okeke MI, Iroegbu CU, Eze EN, Okali AS, Esimone CO (2001). Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for antibacterial activity. J. Ethnopharmacol., 78: 119-127. Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga : Jakarta Radji, Maksum., Ratna Chandra Sari, Atiek Sumiati. 2008. Uji Aktivitas Antimikroba Dan Uji Sitotoksik Ekstrak Etanol Akar Tanaman Akar Kucing (Acalypha Indica Linn), Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Sheff) Boerl) Dan Sari Buah Merah (Pandanus Conoideus Lam). Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. V, No. 1, April 2008, 40 - 46 Rahman, Md Ajijur, Md Mohamad Zahidul Islam, Md.Anwar U.I. Islam. 2011. Antibacterial Activities of Actinomcete Isolates Collected from Soils of Rajshahi, Bangladesh. Biotechnology Research International 2011, Article ID 857925\ Rahman MA, Ahsna T, Islam S. (2010). Antibacterial and antifungal properties of methanol extract from the stem of Argyreia argentea. Bang. J. Pharmacol., 5: 41-44. Rinawati, N.D._____. Daya Antibakteri Tumbuhan Majapahit (Crescentia cujete L.) terhadap Bakteri Vibrio alginolyticus. Biologi, Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember Silva, O., Duarte A, Cabrita J, Pimentel M, Diniz A and Gomez E. 1996. Antimicrobial Activity of Guinea-Bissau Traditional Remedies. J. Ethnopharmacol. 50: 53-59 Tapas, AR., DM Sarkarkar dan RB Kakde. 2008. Flavonoids as Ntraceuticals: a Review. Tropical Journal of Pharmaceutical Research The Global Biodiversity Information Facility: GBIF Backbone Taxonomy, 201307-01. Accessed via http://www.gbif.org/species/3870285 on 2014-02-11 Tiwari, Phrasant., Bimlesh Kumar., Mandeep Kaur., Gurpreet Kaur., Harleen Kaur. Phytochemical Screening and Extraction : A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia Jan-March 2011, Vol. 1, Issue 1. Wachidah, Leliana.N. 2013. Uji Aktivitas Antioksidan serta Penentuan Kandungan Fenolat dan Flavonoid Total dari Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume). Skripsi. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah Wibowo, H.A., Wasino & Dewi Lisnoor Setyowati. 2012. Kearifan Lokal dalam Menjaga Lingkungan Hidup (Studi Kasus Masyarakat di Desa Colo Kecamatan Dawe Kabupaten Kudus). Journal of Educational Social Studies 1 (1) : 25-30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 31 Widiastomo, Bobby Wahyu.,dkk. 2013. Efek Antimikroba Ekstrak Etanol Daun Pepaya (Carica papaya L) Terhadap Bakteri Shigella dysentriae Kode Isolat 2312-F Secara In Vitro. Universitas Brawijaya. Wiegand, Irith., Kai Hilpert & Robert E W Hancock. 2008. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. NATURE PROTOCOLS | VOL.3 NO.2 | 2008 Xia JinYao; Zuo GuoYing; Wang GenChun; Xu GuiLi; Zhao YiBin. Screen of Chinese herbal medicines originated in Yunnan province against drug resistant, Escherichia coli producing ESBLs in vitro. Journal Medical Journal of National Defending Forces in Southwest China 2009 Vol. 19 No. 7 pp. 664-666. http://www.cabdirect.org/abstracts/20093239234.html;jsessionid=F9DDA0 DEA880EE78CB4AD971DDCB41C0# UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 32 Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 33 Lampiran 2. Bagan Alur Kerja Ekstraksi dan Uji Antibakteri Buah Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Pembuatan Ekstrak Buah Parijoto Buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) segar disortasi basah Dicuci dengan air mengalir kemudian ditiriskan Sampel dimaserasi menggunakan metanol yang sudah didestilasi Maserat difiltrasi Sampel dihaluskan menggunakan blender Sampel ditimbang sebanyak 1748g filtrat Ampas Dievaporasi dg Vaccum rotary evaporator Ekstrak kental + 100mL metanol dipartisi dengan 100mL n-heksana hingga fase n-heksana jernih Fraksi n-heksana Fraksi metanol dipartisi dengan 100mL etil asetat hingga fase etil asetat jernih Fraksi etil asetat Fraksi metanol Dievaporasi dg Vaccum rotary evaporator Ext. n-heksana Ext. etil asetat Penapisan fitokimia Ext. metanol Uji antibakteri menggunakan metode difusi cakram UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 34 Pembuatan Media dan Sterilisasi (Pelczar, 2005) Erlenmeyer 250mL diisi dg 2,3g NA 100mL aqudes steril Erlenmeyer 250mL diisi dg 0,8g NB dan 100mL aquades steril Dipanaskan diatas hotplate dan diaduk dg magnetic stirrer sampai mendidih Medium NA dan NB Disterilisasi menggunakan autoklaf suhu 1210C selama 15 menit Cawan petri, tabung reaksi, vial, tip beserta wadah dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas Preparasi Ekstrak Uji Kertas cakram steril dijenuhkan dengan 10µL larutan ekstrak uji dan dikeringkan dalam cawan petri steril pada suhu ruangan. Pembuatan Suspensi Bakteri (Lopez, 2003; Widiastomo 2012) Satu ose bakteri diinokulasikan ke dalam 10mL NB Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam OD625 diukur menggunakan spektrofotometer Hasil OD625 kemudian dikonversi menjadi 0,1 dg menambahkan NB. Suspensi bakteri OD625 0,1 OD625 0,1 setara dg 0,5McF, sementara standar 0,5McF setara dg kepadatan sel bakteri 108 cfu/mL. . UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 35 9mL NB Suspensi bakteri OD 0,1 = 108 cfu/mL 107 cfu/mL Suspensi divortex dahulu sebelum diambil 1mL 106 cfu/mL Uji Aktivitas Antibakteri 1 mL Diinokulasikan ke petri kosong Suspensi bakteri 106 cfu/mL Ditambahkan NA cair Petri diputar agar media NA dan bakteri tercampur 1 Cakram ditanam diatas media yang sudah memadat Keterangan : 2 3 (+) (-) Cawan diinkubasi pada suhu 370C, selama 24 jam 4 5 1 = cakram berisi ekstrak uji konsentrasi 200 mg/mL 2 = cakram berisi ekstrak uji konsentrasi 100 mg/mL 3 = cakram berisi ekstrak uji konsentrasi 50 mg/mL 4 = cakram berisi ekstrak uji konsentrasi 25 mg/mL 5 = cakram berisi ekstrak uji konsentrasi 12,5 mg/mL (-) = cakram berisi pelarut DMSO (+) = cakram antibiotik kloramfenikol 30µg UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 36 Lampiran 3. Hasil Uji Antibakteri Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli a. Pewarnaan Gram Bakteri Uji Staphylococcus aureus Escherichia coli b. Uji Antibakteri Bakteri Pengulangan Ekstrak Ekstrak Etil Ekstrak n- Metanol Asetat heksana I Staphylococcus aureus II III I Escherichia II coli III UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 37 Lampiran 4. Skrining Fitokimia Ekstrak Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Gambar Skrining fitokimia Eksrak metanol Ekstrak etil asetat Ekstrak n-heksana Uji Alkaloid (Pereaksi Dragendorf) Filtrat ekstrak metanol + HCl encer Penambahan P. Dragendorf Tidak terdapat endapan merah (-) Penambahan Filtrat P. Dragendorf ekstrak etil asetat + Tidak terdapat HCl encer endapan merah Penambahan P. Filtrat ekstrak Dragendorf n-heksana + Tidak terdapat HCl encer endapan merah (-) (-) Uji Alkaloid (Pereaksi Meyer) Filtrat ekstrak metanol + HCl encer Penambahan P. Meyer Tidak terdapat endapan kuning (-) Filtrat ekstrak etil asetat + HCl encer Penambahan Penambahan P. P. Meyer Filtrat ekstrak Meyer Tidak Tidak terdapat n-heksana + terdapat endapan HCl encer endapan kuning kuning (-) (-) Uji Flavonoid ekstrak metanol + NaOH Penambahan H2SO4 warna kuning memudar (+) ekstrak etil asetat + NaOH Penambahan H2SO4 warna kuning memudar (+) Penambahan ekstrak n- H2SO4 heksana + warna kuning NaOH tidak memudar (-) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 38 Uji Saponin Terbentuk busa yang stabil Terbentuk busa yang stabil (+) (+) Tidak terbentuk busa yang stabil (-) Uji Tanin Terbentuk warna kehitaman Terbentuk warna kehitaman Tidak terbentuk warna (+) (+) kehitaman (-) Tidak terbentuk cincin coklat Tidak terbentuk cincin coklat Terbentuk cincin coklat kemerahan (-) kemerahan (-) kemerahan (+) Terbentuk cincin coklat (+) Terbentuk cincin coklat (+) Tidak terbentuk cincin coklat (-) Uji Terpenoid Uji Glikosida UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
